JPS6221000B2 - - Google Patents
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- JPS6221000B2 JPS6221000B2 JP54161609A JP16160979A JPS6221000B2 JP S6221000 B2 JPS6221000 B2 JP S6221000B2 JP 54161609 A JP54161609 A JP 54161609A JP 16160979 A JP16160979 A JP 16160979A JP S6221000 B2 JPS6221000 B2 JP S6221000B2
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Description
本発明は新規な抗腫瘍性蛋白複合体とその製造
法に関する。更に詳しくは、本発明は、抗腫瘍免
疫グロブリンからなる構成部分と、ジフテリア毒
素の実質的にフラグメントＡからなる構成部分を
有する、特に悪性腫瘍の治療薬として用いられ
る、新規な蛋白複合体とその製造法に関するもの
である。 悪性腫瘍、即ちガンの治療薬（制ガン剤）とし
てはこれまで多くのものが知られているが、これ
らの薬はガン細胞のみならず正常細胞にも相当の
毒性を発揮するので、ガン細胞を死滅させる程度
にまで十分にその使用量を上げることができない
という欠点を有している。これらの欠点を解決す
るために、制ガン剤や細胞毒性を有する蛋白毒素
を特殊なキヤリヤーと結合させ、選択的にガン細
胞に吸引させるいくつかの試みがなされてきた。
ガン患者の血中あるいはガン細胞の表面には、極
めて微量であるが、抗腫瘍抗体（抗腫瘍免疫グロ
ブリン）が存在する。また、これ迄実際的にはガ
ン組織を動物に免疫し、更にヒト正常組織で吸収
することによつて、抗腫瘍抗体が得られてきた。
このような同一個体の、同種の、又は異種の抗腫
瘍抗体は、必ずしもガン細胞に対して細胞傷害作
用を発揮するとは限らないが、極めて高い特異性
をもつてガン細胞と結合するという共通した性質
を有している。したがつて抗腫瘍抗体が、制ガン
剤や蛋白毒素を選択的にガン細胞に吸引させるた
めのキヤリヤーとして利用されてきたのである。 例えば、特開昭51−144723には、ダウノマイシ
ン等の制ガン剤を抗腫瘍免疫グロブリンのFab′2
量体に共有的に結合させた薬剤一抗体複合物から
なる抗腫瘍剤が開示されている。この複合物は標
的ガン細胞に薬剤を選択的に吸引させうるという
点で優れたものであるが、抗体（Fab′2量体）に
結合したダウノマイシン等の制ガン剤は、ガン細
胞のみならず正常細胞に対しても依然として細胞
毒性を有しているが由に、ガン細胞のみを破壊す
るという点では末だ十分なものではなく、またそ
の細胞毒性も必ずしも十分ではない。 制ガン剤の代わりに、より強力な細胞毒性を有
する蛋白毒素の１つであるジフテリア毒素を利用
する研究も行なわれてきた。 例えば、エフ エル ムールテン（F.L.
Moolten）らは、ウサギ抗SV40抗体とジフテリア
毒素をグルタルアルデヒドで架橋して複合体を調
製し、これをハムスターに投与することによつ
て、SV40でトランスフオームした3T3細胞の腫
瘍形成を抑えることができたことを報告している
（ジヤーナル オブ ザ ナシヨナル キヤンサ
ー インステイチユート（J.Natl.Cancer Inst.
），第55巻，第473〜477頁，1975年）。 ピー イー ソープ（P.E.Thorpe）らは、抗
リンパ球抗体とジフテリア毒素をクロラムブシル
を介して結合し、その複合体がヒトリンパ芽球様
細胞CLA4のタンパク生合成を強く阻害したこと
を報告している（ネイチヤー（Nature）第271
巻，第752〜754頁，1978年）。これらの研究は、
ジフテリア毒素と抗体との複合体が、ガン細胞に
選択的に毒性を発揮しうることを示している。し
かしながら、抗腫瘍剤として用いる場合には、以
下のごとき欠点を有することが予想される。第１
の欠点は、ジフテリア毒素の非特異的な毒性がな
くなつていない点にある。つまり、これらの方法
はジフテリア毒素を抗腫瘍抗体によつてガン細胞
の表面に集めようとするものであるが、複合体は
またジフテリア毒素を構成成分として含むが故
に、正常細胞のジフテリア毒素のリセプターとも
反応し正常細胞表面にも吸引され、正常細胞にも
細胞毒性を発揮する傾向にある。第２には抗体と
ジフテリア毒素との架橋方法に欠点がある。グル
タルアルデヒド，トルエンジイソシアナート，ク
ロラムブシル等の多くの架橋試薬は抗体と毒素の
架橋だけでなく、抗体分子内，毒素分子内，抗体
―抗体間あるいは毒素―毒素間の架橋も起す。そ
の結果、望ましくない生成物が生じたり、抗腫瘍
活性が低下するという欠点がある。 本発明者らは、先行技術の有する欠点を解消
し、ガン細胞にのみ選択的に強力な毒性を発揮す
る抗腫瘍性物質を開発すべく鋭意研究の結果本発
明に到達した。 即ち、本発明は抗腫瘍免疫グロブリンからなる
構成部分とジフテリア毒素の実質的にフラグメン
トＡからなる構成部分を有する、下記式（）で
表わされる抗腫瘍性蛋白複合体である。 Ab−（NHCO−Ｘ−S1−S2−FA）o ……（） 〔Abは抗腫瘍免疫グロブリンからなる構成部
分を、FAはジフテリア毒素の実質的にフラグメ
ントＡからなる構成部分を表わす。Ｘは炭素数が
１〜５個の分枝を有するかあるいは有しないアル
キレン基又はフエニレン基である。アミド結合中
のＮは抗腫瘍免疫グロブリン中のアミノ基に由来
する窒素原子である。S1とS2は共に硫黄原子であ
り、S2はジフテリア毒素中のジスルフイド結合に
由来する硫黄原子を表わす。ｎは１〜５の整数を
表わす。〕 本発明において抗腫瘍免疫グロブリンとは、例
えば癌患者の血清から、または腫瘍細胞又は腫瘍
特異抗原或いは腫瘍関連抗原であるα―フエトプ
ロテイン（AFP）やカルシノエンブリオニツク
アンテイジエン（CEA）をサル，ウマ，ウシ，
ヤギ，ヒツジ，ウサギ等の動物に過免疫した血清
から、コーンのエタノール分画法，硫安分画法，
イオン交換クロマトグラフイー法等の公知の手段
によつて調製されるところの抗腫瘍活性を有する
蛋白質（免疫グロブリン）あるいは、癌細胞や癌
抗原を動物に免疫して得た抗体産生性リンパ球
を、例えば骨髄腫瘍細胞と融合させて、培養可能
で抗体を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）を
得、これをin vitro（生体外）で培養するか、或
いは動物に移植してin vivo（生体内）で増殖せ
しめて、培養液または血清や腹腔液から調整され
る極めて特異性の高い抗腫瘍活性を有する蛋白質
をいう。また、腫瘍組織から界面活性剤等の変性
剤で腫瘍抗体を遊離させ、これから前述と同様な
手段で調製される抗腫瘍活性を有する蛋白質も本
発明の抗腫瘍免疫グロブに含まれる。本発明の抗
腫瘍性蛋白複合体の構成部分の１つである抗腫瘍
免疫グロブリンからなる構成部分とは、前述のご
とき免疫グロブリンからなる構成部分を意味す
る。かかる免疫グロブリンは、分子中に末端アミ
ノ基や構成アミノ酸のリジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミノ基を利用
して本発明の抗腫瘍性蛋白複合体が製造される。
利用されるアミノ基の個数は１〜５個（式(1)にお
いてｎ＝１〜５に相当する）の範囲にあるのが好
ましい。 本発明においてジフテリア毒素とは、ジフテリ
ア菌又はその変異株が産生する蛋白毒素をいう。
例えば、ジフテリア菌が産生するジフテリア毒素
は、分子量約62000〜63000の単一のポリペプチド
鎖からなり、これはインタクトトキシンと呼ばれ
ている。インタクトトキシンは第１図のイに模式
的に示した如く、その分子内にジスルフイド結合
（−Ｓ−Ｓ−結合）を２個有している。このイン
タクトトキシンを、例えば、トリプシンのような
蛋白分解酵素で温和な条件で処理すると、アミノ
基末端に近い側のジフルフイド結合の間の特定の
部位に分割がおこり、第２図のロに示すごときニ
ツクドトキシンとなる。このニツクドトキシンを
直接還元剤で処理するか、一旦Ｓ−スルホ化分解
した後還元剤で処理すると、第１図のハに示した
如く分子量約24000のフラグメントＡと約38000〜
39000のフラグメントＢに分離する。インタクト
トキシンとニツクドトキシンは動物に対する非常
な毒性を有しているが、フラグメントＡとフラグ
メントＢはそのままでは共に非毒性である。一
方、インタクトトキシンとニツクドトキシンは、
以下に定義されるエロンゲーシヨンフアクター２
（EF―２）のアデノシン二燐酸（ADP）リボシ
ル化酵素活性を有しないのに対し、フラグメント
Ａは酵素活性を有している。そして、フラグメン
トＢは酵素活性は有しないが、フラグメントＡに
は見られない細胞のリセプターとの結合能を有し
ている。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体の構成部分の１つ
であるジフテリア毒素の実質的にフラグメントＡ
からなる構成部分とは、前述したフラグメントＡ
の特徴、即ち (1) EF―２のADPリボシル化酵素活性を有する
こと、 (2) 細胞のリセプターとの結合能を有さず、その
ままでは細胞毒性がないこと、 という２つの特徴を満足するジフテリア毒素のフ
ラグメントからなる構成部分を意味する。前記２
つの条件を満足する限り、ジフテリア変異株、例
えばC7（β30）やC7（β45）が産生する、例え
ばCRM30やCRM45のごとき無毒変異蛋白（分子
中にジスルフイド結合を１個有している）や、こ
れらを例えばチオール試薬等の環元剤の存在下で
トリプシンで温和に処理して得られるフラグメン
トも、本発明におけるフラグメントＡに含まれ
る。 かくして得られたフラグメントＡは、フラグメ
ント中に少なくとも１個のチオール基を有してい
る場合にはそのまま、フラグメント中に１個のジ
スルフイド結合を有している場合には、ジスルフ
イド結合を公知の方法で切断し、少なくとも１個
のチオール基を有するフラグメントとした後、本
発明の抗腫瘍性蛋白複合体を製造するために使用
される。本発明におけるフラグメントＡとして
は、分子中に１個のチオール基を有するフラグメ
ントが特に好ましい。 なお、EF―２のADPリボシル化酵素活性とは
次の様に定義される。 細胞の蛋白合成に関係する蛋白伸長因子として
EF―２が知られているが、ジフテリア毒素のフ
ラグメントＡは、EF―２とニコチンアミドーア
デニンジヌクレオチド（NAD）との以下のごと
き反応を触媒的に促進させることによりEF―２
を失活させ、細胞の蛋白合成作用を阻害する。 EF―２＋NAD+→（ADPリボース） −（EF―２）＋ニコチンアミド＋H+ この反応を促進させる作用が、EF―２のADP
リボシル化酵素活性と定義される。 EF―２のADPリボシル化酵素活性は、蛋白合
成阻害作用従つて動物の致死作用の本態である
が、このEF―２のADPリボシル化酵素活性を有
するシフテリア毒素のフラグメントＡが、細胞内
へ到達しその作用を発現するためには、細胞のリ
セプターとの結合能を有するフラグメントＢが必
要であり、フラグメントＡのみでは動物を致死さ
せえないのである。 前記式（）で表わされる本発明の抗腫瘍性蛋
白複合体は、前述の抗腫瘍免疫グロブリンとフラ
グメントＡを加橋剤で結合させることによつて得
られる。本発明において用いられる架橋剤は、基
本骨格（前記式（）におけるＸ）が炭素数１〜
５個の分枝を有するかあるいは有しないアルキレ
ン基又はフエニレン基であり、これに１個の活性
エステル基と１個の活性ジスルフイド基を有する
ものである。基本骨格として特に好ましいのはエ
チレン基である。架橋剤中の活性エステル基は免
疫グロブリン中のアミノ基と反応してアミド結合
を形成し、活性ジスルフイド基はフラグメントＡ
のチオール基と反応して新たなジスルフイド結合
を形成し、前記式（）で表わされる抗腫瘍性蛋
白複合体が得られる。本発明において好ましい架
橋剤は下記式（）で表わされる化合物である。 〔Ｘは炭素数が１〜５個の分枝を有するかある
いは有しないアルキレン基又はフエニレン基であ
る。Ｙは
法に関する。更に詳しくは、本発明は、抗腫瘍免
疫グロブリンからなる構成部分と、ジフテリア毒
素の実質的にフラグメントＡからなる構成部分を
有する、特に悪性腫瘍の治療薬として用いられ
る、新規な蛋白複合体とその製造法に関するもの
である。 悪性腫瘍、即ちガンの治療薬（制ガン剤）とし
てはこれまで多くのものが知られているが、これ
らの薬はガン細胞のみならず正常細胞にも相当の
毒性を発揮するので、ガン細胞を死滅させる程度
にまで十分にその使用量を上げることができない
という欠点を有している。これらの欠点を解決す
るために、制ガン剤や細胞毒性を有する蛋白毒素
を特殊なキヤリヤーと結合させ、選択的にガン細
胞に吸引させるいくつかの試みがなされてきた。
ガン患者の血中あるいはガン細胞の表面には、極
めて微量であるが、抗腫瘍抗体（抗腫瘍免疫グロ
ブリン）が存在する。また、これ迄実際的にはガ
ン組織を動物に免疫し、更にヒト正常組織で吸収
することによつて、抗腫瘍抗体が得られてきた。
このような同一個体の、同種の、又は異種の抗腫
瘍抗体は、必ずしもガン細胞に対して細胞傷害作
用を発揮するとは限らないが、極めて高い特異性
をもつてガン細胞と結合するという共通した性質
を有している。したがつて抗腫瘍抗体が、制ガン
剤や蛋白毒素を選択的にガン細胞に吸引させるた
めのキヤリヤーとして利用されてきたのである。 例えば、特開昭51−144723には、ダウノマイシ
ン等の制ガン剤を抗腫瘍免疫グロブリンのFab′2
量体に共有的に結合させた薬剤一抗体複合物から
なる抗腫瘍剤が開示されている。この複合物は標
的ガン細胞に薬剤を選択的に吸引させうるという
点で優れたものであるが、抗体（Fab′2量体）に
結合したダウノマイシン等の制ガン剤は、ガン細
胞のみならず正常細胞に対しても依然として細胞
毒性を有しているが由に、ガン細胞のみを破壊す
るという点では末だ十分なものではなく、またそ
の細胞毒性も必ずしも十分ではない。 制ガン剤の代わりに、より強力な細胞毒性を有
する蛋白毒素の１つであるジフテリア毒素を利用
する研究も行なわれてきた。 例えば、エフ エル ムールテン（F.L.
Moolten）らは、ウサギ抗SV40抗体とジフテリア
毒素をグルタルアルデヒドで架橋して複合体を調
製し、これをハムスターに投与することによつ
て、SV40でトランスフオームした3T3細胞の腫
瘍形成を抑えることができたことを報告している
（ジヤーナル オブ ザ ナシヨナル キヤンサ
ー インステイチユート（J.Natl.Cancer Inst.
），第55巻，第473〜477頁，1975年）。 ピー イー ソープ（P.E.Thorpe）らは、抗
リンパ球抗体とジフテリア毒素をクロラムブシル
を介して結合し、その複合体がヒトリンパ芽球様
細胞CLA4のタンパク生合成を強く阻害したこと
を報告している（ネイチヤー（Nature）第271
巻，第752〜754頁，1978年）。これらの研究は、
ジフテリア毒素と抗体との複合体が、ガン細胞に
選択的に毒性を発揮しうることを示している。し
かしながら、抗腫瘍剤として用いる場合には、以
下のごとき欠点を有することが予想される。第１
の欠点は、ジフテリア毒素の非特異的な毒性がな
くなつていない点にある。つまり、これらの方法
はジフテリア毒素を抗腫瘍抗体によつてガン細胞
の表面に集めようとするものであるが、複合体は
またジフテリア毒素を構成成分として含むが故
に、正常細胞のジフテリア毒素のリセプターとも
反応し正常細胞表面にも吸引され、正常細胞にも
細胞毒性を発揮する傾向にある。第２には抗体と
ジフテリア毒素との架橋方法に欠点がある。グル
タルアルデヒド，トルエンジイソシアナート，ク
ロラムブシル等の多くの架橋試薬は抗体と毒素の
架橋だけでなく、抗体分子内，毒素分子内，抗体
―抗体間あるいは毒素―毒素間の架橋も起す。そ
の結果、望ましくない生成物が生じたり、抗腫瘍
活性が低下するという欠点がある。 本発明者らは、先行技術の有する欠点を解消
し、ガン細胞にのみ選択的に強力な毒性を発揮す
る抗腫瘍性物質を開発すべく鋭意研究の結果本発
明に到達した。 即ち、本発明は抗腫瘍免疫グロブリンからなる
構成部分とジフテリア毒素の実質的にフラグメン
トＡからなる構成部分を有する、下記式（）で
表わされる抗腫瘍性蛋白複合体である。 Ab−（NHCO−Ｘ−S1−S2−FA）o ……（） 〔Abは抗腫瘍免疫グロブリンからなる構成部
分を、FAはジフテリア毒素の実質的にフラグメ
ントＡからなる構成部分を表わす。Ｘは炭素数が
１〜５個の分枝を有するかあるいは有しないアル
キレン基又はフエニレン基である。アミド結合中
のＮは抗腫瘍免疫グロブリン中のアミノ基に由来
する窒素原子である。S1とS2は共に硫黄原子であ
り、S2はジフテリア毒素中のジスルフイド結合に
由来する硫黄原子を表わす。ｎは１〜５の整数を
表わす。〕 本発明において抗腫瘍免疫グロブリンとは、例
えば癌患者の血清から、または腫瘍細胞又は腫瘍
特異抗原或いは腫瘍関連抗原であるα―フエトプ
ロテイン（AFP）やカルシノエンブリオニツク
アンテイジエン（CEA）をサル，ウマ，ウシ，
ヤギ，ヒツジ，ウサギ等の動物に過免疫した血清
から、コーンのエタノール分画法，硫安分画法，
イオン交換クロマトグラフイー法等の公知の手段
によつて調製されるところの抗腫瘍活性を有する
蛋白質（免疫グロブリン）あるいは、癌細胞や癌
抗原を動物に免疫して得た抗体産生性リンパ球
を、例えば骨髄腫瘍細胞と融合させて、培養可能
で抗体を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）を
得、これをin vitro（生体外）で培養するか、或
いは動物に移植してin vivo（生体内）で増殖せ
しめて、培養液または血清や腹腔液から調整され
る極めて特異性の高い抗腫瘍活性を有する蛋白質
をいう。また、腫瘍組織から界面活性剤等の変性
剤で腫瘍抗体を遊離させ、これから前述と同様な
手段で調製される抗腫瘍活性を有する蛋白質も本
発明の抗腫瘍免疫グロブに含まれる。本発明の抗
腫瘍性蛋白複合体の構成部分の１つである抗腫瘍
免疫グロブリンからなる構成部分とは、前述のご
とき免疫グロブリンからなる構成部分を意味す
る。かかる免疫グロブリンは、分子中に末端アミ
ノ基や構成アミノ酸のリジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミノ基を利用
して本発明の抗腫瘍性蛋白複合体が製造される。
利用されるアミノ基の個数は１〜５個（式(1)にお
いてｎ＝１〜５に相当する）の範囲にあるのが好
ましい。 本発明においてジフテリア毒素とは、ジフテリ
ア菌又はその変異株が産生する蛋白毒素をいう。
例えば、ジフテリア菌が産生するジフテリア毒素
は、分子量約62000〜63000の単一のポリペプチド
鎖からなり、これはインタクトトキシンと呼ばれ
ている。インタクトトキシンは第１図のイに模式
的に示した如く、その分子内にジスルフイド結合
（−Ｓ−Ｓ−結合）を２個有している。このイン
タクトトキシンを、例えば、トリプシンのような
蛋白分解酵素で温和な条件で処理すると、アミノ
基末端に近い側のジフルフイド結合の間の特定の
部位に分割がおこり、第２図のロに示すごときニ
ツクドトキシンとなる。このニツクドトキシンを
直接還元剤で処理するか、一旦Ｓ−スルホ化分解
した後還元剤で処理すると、第１図のハに示した
如く分子量約24000のフラグメントＡと約38000〜
39000のフラグメントＢに分離する。インタクト
トキシンとニツクドトキシンは動物に対する非常
な毒性を有しているが、フラグメントＡとフラグ
メントＢはそのままでは共に非毒性である。一
方、インタクトトキシンとニツクドトキシンは、
以下に定義されるエロンゲーシヨンフアクター２
（EF―２）のアデノシン二燐酸（ADP）リボシ
ル化酵素活性を有しないのに対し、フラグメント
Ａは酵素活性を有している。そして、フラグメン
トＢは酵素活性は有しないが、フラグメントＡに
は見られない細胞のリセプターとの結合能を有し
ている。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体の構成部分の１つ
であるジフテリア毒素の実質的にフラグメントＡ
からなる構成部分とは、前述したフラグメントＡ
の特徴、即ち (1) EF―２のADPリボシル化酵素活性を有する
こと、 (2) 細胞のリセプターとの結合能を有さず、その
ままでは細胞毒性がないこと、 という２つの特徴を満足するジフテリア毒素のフ
ラグメントからなる構成部分を意味する。前記２
つの条件を満足する限り、ジフテリア変異株、例
えばC7（β30）やC7（β45）が産生する、例え
ばCRM30やCRM45のごとき無毒変異蛋白（分子
中にジスルフイド結合を１個有している）や、こ
れらを例えばチオール試薬等の環元剤の存在下で
トリプシンで温和に処理して得られるフラグメン
トも、本発明におけるフラグメントＡに含まれ
る。 かくして得られたフラグメントＡは、フラグメ
ント中に少なくとも１個のチオール基を有してい
る場合にはそのまま、フラグメント中に１個のジ
スルフイド結合を有している場合には、ジスルフ
イド結合を公知の方法で切断し、少なくとも１個
のチオール基を有するフラグメントとした後、本
発明の抗腫瘍性蛋白複合体を製造するために使用
される。本発明におけるフラグメントＡとして
は、分子中に１個のチオール基を有するフラグメ
ントが特に好ましい。 なお、EF―２のADPリボシル化酵素活性とは
次の様に定義される。 細胞の蛋白合成に関係する蛋白伸長因子として
EF―２が知られているが、ジフテリア毒素のフ
ラグメントＡは、EF―２とニコチンアミドーア
デニンジヌクレオチド（NAD）との以下のごと
き反応を触媒的に促進させることによりEF―２
を失活させ、細胞の蛋白合成作用を阻害する。 EF―２＋NAD+→（ADPリボース） −（EF―２）＋ニコチンアミド＋H+ この反応を促進させる作用が、EF―２のADP
リボシル化酵素活性と定義される。 EF―２のADPリボシル化酵素活性は、蛋白合
成阻害作用従つて動物の致死作用の本態である
が、このEF―２のADPリボシル化酵素活性を有
するシフテリア毒素のフラグメントＡが、細胞内
へ到達しその作用を発現するためには、細胞のリ
セプターとの結合能を有するフラグメントＢが必
要であり、フラグメントＡのみでは動物を致死さ
せえないのである。 前記式（）で表わされる本発明の抗腫瘍性蛋
白複合体は、前述の抗腫瘍免疫グロブリンとフラ
グメントＡを加橋剤で結合させることによつて得
られる。本発明において用いられる架橋剤は、基
本骨格（前記式（）におけるＸ）が炭素数１〜
５個の分枝を有するかあるいは有しないアルキレ
ン基又はフエニレン基であり、これに１個の活性
エステル基と１個の活性ジスルフイド基を有する
ものである。基本骨格として特に好ましいのはエ
チレン基である。架橋剤中の活性エステル基は免
疫グロブリン中のアミノ基と反応してアミド結合
を形成し、活性ジスルフイド基はフラグメントＡ
のチオール基と反応して新たなジスルフイド結合
を形成し、前記式（）で表わされる抗腫瘍性蛋
白複合体が得られる。本発明において好ましい架
橋剤は下記式（）で表わされる化合物である。 〔Ｘは炭素数が１〜５個の分枝を有するかある
いは有しないアルキレン基又はフエニレン基であ
る。Ｙは
【式】又は
【式】を表わ
す。S1とS0は共に硫黄原子を表わす。〕
上記式（）に含まれる化合物名を具体的に例
示すれば、 Ｎ―サクシンイミジル―２―（２―ピリジルジ
チオ）アセテート（Ｘ＝―CH2―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（Ｘ＝―（CH2）2―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（４―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（Ｘ＝―（CH2）2―）， Ｎ―サクシンイミジル―４―（２―ピリジルジ
チオ）ブチレート（Ｘ＝―（CH2）3―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジ
チオ）バレレート
示すれば、 Ｎ―サクシンイミジル―２―（２―ピリジルジ
チオ）アセテート（Ｘ＝―CH2―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（Ｘ＝―（CH2）2―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（４―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（Ｘ＝―（CH2）2―）， Ｎ―サクシンイミジル―４―（２―ピリジルジ
チオ）ブチレート（Ｘ＝―（CH2）3―）， Ｎ―サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジ
チオ）バレレート
【式】
Ｎ―サクシンイミジル―４―（２―ピリジルジ
チオ）バレレート
チオ）バレレート
【式】
Ｎ―サクシンイミジル−５―（２―ピリジルジ
チオ）バレレート（Ｘ＝―（CH2）4―）， Ｎ―サクシンイミジル―５―（４―ピリジルジ
チオ）バレレート（Ｘ＝―（CH2）4―）， Ｎ―サクシンイミジル―ｍ―（２―ピリジルジ
チオ）ベンゾエート
チオ）バレレート（Ｘ＝―（CH2）4―）， Ｎ―サクシンイミジル―５―（４―ピリジルジ
チオ）バレレート（Ｘ＝―（CH2）4―）， Ｎ―サクシンイミジル―ｍ―（２―ピリジルジ
チオ）ベンゾエート
【式】
等がある。かかる化合物，例えばＮ―サクシンイ
ミジル―３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ートは、３―メルカプトプロピオン酸を適当な溶
剤中で２，2′―ジピリジルジスルフイドと反応さ
せ、次いで生成物を縮合剤の存在下にＮ―ヒドロ
キシサクシンイミドと反応させることによつて得
られる（例えば、Biochem.J.173（1978）723〜
737頁参照）。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体は、前述した如
く、抗腫瘍免疫グロブリンと、ジフテリア毒素の
実質的なフラグメントＡと、分子中に１個の活性
エステル基と１個の活性ジスルフイド基を有する
架橋剤を反応させることによつて得られる。かか
る反応の順序，方法等は特に限定されるものでは
ないが、好ましいのは、まず抗腫瘍免疫グロブリ
ン中の１〜５個のアミノ基と架橋剤を反応させ、
次いで得られた生成物とフラグメント中に少なく
とも１個のチオール基を有するジフテリア毒素の
実質的なフラグメントＡを反応させる方法であ
る。 抗腫瘍免疫グロブリンと架橋剤との反応は、例
えば抗腫瘍免疫グロブリンのPH５〜９の緩衝液の
溶液（蛋白濃度は好ましくは0.5〜100mg/ml，よ
り好ましくは１〜20mg/mlに調製する）に，０〜
40℃で撹拌しながら、少量の溶媒，例えばメタノ
ール，エタノール，アセトン等に溶かした架橋剤
（好ましくは５〜40mM濃度，前者１モルに対し
後者が１〜40モル）を添加し、15分〜12時間行わ
れる。その後反応混合物をゲル過あるいは透析
することによつて未反応の架橋剤と低分子量反応
生成物が除かれる。ついでかくして得られる生成
物，即ち抗腫瘍免疫グロブリンに１〜５個の架橋
剤がアミド結合で結合している蛋白質の溶液にジ
フテリア毒素のフラグメントＡ（少なくとも１個
のチオール基を有する）のPH５〜９の緩衝液の溶
液（好ましい蛋白濃度の範囲は上に記載したのと
同じである）を添加して、０〜40℃で15分〜12時
間反応せしめる。上記方法によつて得られる抗腫
瘍免疫グロブリンとフラグメントＡの複合体の、
反応混合物からの分離，精製は通常用いられる操
作、例えば分子ふるいのカラムクロマトグラフイ
ーによつて行なうことができる。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体は、腫瘍細胞に対
し毒性を発揮するジフテリア毒素の実質的にフラ
グメントＡからなる構成部分と、腫瘍細胞を特異
的に認識しフラグメントＡを腫瘍細胞まで誘導す
るためのキヤリヤーであると共、フラグメントＡ
を細胞内部にとり込ませる働きをする抗腫瘍免疫
グロブリンとからなるものであるが、この複合体
は以下のごとき優れた特徴を有する。 (1) 本発明の複合体においては、免疫グロブリン
が実質的に原形を保持した状態で存在している
ので、抗腫瘍免疫グロブリンの有する腫瘍細胞
認識能や補体活性能がそのまゝ保持されてい
る。 (2) ジフテリア毒素分子において、細胞（正常細
胞および腫瘍細胞）のリセプターと結合する性
質を有するのはフラグメントＢ部分であり、フ
ラグメントＢ部分の細胞表面への結合を介して
フラグメントＡ部分が細胞内部にとり込まれ、
それによつてはじめて細胞毒性が発揮されるこ
とが知られているが、本発明の複合体において
は、フラグメントＢは含まれていないので、本
発明の複合体は正常細胞に対しては細胞毒性を
発揮しない。またフラグメントＢが含まれてい
ないのでジフテリア毒素の抗原性も軽減されて
いる。 (3) 本発明の複合体は、抗腫瘍免疫グロブリンか
らなる構成部分を有しているので、この構成部
分が腫瘍細胞を特異的に認識し、ジフテリア毒
素の実質的にフラグメントＡからなる構成部分
を腫瘍細胞に特異的にとり込ませ、とり込まれ
たフラグメントＡは腫瘍細胞に対し著しい細胞
毒性を発揮する。 以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ (イ) ウサギ抗AH66抗体の調製 ラツト肝腫瘍細胞AH66で過免疫したウサギ
３匹より抗血清70mlを得た。抗血清は非働化
（56℃で30分処理）の後，硫安を加えて（40％
飽和）免疫グロブリン（1gG）を沈澱させ、生
じた沈澱は遠心分離によつて分取した。得られ
た沈澱を10mMリン酸塩緩衝液（PH7.8）に溶
解し、同じ緩衝液を用いて透析した。次いで得
られた免疫グロブリンの溶液をDEAEセルロー
スクロマトグラフイー（カラム容積130ml）に
かけ、未吸着画分としてIgG約100mgを含むリ
ン酸塩緩衝液溶液を得た。得られたIgGは、抗
AH66抗体を含むものであり、SDS―ポリアク
リルアミドゲル電気泳動的にほぼ均一であつ
た。 (ロ) ジフテリア毒素のフラグメントＡの調製 ジフテリア毒素210mgを含む0.05Mトリス・
塩酸―2mMエチレンジアミン四酢酸水溶液
（PH8.3）18.5mlに、0.1mg/ml濃度のトリプシン
溶液を0.15ml加えて、25℃で50分間分解し、そ
の後0.5mg/ml濃度の大豆トリプシン阻害物質溶
液0.3mlを加えて反応を停止した。この分解生
成物に尿素（最終濃度6M），亜硫酸ナトリウム
（最終濃度0.168M）およびテトラチオン酸ナト
リウム（最終濃度0.042M）を加えて、37℃で
２時間Ｓ―スルホ化分解を行なつた。得られた
反応後を、6M尿素―0.03M酢酸緩衝液（PH
5.3）中でセフアデツクスG150カラムクロマト
グラフイー（カラムサイズ，3.5cm×112cm）に
かけて、遅れて流出するフラグメントＡ画分の
みを取り出し更に水で透析することによつて
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動的に純粋
なフラグメントＡ溶液を得た（Ｓ―スルホ基を
１個有する）。 かくして得たＳスルホ化フラグメントＡ（約
６mg）は、2mM―２―メルカプトエタノール
及び0.5mMエチレンジアミン四酢酸を含む
20mMトリス・塩酸緩衝液（PH8.3）中で、37
℃で１時間処理した後0.1M塩化ナトリウム及
び1mMエチレンジアミン四酢酸を含む5mM酢
酸塩緩衝液（PH5.5）中で、セフアデツクス
G25（カラムサイズ１cm×44cm）のゲル過に
かけ、チオール基を１個有するフラグメントＡ
を得た。 (ハ) 抗腫瘍性蛋白複合体の製造 前記(イ)で得られた抗AH66免疫グロブリンの
溶液（5.94mg/ml）1.2mlに0.3M―塩化ナトリウ
ム0.3Mリン酸塩緩衝液（PH7.5）0.6ml及びＮ―
サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートの10mMエタノール溶液
0.05mlを加え、時々振とうしながら、23℃で45
分反応させた。反応物は、0.1M塩化ナトリウ
ム0.1Mリン酸塩緩衝液（PH7.5）中でセフアデ
ツクスG25（カラムサイズ：0.8cm×3.9cm）の
ゲル過にかけ、過剰の試薬と低分子量反応生
成物を除いた。 免疫グロブリン１分子当りに導入された架橋
剤の個数は、試料の一部に10mMのエチレンジ
アミン四酢酸を含む0.4Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.3）20分の１容積及び0.5M―２メルカプ
トエタノール20分の１容積を加えて還元し、放
出されたピリジン―２―チオンの濃度を343nm
の吸光度を測定することにより求めた。その結
果、免疫グロブリン１分子当り、平均５個の架
橋剤が導入されていることが判明した。 こうして得られた活性ジスルフイド基を含む
架橋剤をアミド結合導入した抗AH66免疫グロ
ブリンの溶液（2.82mg/ml）1.7mlに，前記(ロ)で
調製したジフテリア毒素のフラグメントＡの溶
液（1.07mg/ml）1.5mlを加え，０℃で１時間放
置の後，0.1M塩化ナトリウム0.1Mリン酸塩緩
衝液（PH7.5）１に室温（18〜23℃）で一晩
透析した。次いで反応物は、0.9％塩化ナトリ
ウム中でセフアデツクスG150スーパーフアイ
ン（カラムサイズ：1.6cm×93cm）のゲル過
にかけて未反応のジフテリア毒素のフラグメン
トＡと低分子量反応生成物及び同時に少量生ず
るフラグメントＡの２量体を除き、抗腫瘍性蛋
白複合体約６mgを得た。（第２図参照）この複
合体は、ウマ抗ジフテリア毒素抗血清及びヒツ
ジ抗ウサギIgG抗血清に対してケル内沈降反応
を行うと、両者に対し沈降線を生じ、しかも両
沈降線が融合することから、これが抗体毒素複
合体であることが確認された。 (ニ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（５×104個）に、前
記(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃度
5.2μg/ml、または52μｇ／ml）を加え，10％
仔牛血清を含むイーグル・MEM培地１ml中
で、５％二酸化炭素雰囲気下、37℃で42時間培
養した。対象群には0.9％塩化ナトリウム溶液
を加え、各群共例数３で行つた。 培養後、0.02％エチレンジアミン四酢酸を含
むリン酸塩緩衝化食塩水で処理して均一な細胞
浮遊液とし、0.3％トリパンブルーで染色して
顕微鏡下生細胞を計数した。その結果、第６図
に示したように、対象群では、10.1×104個に
細胞が増殖したのに対し、5.2μg/mlの複合体
を加えた群では、約60％の成長抑制が見られ、
更に52μg/mlの複合体を加えた群では、完全
に成長が抑えられ、製造した複合体に抗腫瘍性
があることが判つた。 (ホ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（4.5×104個）に，
前記(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃
度0.1，１，10または100μg/ml）または抗
AH66免疫グロブリンIgG（最終濃度１，10ま
たは100μg/ml）を加え，10％仔牛血清を含む
イーグルMEM培地１ml中で、５％二酸化炭素
雰囲気下，37℃で48時間培養した。対象群に
は、0.9％塩化ナトリウムを加え，また各群共
例数３で行つた。培養後の操作は、前記(ニ)の方
法に従つた。 結果を第４図に示した。IgG，複合体共濃度
の増加に伴いAH66細胞の増殖は抑制された
が、その効果は複合体の方が一桁以上大きいこ
とが明らかになつた。従つて、このことは複合
体の細胞増殖抑制効果が、抗体の機能によるの
ではなく、ジフテリア毒素のフラグメントＡの
タンパク合成阻害活性に基くものであることを
示している。 (ヘ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（4.3×104）に，前記
(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃度10
または100μg/ml）を加え，10％仔牛血清を含
むイーグルMEM培地１ml中で，５％二酸化炭
素雰囲気下，37℃で１，２，３または４日間培
養した。対象群には0.9％塩化ナトリウムを加
え、また各群共例数３で行つた。培養後の操作
は、前記(ニ)の方法に従つた。 結果は第５図に示した。各濃度共、著しい増
殖抑制効果が見られ、その効果は特に３日目，
４日目で顕著であつた。更に増殖抑制効果だけ
でなく、細胞死を引越こすところの細胞障害性
をも認められた。尚、トリパンブルーで染色さ
れない生細胞についても、対象群に比べ処理群
のものの方が形態的に変化していることが顕微
鏡下で観察された。 (ト) ウサギ抗AH66抗体がAH66細胞に結合して
いることの証明 AH66の細胞けん濁液（３×106細胞／ml）
100μに得られたウサギ抗AH66抗体（100μ
ｇ／ml）50μを添加して37℃、30分反応さ
せ、リン酸塩緩衝化生理食塩水１mlで３回洗浄
した。更に蛍光（FITC）標識したヤギ抗ウサ
ギIgG抗体（100μｇ/ml）50μを添加して37
℃30分させた。AH66細胞をリン酸塩緩衝化生
理食塩水１mlで３回洗浄して過剰試薬を除いた
後、蛍光顕微鏡により調べたところ、AH66細
胞の膜表面に蛍光の分布していることが観察さ
れた。一方、ウサギ抗AH66抗体の代わりに、
正常ウサギIgGを用いた場合は蛍光が観察され
なかつた。 即ち、得られたウサギ抗AH66抗体が、
AH66細胞に特異的に結合することが証明され
た。 (チ) ジフテリア毒素のフラグメントＡが細胞毒性
を示さないことの証明 ジフテリア毒素フラグメントＡの培養AH66
細胞に対する抗腫瘍活性を実施例１の(ニ)に記載
した方法に従つて調べた。その結果、実施例１
の(ニ)の抗腫瘍性蛋白複合体に含まれているジフ
テリア毒素フラグメントＡ量では、培養AH66
細胞に細胞毒性を示さなかつた。 上記１，２より実施例１の(ニ)，(ホ)，(ヘ)で示され
た複合体の効果は、フリーのジフテリア毒素フラ
グメントＡの効果によるものではなく、複合体に
おける抗AH66抗体の細胞への特異的結合に基く
誘導効果によるものであることが証明された。 実施例 ２ (イ) ウサギ抗ラツトα―フエトプロテイン抗体の
調製 ラツトα―フエトプロテン（以下AFPと省
略する）で過免疫したウサギ２匹より、抗血清
45mlを得た。抗血清は非働化の後、10mMリン
酸塩緩衝化食塩水45mlで希釈し、次いでAFP
セフアロース（ブロムシアン法でAFPを結合
させたセフアロース4B，ゲル１ml当り2.3mg結
合したものを約14ml用いた。）に通した。ゲル
は10mMリン酸塩緩衝化食塩水30ml，0.5M塩化
ナトリウム50ml更に水100mlで充分洗浄した
後，PH2.8の塩酸で抗AFP抗体を溶出した。溶
出後直ちに、0.5Mトリス塩酸緩衝液（PH8.3）
10分１溶積を加えてPHを上げ，次に限外過法
により濃縮し、0.9％塩化ナトリウム水溶液に
充分透析した。こうして得られた抗AFP抗体
は、SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動的
に均一であつた。 (ロ) 抗腫瘍性蛋白複合体の製造 前記(イ)で得られた抗AFP免疫グロブリンを
実施例１の(ハ)の抗AH66免疫グロブリンの代り
に用いる他は、実施例１の(ハ)と同様にして、抗
腫瘍性蛋白複合体（免疫グロブリン１分子当り
に平均１個のジフテリア毒素のフラグメントＡ
が結合している）を得た。この複合体は、ウマ
抗ジフテリア毒素抗血清及びヒツジ抗ウサギ
IgG抗血清に対してゲル内沈降反応を行なう
と、両者に対し沈降線を生じ、しかも両沈降線
が融合することから、これが抗体毒素複合体で
あることが確認された。 (ハ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性 前記(ロ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終
濃度11または110μｇ/ml）をラツト肝腫瘍細胞
AH66（５×104個）に加え、前記実施例１の(ニ)
に従つて、同様に活性を調べた。 第６図に結果を示した。複合体1.1μｇ/mlの
濃度では対象群と全く同様に細胞増殖がおこつ
たのに対し、複合体110μｇ/mlを加えた系では
約40％の増殖抑制効果が認められた。従つて、
抗AH66抗体を用いて作つた複合体よりは、活
性が弱いが、ガン胎児性抗原であるAFPに対
する抗体を用いて作つた複合体においても、同
様に抗腫瘍性のあることが判つた。
ミジル―３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ートは、３―メルカプトプロピオン酸を適当な溶
剤中で２，2′―ジピリジルジスルフイドと反応さ
せ、次いで生成物を縮合剤の存在下にＮ―ヒドロ
キシサクシンイミドと反応させることによつて得
られる（例えば、Biochem.J.173（1978）723〜
737頁参照）。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体は、前述した如
く、抗腫瘍免疫グロブリンと、ジフテリア毒素の
実質的なフラグメントＡと、分子中に１個の活性
エステル基と１個の活性ジスルフイド基を有する
架橋剤を反応させることによつて得られる。かか
る反応の順序，方法等は特に限定されるものでは
ないが、好ましいのは、まず抗腫瘍免疫グロブリ
ン中の１〜５個のアミノ基と架橋剤を反応させ、
次いで得られた生成物とフラグメント中に少なく
とも１個のチオール基を有するジフテリア毒素の
実質的なフラグメントＡを反応させる方法であ
る。 抗腫瘍免疫グロブリンと架橋剤との反応は、例
えば抗腫瘍免疫グロブリンのPH５〜９の緩衝液の
溶液（蛋白濃度は好ましくは0.5〜100mg/ml，よ
り好ましくは１〜20mg/mlに調製する）に，０〜
40℃で撹拌しながら、少量の溶媒，例えばメタノ
ール，エタノール，アセトン等に溶かした架橋剤
（好ましくは５〜40mM濃度，前者１モルに対し
後者が１〜40モル）を添加し、15分〜12時間行わ
れる。その後反応混合物をゲル過あるいは透析
することによつて未反応の架橋剤と低分子量反応
生成物が除かれる。ついでかくして得られる生成
物，即ち抗腫瘍免疫グロブリンに１〜５個の架橋
剤がアミド結合で結合している蛋白質の溶液にジ
フテリア毒素のフラグメントＡ（少なくとも１個
のチオール基を有する）のPH５〜９の緩衝液の溶
液（好ましい蛋白濃度の範囲は上に記載したのと
同じである）を添加して、０〜40℃で15分〜12時
間反応せしめる。上記方法によつて得られる抗腫
瘍免疫グロブリンとフラグメントＡの複合体の、
反応混合物からの分離，精製は通常用いられる操
作、例えば分子ふるいのカラムクロマトグラフイ
ーによつて行なうことができる。 本発明の抗腫瘍性蛋白複合体は、腫瘍細胞に対
し毒性を発揮するジフテリア毒素の実質的にフラ
グメントＡからなる構成部分と、腫瘍細胞を特異
的に認識しフラグメントＡを腫瘍細胞まで誘導す
るためのキヤリヤーであると共、フラグメントＡ
を細胞内部にとり込ませる働きをする抗腫瘍免疫
グロブリンとからなるものであるが、この複合体
は以下のごとき優れた特徴を有する。 (1) 本発明の複合体においては、免疫グロブリン
が実質的に原形を保持した状態で存在している
ので、抗腫瘍免疫グロブリンの有する腫瘍細胞
認識能や補体活性能がそのまゝ保持されてい
る。 (2) ジフテリア毒素分子において、細胞（正常細
胞および腫瘍細胞）のリセプターと結合する性
質を有するのはフラグメントＢ部分であり、フ
ラグメントＢ部分の細胞表面への結合を介して
フラグメントＡ部分が細胞内部にとり込まれ、
それによつてはじめて細胞毒性が発揮されるこ
とが知られているが、本発明の複合体において
は、フラグメントＢは含まれていないので、本
発明の複合体は正常細胞に対しては細胞毒性を
発揮しない。またフラグメントＢが含まれてい
ないのでジフテリア毒素の抗原性も軽減されて
いる。 (3) 本発明の複合体は、抗腫瘍免疫グロブリンか
らなる構成部分を有しているので、この構成部
分が腫瘍細胞を特異的に認識し、ジフテリア毒
素の実質的にフラグメントＡからなる構成部分
を腫瘍細胞に特異的にとり込ませ、とり込まれ
たフラグメントＡは腫瘍細胞に対し著しい細胞
毒性を発揮する。 以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ (イ) ウサギ抗AH66抗体の調製 ラツト肝腫瘍細胞AH66で過免疫したウサギ
３匹より抗血清70mlを得た。抗血清は非働化
（56℃で30分処理）の後，硫安を加えて（40％
飽和）免疫グロブリン（1gG）を沈澱させ、生
じた沈澱は遠心分離によつて分取した。得られ
た沈澱を10mMリン酸塩緩衝液（PH7.8）に溶
解し、同じ緩衝液を用いて透析した。次いで得
られた免疫グロブリンの溶液をDEAEセルロー
スクロマトグラフイー（カラム容積130ml）に
かけ、未吸着画分としてIgG約100mgを含むリ
ン酸塩緩衝液溶液を得た。得られたIgGは、抗
AH66抗体を含むものであり、SDS―ポリアク
リルアミドゲル電気泳動的にほぼ均一であつ
た。 (ロ) ジフテリア毒素のフラグメントＡの調製 ジフテリア毒素210mgを含む0.05Mトリス・
塩酸―2mMエチレンジアミン四酢酸水溶液
（PH8.3）18.5mlに、0.1mg/ml濃度のトリプシン
溶液を0.15ml加えて、25℃で50分間分解し、そ
の後0.5mg/ml濃度の大豆トリプシン阻害物質溶
液0.3mlを加えて反応を停止した。この分解生
成物に尿素（最終濃度6M），亜硫酸ナトリウム
（最終濃度0.168M）およびテトラチオン酸ナト
リウム（最終濃度0.042M）を加えて、37℃で
２時間Ｓ―スルホ化分解を行なつた。得られた
反応後を、6M尿素―0.03M酢酸緩衝液（PH
5.3）中でセフアデツクスG150カラムクロマト
グラフイー（カラムサイズ，3.5cm×112cm）に
かけて、遅れて流出するフラグメントＡ画分の
みを取り出し更に水で透析することによつて
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動的に純粋
なフラグメントＡ溶液を得た（Ｓ―スルホ基を
１個有する）。 かくして得たＳスルホ化フラグメントＡ（約
６mg）は、2mM―２―メルカプトエタノール
及び0.5mMエチレンジアミン四酢酸を含む
20mMトリス・塩酸緩衝液（PH8.3）中で、37
℃で１時間処理した後0.1M塩化ナトリウム及
び1mMエチレンジアミン四酢酸を含む5mM酢
酸塩緩衝液（PH5.5）中で、セフアデツクス
G25（カラムサイズ１cm×44cm）のゲル過に
かけ、チオール基を１個有するフラグメントＡ
を得た。 (ハ) 抗腫瘍性蛋白複合体の製造 前記(イ)で得られた抗AH66免疫グロブリンの
溶液（5.94mg/ml）1.2mlに0.3M―塩化ナトリウ
ム0.3Mリン酸塩緩衝液（PH7.5）0.6ml及びＮ―
サクシンイミジル―３―（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートの10mMエタノール溶液
0.05mlを加え、時々振とうしながら、23℃で45
分反応させた。反応物は、0.1M塩化ナトリウ
ム0.1Mリン酸塩緩衝液（PH7.5）中でセフアデ
ツクスG25（カラムサイズ：0.8cm×3.9cm）の
ゲル過にかけ、過剰の試薬と低分子量反応生
成物を除いた。 免疫グロブリン１分子当りに導入された架橋
剤の個数は、試料の一部に10mMのエチレンジ
アミン四酢酸を含む0.4Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.3）20分の１容積及び0.5M―２メルカプ
トエタノール20分の１容積を加えて還元し、放
出されたピリジン―２―チオンの濃度を343nm
の吸光度を測定することにより求めた。その結
果、免疫グロブリン１分子当り、平均５個の架
橋剤が導入されていることが判明した。 こうして得られた活性ジスルフイド基を含む
架橋剤をアミド結合導入した抗AH66免疫グロ
ブリンの溶液（2.82mg/ml）1.7mlに，前記(ロ)で
調製したジフテリア毒素のフラグメントＡの溶
液（1.07mg/ml）1.5mlを加え，０℃で１時間放
置の後，0.1M塩化ナトリウム0.1Mリン酸塩緩
衝液（PH7.5）１に室温（18〜23℃）で一晩
透析した。次いで反応物は、0.9％塩化ナトリ
ウム中でセフアデツクスG150スーパーフアイ
ン（カラムサイズ：1.6cm×93cm）のゲル過
にかけて未反応のジフテリア毒素のフラグメン
トＡと低分子量反応生成物及び同時に少量生ず
るフラグメントＡの２量体を除き、抗腫瘍性蛋
白複合体約６mgを得た。（第２図参照）この複
合体は、ウマ抗ジフテリア毒素抗血清及びヒツ
ジ抗ウサギIgG抗血清に対してケル内沈降反応
を行うと、両者に対し沈降線を生じ、しかも両
沈降線が融合することから、これが抗体毒素複
合体であることが確認された。 (ニ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（５×104個）に、前
記(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃度
5.2μg/ml、または52μｇ／ml）を加え，10％
仔牛血清を含むイーグル・MEM培地１ml中
で、５％二酸化炭素雰囲気下、37℃で42時間培
養した。対象群には0.9％塩化ナトリウム溶液
を加え、各群共例数３で行つた。 培養後、0.02％エチレンジアミン四酢酸を含
むリン酸塩緩衝化食塩水で処理して均一な細胞
浮遊液とし、0.3％トリパンブルーで染色して
顕微鏡下生細胞を計数した。その結果、第６図
に示したように、対象群では、10.1×104個に
細胞が増殖したのに対し、5.2μg/mlの複合体
を加えた群では、約60％の成長抑制が見られ、
更に52μg/mlの複合体を加えた群では、完全
に成長が抑えられ、製造した複合体に抗腫瘍性
があることが判つた。 (ホ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（4.5×104個）に，
前記(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃
度0.1，１，10または100μg/ml）または抗
AH66免疫グロブリンIgG（最終濃度１，10ま
たは100μg/ml）を加え，10％仔牛血清を含む
イーグルMEM培地１ml中で、５％二酸化炭素
雰囲気下，37℃で48時間培養した。対象群に
は、0.9％塩化ナトリウムを加え，また各群共
例数３で行つた。培養後の操作は、前記(ニ)の方
法に従つた。 結果を第４図に示した。IgG，複合体共濃度
の増加に伴いAH66細胞の増殖は抑制された
が、その効果は複合体の方が一桁以上大きいこ
とが明らかになつた。従つて、このことは複合
体の細胞増殖抑制効果が、抗体の機能によるの
ではなく、ジフテリア毒素のフラグメントＡの
タンパク合成阻害活性に基くものであることを
示している。 (ヘ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性（） ラツト肝腫瘍細胞AH66（4.3×104）に，前記
(ハ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終濃度10
または100μg/ml）を加え，10％仔牛血清を含
むイーグルMEM培地１ml中で，５％二酸化炭
素雰囲気下，37℃で１，２，３または４日間培
養した。対象群には0.9％塩化ナトリウムを加
え、また各群共例数３で行つた。培養後の操作
は、前記(ニ)の方法に従つた。 結果は第５図に示した。各濃度共、著しい増
殖抑制効果が見られ、その効果は特に３日目，
４日目で顕著であつた。更に増殖抑制効果だけ
でなく、細胞死を引越こすところの細胞障害性
をも認められた。尚、トリパンブルーで染色さ
れない生細胞についても、対象群に比べ処理群
のものの方が形態的に変化していることが顕微
鏡下で観察された。 (ト) ウサギ抗AH66抗体がAH66細胞に結合して
いることの証明 AH66の細胞けん濁液（３×106細胞／ml）
100μに得られたウサギ抗AH66抗体（100μ
ｇ／ml）50μを添加して37℃、30分反応さ
せ、リン酸塩緩衝化生理食塩水１mlで３回洗浄
した。更に蛍光（FITC）標識したヤギ抗ウサ
ギIgG抗体（100μｇ/ml）50μを添加して37
℃30分させた。AH66細胞をリン酸塩緩衝化生
理食塩水１mlで３回洗浄して過剰試薬を除いた
後、蛍光顕微鏡により調べたところ、AH66細
胞の膜表面に蛍光の分布していることが観察さ
れた。一方、ウサギ抗AH66抗体の代わりに、
正常ウサギIgGを用いた場合は蛍光が観察され
なかつた。 即ち、得られたウサギ抗AH66抗体が、
AH66細胞に特異的に結合することが証明され
た。 (チ) ジフテリア毒素のフラグメントＡが細胞毒性
を示さないことの証明 ジフテリア毒素フラグメントＡの培養AH66
細胞に対する抗腫瘍活性を実施例１の(ニ)に記載
した方法に従つて調べた。その結果、実施例１
の(ニ)の抗腫瘍性蛋白複合体に含まれているジフ
テリア毒素フラグメントＡ量では、培養AH66
細胞に細胞毒性を示さなかつた。 上記１，２より実施例１の(ニ)，(ホ)，(ヘ)で示され
た複合体の効果は、フリーのジフテリア毒素フラ
グメントＡの効果によるものではなく、複合体に
おける抗AH66抗体の細胞への特異的結合に基く
誘導効果によるものであることが証明された。 実施例 ２ (イ) ウサギ抗ラツトα―フエトプロテイン抗体の
調製 ラツトα―フエトプロテン（以下AFPと省
略する）で過免疫したウサギ２匹より、抗血清
45mlを得た。抗血清は非働化の後、10mMリン
酸塩緩衝化食塩水45mlで希釈し、次いでAFP
セフアロース（ブロムシアン法でAFPを結合
させたセフアロース4B，ゲル１ml当り2.3mg結
合したものを約14ml用いた。）に通した。ゲル
は10mMリン酸塩緩衝化食塩水30ml，0.5M塩化
ナトリウム50ml更に水100mlで充分洗浄した
後，PH2.8の塩酸で抗AFP抗体を溶出した。溶
出後直ちに、0.5Mトリス塩酸緩衝液（PH8.3）
10分１溶積を加えてPHを上げ，次に限外過法
により濃縮し、0.9％塩化ナトリウム水溶液に
充分透析した。こうして得られた抗AFP抗体
は、SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動的
に均一であつた。 (ロ) 抗腫瘍性蛋白複合体の製造 前記(イ)で得られた抗AFP免疫グロブリンを
実施例１の(ハ)の抗AH66免疫グロブリンの代り
に用いる他は、実施例１の(ハ)と同様にして、抗
腫瘍性蛋白複合体（免疫グロブリン１分子当り
に平均１個のジフテリア毒素のフラグメントＡ
が結合している）を得た。この複合体は、ウマ
抗ジフテリア毒素抗血清及びヒツジ抗ウサギ
IgG抗血清に対してゲル内沈降反応を行なう
と、両者に対し沈降線を生じ、しかも両沈降線
が融合することから、これが抗体毒素複合体で
あることが確認された。 (ハ) 抗腫瘍性蛋白複合体の抗腫瘍活性 前記(ロ)で製造した抗腫瘍性蛋白複合体（最終
濃度11または110μｇ/ml）をラツト肝腫瘍細胞
AH66（５×104個）に加え、前記実施例１の(ニ)
に従つて、同様に活性を調べた。 第６図に結果を示した。複合体1.1μｇ/mlの
濃度では対象群と全く同様に細胞増殖がおこつ
たのに対し、複合体110μｇ/mlを加えた系では
約40％の増殖抑制効果が認められた。従つて、
抗AH66抗体を用いて作つた複合体よりは、活
性が弱いが、ガン胎児性抗原であるAFPに対
する抗体を用いて作つた複合体においても、同
様に抗腫瘍性のあることが判つた。
第１図はジフテリア毒素及びそのフラグメント
の模式図であり、イはインタクトトキシン、ロは
ニツクドトキシン、ハはフラグメントＡとフラグ
メントＢの構造を示す。第２図はＮ―サクシンイ
ミジル―３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ートをアミド結合で導入した抗AH66免疫グロブ
リンとジフテリア毒素のフラグメントＡの反応生
成物のセフアデツクスG150スーパーフアインカ
ラムクロマトグラフイーによる流出パターンであ
り、斜線部に本発明の複合体が流出されることを
示す。第３〜５図は抗AH66免疫グロブリンを用
いて製造した本発明の複合体のAH66に対する抗
腫瘍活性を示す。第６図は抗AFP免疫グロブリ
ンを用いて製造した複合体のAH66に対する抗腫
瘍活性を示す。
の模式図であり、イはインタクトトキシン、ロは
ニツクドトキシン、ハはフラグメントＡとフラグ
メントＢの構造を示す。第２図はＮ―サクシンイ
ミジル―３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ートをアミド結合で導入した抗AH66免疫グロブ
リンとジフテリア毒素のフラグメントＡの反応生
成物のセフアデツクスG150スーパーフアインカ
ラムクロマトグラフイーによる流出パターンであ
り、斜線部に本発明の複合体が流出されることを
示す。第３〜５図は抗AH66免疫グロブリンを用
いて製造した本発明の複合体のAH66に対する抗
腫瘍活性を示す。第６図は抗AFP免疫グロブリ
ンを用いて製造した複合体のAH66に対する抗腫
瘍活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗腫瘍免疫グロブリンからなる構成部分とジ
フテリア毒素の実質的にフラグメントＡからなる
構成部分を有する下記式（）で表わされる抗腫
瘍性蛋白複合体。 Ab−（NHCO−Ｘ−S1−S2−FA）o ……（） 〔Abは抗腫瘍免疫グロブリンからなる構成部
分を、FAはジフテリア毒素の実質的にフラグメ
ントＡからなる構成部分を表わす。Ｘは炭素数が
１〜５個の分枝を有するかあるいは有しないアル
キレン基又はフエニレン基である。アミド結合中
のＮは抗腫瘍免疫グロブリン中のアミノ基に由来
する窒素原子である。S1とS2は共に硫黄原子であ
り、S2はジフテリア毒素中のジスルフイド結合に
由来する硫黄原子を表わす。ｎは１〜５の整数を
表わす。〕 ２ Ｘがエチレン基である特許請求の範囲第１項
記載の抗腫瘍性蛋白複合体。 ３ FAがジフテリア毒素のフラグメントＡから
なる構成部分である特許請求の範囲第１項記載の
抗腫瘍性蛋白複合体。 ４ 抗腫瘍免疫グロブリン中の１〜５個のアミノ
基と下記式（） 〔Ｘは炭素数が１〜５個の分枝を有するかある
いは有しないアルキレン基又はフエニレン基であ
る。Ｙは【式】又は【式】を表わ す。S1とS0は共に硫黄原子を表わす。〕 の化合物を反応させ、次いで得られた生成物とフ
ラグメント中に少なくとも１個のチオール基を有
するジフテリア毒素の実質的なフラグメントＡを
反応させることを特徴とする、次記式（）で表
わされる抗腫瘍性蛋白複合体の製造法。 Ab−（NHCO−Ｘ−S1−S2−FA）o ……（） Abは抗腫瘍免疫グロブリンからなる構成部分
を、FAはジフテリア毒素の実質的にフラグメン
トＡからなる構成部分を表わす。Ｘは炭素数が１
〜５個の分枝を有するかあるいは有しないアルキ
レン基又はフエニレン基である。アミド結合中の
Ｎは抗腫瘍免疫グロブリン中のアミノ基に由来す
る窒素原子である。S1とS2は共に硫黄原子であ
り、S2はジフテリア毒素中のジスルフイド結合に
由来する硫黄原子を表わす。ｎは１〜５の整数を
表わす。〕
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP16160979A JPS5686121A (en) | 1979-12-14 | 1979-12-14 | Antitumor proten complex and its preparation |
| EP80304352A EP0031999B1 (en) | 1979-12-14 | 1980-12-03 | Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof |
| DE8080304352T DE3067584D1 (en) | 1979-12-14 | 1980-12-03 | Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof |
| US06/216,709 US4379145A (en) | 1979-12-14 | 1980-12-15 | Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16160979A JPS5686121A (en) | 1979-12-14 | 1979-12-14 | Antitumor proten complex and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5686121A JPS5686121A (en) | 1981-07-13 |
| JPS6221000B2 true JPS6221000B2 (ja) | 1987-05-11 |
Family
ID=15738406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16160979A Granted JPS5686121A (en) | 1979-12-14 | 1979-12-14 | Antitumor proten complex and its preparation |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4379145A (ja) |
| EP (1) | EP0031999B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5686121A (ja) |
| DE (1) | DE3067584D1 (ja) |
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