JPS62253384A - 酵母における組換え蛋白の制御可能な発現 - Google Patents
酵母における組換え蛋白の制御可能な発現Info
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- JPS62253384A JPS62253384A JP62044152A JP4415287A JPS62253384A JP S62253384 A JPS62253384 A JP S62253384A JP 62044152 A JP62044152 A JP 62044152A JP 4415287 A JP4415287 A JP 4415287A JP S62253384 A JPS62253384 A JP S62253384A
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- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、
異種蛋白の発現に有能な宿主種であることが明らかとな
った。種々の種からの多くの異種蛋白がＳ．セレビシエ
中で発現され、あるものでは全細胞蛋白の１０％を越え
る程度に達した。典型的には、発現はＳ．セレビシエお
よびニジエリシアコリ（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）の両方の中で選択ならびに増幅のために必要な
配列とともに１発現されるポリペプチドのための構造遺
伝子を取り囲む酵母制御配列（転写プロモーターおよび
ターミネータ−）を含むプラスミドにより仲介されてい
る。
異種蛋白の発現に有能な宿主種であることが明らかとな
った。種々の種からの多くの異種蛋白がＳ．セレビシエ
中で発現され、あるものでは全細胞蛋白の１０％を越え
る程度に達した。典型的には、発現はＳ．セレビシエお
よびニジエリシアコリ（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）の両方の中で選択ならびに増幅のために必要な
配列とともに１発現されるポリペプチドのための構造遺
伝子を取り囲む酵母制御配列（転写プロモーターおよび
ターミネータ−）を含むプラスミドにより仲介されてい
る。
アルファ接合因子は、ＭＡＴαおよびＭＡＴａ細胞の間
の接合に必要とされるＳ．セレビシエの性フェロモンで
ある。このトリデカペプチドは、粗面小胞体中に向けら
れるプレプロフェロモンとして発現され、糖付加され、
細胞から分泌されるその最終的な成熟形に蛋白分解的に
プロセスされる。この生化学的な経路は、異種ペプチド
のための発現戦略として利用されてきた。該アルファ接
合因子遺伝子は分子的にクローン化され、プレ−プロー
リーダー配列を伴うそのプロモーターは、種々のポリペ
プチドを発現し分泌するのに利用されてきた。それらの
粗面小胞体およびゴルジ器官の横断から期待されるよう
に、異種蛋白はＮ−および〇−結結合付付加両反応を受
は得る。
の接合に必要とされるＳ．セレビシエの性フェロモンで
ある。このトリデカペプチドは、粗面小胞体中に向けら
れるプレプロフェロモンとして発現され、糖付加され、
細胞から分泌されるその最終的な成熟形に蛋白分解的に
プロセスされる。この生化学的な経路は、異種ペプチド
のための発現戦略として利用されてきた。該アルファ接
合因子遺伝子は分子的にクローン化され、プレ−プロー
リーダー配列を伴うそのプロモーターは、種々のポリペ
プチドを発現し分泌するのに利用されてきた。それらの
粗面小胞体およびゴルジ器官の横断から期待されるよう
に、異種蛋白はＮ−および〇−結結合付付加両反応を受
は得る。
Ｓ．セレビシエは、生育のための炭素原としてガラクト
ースを利用するために機能する酵素をコードする３遺伝
子を有する。ＧＡＬｌ、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝
子はそれぞれガラクトキナーゼ、α−Ｄ−ガラクトース
ー１−燐酸 ウリジルトランスフェラーゼおよびウリジ
ン ジフォスフォガラクトースー４−エピメラーゼをコ
ードする。ガラクトースのないところでは、これら酵素
はごく僅かしか発現されない。もし細胞が最初グルコー
スで生育し、そして培養にガラクトースが添加されると
、グルコースが枯渇したときこれら３酵素が同時に少な
くとも１，０００倍まで誘導される。この誘導はＲＮＡ
転写の段階で生じることが示されている。ＧＡＬｌおよ
びＧＡＬＩＯ遺伝子は分子的にクローン化され配列が決
定されている。各コード領域の５′側の制御並びにプロ
モーター配列が、１ａｃＺ遺伝子のコード領域の近傍に
おかれた。これらの実験はガラクトース誘導に必要なそ
れらプロモーターおよび制御配列を明らかにした。
ースを利用するために機能する酵素をコードする３遺伝
子を有する。ＧＡＬｌ、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝
子はそれぞれガラクトキナーゼ、α−Ｄ−ガラクトース
ー１−燐酸 ウリジルトランスフェラーゼおよびウリジ
ン ジフォスフォガラクトースー４−エピメラーゼをコ
ードする。ガラクトースのないところでは、これら酵素
はごく僅かしか発現されない。もし細胞が最初グルコー
スで生育し、そして培養にガラクトースが添加されると
、グルコースが枯渇したときこれら３酵素が同時に少な
くとも１，０００倍まで誘導される。この誘導はＲＮＡ
転写の段階で生じることが示されている。ＧＡＬｌおよ
びＧＡＬＩＯ遺伝子は分子的にクローン化され配列が決
定されている。各コード領域の５′側の制御並びにプロ
モーター配列が、１ａｃＺ遺伝子のコード領域の近傍に
おかれた。これらの実験はガラクトース誘導に必要なそ
れらプロモーターおよび制御配列を明らかにした。
種々の組換え微生物発現系において、多くの異なるポリ
ペプチドが宿主細胞に有害であることが示されている。
ペプチドが宿主細胞に有害であることが示されている。
その結果、そのような組換え培養の大規模化において、
異種ポリペプチドを発現しないかまたは、培養が該ポリ
ペプチドの源として経済的に見合わないくらいの微量量
しか発現しないような細胞のみとなるような、該ポリペ
プチドの発現に対抗する圧力がある。
異種ポリペプチドを発現しないかまたは、培養が該ポリ
ペプチドの源として経済的に見合わないくらいの微量量
しか発現しないような細胞のみとなるような、該ポリペ
プチドの発現に対抗する圧力がある。
本発明の目的は、その発現が、酵母において不安定か酵
母にとって有害である異種蛋白の、組換えプラスミドＤ
ＮＡ−制御発現のための方法を与えることである。本発
明の他の目的は、そのような組換えプラスミドベクター
で形質転換された組換え細胞の生育を大規模化するため
の条件を、異種蛋白の最大収率が大容量において到達さ
れるように特定することである１本発明のさらに他の目
的は、エブスタイン−バールウイルスの膜抗原（ｇｐ３
５０／ｇｐ２２０）を酵母において糖付加された（ｇｌ
ｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形で発現させる方法を与えるこ
とである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の記
述より明かとなろう６エプスタインーパールウイルスの
膜抗原（ｇｐ３５０／ｇｐ２２０）遺伝子の発現は酵母
において毒性効果のために逆選択される。
母にとって有害である異種蛋白の、組換えプラスミドＤ
ＮＡ−制御発現のための方法を与えることである。本発
明の他の目的は、そのような組換えプラスミドベクター
で形質転換された組換え細胞の生育を大規模化するため
の条件を、異種蛋白の最大収率が大容量において到達さ
れるように特定することである１本発明のさらに他の目
的は、エブスタイン−バールウイルスの膜抗原（ｇｐ３
５０／ｇｐ２２０）を酵母において糖付加された（ｇｌ
ｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形で発現させる方法を与えるこ
とである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の記
述より明かとなろう６エプスタインーパールウイルスの
膜抗原（ｇｐ３５０／ｇｐ２２０）遺伝子の発現は酵母
において毒性効果のために逆選択される。
分泌過程においてプロセスされるように蛋白の制御され
た発現をさせる遺伝的な発現系が記載されている。この
系は、酵母中で細胞に対し毒性効果を示すか、その発現
が逆選択され゛るような糖蛋白の発現に応用し得る。
た発現をさせる遺伝的な発現系が記載されている。この
系は、酵母中で細胞に対し毒性効果を示すか、その発現
が逆選択され゛るような糖蛋白の発現に応用し得る。
本発明は、ガラクトース−誘導可能プロモーターおよび
アルファ接合因子プレ−プローリーダー配列を、その発
現が酵母中で不安定か有毒である分泌系でプロセスされ
る異種糖蛋白または蛋白の発現に応用するための方法に
向けられている。本発明はまた、そのようなベクター系
を、酵母中で糖付加形で大量のエブスタイン−バールウ
イルス膜抗原（ＥＢＭＡ）を安定に発現するために用い
ることに向けられている。より特定すると１本発明はＥ
ＢＭＡを発現している組換え培養の大量規模化のための
条件に向けられている０本分野の熟練者にとって、その
発現が酵母中で有毒か逆選択される１分泌系でプロセス
される他の異種糖蛋白あるいは蛋白の遺伝子が、このベ
クター−宿主細胞系を用いることにより大量に安定に発
現されるということは自明である。
アルファ接合因子プレ−プローリーダー配列を、その発
現が酵母中で不安定か有毒である分泌系でプロセスされ
る異種糖蛋白または蛋白の発現に応用するための方法に
向けられている。本発明はまた、そのようなベクター系
を、酵母中で糖付加形で大量のエブスタイン−バールウ
イルス膜抗原（ＥＢＭＡ）を安定に発現するために用い
ることに向けられている。より特定すると１本発明はＥ
ＢＭＡを発現している組換え培養の大量規模化のための
条件に向けられている０本分野の熟練者にとって、その
発現が酵母中で有毒か逆選択される１分泌系でプロセス
される他の異種糖蛋白あるいは蛋白の遺伝子が、このベ
クター−宿主細胞系を用いることにより大量に安定に発
現されるということは自明である。
該アルファ接合因子遺伝子ＭＦαＩは、Ｓ。
セレビシェ ゲノムＤＮＡからプラスミドベクター上に
クローンされている。このＤＮＡは、Ｈｉｎｄｍで消化
され自己連結されて。
クローンされている。このＤＮＡは、Ｈｉｎｄｍで消化
され自己連結されて。
プレ−プローリーダー配列の３′側に唯一のＨｉｎｄｌ
ｌＩをともなった新たなプラスミドを形成する６次いで
、全３種の読み取り枠において翻訳終結シグナルを含む
オリゴヌクレオチド アダプターが、その唯一のＨｉ
ｎ ｄ ｍ部位に、唯一のＨｉｎｄｎ［部位がオリゴヌ
クレオチド挿入体の ５′側に保持されるように挿入さ
れる。その結果できたプラスミドはＨｉｎｃｌＩｎで消
化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ（Ｋ １ｅｎ
ｏｖ）断片により平滑末端化され、Ｂａｍ）（Ｉリンカ
−の存在下で自己連結される。このプラスミドＤＮＡは
Ｅ ｃ ｏ ＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼエの
クレノフ断片により平滑末端化され、ＢｃｌＩリンカ−
と連結され、ＢｃｌＩで消化され、アルファ接合因子遺
伝子を含む１．４キロ塩基対（ｋｂｐ）断片が単離され
る。Ｅ、コリーＳ。
ｌＩをともなった新たなプラスミドを形成する６次いで
、全３種の読み取り枠において翻訳終結シグナルを含む
オリゴヌクレオチド アダプターが、その唯一のＨｉ
ｎ ｄ ｍ部位に、唯一のＨｉｎｄｎ［部位がオリゴヌ
クレオチド挿入体の ５′側に保持されるように挿入さ
れる。その結果できたプラスミドはＨｉｎｃｌＩｎで消
化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ（Ｋ １ｅｎ
ｏｖ）断片により平滑末端化され、Ｂａｍ）（Ｉリンカ
−の存在下で自己連結される。このプラスミドＤＮＡは
Ｅ ｃ ｏ ＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼエの
クレノフ断片により平滑末端化され、ＢｃｌＩリンカ−
と連結され、ＢｃｌＩで消化され、アルファ接合因子遺
伝子を含む１．４キロ塩基対（ｋｂｐ）断片が単離され
る。Ｅ、コリーＳ。
セレビシェ シャトルベクターｐ Ｃ１／ １がＢａｍ
ＨＩで消化され１次いで上述の１．４ｋｂｐ Ｂｃｌ
Ｉ断片と連結される。このプラスミドＤＮＡ （ｐＪｃ
１９７）は５ａｌＩで消化され、ポリメラーゼエのクレ
ノフ断片で平滑末端化され、そして０．３５ ｋｂｐ
断片の単離のためにＰ’ｓｔＩで消化される。Ｅ。
ＨＩで消化され１次いで上述の１．４ｋｂｐ Ｂｃｌ
Ｉ断片と連結される。このプラスミドＤＮＡ （ｐＪｃ
１９７）は５ａｌＩで消化され、ポリメラーゼエのクレ
ノフ断片で平滑末端化され、そして０．３５ ｋｂｐ
断片の単離のためにＰ’ｓｔＩで消化される。Ｅ。
コリーＳ．セレビシエ シャトルベクターＹＥｐ５１が
ＢｃｌＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ
断片で平滑末端化され、そして６．３ ｋｂｐ断片の単
離のために５ａＬＩで消化される。これら２断片は、Ａ
ＴＧとアルファ接合因子プレ−プローリーダーの最初の
８アミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチド アダ
プターとともに連結され、新たな発現プラスミド（ｐＧ
ＡＬｌｏ−ＭＦα１）を創り出す、このベクターの顕著
な側面は：（１） Ｅ、コリ中でのプラスミドの選択
ならびに増幅のためのＥ、コリ由来の配列、（２）Ｓ．
セレビシエ中でのプラスミドの選択ならびに増幅のため
のＳ．セレビシエ由来の配列、（３）酵母ＧＡＬＩＯプ
ロモーター、（４）翻訳産物を粗面小胞体に向けるため
の酵母アルファ接合因子プレ−リーダー、（５）Ｎ−グ
リコジル化シグナル配列をコードし、ＫＥＸ２および５
ＴＥ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂される
酵母アルファ接合因子ブローリーダー、（６）発現され
るべき異種ポリペプチドをコードしている遺伝子のクロ
ーン化のための唯一のＢ ａ ｍ ＨＩ部位、（７）全
３種の読み取り枠における翻訳終結配列、（８）転写終
結配列である。
ＢｃｌＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ
断片で平滑末端化され、そして６．３ ｋｂｐ断片の単
離のために５ａＬＩで消化される。これら２断片は、Ａ
ＴＧとアルファ接合因子プレ−プローリーダーの最初の
８アミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチド アダ
プターとともに連結され、新たな発現プラスミド（ｐＧ
ＡＬｌｏ−ＭＦα１）を創り出す、このベクターの顕著
な側面は：（１） Ｅ、コリ中でのプラスミドの選択
ならびに増幅のためのＥ、コリ由来の配列、（２）Ｓ．
セレビシエ中でのプラスミドの選択ならびに増幅のため
のＳ．セレビシエ由来の配列、（３）酵母ＧＡＬＩＯプ
ロモーター、（４）翻訳産物を粗面小胞体に向けるため
の酵母アルファ接合因子プレ−リーダー、（５）Ｎ−グ
リコジル化シグナル配列をコードし、ＫＥＸ２および５
ＴＥ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂される
酵母アルファ接合因子ブローリーダー、（６）発現され
るべき異種ポリペプチドをコードしている遺伝子のクロ
ーン化のための唯一のＢ ａ ｍ ＨＩ部位、（７）全
３種の読み取り枠における翻訳終結配列、（８）転写終
結配列である。
ＥＢＭＡ蛋白はウィルスによりコードされる３ ５０，
０００および２２０．０００ダルトンの糖蛋白を表わす
０両蛋白の構造遺伝子は同一で、全てがＢａｍＨＩ−Ｌ
ゲノム性ＤＮＡ断片中に含まれている。該ＥＢＭＡ遺伝
子断片はｐＧＡＬｌｏ−ＭＦα１発現ベクター中にクロ
ーン化されている。この組換えプラスミドはＳ．セレビ
シエ中に導入され、形質転換クローンが選択される。細
胞はグリセロール−乳酸培地で生育させられる；発現を
誘導するために培養にガラクトースが添加される。溶菌
液が調製され、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動さ
れニトロセルロースにウェスタン（Ｗ ６ｇｔｅｒｎ
）プロットされる。
０００および２２０．０００ダルトンの糖蛋白を表わす
０両蛋白の構造遺伝子は同一で、全てがＢａｍＨＩ−Ｌ
ゲノム性ＤＮＡ断片中に含まれている。該ＥＢＭＡ遺伝
子断片はｐＧＡＬｌｏ−ＭＦα１発現ベクター中にクロ
ーン化されている。この組換えプラスミドはＳ．セレビ
シエ中に導入され、形質転換クローンが選択される。細
胞はグリセロール−乳酸培地で生育させられる；発現を
誘導するために培養にガラクトースが添加される。溶菌
液が調製され、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動さ
れニトロセルロースにウェスタン（Ｗ ６ｇｔｅｒｎ
）プロットされる。
３５０．０００ダルトン糖蛋白は、 それが形質転換に
のみ存在すること、エプスタイン−パールウィルス回復
期ヒト血清および特異的モノクローナル抗体と反応する
こと、および集積した陰性ヒト血清とは反応しないとい
う点でＥ Ｂ Ｍ、 Ａに特異的であることが認められ
る。
のみ存在すること、エプスタイン−パールウィルス回復
期ヒト血清および特異的モノクローナル抗体と反応する
こと、および集積した陰性ヒト血清とは反応しないとい
う点でＥ Ｂ Ｍ、 Ａに特異的であることが認められ
る。
以前に、ＥＢＭＡの発現が高レベルで構成的に転写され
るアルファ接合因子プロモーターから出ることを除くと
、上述のものと同様な発現ベクターにおいてＥＢＭＡを
発現するための試みがなされていた。形質転換体の生育
が１０ミリリットル以上の体積で試みられたどの場合に
おいても、ＥＢＭＡの発現はなくなる。細胞が液体培養
の途中で平板に撒かれると、非形質転換対照と同じ大き
さの大集落の数が増加していることが認められる。集落
の大きさが大きいことは、細胞の生育が小さな集落のも
のより早いことを反映している。
るアルファ接合因子プロモーターから出ることを除くと
、上述のものと同様な発現ベクターにおいてＥＢＭＡを
発現するための試みがなされていた。形質転換体の生育
が１０ミリリットル以上の体積で試みられたどの場合に
おいても、ＥＢＭＡの発現はなくなる。細胞が液体培養
の途中で平板に撒かれると、非形質転換対照と同じ大き
さの大集落の数が増加していることが認められる。集落
の大きさが大きいことは、細胞の生育が小さな集落のも
のより早いことを反映している。
ウェスタンプロットが形質転換体の大および小集落につ
いてなされるときは、大集落は常にＥＢＭＡを発現して
おらず小集落は常にＥＢＭＡを発現している。連続的な
生育の間平板に撒くと大集落の数が増加することは、Ｓ
。
いてなされるときは、大集落は常にＥＢＭＡを発現して
おらず小集落は常にＥＢＭＡを発現している。連続的な
生育の間平板に撒くと大集落の数が増加することは、Ｓ
。
セレビシェに対するＥＢＭＡの負の生理的効果を反映し
ている。この負の効果は、発現に対して対抗する選択圧
となり、その結果大容量では最終的にポリペプチドの発
現が観察されなくなる。
ている。この負の効果は、発現に対して対抗する選択圧
となり、その結果大容量では最終的にポリペプチドの発
現が観察されなくなる。
これらのＩ察は、その発現が逆選択されたり酵母に対し
て有毒である、分泌系でプロセスされる異種Ｍ蛋白また
は蛋白の発現に対するＰＧＡＬ−１０ＭＦα１の利用を
際だたせる。
て有毒である、分泌系でプロセスされる異種Ｍ蛋白また
は蛋白の発現に対するＰＧＡＬ−１０ＭＦα１の利用を
際だたせる。
本分野の熟練者にとって、区別がつかないような様式で
機能する制御可能なＧＡＬ１０プロモーターまたはＧＡ
ＬＬ、ＧＡＬ２．ＧＡＬ７またはＭＥＬＩプロモーター
が、該組換え蛋白の合成が開始する前すなわち宿主に対
する負の効果が最小であるときに、組替え体Ｓ．セレビ
シエ培養の生育を生産規模容量にまで大規模化させ得る
ことは自明である。さらに１本分野の熟練者にとって、
ガラクトース以外の手段によって生理的に誘導可能な他
のプロモーターを含む発現ベクターが、アルファ接合因
子プレ−プローリーダーに連結された異種蛋白の発現を
支持するのに利用されることは自明である０本分野の熟
練者にとって、最大収率を得るための培養収穫時を至適
化する目的でこの系における異種蛋白の発現を検定する
ために、例えばウェスタンプロットまたはラジオイムノ
アッセイのような適当な検定法が利用されるべきである
ことは自明である。
機能する制御可能なＧＡＬ１０プロモーターまたはＧＡ
ＬＬ、ＧＡＬ２．ＧＡＬ７またはＭＥＬＩプロモーター
が、該組換え蛋白の合成が開始する前すなわち宿主に対
する負の効果が最小であるときに、組替え体Ｓ．セレビ
シエ培養の生育を生産規模容量にまで大規模化させ得る
ことは自明である。さらに１本分野の熟練者にとって、
ガラクトース以外の手段によって生理的に誘導可能な他
のプロモーターを含む発現ベクターが、アルファ接合因
子プレ−プローリーダーに連結された異種蛋白の発現を
支持するのに利用されることは自明である０本分野の熟
練者にとって、最大収率を得るための培養収穫時を至適
化する目的でこの系における異種蛋白の発現を検定する
ために、例えばウェスタンプロットまたはラジオイムノ
アッセイのような適当な検定法が利用されるべきである
ことは自明である。
サツカロミセス属は種々の種からなっている０種々の異
種ポリペプチドの組換えＤＮＡ−仲介発現のための宿主
として最も普通に利用されているのは、サン力ロミセス
セレビシェ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、あるいはパン酵母、である、しかし
サツカロミセス属の他の種の間の区別は常に明確である
とは限らない、これら種の多くはＳ．セレビシエと交配
可能であり、Ｓ．セレビシエ中のものと類似または同一
の、ＧＡＬｌｏのような、制御可能なプロモーターを有
するようである。
種ポリペプチドの組換えＤＮＡ−仲介発現のための宿主
として最も普通に利用されているのは、サン力ロミセス
セレビシェ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、あるいはパン酵母、である、しかし
サツカロミセス属の他の種の間の区別は常に明確である
とは限らない、これら種の多くはＳ．セレビシエと交配
可能であり、Ｓ．セレビシエ中のものと類似または同一
の、ＧＡＬｌｏのような、制御可能なプロモーターを有
するようである。
それゆえ、本分野の熟練者にとって、その発現が負に制
御されているかまたはＳ．セレビシエにたいして有毒で
ある、分泌系によりプロセスされる異種糖蛋白または蛋
白の制御可能な発現のために、宿主株の選択がカルスベ
ルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、 ウバ
ルム（ｕｖａｒｕｍ）、ルクシ（ｒｏｕｘｉｉ）、モン
タナス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、クルベリ （ｋｌｕｙｖ
ｅｒｉ） 、二ロンギスポラス （ｅｌｏｎｇｉｓｐｏ
ｒｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、オビ
フオルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ） 。
御されているかまたはＳ．セレビシエにたいして有毒で
ある、分泌系によりプロセスされる異種糖蛋白または蛋
白の制御可能な発現のために、宿主株の選択がカルスベ
ルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、 ウバ
ルム（ｕｖａｒｕｍ）、ルクシ（ｒｏｕｘｉｉ）、モン
タナス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、クルベリ （ｋｌｕｙｖ
ｅｒｉ） 、二ロンギスポラス （ｅｌｏｎｇｉｓｐｏ
ｒｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、オビ
フオルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ） 。
およびジアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）を含
みそれに限定されない他の種にまで拡張されることは自
明であろう。
みそれに限定されない他の種にまで拡張されることは自
明であろう。
ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａン、カンヂダ（Ｃａｎ
−ｄｉｄａ）、 トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のようないくつかの酵
母属は、生育のためにメタノールを唯一炭素源として利
用するための同様な代謝系を含むことが知られている。
−ｄｉｄａ）、 トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のようないくつかの酵
母属は、生育のためにメタノールを唯一炭素源として利
用するための同様な代謝系を含むことが知られている。
この代謝系に関与する酵素の一つであるアルコールオキ
シダーゼの遺伝子は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）から単離されている。Ｐ、パスト
リスのアルコールオキシダーゼ プロモーターが単離さ
れ、誘導がメタノール感受性であることが示された。こ
のプロモーターは発現ベクター上におかれ、そこで近傍
にクローンされた異種遺伝子の発現を促進することが示
された。そのような誘導可能なプロモーターは、ＥＢＭ
Ａのような発現が逆選択されるペプチドまたはポリペプ
チドの酵母中での発現のために有用である。アルファ接
合因子のプレ−プローリーダー配列は、Ｓ．セレビシエ
中のリーダー配列の一例に過ぎない、第一次翻訳産物を
糖付加系の横断のための粗面小胞体中へ向けるそのよう
なリーダー配列は、全ての研究された真核細胞中に認め
られている。ＥＢＭＡ遺伝子の翻訳産物がウィルス感染
した細胞中および組換え酵母中で糖付加されるのは、プ
レ−リーダー配列の存在によるのである。ブローリーダ
ー配列は、第一次翻訳産物を粗面小胞体に向けるのに必
要とされない１本分野の熟練者にとって自明であるよう
に、この配列は適当な制限エンドヌクレアーゼの利用そ
して／またはプレ−リーダー配列だけのオリゴヌクレオ
チド合成により欠失され得る。従って、本分野の熟練者
にとって、ＥＢＭＡの発現および糖付加のための適当な
プロモーターおよびプレ−リーダー配列を利用するとい
う考えが、適当な酵母宿主域としてピキア、カンヂダ、
ハンセヌラ、トルロプシス、クルベロミセス（にｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびサツカロミコプシス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属からの種を含みそ
れに限定されないサツカロミセス科およびクリプトコカ
ス科からの酵母種にまで拡張することは自明である。
シダーゼの遺伝子は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）から単離されている。Ｐ、パスト
リスのアルコールオキシダーゼ プロモーターが単離さ
れ、誘導がメタノール感受性であることが示された。こ
のプロモーターは発現ベクター上におかれ、そこで近傍
にクローンされた異種遺伝子の発現を促進することが示
された。そのような誘導可能なプロモーターは、ＥＢＭ
Ａのような発現が逆選択されるペプチドまたはポリペプ
チドの酵母中での発現のために有用である。アルファ接
合因子のプレ−プローリーダー配列は、Ｓ．セレビシエ
中のリーダー配列の一例に過ぎない、第一次翻訳産物を
糖付加系の横断のための粗面小胞体中へ向けるそのよう
なリーダー配列は、全ての研究された真核細胞中に認め
られている。ＥＢＭＡ遺伝子の翻訳産物がウィルス感染
した細胞中および組換え酵母中で糖付加されるのは、プ
レ−リーダー配列の存在によるのである。ブローリーダ
ー配列は、第一次翻訳産物を粗面小胞体に向けるのに必
要とされない１本分野の熟練者にとって自明であるよう
に、この配列は適当な制限エンドヌクレアーゼの利用そ
して／またはプレ−リーダー配列だけのオリゴヌクレオ
チド合成により欠失され得る。従って、本分野の熟練者
にとって、ＥＢＭＡの発現および糖付加のための適当な
プロモーターおよびプレ−リーダー配列を利用するとい
う考えが、適当な酵母宿主域としてピキア、カンヂダ、
ハンセヌラ、トルロプシス、クルベロミセス（にｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびサツカロミコプシス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属からの種を含みそ
れに限定されないサツカロミセス科およびクリプトコカ
ス科からの酵母種にまで拡張することは自明である。
以下の実施例は、本発明を説明するがそれだけに限定す
るものではない、以下の実施例中に指摘されている各参
照の開示は、ここに参考として取り入れられている。
るものではない、以下の実施例中に指摘されている各参
照の開示は、ここに参考として取り入れられている。
実施例 １
アルファ 合因子 ベクターの調製
アルファ接合因子遺伝子ＭＦα１がＳ．セレビシエ ゲ
ノムＤＮＡからプラスミド上にクローンされているプラ
スミド ＰＫＨ２は。
ノムＤＮＡからプラスミド上にクローンされているプラ
スミド ＰＫＨ２は。
カージャン（Ｋｕｒｊａｎ）ほか（セル（Ｃａｌｌ）第
３０巻＝９３３頁（１９８２年））およびサイン（Ｓｉ
ｎｇｈ）ほか（ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第１１
巻：４０４９頁（１９８３年））の方法に従って調製さ
れた。できたプラスミドｐＫＨ２がＥｃｏＲＩで消化さ
れ、アルファ接合因子遺伝子を運んでいる１、７ ｋ
ｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精製さ
れた（第１図上段）、プラスミドｐＲＪ１４８（Ｈｉｎ
ｄＩＵを欠いた修飾ｐＢＲ３２２）がＥｃｏＲＩで消化
され、その１．７ ｋｂｐ断片と連結されてプラスミ
ドｐ ＲＪ １５９を与えた（第１図、中段）、このＤ
ＮＡはＨｉｎｄ■で消化され、 自己連結されてプラス
ミドｐＲＪ１６７を形成した。これは今や唯一のＨｉｎ
ｄｎ［部位を有する（第１図、下段）、プラスミドｐＲ
Ｊ１６７はＨｉ ｎ ｄ ｍで消化され１合成オリゴヌ
クレオチド アダプターの挿入により修飾され、プロモ
ーターおよびプレ−プローリーダーの３′側でかつ全３
種の読み取り枠での翻訳終結シグナルの５′側に唯一の
Ｈｉｎｄｍ部位を含んでいる新プラスミド（ｐＲＪ１７
８）を与える（第１図、下段）。そのＨｉ ｎ ｄ ｍ
部位は、Ｈｉ ｎ ｄ ｍによる消化、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノフ断片による平滑末端化、ＢａｍＨＩリ
ンカ−の添加および自己連結で、プラスミドｐＪＣ１９
３を形成することによってＢ ａ ｍ ＨＩ部位に変換
された（第２図、上段）、このプラスミドはＥ ｃ ｏ
ＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断
片により平滑末端化され、ＢｃｌＩリンカ−の添加によ
り修飾され、ＢｃｌＩにより消化され、アルファ接合因
子遺伝子を運ぶ１．４ ｋｂｐ断片が調製用ゲル電気
泳動により単離された（第２図、中段）、こうして出来
たＢｃｌＩ断片は次いでｐ Ｃ１／ １の唯一のＢ ａ
ｍ ＨＩ部位中に挿入され、その過程で元来のＢａｍ
ＨＩ部位を破壊した（プラスミドｐＪｃ１９４：第２図
、下段）、このＤＮＡは、過剰なりａｍＨＩリンカ−を
除くためにＢ ａ ｍ ＨＩで消化され自己連結された
（第２図、下段）、その結果、以下の顕著な性質を有す
る新たなアルファ接合因子発現プラスミド（ｐＪｃ１９
７）が創られた： （１）Ｅ、コリ中でのプラスミド
の選択（ｂ ｌ ａ遺伝子）および増幅（ｏｒｉ）のた
めのＥ、コリ由来の配列、（２）Ｓ．セレビシエ中での
プラスミドの選択（Ｌ Ｅ Ｕ ２）および増幅（２−
ミクロンＤＮＡ）のためのＳ。
３０巻＝９３３頁（１９８２年））およびサイン（Ｓｉ
ｎｇｈ）ほか（ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第１１
巻：４０４９頁（１９８３年））の方法に従って調製さ
れた。できたプラスミドｐＫＨ２がＥｃｏＲＩで消化さ
れ、アルファ接合因子遺伝子を運んでいる１、７ ｋ
ｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精製さ
れた（第１図上段）、プラスミドｐＲＪ１４８（Ｈｉｎ
ｄＩＵを欠いた修飾ｐＢＲ３２２）がＥｃｏＲＩで消化
され、その１．７ ｋｂｐ断片と連結されてプラスミ
ドｐ ＲＪ １５９を与えた（第１図、中段）、このＤ
ＮＡはＨｉｎｄ■で消化され、 自己連結されてプラス
ミドｐＲＪ１６７を形成した。これは今や唯一のＨｉｎ
ｄｎ［部位を有する（第１図、下段）、プラスミドｐＲ
Ｊ１６７はＨｉ ｎ ｄ ｍで消化され１合成オリゴヌ
クレオチド アダプターの挿入により修飾され、プロモ
ーターおよびプレ−プローリーダーの３′側でかつ全３
種の読み取り枠での翻訳終結シグナルの５′側に唯一の
Ｈｉｎｄｍ部位を含んでいる新プラスミド（ｐＲＪ１７
８）を与える（第１図、下段）。そのＨｉ ｎ ｄ ｍ
部位は、Ｈｉ ｎ ｄ ｍによる消化、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノフ断片による平滑末端化、ＢａｍＨＩリ
ンカ−の添加および自己連結で、プラスミドｐＪＣ１９
３を形成することによってＢ ａ ｍ ＨＩ部位に変換
された（第２図、上段）、このプラスミドはＥ ｃ ｏ
ＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断
片により平滑末端化され、ＢｃｌＩリンカ−の添加によ
り修飾され、ＢｃｌＩにより消化され、アルファ接合因
子遺伝子を運ぶ１．４ ｋｂｐ断片が調製用ゲル電気
泳動により単離された（第２図、中段）、こうして出来
たＢｃｌＩ断片は次いでｐ Ｃ１／ １の唯一のＢ ａ
ｍ ＨＩ部位中に挿入され、その過程で元来のＢａｍ
ＨＩ部位を破壊した（プラスミドｐＪｃ１９４：第２図
、下段）、このＤＮＡは、過剰なりａｍＨＩリンカ−を
除くためにＢ ａ ｍ ＨＩで消化され自己連結された
（第２図、下段）、その結果、以下の顕著な性質を有す
る新たなアルファ接合因子発現プラスミド（ｐＪｃ１９
７）が創られた： （１）Ｅ、コリ中でのプラスミド
の選択（ｂ ｌ ａ遺伝子）および増幅（ｏｒｉ）のた
めのＥ、コリ由来の配列、（２）Ｓ．セレビシエ中での
プラスミドの選択（Ｌ Ｅ Ｕ ２）および増幅（２−
ミクロンＤＮＡ）のためのＳ。
セレビシェ由来の配列、（３）酵母アルファ接合因子プ
ロモーター、（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向ける酵
母アルファ接合因子プレ−プローリーダー、（５）Ｎ−
グリコジル化シグナル配列をコードし、ＫＥＸ２および
ＳＴＥ １３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂さ
れる酵母アルファ接合因子ブローリーダー（シュリアス
（Ｊｕｌｉｕｓ）ほか、セル第３２巻：８３９頁（１９
８３年）：シュリアスほか、セル第３７巻：１０７５頁
（１９８４年））、（６）発現されるべき異種ポリペプ
チドのクローン化のための唯一のＢ ａ ｍ ＨＩ部位
、（７）全読み取り枠における翻訳終結配列、（８）転
写終結配列。
ロモーター、（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向ける酵
母アルファ接合因子プレ−プローリーダー、（５）Ｎ−
グリコジル化シグナル配列をコードし、ＫＥＸ２および
ＳＴＥ １３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂さ
れる酵母アルファ接合因子ブローリーダー（シュリアス
（Ｊｕｌｉｕｓ）ほか、セル第３２巻：８３９頁（１９
８３年）：シュリアスほか、セル第３７巻：１０７５頁
（１９８４年））、（６）発現されるべき異種ポリペプ
チドのクローン化のための唯一のＢ ａ ｍ ＨＩ部位
、（７）全読み取り枠における翻訳終結配列、（８）転
写終結配列。
実施例 ２
該ＥＢＭＡ蛋白は、ウィルスによりコードされる３５０
，０００ダルトンおよび２２０，０００ダルトンの糖蛋
白を表す（クオリテール（Ｑａｕｌ−ｔｉａｒｅ）ほか
、 ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） 第１０２巻＝
３６０頁（１９８４年））１両蛋白の構造遺伝子は同一
で、Ｂ ａ ｍ ＨＩ −Ｌゲノム性ＤＮＡ断片中に総
て含まれている（ハメル（Ｈｕｓ＋ｍｅｌ）ほか、ジャ
ーナルオブビロロジ−（Ｊ 、 Ｖｉｒｏｌ、）第４９
巻： ４１３頁（１９８４年））、そのＢ ａ ｍ Ｈ
Ｉ −Ｌ断片を運ぶＢ−６８’プラスミドはＸｈｏｌｌ
および５ｃａＩで消化され、ＥＢＭＡ構造遺伝子配列を
含む２．５ ｋｂｐ断片はＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノフ断片により平滑末端化され、調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製された（第３図、上段）。アルフ
ァ接合因子ベクターＰＪＣ１９７はＢ ａ ｍ ＨＩで
消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ断片により
平滑末端化された。該ＥＢＭＡ断片は、ベクターに平滑
末端連結された（第３図、下段）。
，０００ダルトンおよび２２０，０００ダルトンの糖蛋
白を表す（クオリテール（Ｑａｕｌ−ｔｉａｒｅ）ほか
、 ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） 第１０２巻＝
３６０頁（１９８４年））１両蛋白の構造遺伝子は同一
で、Ｂ ａ ｍ ＨＩ −Ｌゲノム性ＤＮＡ断片中に総
て含まれている（ハメル（Ｈｕｓ＋ｍｅｌ）ほか、ジャ
ーナルオブビロロジ−（Ｊ 、 Ｖｉｒｏｌ、）第４９
巻： ４１３頁（１９８４年））、そのＢ ａ ｍ Ｈ
Ｉ −Ｌ断片を運ぶＢ−６８’プラスミドはＸｈｏｌｌ
および５ｃａＩで消化され、ＥＢＭＡ構造遺伝子配列を
含む２．５ ｋｂｐ断片はＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノフ断片により平滑末端化され、調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製された（第３図、上段）。アルフ
ァ接合因子ベクターＰＪＣ１９７はＢ ａ ｍ ＨＩで
消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ断片により
平滑末端化された。該ＥＢＭＡ断片は、ベクターに平滑
末端連結された（第３図、下段）。
この組換えプラスミド（ｐＹＥＢＶ−１）は、Ｓ．セレ
ビシエＬＨ８６８株（本株は１本発明の属する技術の分
野における通常の知識を有する者によりよく知られてお
り容易に入手できるものである。）（ＤＣ６（ＭＡＴα
。
ビシエＬＨ８６８株（本株は１本発明の属する技術の分
野における通常の知識を有する者によりよく知られてお
り容易に入手できるものである。）（ＤＣ６（ＭＡＴα
。
１ｅｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ、ｇａ１２）とも呼ばれ
る；カージャンほか、同）に導入され、形質転換クロー
ンが選択され増幅された。
る；カージャンほか、同）に導入され、形質転換クロー
ンが選択され増幅された。
溶菌液が調製され、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動されニトロセルロースにウェスタンプロットされた。
動されニトロセルロースにウェスタンプロットされた。
１７５，０００および３５０．０００ダルトンの面
精蛋白は、それらが形質転換体にのみ存在すること、そ
れらがエプスタイン−パールウィルス回復期ヒト血清お
よびＥＢＭＡ−特異的モツクローナル抗体（クオリテー
ルほか、プロシージングスオブザナショナルアカデミー
オブサイエンスＵＳＡ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
精蛋白は、それらが形質転換体にのみ存在すること、そ
れらがエプスタイン−パールウィルス回復期ヒト血清お
よびＥＢＭＡ−特異的モツクローナル抗体（クオリテー
ルほか、プロシージングスオブザナショナルアカデミー
オブサイエンスＵＳＡ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ）第７９巻：６１６頁（１９８２年））と反応す
ること、および集積した陰性ヒト血清と反応しないこと
、からＥＢＭＡに特異的であると認められた。ｐＹＥＢ
Ｖ−１形質転換体の生育が１０ミリリットル以上の体積
で試みられたどの場合においても、ＥＢＭＡの発現は検
出されなかった。初期には選択培地平版に撒かれると培
養は基本的に小集落のみを与えたが、細胞が液体培養に
おける生育の間に平板に撒かれると、非形質転換対照と
同じ大きさの大集落の数が相対的に増加することが認め
られた。集落の大きさが大きいことは、細胞の生育が小
集落のものより早いことを反映していた。ウェスタンプ
ロットが形質転換体の大および小集落についてなされた
ところ、大集落は常にＥＢＭＡを発現しておらず、小集
落は常にＥＢＭＡを発現していた。
ること、および集積した陰性ヒト血清と反応しないこと
、からＥＢＭＡに特異的であると認められた。ｐＹＥＢ
Ｖ−１形質転換体の生育が１０ミリリットル以上の体積
で試みられたどの場合においても、ＥＢＭＡの発現は検
出されなかった。初期には選択培地平版に撒かれると培
養は基本的に小集落のみを与えたが、細胞が液体培養に
おける生育の間に平板に撒かれると、非形質転換対照と
同じ大きさの大集落の数が相対的に増加することが認め
られた。集落の大きさが大きいことは、細胞の生育が小
集落のものより早いことを反映していた。ウェスタンプ
ロットが形質転換体の大および小集落についてなされた
ところ、大集落は常にＥＢＭＡを発現しておらず、小集
落は常にＥＢＭＡを発現していた。
連続的な生育の間平板に撒くと大集落の数が増加するこ
とは、Ｓ．セレビシエに対するＥＢＭＡの負の生理的効
果を反映していた。この負の効果は、発現に対して対抗
する選択圧となり、その結果１０ミリリットル以上の容
量で最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
とは、Ｓ．セレビシエに対するＥＢＭＡの負の生理的効
果を反映していた。この負の効果は、発現に対して対抗
する選択圧となり、その結果１０ミリリットル以上の容
量で最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
実施例 ３
アルファ接合因子発現ベクターｐＪｃ１９７が５ａｌＩ
で消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片で平
滑末端化されＰｓｔＩで消化された。０．３５ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により単離され
た；この断片はアルファ接合因子プレ−プローリーダー
配列の大部分、ＢａｍＨＩクローン化部位、上部位全３
読み取り枠における翻訳終結シグナルを含んでいた（第
４図、上段）。
で消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片で平
滑末端化されＰｓｔＩで消化された。０．３５ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により単離され
た；この断片はアルファ接合因子プレ−プローリーダー
配列の大部分、ＢａｍＨＩクローン化部位、上部位全３
読み取り枠における翻訳終結シグナルを含んでいた（第
４図、上段）。
Ｅ、コリーＳ．セレビシエ シャトルベクターＹＥｐ５
１（ブローチ（Ｂ ｒｏａｃｈ）ほか、遺伝子発現の実
験操作（Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉ−ｐｕ
Ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）中、８３頁、アカデミツク プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３年））は、
酵母ＧＡＬＩＯ遺伝子プロモーター配列を含む、このＤ
ＮＡはＢｃｌＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノフ断片により平滑末端化されそして５ａｌＩで消化
された。６．３ ｋｂｐ断片が！！１ｉｌＩＩｌ用ゲ
ル電気泳動により単離された（第４図、上段）、 ３
５ｂｐ ５ａｌＩ−Ｐｓｔ Ｉ合成オリゴヌクレオチド
アダプターが合成され、以下の構造を有した ＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡτＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴ
ＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＡＣ
ＴＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧ。
１（ブローチ（Ｂ ｒｏａｃｈ）ほか、遺伝子発現の実
験操作（Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉ−ｐｕ
Ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）中、８３頁、アカデミツク プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３年））は、
酵母ＧＡＬＩＯ遺伝子プロモーター配列を含む、このＤ
ＮＡはＢｃｌＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノフ断片により平滑末端化されそして５ａｌＩで消化
された。６．３ ｋｂｐ断片が！！１ｉｌＩＩｌ用ゲ
ル電気泳動により単離された（第４図、上段）、 ３
５ｂｐ ５ａｌＩ−Ｐｓｔ Ｉ合成オリゴヌクレオチド
アダプターが合成され、以下の構造を有した ＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡτＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴ
ＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＡＣ
ＴＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧ。
このアダプターはアルファ接合因子遺伝子の非翻訳リー
ダーおよびＡＴＧの１１塩基対およびアルファ接合因子
プレ−プローリーダーの最初の８アミノ酸を含む（第４
図、上段）。
ダーおよびＡＴＧの１１塩基対およびアルファ接合因子
プレ−プローリーダーの最初の８アミノ酸を含む（第４
図、上段）。
６．３ ｋｂｐ、０．３５ ｋｂｐ および３５
ｂｐ断片はともに連結され、新たな発現プラスミド、ｐ
ＧＡＬｌｏ−ＭＦα１を創った（第４図、下段）、この
ベクターの顕著な側面は＝（１）Ｅ、：Ｉり由来の選択
（ｂｌａ）およびＥ。
ｂｐ断片はともに連結され、新たな発現プラスミド、ｐ
ＧＡＬｌｏ−ＭＦα１を創った（第４図、下段）、この
ベクターの顕著な側面は＝（１）Ｅ、：Ｉり由来の選択
（ｂｌａ）およびＥ。
コリ中でのプラスミドの増幅（ｏｒｉ）のための配列、
（２）Ｓ．セレビシエ−由来の選択（ＬＥＵ２）および
Ｓ．セレビシエ中でのプラスミドの増幅（２ミクロンＤ
ＮＡ）のための配列、（３）酵母ＧＡＬ１０プロモータ
ー、（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向け、るための酵
母アルファ接合因子プレ−リーダー、（５）Ｎ−グリコ
ジル化シグナル配列を コードし、ＫＥＸ２および５Ｔ
Ｅ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂される酵
母アルファ接合因子ブロー リーダー（シュリアス（Ｊ
ｕｌｉｕｓ）ほか、同（１９８３年）；シュリアスほか
、同（１９８４年））、（６）発現されるべき異種ペプ
チドまたはポリペプチドのクローニングのための唯一の
ＢａｍＨ１部位、（７）全３種の読み取り枠における翻
訳終結シグナル、そして（８）転写終結配列である。
（２）Ｓ．セレビシエ−由来の選択（ＬＥＵ２）および
Ｓ．セレビシエ中でのプラスミドの増幅（２ミクロンＤ
ＮＡ）のための配列、（３）酵母ＧＡＬ１０プロモータ
ー、（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向け、るための酵
母アルファ接合因子プレ−リーダー、（５）Ｎ−グリコ
ジル化シグナル配列を コードし、ＫＥＸ２および５Ｔ
Ｅ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）により解裂される酵
母アルファ接合因子ブロー リーダー（シュリアス（Ｊ
ｕｌｉｕｓ）ほか、同（１９８３年）；シュリアスほか
、同（１９８４年））、（６）発現されるべき異種ペプ
チドまたはポリペプチドのクローニングのための唯一の
ＢａｍＨ１部位、（７）全３種の読み取り枠における翻
訳終結シグナル、そして（８）転写終結配列である。
実施例 ４
ＥＢＭＡ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｌ ＤＮＡ断片を
運んでいるＢ−６８’ プラスミドがＸ ｈ ｏ■およ
び５ｃａＩで消化され、ＥＢＭＡ構造遺伝子を含む２．
５ ｋｂｐ断片がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断
片により平滑末端化された（第５図、上段）６発現ベク
ター ｐ Ｇ Ａ Ｌ １０− Ｍ Ｆ ａ １はＢａ
ｍＨＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ断
片で平滑末端化された。該２．５ ｋｂｐ ＥＢＭＡ断
片はベクターに連結された。この組換えプラスミドｐＹ
ＥＢＶ−２（第５図、下段）ハ、Ｓ、セレビシよりＣ０
４株（本株は、本発明の属する技術の分野における通常
の知識を有するものによりよく知られたものであり容易
に入手できる＊ ）（ＭＡＴａ、１ｅｕ２−０４゜ａｄ
ａｌ）に導入され（ブローチ（Ｂ ｒｏａｃｈ）ほか、
セル２１巻：５０１頁（１９８０年））。
運んでいるＢ−６８’ プラスミドがＸ ｈ ｏ■およ
び５ｃａＩで消化され、ＥＢＭＡ構造遺伝子を含む２．
５ ｋｂｐ断片がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断
片により平滑末端化された（第５図、上段）６発現ベク
ター ｐ Ｇ Ａ Ｌ １０− Ｍ Ｆ ａ １はＢａ
ｍＨＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノフ断
片で平滑末端化された。該２．５ ｋｂｐ ＥＢＭＡ断
片はベクターに連結された。この組換えプラスミドｐＹ
ＥＢＶ−２（第５図、下段）ハ、Ｓ、セレビシよりＣ０
４株（本株は、本発明の属する技術の分野における通常
の知識を有するものによりよく知られたものであり容易
に入手できる＊ ）（ＭＡＴａ、１ｅｕ２−０４゜ａｄ
ａｌ）に導入され（ブローチ（Ｂ ｒｏａｃｈ）ほか、
セル２１巻：５０１頁（１９８０年））。
そして形質転換したクローンが選択され増幅された。細
胞はグリセロール−乳酸中で１０リツトル容まで生育さ
せられ、その間ウェスタンプロットで検出し得るＥＢＭ
Ａの合成はなかった。培養が対数増殖初期に達したとき
、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ）に添加された。
胞はグリセロール−乳酸中で１０リツトル容まで生育さ
せられ、その間ウェスタンプロットで検出し得るＥＢＭ
Ａの合成はなかった。培養が対数増殖初期に達したとき
、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ）に添加された。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解された溶菌
液のウェスタンプロットでの診断によると、ＥＢＭＡの
合成はガラクトースの添加後４時間以内に先ず検出可能
となり、４８時間で最大となりそして９６時間で消失し
た。
液のウェスタンプロットでの診断によると、ＥＢＭＡの
合成はガラクトースの添加後４時間以内に先ず検出可能
となり、４８時間で最大となりそして９６時間で消失し
た。
第１図は、プラスミドｐＲＪ１７８の構築を説明する模
式図である。 第２図は、プラスミドｐ Ｊ Ｃ１９７の構築を説明す
る模式図である。 第３図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−１の構築を説明する
模式図である。 第４図は、プラスミドｐＧＡＬ１０−ＭＦα１の構築を
説明する模式図である。 第５図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−２の構築を説明する
模式図である。 ００口 １ヨＯ 日日０９層目１０矩
式図である。 第２図は、プラスミドｐ Ｊ Ｃ１９７の構築を説明す
る模式図である。 第３図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−１の構築を説明する
模式図である。 第４図は、プラスミドｐＧＡＬ１０−ＭＦα１の構築を
説明する模式図である。 第５図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−２の構築を説明する
模式図である。 ００口 １ヨＯ 日日０９層目１０矩
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｅ．コリ中での選択および増殖のた めのＥ．コリ由来のＤＮＡ配列、クリプトコカスおよび
サッカロミセス科の種中でのプラスミドの選択および増
殖のための酵母由来の配列、酵母の制御可能なプロモー
ターＤＮＡ配列、プレ−またはプレ−プロ−リーダー配
列、少なくとも一つの読み取り枠のための翻訳終結配列
、酵母転写終結配列、および宿主中で発現すると宿主に
とって有害である既に決定されたペプチドまたはポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を挿入するための唯一の
制限エンドスクレアーゼクローン化部位、を含むプラス
ミド発現ベクター。 ２、既に決定されているペプチドまたは ポリペプチド配列が、サッカロミセスまたはクリプトコ
カス科の種である宿主中で発現されると有害である、特
許請求の範囲第１項によるプラスミド発現ベクター。 ３、エブスタイン−バールウイルス膜抗 原（ｇｐ３５０／ｇｐ２２０）をコードするＤＮＡの配
列を有する、特許請求の範囲第２項によるプラスミド発
現ベクター。 ４、プレ−リーダーまたはプレ−プロ− リーダー配列が、アルファ接合因子遺伝子から由来する
、特許請求の範囲第２項によるプラスミド発現ベクター
。 ５、制御可能なプロモーターが、ＧＡＬ １、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０またはＭＥＬ１で
ある、特許請求の範囲第２項によるプラスミド発現ベク
ター。 ６、特許請求の範囲第２項によるプラス ミド発現ベクターにより形質転換された、サッカロミセ
スまたはクリプトコカス科の種。 ７、（１）該科の種の細胞を特許請求の 範囲第２項によるプラスミドで形質転換する、（２）形
質転換した細胞を培養する、そして（３）培養した細胞
から蛋白を回収する、ことからなる、サッカロミセスま
たはクリプトコカス科の種である宿主中で発現されると
有害である、既に決定されているペプチドまたはポリペ
プチドを得るための方法。 ８、種がサッカロミセス属のものである、 特許請求の範囲第７項による方法。 ９、種がＳ．セレビシエである、特許請 求の範囲第７項による方法。 １０、既に決定されているペプチドまたは ポリペプチドが、エブスタイン−バールウイルス膜抗原
（ｇｐ３５０／ｇｐ２２０）である、特許請求の範囲第
７項による方法。 １１、種がサッカロミセス属のものである、特許請求の
範囲第１０項による方法。 １２、種がＳ．セレビシエである、特許請 求の範囲第１０項による方法。 １３、プラスミドが、エブスタイン−バー ルウイルス膜抗原の発現を糖付加型でおこなわせる、特
許請求の範囲第１０項による方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83550686A | 1986-02-28 | 1986-02-28 | |
| US835506 | 1986-02-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62253384A true JPS62253384A (ja) | 1987-11-05 |
Family
ID=25269678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62044152A Pending JPS62253384A (ja) | 1986-02-28 | 1987-02-28 | 酵母における組換え蛋白の制御可能な発現 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0234871A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62253384A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011099263A1 (ja) * | 2010-02-09 | 2011-08-18 | 国立大学法人山口大学 | クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
| CA1324969C (en) | 1988-05-06 | 1993-12-07 | Jeffrey R. Shuster | High level expression of proteins in yeast |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3382547D1 (de) * | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| ATE95236T1 (de) * | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| JPS59227899A (ja) * | 1983-05-25 | 1984-12-21 | チロン・コ−ポレイシヨン | 成長ホルモン放出因子の製造方法 |
| US4707358A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | The University Of Chicago | Vaccine against Epstein-Barr Virus |
| JPS6156078A (ja) * | 1984-07-27 | 1986-03-20 | Suntory Ltd | 酵母を宿主とする分泌発現ベクタ− |
| DE3583564D1 (de) * | 1984-08-23 | 1991-08-29 | Hans Joachim Wolf | Dna-sequenzen des ebv-genoms, rekombinante dna-molekuele, verfahren zur herstellung von ebv-verwandten antigenen sowie diagnostische zusammensetzungen und pharmazeutische zusammensetzungen, die die genannten antigene enthalten. |
| EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
| GB8613388D0 (en) * | 1986-06-03 | 1986-07-09 | Delta Biotechnology Ltd | Induction of galactose regulated gene expression in yeast |
-
1987
- 1987-02-19 EP EP87301443A patent/EP0234871A3/en not_active Withdrawn
- 1987-02-28 JP JP62044152A patent/JPS62253384A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011099263A1 (ja) * | 2010-02-09 | 2011-08-18 | 国立大学法人山口大学 | クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター |
| JP5804378B2 (ja) * | 2010-02-09 | 2015-11-04 | 国立大学法人山口大学 | クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0234871A3 (en) | 1988-10-12 |
| EP0234871A2 (en) | 1987-09-02 |
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