JPH0780294A

JPH0780294A - 複合化吸着剤

Info

Publication number: JPH0780294A
Application number: JP5224717A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Yoshida; 弘之吉田; Hideaki Kiba; 秀明木庭; Masahiko Yasunaka; 雅彦安中; Keiko Kudo; 慶子工藤
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 1995-03-28

Abstract

(57)【要約】【構成】キトサン多孔質体の細孔内に、３次元架橋網
目構造を持つ親水性高分子からなる架橋ゲルが担持さ
れ、かつイオン交換能を有する複合化吸着剤。【効果】本発明の複合化吸着剤は、体積変化が少な
く、従来の架橋ゲルの通液特性における欠点を改善し、
更にタンパク質等の生体高分子の吸着において、高吸着
を達成出来るという効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィー
用担体として有用な複合化吸着剤に関する。詳しくは、
本発明は強度の弱い架橋ゲルを、キトサン多孔質体の細
孔内に埋め込んでなる、大きな吸着能と強度を有し、通
液性に優れ、かつ体積変化の少ない吸着剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質に代表される生体高分子の吸
着剤としては、主に合成高分子からなる多孔質型のイオン交換体親水性高分子の架橋ゲルからなるイオン交換体が用いられている。

【０００３】上記の合成高分子からなる多孔質型のイ
オン交換体は、これと接触する溶液のｐＨ、塩濃度によ
る体積変化が小さく、液体クロマトグラフィーの担体と
して用いた場合、通液時の耐圧性が良いという利点を有
している。しかし、このイオン交換体は、タンパク質の
分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく非特異吸着
が生起し、クロマトグラムのピークに非対称化が起きた
り、吸着されたタンパク質が吸着されたままで回収でき
ない事があるといった問題点がある。また、合成高分子
に弱塩基性陰イオン交換基を導入してなるイオン交換体
は、イオン交換基の導入量を多くして交換容量を大きく
しても、タンパク質の吸着量が低いという欠点がある。

【０００４】一方、上記のデキストラン、アガロース
等の多糖に代表される親水性高分子の架橋ゲルからなる
イオン交換体は、タンパク質の非特異吸着が殆ど無いと
いう利点がある。しかし、逆にこのイオン交換体は、水
溶液中で著しく膨潤したり、溶液のイオン強度による体
積変化及び、遊離型と負荷型との体積変化が大きく、か
つ機械的強度も小さいという欠点を有する。特に、この
イオン交換体をクロマトグラフィーの担体として使用す
る場合、通液時の圧力損失が大きく、かつ通液により圧
密化するといった欠点がある。

【０００５】親水性高分子の架橋ゲルが持つ上記の欠点
を克服する為に、いわば「骨格」となる剛直な物質と組
み合わせる試みがこれまでになされている。例えば、米
国特許第４９６５２８９号では、多孔性高分子の細孔内
にゲルを保持した複合体を、ペプチド合成の分野で用い
ている。硬い高分子物質でゲルを包囲するため容積変化
が無く、カラムに充填して用いてもカラムを通過するフ
ロースルーの圧力が変化しないという効果を上げてい
る。しかし、この複合体の多孔性高分子は７５％以上と
いう大きな細孔容積を有しているので、いわゆる“骨
格”部分が少なく、従って強度が弱いと考えられる。さ
らに、この複合体は粉砕されたもので球状ではないた
め、クロマトグラフィーの担体として使用した場合、満
足な分離が得られない。

【０００６】米国特許第４３３６１６１号では、セライ
ト等の無機多孔質体にセルロースなどのキセロゲルを保
持させ、クロマトグラフィーの担体として使用してい
る。その結果として、カラムでの通液性の良さをあげて
いるが、セライト等の無機物質は、一般にアルカリに不
安定なので、クロマトグラフィーの操作上好ましくない
という欠点を有する。

【０００７】米国特許第３９６６４８９号には、いわゆ
るマクロネットワーク構造のコポリマーの細孔を、モノ
マーから合成した共重合体のゲルで埋めたハイブリッド
コポリマーのイオン交換体が記載されている。架橋共重
合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失が大きい、体
積が変化する等の問題があるが、ハイブリッドコポリマ
ーにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく
なること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動
が改善されることを発明の効果としてあげている。しか
し、このハイブリッドコポリマーのネットワーク構造、
すなわち骨格は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体
からなっている。従ってこのものは、疎水性が高く、タ
ンパク質等の生体高分子の分離に使用した場合、非特異
吸着が起きるという欠点を有する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、親水性高分
子からなる吸着剤が有するタンパク質等の生体高分子に
対する優れた吸着性能を保持しながら、疎水的相互作用
による非特異吸着がなく、かつ、体積変化が少ない吸着
剤を提供せんとするものである。

【０００９】

【課題を解決する為の手段】本発明に係る吸着剤は、機
械的強度の大きいキトサン多孔質体の細孔内に、親水性
高分子からなる架橋ゲルを担持した構造を有する複合化
吸着剤である。本発明に係る複合化吸着剤について更に
詳細に説明するに、このものは球状の粒子であり、その
粒径は通常２〜１０００μｍであり、用途により適宜選
択される。例えばカラムに充填してタンパク質等の生体
高分子の吸着に用いる場合には１０〜５００μｍの粒径
のものが好ましい。また分取クロマト、工業用クロマト
の分野では、一般に１００〜２００μｍの粒径のものが
好んで用いられる。また、このものはイオン交換能を有
しており、そのイオン交換容量は少くとも０．３ｍｅｑ
／ｍｌ、通常は０．５ｍｅｑ／ｍｌ以上である。一般に
イオン交換容量が大きい方がタンパク質等の吸着量が大
きいので、１．０ｍｅｑ／ｍｌ以上のイオン交換容量を
有するものが好んで用いられる。

【００１０】本発明に係る複合化吸着剤は、球状のキト
サン多孔質体に親水性高分子を含浸させたのち架橋剤を
反応させて、親水性高分子を架橋させて架橋ゲルとする
ことにより製造することができる。イオン交換基は、親
水性高分子を含浸する前にキトサン多孔質体に導入して
おいてもよいが、キトサン多孔質体内に架橋ゲルを形成
したのちに導入するのが好ましい。架橋ゲルを形成した
後にイオン交換基を導入すると、架橋ゲル自体にもイオ
ン交換基が導入され、架橋ゲル部分における吸着能が高
まると考えられる。なお、キトサン自体の１級アミノ基
もイオン交換基であるのが、通常はこれに加えて更に外
部からイオン交換基を導入するのが好ましい。

【００１１】本発明に係る複合化吸着剤の製造法につい
て更に詳細に説明すると、原料として用いる球状のキト
サン多孔質体は、キトサンをジイソシアネートその他の
架橋剤で架橋したものである。架橋度及び多孔度は、架
橋反応のやり方およびその際の架橋剤の使用量により適
宜選択できる。通常は０．０１〜１．０μｍの孔径を有
する細孔の容積が樹脂体積の７０〜９５％を占めるよう
な、極めて多孔質のものを用いるのが好ましい。すなわ
ちキトサン多孔質体は、十分な量の親水性高分子の架橋
ゲルを担持できる細孔容積と、タンパク質等の生体高分
子が内部に拡散して行くことのできる細孔直径を有して
いなければならない。キトサン多孔質体には予じめイオ
ン交換基を導入しておいてもよい。

【００１２】もう一方の原料である親水性高分子として
は、デキストラン、アガロース等の多糖類や、ポリビニ
ルアルコール等の親水性合成高分子が用いられる。通常
はタンパク質等の生体高分子の非特異吸着が殆ん無い多
糖類、特にデキストランが用いられる。親水性高分子の
分子量は１０⁴〜２×１０⁶、特に１０⁵〜１０⁶の範
囲にあるのが好ましい。分子量が小さ過ぎるとゲルの形
成が困難となる。逆に分子量が大き過ぎると、溶液にし
たときの粘度が大きくなり、キトサン多孔質体内への拡
散・浸透が困難となる。

【００１３】この親水性高分子を溶媒、通常は水に溶解
して水溶液とし、これに前述のキトサン多孔質体を加え
て常温ないし加温下に保持し、水溶液をキトサン多孔質
体に含浸させる。含浸に用いる親水性高分子水溶液の濃
度は通常５〜３０（重量）％である。一般に低濃度の水
溶液を含浸させると高含水率の架橋ゲルが生成し、逆に
高濃度の水溶液を含浸させると低含水率の架橋ゲルが生
成する傾向がある。

【００１４】親水性高分子の水溶液を含浸させたキトサ
ン多孔質体は、次いでこれに架橋剤を反応させて多孔質
体内に親水性高分子の架橋ゲルを生成させる。このとき
親水性高分子だけでなくキトサン自体も架橋剤と反応す
ると考えられ、従ってキトサン−親水性高分子間の架橋
などキトサンも架橋に関与すると考えられる。架橋剤と
しては、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グ
ルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンビ
ス（フェニルイソシアネート）等のジイソシアネート化
合物の如き、ＯＨ基と反応性を有する官能基を２個以上
有する化合物が用いられる。なお、親水性高分子として
キトサンの如きアミノ基を有する化合物を用いる場合に
は、１，８−ジクロロオクタンのようなジハライドを架
橋剤として用いることもできる。

【００１５】架橋反応は通常は触媒の存在下に行なわれ
る。触媒は架橋剤の種類に応じて適宜選択するが、例え
ば架橋剤がハロヒドリンの場合には水酸化ナトリウム等
のアルカリが用いられ、ジアルデヒド化合物の場合には
塩酸等の鉱酸が用いられる。架橋反応は、親水性高分子
を含浸させたキトサン多孔質体を反応媒体中に懸濁させ
ておき、これに架橋剤を添加して反応させればよい。架
橋剤の量は目的とする複合化吸着剤の物性に応じて適宜
定めればよい。一般に架橋剤の量を多くすると、生成す
る複合化吸着剤の水中での膨潤度が小さくなる。架橋剤
の量が多過ぎると、架橋が進みすぎて親水性高分子の特
性が損なわれることがあるので注意を要する。

【００１６】また、架橋反応が触媒によって制御可能な
場合には、架橋剤と親水性高分子の混合溶液をキトサン
多孔質体に含浸させ、次いでこの多孔質体を適当な反応
媒体中に懸濁させ、これに触媒を添加して架橋反応を進
行させることもできる。さらに、温度等の反応条件によ
って架橋反応を制御できる場合には、親水性高分子、架
橋剤および触媒を予じめキトサン多孔質体に含浸させ、
次いでこれを反応触媒に懸濁させ、昇温して架橋反応を
進行させることもできる。これらの架橋反応の反応媒体
としては、多孔質体に含浸させてある親水性高分子等を
抽出せず、且つ架橋反応に不活性なものであれば任意の
溶媒を用いることができる。このような溶媒としては例
えば、トルエン、ジクロロベンゼン、ニトロメタン等が
あげられる。なお架橋反応の反応温度や反応時間など
は、架橋剤により異なるが、通常は５〜９０℃、好まし
くは３０〜９０℃で１〜１０時間反応させればよい。

【００１７】キトサン多孔質体に担持する架橋ゲルの担
持量は任意であるが、担持量が少なすぎると複合化吸着
剤としての性能が十分に発現しない。架橋ゲルの担持量
は、キトサン多孔質体に対し通常は１０（重量）％以上
であり、好ましくは５０（重量）％以上である。担持量
の上限は、キトサン多孔質体の細孔容積と架橋ゲルの含
水率により規制される。担持量の上限は通常キトサン多
孔質体に対し２５０（重量）％以下、特に２００（重
量）％以下である。

【００１８】架橋反応が終了したならば、濾過してキト
サン多孔質体と架橋ゲルの複合体を取出し、メタノール
やエタノール等の親水性有機溶媒や水で洗浄して未反応
の親水性高分子や反応媒体等を除去する。次いで、この
複合体にイオン交換基を導入して複合化吸着剤とする。
イオン交換基の導入は、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲ
ノプロピオン酸等のハロゲノカルボン酸や、ジエチルア
ミノエチルクロライド等のハロゲノアルキルアミンを用
いて行なわれる。すなわち上記で得た架橋ゲルを担持し
た複合体を苛性ソーダ等のアルカリ水溶液に浸漬して複
合体中にアルカリを含浸させ、次いでこれに有機溶媒中
で上記の試薬を加えて反応させればよい。有機溶媒とし
てはエタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ル、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノー
ル等のアルコール類を用いるのが好ましい。

【００１９】反応は４０〜９０℃で０．５〜１２時間行
なえばよい。一般に複合化吸着剤はイオン交換容量が大
きい方がタンパク質等の生体高分子の吸着量が大きい。
従ってイオン交換基の導入は、イオン交換容量が０．３
〜３．０ｍｅｑ／ｍｌ、特に０．５〜２．０ｍｅｑ／ｍ
ｌとなるように行なうのが好ましい。なお、架橋ゲルを
担持する前のキトサン多孔質体にイオン交換基を導入す
る場合にも上記と同様にして行なうことができる。ま
た、別法として親水性高分子にイオン交換基を導入して
からキトサン多孔質体に含浸させ、次いで架橋剤と反応
させて架橋ゲルを形成させることもできる。

【００２０】このようにして得られる複合化吸着剤は、
タンパク質等の生体高分子に対し大きな吸着能を有して
いる。例えば牛血清アルブミンに対して１５０ｇ／ｌ−
吸着剤以上、特に２００ｇ／ｌ−吸着剤以上の吸着能を
有する複合化吸着剤を容易に得ることができる。また、
本発明に係る複合化吸着剤では、親水性高分子の架橋ゲ
ルがキトサン多孔質体の細孔内に担持されているため、
架橋ゲルが水中で膨潤したり、周囲の溶液のイオン強度
の影響で体積変化しても、複合化吸着剤そのものの体積
は殆んど変化しない。

【００２１】なお、本発明に係る複合化吸着剤の製造過
程において、イオン交換基の代りにアフィニティーリガ
ンドを導入すると、アフィニティークロマトグラフィー
の担体が得られる。この担体においても、タンパク質の
非特異吸着が無いという親水性高分子架橋ゲルの特徴が
発揮され、タンパク質の吸着−脱着が容易であり、且つ
タンパク質の変性も起こらない。

【００２２】以下に実施例および比較例により本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限
定されるものではない。なお、本明細書において粒径は
水中で膨潤した状態での値である。またイオン交換容量
及び牛血清アルブミン吸着量も、水中で膨潤した状態で
の複合化吸着剤に基づく値である。複合化吸着剤の体積
は、水中で膨潤した複合化吸着剤を１０ｍｌのメスシリ
ンダーに流し込み、振動させて密に充填するようにして
自然沈降させ、その体積を測定することにより求められ
る。

【００２３】

【実施例】

〔実施例１〕膨潤状態のキトサン多孔質体（キトパール
ＢＣＷ−２５０１、富士紡績社製品、陰イオン交換容量
０．５８ｍｅｑ／ｍｌ）１００ｍｌを、デキストラン水
溶液（蒸留水１００ｍｌに、分子量５０万のデキストラ
ン１９．２５ｇを溶解）に浸せきし、室温で６６．３時
間撹拌した。次いでデキストラン水溶液（蒸留水１００
ｍｌに分子量５０万のデキストラン１２．５ｇを溶解）
を加え、５０度で２５時間放置した。更にデキストラン
水溶液（蒸留水１００ｍｌに分子量５０万のデキストラ
ン１２．４９ｇを溶解）を加え、５０℃で４７．５時間
放置した。更にデキストラン水溶液（蒸留水１００ｍｌ
に分子量５０万のデキストラン１２．７２ｇを溶解）を
加え、５０℃で４９．５時間放置した。再度デキストラ
ン水溶液（蒸留水１００ｍｌに分子量５０万のデキスト
ラン１２．７７ｇを溶解）を加え、５０℃で２８．３時
間放置した後、デキストラン溶液（３．８５規定水酸化
ナトリウム水溶液１００ｍｌに分子量５０万のデキスト
ラン１２．６６ｇと水素化ほう素ナトリウム３．８４ｇ
を溶解）を加え、５０℃で１４．５時間放置した。遠心
分離機で、多孔質体の外部に付着した過剰のデキストラ
ン溶液を除去した。デキストラン溶液含浸キトサン多孔
質体を、トルエン９６０ｍｌ中にエチルセルロース３
８．９ｇを溶解した溶液中に加え、５０℃で撹拌し、分
散、懸濁した。懸濁液中にエピクロルヒドリン１６．３
ｍｌを加えて、この温度で８時間撹拌し、架橋反応させ
た。トルエン、５０％エタノール水溶液、脱イオン水で
順次洗浄した。複合体を、遠心分離で水を除去した後、
３規定の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌ中にいれ、
室温で１時間放置した。１２．９ｇのジエチルアミノエ
チルクロリド塩酸塩を１４．７ｍｌの水に溶解し、更に
イソプロピルアルコール１６０ｍｌと混合した溶液を、
水酸化ナトリウム含浸状態の複合体に加えた。温度を５
０℃まで上げ、撹拌しながら９時間反応させた。反応終
了後、濾過、水洗し、目的の複合化吸着剤を得た。複合
化吸着剤の収率は、原料のキトサン多孔質体の重量に対
し２８７％であった。また、この複合化吸着剤のイオン
交換容量は１．１２ｍｅｑ／ｍｌで、そのうち１級アミ
ノ基は、０．７１ｍｅｑ／ｍｌであった。

【００２４】次に、この複合化吸着剤を用いて、タンパ
ク質の吸着実験を行った。複合化吸着剤を０．１Ｎ−水
酸化ナトリウム水溶液に浸漬した。次いで、充分な量の
脱塩水で洗浄したのち、７ｍＭ−リン酸塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．９）で緩衝化した。これをカラムに充填し、同一
緩衝液で調製した牛血清アルブミン溶液を通液して、そ
の破過曲線を求めた。この結果、牛血清アルブミンの飽
和吸着量は、３４２ｇ／ｌであった。

【００２５】また、固相物質移動容量係数（ｋ_P）を、
破過曲線の実測値と、ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇＳｃｉｅｎｃｅ３９号１４８９頁（１
９８４年）に記載のＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｏｌｕｔ
ｉｏｎｏｆｔｈｅＢｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｆ
ｏｒＲｅｃｔａｎｇｕｌａｒＩｓｏｔｈｅｒｍＳｙ
ｓｔｅｍｓに基づく均一モデルによる理論線とのカーブ
フィッティングにより決定し、次式を用いて固相拡散係
数（Ｄ_s）を求めた。

【００２６】

【数１】ｋ_P＝１５Ｄ_s／ｒ₀ ²（ｒ₀：複合化吸着剤
の半径（ｃｍ））その結果、固相拡散係数は２．４３×１０^-9ｃｍ²／ｓ
ｅｃであった。

【００２７】〔比較例１〕デキストランの架橋ゲルから
なる弱塩基性陰イオン交換体（ファルマシア社製品、Ｄ
ＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−５０）について、実施
例１と同様の要領で、交換容量、タンパク質の飽和吸着
量および固相拡散係数を求めた。その結果、交換容量
０．０５ｍｅｑ／ｍｌ、牛血清アルブミンの飽和吸着量
２６１ｇ／ｌ、固相拡散係数１．８６×１０^-9ｃｍ²／
ｓｅｃであった。

【００２８】従って、実施例１の複合化吸着剤は、本比
較例のデキストランの架橋ゲルからなる弱塩基性陰イオ
ン交換体と比べて、固相拡散係数および牛血清アルブミ
ンの平衡吸着量がいずれも大きく、吸着剤として優れた
性能を有する事がわかる。また、本比較例のデキストラ
ン架橋ゲルからなるイオン交換体は、機械的強度が弱
く、カラムに充填し、線速度１０ｃｍ／ｈで通液した場
合、徐々に圧縮され、カラム内圧が増加する。これに対
して、実施例１の複合化吸着剤は、線速度１００ｃｍ／
ｈで通液が可能であり、強度的にも優れている事がわか
る。

【００２９】〔比較例２〕複合化吸着剤の母体として用
いた、キトサン多孔質体（富士紡績社製キトパールＢ
ＣＷ−２５０１）について実施例１と同様の要領で、牛
血清アルブミンの飽和吸着量および固相拡散係数を求め
た。その結果、飽和吸着量は１３８ｇ／ｌ、固相拡散係
数は０．２３９×１０^-9ｃｍ²／ｓｅｃであった。従っ
て、実施例１の複合化吸着剤は、その母体のキトサン多
孔質体と比べても、固相拡散係数が１０．２倍で、かつ
牛血清アルブミンの平衡吸着量が約２．５倍と高く、優
れた性能を有する事がわかる。

【００３０】

【発明の効果】本発明に係る複合化吸着剤は、体積変化
が少なく、カラムに充填して使用する際にも大きな線速
度で通液することができる。また、タンパク質等の生体
高分子に対し大きな吸着能を有している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者工藤慶子神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キトサン多孔質体の細孔内に、親水性高
分子からなる架橋ゲルが担持されていることを特徴とす
るイオン交換能を有する複合化吸着剤。
【請求項２】イオン交換容量が０．５ｍｅｑ／ｍｌ以
上であることを特徴とする請求項１記載の複合化吸着
剤。
【請求項３】牛血清アルブミンの飽和吸着量が２００
ｇ／ｌ以上であることを特徴とする請求項１又は２記載
の複合化吸着剤。
【請求項４】球状のキトサン多孔質体に親水性高分子
溶液を含浸させる工程、該親水性高分子に架橋剤を反応
させてキトサン多孔質体−親水性高分子架橋ゲルの複合
体を形成する工程、及びこの複合体にイオン交換基を導
入する工程の各工程を経ることを特徴とする請求項１な
いし３のいずれかに記載の複合化吸着剤の製造法。