JPS62262995A - ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター - Google Patents
ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーターInfo
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- JPS62262995A JPS62262995A JP61107181A JP10718186A JPS62262995A JP S62262995 A JPS62262995 A JP S62262995A JP 61107181 A JP61107181 A JP 61107181A JP 10718186 A JP10718186 A JP 10718186A JP S62262995 A JPS62262995 A JP S62262995A
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- Japan
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- dna
- promoter
- cat
- human
- actin gene
- Prior art date
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- Granted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明はヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターおよび
それを用いる蛋白質の製造方法に関する。
それを用いる蛋白質の製造方法に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］
近年、組換ＤＮＡ技術の向上により動物細胞を宿主とす
る物質生産の技術が開発され、種々の物質の動物細胞に
よる生産が報告されている。
る物質生産の技術が開発され、種々の物質の動物細胞に
よる生産が報告されている。
そのような生産に用いられるプロモーターは５１ａｉａ
ｎ ｖｉｒｕｓ ４０ （以下、ＳＶ４０という）の
プロモーターあるいはチミジンキナーゼのプロモーター
などがあるが、これらのプロモーター活性のみでは発現
の程度は弱く、エンハンサ−との結合、増幅遺伝子との
結合などで生産性をあげる工夫がなされていた。
ｎ ｖｉｒｕｓ ４０ （以下、ＳＶ４０という）の
プロモーターあるいはチミジンキナーゼのプロモーター
などがあるが、これらのプロモーター活性のみでは発現
の程度は弱く、エンハンサ−との結合、増幅遺伝子との
結合などで生産性をあげる工夫がなされていた。
［問題点を解決するための手段］
本発明者らは、さらに高い活性を有するプロモーターを
検討した結果、ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
がＳＶ４０のプロモーターよりも高い活性があることを
見出し本発明を完成した。
検討した結果、ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
がＳＶ４０のプロモーターよりも高い活性があることを
見出し本発明を完成した。
アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白であり細胞の全
蛋白質中で最も含量が多く、その遺伝子は正常真核細胞
由来の遺伝子としては非常に強いプロモーター活性を有
すると考えられる。
蛋白質中で最も含量が多く、その遺伝子は正常真核細胞
由来の遺伝子としては非常に強いプロモーター活性を有
すると考えられる。
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターのＤＮＡはヒト
ＤＮＡからえられるが、ヒトＤＮＡは、たとえばヒト由
来の培養細胞を用いプリン（Ｂ１１ｎ）らの方法［Ｂ１
１ｎ、Ｎら（１９７６年）のユニクレイック アシッズ
リサーチ（ＮｕｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｃｓ、）３
巻、２３０３頁参照］を用いて調製される。
ＤＮＡからえられるが、ヒトＤＮＡは、たとえばヒト由
来の培養細胞を用いプリン（Ｂ１１ｎ）らの方法［Ｂ１
１ｎ、Ｎら（１９７６年）のユニクレイック アシッズ
リサーチ（ＮｕｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｃｓ、）３
巻、２３０３頁参照］を用いて調製される。
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターのクローニング
ベクターとしては、ｃｈａｒｏｎ ２８に代表されるλ
フアージベクター、ｐＢＲ３２２に代表されるプラスミ
ドベクターなどが利用できるが、一般的には高率で長鎖
のＤＮＡ断片をクローニングできるλフアージベクター
を用いる方法が用いられる。
ベクターとしては、ｃｈａｒｏｎ ２８に代表されるλ
フアージベクター、ｐＢＲ３２２に代表されるプラスミ
ドベクターなどが利用できるが、一般的には高率で長鎖
のＤＮＡ断片をクローニングできるλフアージベクター
を用いる方法が用いられる。
上記でえられたヒトＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、
λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し組換
えファージＤＮＡを作成する。
λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し組換
えファージＤＮＡを作成する。
つぎにインビトロパッケージングの手法を用いてファー
ジ粒子を作成し、宿主大腸菌とともにプレートにまき、
組換え型ファージプラークを形成させる［エンキストら
（１９７９年）のメソッズ イン エンザイモロジ−（
ＭｅｔｈＯｄＳ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｚｙ） 、８８
巻、 ２８１頁参照］。ヒトβ−アクチン遺伝子断片を
有する組換えファージのプラーク検出は、ｃＤＮＡや合
成りＮＡをプローブとするプラークハイブリダイゼーシ
ョン［ウーら（１９７９年）のメソッズ イン エンザ
イモロジー、６８巻、３８９頁、およびシスタックら（
１９７９年）の同４１７頁参照］が利用できる。
ジ粒子を作成し、宿主大腸菌とともにプレートにまき、
組換え型ファージプラークを形成させる［エンキストら
（１９７９年）のメソッズ イン エンザイモロジ−（
ＭｅｔｈＯｄＳ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｚｙ） 、８８
巻、 ２８１頁参照］。ヒトβ−アクチン遺伝子断片を
有する組換えファージのプラーク検出は、ｃＤＮＡや合
成りＮＡをプローブとするプラークハイブリダイゼーシ
ョン［ウーら（１９７９年）のメソッズ イン エンザ
イモロジー、６８巻、３８９頁、およびシスタックら（
１９７９年）の同４１７頁参照］が利用できる。
検出された組換えファージは回収後、宿主大腸菌ととも
に培養することにより大量に調製できる。また組換え型
ファージのＤＮＡはフェノール法などにより調製できる
。調製されたＤＮＡはマキサム・ギルバート法、Ｍ−１
３法などによって配列を決定することができ、それによ
ってプロモーター配列を有するか否かが決定できる。
に培養することにより大量に調製できる。また組換え型
ファージのＤＮＡはフェノール法などにより調製できる
。調製されたＤＮＡはマキサム・ギルバート法、Ｍ−１
３法などによって配列を決定することができ、それによ
ってプロモーター配列を有するか否かが決定できる。
またプロモーターの活性は、ヒトβ−アクチン遺伝子の
５”側頭域と原核細胞由来のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴという）遺伝子
との融合遺伝子を作成し、Ｌｔｋ−細胞に形質転換し、
生産されるＣＡＴの活性を調べることにより測定するこ
とができる〔ゴーマン（Ｇｏｒａ＋ａｎ）ら（１９８２
年）のモレキュラー アンド セルラー バイオロジー
（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ２巻、１０４４〜
１０５１頁参照］。
５”側頭域と原核細胞由来のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴという）遺伝子
との融合遺伝子を作成し、Ｌｔｋ−細胞に形質転換し、
生産されるＣＡＴの活性を調べることにより測定するこ
とができる〔ゴーマン（Ｇｏｒａ＋ａｎ）ら（１９８２
年）のモレキュラー アンド セルラー バイオロジー
（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、） ２巻、１０４４〜
１０５１頁参照］。
このようにしてえられたヒトβ−アクチン遺伝子のプロ
モーターは下記の配列を有していた。
モーターは下記の配列を有していた。
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７２
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ＧＧＡＴＧ 本プロモーターの特徴として、上記配列１番目付近のポ
リオーマウィルスのエンハンサ一様配列を含めた３カ所
のエンハンサ一様の塩基配列、上記配列２２０番目付近
のＴＡＴＡボックス以下に存在するＺ−ＤＮＡ構造をと
りうる塩基配列があることがあげられ、これらの配列が
゛β−アクチンプロモーターの活性に大きな影響を与え
ているものと考えられる。また該プロモーターは従来よ
り使用されている５Ｖ４Ｇのプロモーターよりも１．７
倍高い活性を有し、真核細胞由来のプロモーターとして
種々の蛋白質の生産に応用され有用性が高いものである
。
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り使用されている５Ｖ４Ｇのプロモーターよりも１．７
倍高い活性を有し、真核細胞由来のプロモーターとして
種々の蛋白質の生産に応用され有用性が高いものである
。
［実施例］
以下に実施例を示すが、本発明における諸実験は内閣総
理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」にしたがって
行なった。
理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」にしたがって
行なった。
実施例１
ヒトβ−アクチン遺伝子のクローニング（１）ヒトゲノ
ムライブラリーの作製 ヒトセルラインＯＵＴ−１４（Ｋａｋｕｎａｇａ 、
Ｔ、７８Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 ７５．１３３４頁）を１０
％ウシ胎児血清（以下、Ｆｅ２という）を含む、イーグ
ル最小必 ・須培地（イーグルＭＥＮ）で培養後、遠心
にて集め、イーグルＭＥＮで洗浄した。１０１０個のＨ
ＵＴ−１４を５０ｍ１の ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、 ０
．５％ザルコシル、 １００μｇ／ｍｌプロテアーゼに
の溶液に懸濁し、３時間振盪して溶解した。フェノール
抽出を３回行ない、水層を２０ｍＭ ）リス−１１ＣＩ
（ｐｉｔ ａ、ｏ＞、ｌＯａ＋Ｍ ＥＤＴＡ。
ムライブラリーの作製 ヒトセルラインＯＵＴ−１４（Ｋａｋｕｎａｇａ 、
Ｔ、７８Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 ７５．１３３４頁）を１０
％ウシ胎児血清（以下、Ｆｅ２という）を含む、イーグ
ル最小必 ・須培地（イーグルＭＥＮ）で培養後、遠心
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抽出を３回行ない、水層を２０ｍＭ ）リス−１１ＣＩ
（ｐｉｔ ａ、ｏ＞、ｌＯａ＋Ｍ ＥＤＴＡ。
１０ｍＭＮａｃｆに対し透析した。透析物を３７℃で３
．５時間リボヌクレアーゼ１００μｇ ／ ｍｌで処理
し、フェノール抽出後、２０ｍＭトリス−１１ｃ１（ｐ
ｔｌ ｓ、口）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ５１０ｄ Ｎａ
Ｃｌに対して透析し、高分子のヒトＤＮＡをえた。ヒト
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲｌで部分分解し、ショ糖密度
勾配遠心により約１５ｋｂの大きさのＥｃｏＲ１部分分
解断片を調製した。
．５時間リボヌクレアーゼ１００μｇ ／ ｍｌで処理
し、フェノール抽出後、２０ｍＭトリス−１１ｃ１（ｐ
ｔｌ ｓ、口）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ５１０ｄ Ｎａ
Ｃｌに対して透析し、高分子のヒトＤＮＡをえた。ヒト
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲｌで部分分解し、ショ糖密度
勾配遠心により約１５ｋｂの大きさのＥｃｏＲ１部分分
解断片を調製した。
ラムダファージベクターｃｈａｒｏｎ ４Ａ ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで切断後、ショ糖密度勾配遠心により左端断
片、右端断片を含む両分をそれぞれ集め、エタノール沈
澱により回収した。ヒトＬ５ｋｂ ＤＮＡＥｃｏＲＩ断
片と、ｃｈａｒｏｎ ４Ａの両端断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合後インビトロパッケージングを行ない、大腸
菌ＬＥ ３９２を宿主として組換えファージのプラーク
を形成させた。
ＥｃｏＲＩで切断後、ショ糖密度勾配遠心により左端断
片、右端断片を含む両分をそれぞれ集め、エタノール沈
澱により回収した。ヒトＬ５ｋｂ ＤＮＡＥｃｏＲＩ断
片と、ｃｈａｒｏｎ ４Ａの両端断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合後インビトロパッケージングを行ない、大腸
菌ＬＥ ３９２を宿主として組換えファージのプラーク
を形成させた。
（２）β−アクチン遺伝子のプロモーターの検出プラー
クハイブリダイゼーション法［ベンソンド（Ｂｅｎｔｈ
ｏｎｄ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ） （１９７７年
）のサイエンス、１９６巻、 １８０頁参照］により検
出した。コーティング領域のプローブとしてβ−アクチ
ン偽遺伝子［モント（Ｍｏｎｔｅ）ら（１９８３年）の
モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、３巻、１７８３〜１７９
１頁］のｌ１ｉｎｆ’ｌ ０Ｊｋｂ断片（プローブＩ）
、非翻訳領域のプローブとしてβ−アクチン偽遺伝子の
ｌ１ｉｎｆ’Ｉ Ｏ，２ｋｂ断片（プローブ■）をそれ
ぞれ″Ｐラベルしたものおよびβ−アクチン遺伝子の最
初の６個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列ＣＴＣＡＣ
ＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣを合成し Ｐ
ラベルしたもの（プローブ■）を用いた。
クハイブリダイゼーション法［ベンソンド（Ｂｅｎｔｈ
ｏｎｄ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ） （１９７７年
）のサイエンス、１９６巻、 １８０頁参照］により検
出した。コーティング領域のプローブとしてβ−アクチ
ン偽遺伝子［モント（Ｍｏｎｔｅ）ら（１９８３年）の
モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、３巻、１７８３〜１７９
１頁］のｌ１ｉｎｆ’ｌ ０Ｊｋｂ断片（プローブＩ）
、非翻訳領域のプローブとしてβ−アクチン偽遺伝子の
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ぞれ″Ｐラベルしたものおよびβ−アクチン遺伝子の最
初の６個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列ＣＴＣＡＣ
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ラベルしたもの（プローブ■）を用いた。
プローブＩおよびプローブ■の両方のプローブとハイブ
リダイズするクローンが２５株えられ、さらにプローブ
■を用いたばあい６５℃でフィルターを洗浄してもハイ
ブリダイズするクローンλＨａ１６０株１株かえられた
。
リダイズするクローンが２５株えられ、さらにプローブ
■を用いたばあい６５℃でフィルターを洗浄してもハイ
ブリダイズするクローンλＨａ１６０株１株かえられた
。
（３）ＤＮＡ配列の決定
λＨａ１６０のファージクローンを単離し、宿主大腸菌
ＬＥ−３９２とともに培養し、ファージ溶菌液をえた。
ＬＥ−３９２とともに培養し、ファージ溶菌液をえた。
遠心後上清をＳＤＳ処理し、酢酸カリウムを添加し、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡは制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、０．７％アガロースゲルにかけ
、サザーン法で確認、回収した。ＤＮＡを精製後、マキ
サム・ギルバート法によってプロモータ一部分のＤＮＡ
配列を決定 １した。その結果、塩基配列はつぎのとお
りであった。
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡは制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、０．７％アガロースゲルにかけ
、サザーン法で確認、回収した。ＤＮＡを精製後、マキ
サム・ギルバート法によってプロモータ一部分のＤＮＡ
配列を決定 １した。その結果、塩基配列はつぎのとお
りであった。
４０ Ｇ（ｌ
ｂ。
ｂ。
ＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ Ｃ
ＴＴＣＣＴＣＡＡＴ１６１＋
１７１１ ｌ８０ＧＣＧＧＧＧ
ＣＣＡＡ ＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧ ＣＣＧＴＴＣＣ
ＧＡＡＬｉＬ＋Ｌ＋１１ｊＬｉｌｊＬ；ＬｉＬ； Ｌ
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ｂｏｏ
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ＣＴ ＡＡＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＡＡ
ＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡ ＴＴＧＣＧＣＣＴＧＣ７３
１） ７４０
７り０ＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＴ
ＡＡＴＴＧＣＣＣＧＴ７６ｏ
フ７０
７ＪＯＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧ ＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧ
ＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧ７９０ ８０
０ ａｔＯＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧ
ＡＡＧＧＣＧＧＯＣＴ ＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧ
ＴＧＣ；ＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＧ
ＣＴＴａｇｏ ａω
ｔｎａＧＣＧＣＧＣＡＣＴＴ ＣＣＴＧＣＣ
ＣＧＡＧ ＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧ８８ｏ
８９ｏ ９ｏ。
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ＣＣＣＣＣＣＣ９／Ｉ） ９２０
９３０ＧＣＣＧＡＣＣＣＧＧ Ｃ
ＧＣＴＣＴＴＴＣＡ ＡＣＣＧＧＧＣＧＣＡ９４０
９．０ ９ωＧＧＣ
ＧＣ；ＧＧＣＴＧ ＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴ ＧＧＣ
ＡＩＣＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧ ＣＴＴＣＣ
ＴＧＣＩＪ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣｉＡＣＧＣＣ
ＴＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴ ＴＣＣＣＴＴＴＴＡＴ
ｒｏｚｏ ｒｏ４ｏＩＯＧＯＧＧ
ＴＡＡＴＡＡＣＧ ＣＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴ
ＣＣＴＴＴｒｏω １０１０
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ｌ１４０ＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧ ＣＧ
ＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＡＣＩＩ６０１１７
０ ＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧ ＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧ Ｃ
ＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧ 実施例２ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターによるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡ
Ｔ遺伝子）の発現 ＣＡＴ遺伝子のβ−アクチン遺伝子のプロモーターへの
結合は以下のようにして行なった。
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フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡ
Ｔ遺伝子）の発現 ＣＡＴ遺伝子のβ−アクチン遺伝子のプロモーターへの
結合は以下のようにして行なった。
実施例１で単離したＤＮＡを第１図に示すように制限酵
素５ａｌａｌ ５Ｓａｊ Ｉで切断し、５ａｆｆ Ｉの
制限酵素切断部位をＳｔヌクレアーゼを用いてＨ１ｎｄ
ｍリンカ−で置換し、約１２００ｂｐのヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター断片をえた。
素５ａｌａｌ ５Ｓａｊ Ｉで切断し、５ａｆｆ Ｉの
制限酵素切断部位をＳｔヌクレアーゼを用いてＨ１ｎｄ
ｍリンカ−で置換し、約１２００ｂｐのヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター断片をえた。
ＣＡＴ遺伝子を有する発現ベクターｐｓＶ２−８Ｈを制
限酵素ＳａＮ Ｉ 、 Ｈｌｎｄｎ［で切断し、これに
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター断片を混合し、
Ｔａ ＤＮＡリガーゼで結合し、これをｐβ１０９７−
ＣＡＴとした。これらをカルシウムフォスフェート法［
ライスラ−（Ｗｌｓｌｅｒ）らのプロシーディングズ
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンスイ
ズ オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリ
カ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 。
限酵素ＳａＮ Ｉ 、 Ｈｌｎｄｎ［で切断し、これに
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター断片を混合し、
Ｔａ ＤＮＡリガーゼで結合し、これをｐβ１０９７−
ＣＡＴとした。これらをカルシウムフォスフェート法［
ライスラ−（Ｗｌｓｌｅｒ）らのプロシーディングズ
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンスイ
ズ オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリ
カ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 。
ＡｃａｄｙＳｃｌ、ＵＳＡ） （１９７９）７８．３．
１３７３〜１３７Ｂ頁参照コを用いて、マウスＬｔｋ−
株に導入し、５９１ＦＣ９を含むイーグルＨＥＭで４８
時間培養した。尼下ゴールマンらのＣＡＴアッセイ法［
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
１３７３〜１３７Ｂ頁参照コを用いて、マウスＬｔｋ−
株に導入し、５９１ＦＣ９を含むイーグルＨＥＭで４８
時間培養した。尼下ゴールマンらのＣＡＴアッセイ法［
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｌ、２巻、１０４４〜１０５１頁、ライスラーら
のフロシーディングズ オブ ザ ナショナル ７カデ
ミー オブ サイエンスイズ オブ ザユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ）、 １旦、 ６７７７〜８５
８１コにしたがってＣＡＴａｓｅ活性を測定した。
のフロシーディングズ オブ ザ ナショナル ７カデ
ミー オブ サイエンスイズ オブ ザユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ）、 １旦、 ６７７７〜８５
８１コにしたがってＣＡＴａｓｅ活性を測定した。
すなわち、１４ｃでラベルされたクロラムフェニコール
（０，０２ｍａ＋ｏｌｅ、 １ μｃｉ）細胞抽出液２
μΩに４ａ＋ＭアセチルコエンザイムＡ ２０μｇを力
えて３７℃で反応させ、薄層クロマトグラフィー［メル
ク社製Ｔ’２５４、展開溶媒：クロロホノムーメタノー
ル（１９：１）］にかけ、アセチノ化されたクロラムフ
ェニコールの放射能活性シβ−スキャナーで測定した。
（０，０２ｍａ＋ｏｌｅ、 １ μｃｉ）細胞抽出液２
μΩに４ａ＋ＭアセチルコエンザイムＡ ２０μｇを力
えて３７℃で反応させ、薄層クロマトグラフィー［メル
ク社製Ｔ’２５４、展開溶媒：クロロホノムーメタノー
ル（１９：１）］にかけ、アセチノ化されたクロラムフ
ェニコールの放射能活性シβ−スキャナーで測定した。
比較例としてヒトβ−アクチン遺伝子のブーモーターの
かわりに５Ｖ４Ｄのプロモーターを同）の方法で導入し
たプラスミドｐｓＶ２−ＣＡＴを用（てＣＡＴアッセイ
を行なった。ｐ’３Ｖ２−ＣＡＴを用いた！ ばあ
い、比活性は（１，４７ｃｐｍ／μｇ蛋白質／分、ｐβ
１０９７−ＣＡＴを用いたばあいはＱ、８１ｃｐｍ／
ｕ ｇ蛋白質／分の比活性を示し、β−アクチン遺伝子
のプロモーターが約１．７倍高かった。すなわち １．
７倍のＣＡＴ蛋白質が生産されていることがわかる。
かわりに５Ｖ４Ｄのプロモーターを同）の方法で導入し
たプラスミドｐｓＶ２−ＣＡＴを用（てＣＡＴアッセイ
を行なった。ｐ’３Ｖ２−ＣＡＴを用いた！ ばあ
い、比活性は（１，４７ｃｐｍ／μｇ蛋白質／分、ｐβ
１０９７−ＣＡＴを用いたばあいはＱ、８１ｃｐｍ／
ｕ ｇ蛋白質／分の比活性を示し、β−アクチン遺伝子
のプロモーターが約１．７倍高かった。すなわち １．
７倍のＣＡＴ蛋白質が生産されていることがわかる。
第１図は、実施例２においてｐβ１０９７−ＣＡＴを０
うる手順を示す模式図である。 ］ し 特許出願人 蜜酒造株式会社 はか１名ゴ 支
うる手順を示す模式図である。 ］ し 特許出願人 蜜酒造株式会社 はか１名ゴ 支
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記のＤＮＡ配列を有するヒトβ−アクチン遺伝子
のプロモーター。 【遺伝子配列があります】 ２ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
た特定の蛋白質をコードするＤＮＡ。 ３ 特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ。 ４ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
た特定の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された細
胞。 ５ 特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
である特許請求の範囲第４項記載の細胞。 ６ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
た特定の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された細
胞を培養することによる、該特定の蛋白質を製造する方
法。 ７ 特定の蛋白質がクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼである特許請求の範囲第６項記載の方法
。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61107181A JPH07106152B2 (ja) | 1986-05-10 | 1986-05-10 | ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター |
| JP5060394A JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61107181A JPH07106152B2 (ja) | 1986-05-10 | 1986-05-10 | ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター |
| JP5060394A JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5060394A Division JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62262995A true JPS62262995A (ja) | 1987-11-16 |
| JPH07106152B2 JPH07106152B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=26401462
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61107181A Expired - Fee Related JPH07106152B2 (ja) | 1986-05-10 | 1986-05-10 | ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター |
| JP5060394A Expired - Fee Related JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5060394A Expired - Fee Related JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPH07106152B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2365076A1 (en) * | 2000-09-20 | 2011-09-14 | Millipore Corporation | Artificial ubiquitous chromatin opening elements (ucoe) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI335354B (en) | 2006-09-27 | 2011-01-01 | Univ Hong Kong Chinese | Methods for the detection of the degree of the methylation of a target dna and kits |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0174608A1 (en) * | 1984-09-13 | 1986-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Beta-actin gene and regulatory elements, preparation and use |
-
1986
- 1986-05-10 JP JP61107181A patent/JPH07106152B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-03-19 JP JP5060394A patent/JPH06102036B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2365076A1 (en) * | 2000-09-20 | 2011-09-14 | Millipore Corporation | Artificial ubiquitous chromatin opening elements (ucoe) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07106152B2 (ja) | 1995-11-15 |
| JPH06102036B2 (ja) | 1994-12-14 |
| JPH067168A (ja) | 1994-01-18 |
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