JPS6225102A - 多孔性ポリサツカライドの架橋方法 - Google Patents

多孔性ポリサツカライドの架橋方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は多孔性ポリサッカライドの架橋方法に関する
。
〔背景技術〕
架橋されたポリサッカライドは、種々の形態において、
特にバイオ分子、例えば蛋白質、核酸等のクロマトグラ
フ分離のためのゲルマトリクスとして非常に重要になっ
てきている。
クロマトグラフ分離は、その中を液体が流されるマトリ
クスを充填したカラム中で行われる。例えば異る蛋白質
の混合物であるサンプルがカラムの頂部に導入され、次
に前記の′流れと共にカラム中を移動する。これらの蛋
白質は、異る性質、例えば異るサイズを有する該蛋白質
が異る程度に減速されそしてそれ故に分離されるような
態様において、マトリクス上で減速されるであろう。
これらのゲルマトリクスを作るときのポリサッカライド
のン；度を変えることによって、異る細孔サイズを得る
ことができ、濃度が低くなるに従って細孔サイズが大と
なり、すなわち排除限界が大きくなる。分離されるべき
バイオ分子のサイズに対する細孔のサイズは分離にとっ
て決定的である。
バイオ分子を分離するために最も知られている技法は、
これらの細孔への又は細孔からの分子の拡散に基礎を置
いている。固定された細孔サイズにおいては、細孔より
大きな分子は完全に排除され、そしてそれ故にカラムか
ら急速に流出する。
蛋白質混合物がこれらの細孔より小さい場合には細孔へ
の分子の拡散が起こり、これらの分子は減速される。細
孔中に拡散する分子の大きさの差異に基いて一層多きな
、又は一層小さな減速が得られ、この結果、分子の大き
さによる分離が行われる。このタイプの分離は分子篩分
離又はゲル濾過と称される。しかしながら、分子に暴露
されるマトリクス部分は他の相互作用性をなんら有しな
いと仮定される。すなわち、クロマトグラフ分離される
べき分子混合物に対してゲルマトリクスは完全に不活性
であるべきである。
他の分離技法、例えばイオン交°換、疎水性相互作用、
ファイニティー等においては、ゲルマトリクス中に天然
に存在する性質、又はゲルの化学的変化により細孔中に
導入された性質が利用される。
近年、一層短い分離時間及び一層高い分離性能に向けら
れた分離技法が開発され、この結果、硬質で小さい（５
〜１０マイクロメータ）の粒子をマトリクスとして使用
することとなった。従来のポリサッカライドはその軟い
性質のため４０ミクロン以上の粒子サイズで製造されて
おり、そしてそれにもかかわらず、分離を行うのに１０
〜２０時間を要していた。このことは特にゲル濾過につ
いて妥当し、そして特に排除限界が高い場合にそうであ
った。この限界は、前記のように、ポリサッカライドの
濃度に依存する。
これらの新しい要求を満たす他の一般的マトリクスはシ
リカを基礎とするゲルである。しかしながら、シリカは
水性溶液、特に高ｐＨ値（７，５以上）の水性溶液中で
安定でない。その上、シリカはシラノール基を含有し、
この基はそれ自体イオン効果及び／又は強い水素結合効
果を有する。
従来のポリサッカライドゲルマトリクスは、ポリマー鎖
を相互に化学的に架橋することにより安定化され得る。
この架橋は、ポリサッカライド上の利用可能なヒドロキ
シル基間で起こり、そして例えばアガロースに関して使
用されている。アガロースはエピクロルヒドリンにより
　（米国特許Ｎｏ　３，５０７．８５１）、及び他の三
官能試薬により（米国特許Ｎｏ　３，８６０，５７３）
により架橋されている。これに関し、三官能試薬は、同
じ条件下でその両官能基により反応する化合物である。
使用される他の二官Ｒ３Ｅ薬はビス−エポキシド、ジビ
ニルスルホン及びジカルボン酸クロリドである（英国特
許Ｎｏ　１３５２６１３）。
寒天及びアガロース、並びに若干の類似のポリサッカラ
イドは一定温度においてゲルを形成する。
ゲル化の後、巨大多孔性ゲル（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ
　ｇｅｌ）が得られ、そして孔のサイズは前記のように
ポリサッカライドの濃度により決定される。次に、ポリ
サッカライド鎖は水素結合によりある一定の距離を達成
し、そして鎖様構造を形成し、この構造の間に孔が形成
される。これらの構造内の架橋により孔の大きさは影響
されず、粒子の硬さのみが影響を受は生。Ｊ、　　Ｐｏ
ｒａｔｈ等（Ｊ、　ｏｆ　　Ｃｈｒｏ−ｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ　　１０３　　（１９７５）　　４９−６２　）
は、アガロースゲルの性質に対する異る鎖長を存する架
橋剤の影響を研究し、そして挿入された分子鎖が５原子
の長さを有する場合架橋剤によりかなり改良された硬さ
のゲルマトリクスが得られることを見出した。これらの
要求を満たす架橋剤はジビニルスルホンであり、これは
ホモニ官能架橋剤である。
ヨーロンパ特許出願Ｎｏ　８４８５０２１５．９には、
ホモ多官能架橋剤の使用が記載されており、そして架橋
原子の数の一層の増加が硬さを改良することが示されて
いる。
このようなホモニ官能架橋剤及びホモ多官能架橋剤の欠
点が幾つか存在する６　１つの本質的な要件は架橋剤が
可能な限り親水性であるべきことである。なぜなら、親
水性官能基間の距離が増加するに従って親水性が低下す
るからである。このことは、ヒドロキシル基を含有する
架橋剤、又は架橋後にヒドロキシル基を形成する架橋剤
を使用することにより補われる。しかしながら、ヒドロ
キシル基は架橋に影響を与える。前記のように、架橋は
ポリサッカライド上の利用可能なヒドロキシル基間で行
われる。Ｌ　、　　Ｈｏｌｍｂｅｒｇ　　（スエーデン
農業科学大学、学位論文、　１９８３．　２８−２９頁
）により、エピクロルヒドリンによるポリサッカライド
の架橋の際に七ツマー架橋、すなわちモノマーエビクロ
リヒドリンのみが関与する架橋はほとんど起こらないこ
とが示された。これに対して、Ｈｏｌ＋ｎｂｅｒｇ等は
大部分く〉９８％）がポリマー架橋及び／又は置換であ
ることを指摘した。従って、架橋反応の過程で架橋ブリ
ッジ中の原子の数はわからないことが明らかである。こ
のことはまた、ジビニルスルホンを用いた結果ＣＪ　、
　　Ｐｏｒａｔｈ。
Ｊ、　ｏｆ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１０３　（１
９７５）　　４９　６２）によっても示され、この場合
圧力／流量に関する低い再現性が示される。
ホモ−官能架橋剤はエピクロルヒドリンより一層疎水性
である。架橋の後、エピクロルヒドリンは最も親水性の
架橋を与え、そしてそれ故に理想的なはずである。しか
しながら、ポリマー架橋が得られる。
〔発明の開示〕
この発明は、架橋の長さの調整された組み立てにより多
孔性ポリサッカライドゲルの硬さをかなりの程度改良し
、そして同時に非特異的相互作用を最小にすることであ
る。こうして、一層小粒であり且つ硬さの要求をなお満
たず粒子を製造することができる。硬さを完全に調節す
ることができ、そして反応段階の回数を選択することに
より所望の硬さを得ることができる。
〔具体的な説明〕
架橋反応を完全に調節できるためには、使用される試薬
は次の要件を満たさなければならない。
１、試薬は第１反応段階において単に七ツマ−として反
応することができるべきである。すなわち、架橋すべき
でなく置換すべきである。
２、　試薬は活性化され得る少なくとも１個の官能基を
含有すべきである。
３、試薬は活性化及び架橋の後一定の長さの親水性架橋
を提供すべきである。
例えば、活性化され得る１個の官能基を有する下記の一
官能試薬を使用することができる。
Ｘ　　ＣＨｚ　ＣＨ＝ＣＨｚ （式中、Ｘは反応性基、例えばハロゲンである）。
ポリサッカライドゲル、例えば７ガロースゲル（０とし
て示す）がこの試薬によりＨＭ　ｍ体化される場合、次
のものが得られる。
［Ｆ］−〇　−ＣＨ、ＣＩ　＝　ＣＨ２段階　に重結合
を簡単に活性化することができ、そして例えば次のよう
にハロヒドリン又はエポキシドを生じさせる。
以下全白 　Ｈ Ｐ　　ＯＣＨｚ　ＪＨＣＨｚ　　ｌ−１ａｌ　　段階２
Ａ及び これらはいずれも０上のヒドロキシル基又は水と反応す
ることができ、そしてもしアガロース鎖が相互に十分に
近接していれば次のような第１架橋（又は加水分解）が
行われる。
又は これらの段階を実施した後、硬さ及び流量についてゲル
を試験する。Ｂ　１ａｋｅ　−Ｋ　ｏｚｅｎｙ式から得
られる理論値からの偏差が小さいこと、すなわち１サイ
クル後に得られる圧力が対応する最高流量を供すること
が重要である。圧力／流量曲線が不満足なものである場
合、段階１，２及び３を反復し、そして圧力／／Ｍ、量
試験を再度行う。ゲルが十分に硬くなるまでこれらの段
階を反応する。こうして、架橋ブリッジ中の原子の最大
数の調節が実現する。次に、ある回数のサイクル後の架
橋中の原子の可能な個数を示す。
サイクル数　　　　　　　原子の数 １　　　　　　　３及び／又は７ 次の一般式： ％式％ 中の炭素原子の故を変えることにより１又は複数の反応
段階を省略することができる。
例えば、エボキシド： ハ １１□Ｃ−Ｃｌ１−ＣＨｚ−０−ＣＩ□Ｃｌｌ＝ＣＨ。
は１サイクルで７及び／又は１５原子が得られる生成物
をもたらす。
一般に次のように記載することができ、−Ｂ ここで、Ｂの要件は、この試薬がＡを介してポリサッカ
ライド上で置換された後に活性化され得る少なくとも１
個の基を含有すべきことである。
それぞれの基の構造はマトリクスに依存する。
ゲル濾過においては、可能な限り非特異的相虻作用を行
わないことが目的とされる。すなわち、試薬は親水性で
あるべきである。疎水性相互作用のごとき他の技法にお
いては、疎水性試薬を選択することができる。すなわち
、Ｂ又はＡ中で置換されている分枝した長い全体積を選
択することができる。イオン交換クロマトグラフィーに
おいては、試薬の部分として陰イオン交換基又は陽イオ
ン交換基を導入することができる。
ポリサッカライド濃度及び上記の反応サイクルの反復数
を変えて、幾つかの例によりこの発明をさらに詳細に説
明する。
例　　１゜ セファロース（商標）を水中に懸濁する（容量比ｌ：３
）。次に塩基（モル比１：１５）、了りルブロミド（モ
ル比１：１０）及びナトリウムボロヒドリド（モル比１
：２）を加える。反応混合物を室温で攪拌する。３〜１
８時間の後、ガラスフィルター上でゲルを濾過し、そし
てアセトン、エタノール及び水で中性ｐ　Ｈまで洗浄す
る。
ゲルを水中に懸濁する（容量比１：３）。継続する黄色
が得られる（約１０分間）まで、臭素水を加える。混合
物を中和し、濾過しそして水で洗浄する。
ゲルを」二記のようにして再び水中に懸濁し、そして塩
基と共に（モル比１：２）室温にて撹拌する（３〜１８
時間）。ゲルを濾過し、そして水で洗浄して中性ｐＨま
で洗浄する。
ゲルを既知の方法で充填し、そして圧力／流計曲線をプ
ロットする。
上記の方法は、セファロース６Ｂの５０倍に相当するゲ
ル硬度の増加をもたらす（第１表）、所望の硬度が得ら
れるまで上記のようにして方法を反復するく第１表）。
以下余白 拠−」− セファロース６Ｂの代りにセファロース４Ｂを使用し、
そして所望の硬度が得られるまで例１に従って方法を反
復する（第１表）。
桝−Ａ− セファロース６Ｂの代りにセファロース２Ｂを使用し、
そして所望の硬度が得られるまで例１に従って方法を反
復する（第１表）。
例−［− 既知の方法に従って８６７％の濃度のアガロース粒子を
調製し、そして篩別して４０〜６０マイクロメーターの
粒子を得、例１と同し方式で反応せしめる。３サイクル
の後、２２３０ｅｍ／　ｈの流速が得られた。
例−」し＝ 既知の方法に従って１０．７％の濃度のアガロース粒子
を調整し、そして篩別し、て４０〜６０マイクロメータ
ーの粒子を得、そして例１と同じ方式で反応せしめる。
３サイクルの後、２．３ＭＰａの圧力において３２００
ｃｍ／　ｈの速度が得られた。Ｂｌ−ａｋｅ　−Ｋｏｚ
ｅｎｙの式に従うカラム中での理論圧力低下は２．０Ｍ
Ｐａであった。
言うまでもなく、上記の例により架橋されたゲルは、そ
れ自体既知の方法で上記の二官能又は官能架橋剤を使用
することによりさらに安定化され得る。これは任意の数
のサイクルの後に行うことができる。下記の例６は２種
類の架橋法の組合わせに関する。
■一旦一 例４に従って得られたゲル（流速２２３０ｃｍ／　ｈ　
）３０ｍｌを６０ｒ＋１の水に懸濁する。５時間にわた
って、１１ｍ＃のエピクロルヒドリン、２ｇのナトリウ
ムボロヒドリド及び１０ｍ７！の４５％水酸化ナトリウ
ムを添加する。混合物を５０℃で攪拌し、そして次に濾
過しそして水で洗浄して中性ｐＨにする。ゲルを既知の
方法により充填し、そして圧力／流量曲線をプロットす
る。この曲線は３０６０ｃｍ／　ｈの最大流量を示した
。
ＩどＺトゲラフ性捕 例５において製造した７トリクスをカラムに充填し、そ
してゲル濾過について試験した。このマトリクスは約３
Ｘ１０’ダルトンにおいて蛋白質について排除限界を示
した。ゲルＩＩＫ過が一般に困難な蛋白質（キモトリプ
シノーゲン、チＩ・クロームＣ）は０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムの基量及びｐ　Ｈ７（０，０１Ｍリン酸緩衝液）に
おいてプロットされた分子量曲線と良好な直線性を示し
た。
以下余白

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、多孔性ポリサッカライドを架橋する方法であって、 次の段階すなわち、 ａ）活性化され得る少なくとも１個の官能基を有する一
    官能試薬によりポリサッカライドを誘導体にすること、 ｂ）前記試薬の官能基を活性化すること、 ｃ）該活性化された基を反応せしめること、ｄ）場合に
    よっては、生ずる生成物を一官能化試薬と反応せしめる
    こと、 ｅ）段階ｂ）及びｃ）を反復すること及び ｆ）段階ｄ）及びｅ）を少なくとも１回反復すること、 を特徴とする方法。 ２、段階ｃ）の後に、生ずる生成物をそれ自体既知の方
    法で二官能又は多官能架橋剤と反応せしめることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
JP61110966A 1985-05-23 1986-05-16 多孔性ポリサツカライドの架橋方法 Expired - Lifetime JP2565490B2 (ja)

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SE8502574-0 1985-05-23
SE8502574A SE458525B (sv) 1985-05-23 1985-05-23 Foerfarande foer tvaerbindning av en poroes agar- eller agarosgel

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JPS6225102A true JPS6225102A (ja) 1987-02-03
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US (1) US4973683A (ja)
EP (1) EP0203049B1 (ja)
JP (1) JP2565490B2 (ja)
DE (1) DE3669722D1 (ja)
SE (1) SE458525B (ja)

Cited By (2)

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