JPS62273000A - 哺乳類の雄ゲノムに対して特異的なｄｎａの分子プロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、とくにウシの亜科に属し、ことにボス属（
ｇｅｎｕｓ　Ｂｏｓ）の反芻動物の胚もしくは胎児の性
別を決定するのに有用で、雄の性に対して特異的なＤＮ
Ａの塩基配列を示す、特異的ＤＮＡの分子プローブの製
造法に関する。

胚や胎児の性別を決定することは、いくつかの点で極め
て興味深いものである。ヒトの胚の性別を決定すること
によって、胚の性別に関連する重篤な遺伝病を速やかに
検出することができる。一方、家畜の胚の性別決定は経
済的に極めて興味深いものである。

性別（雄もしくは雌）が性染色体によって決定されると
いうことは知られている。哺乳動物において、Ｙ染色体
が存在することは、雄表現型を産生ずるのに充分なもの
であり、Ｙ染色体に存在する性別決定遺伝子は、優性の
遺伝特性のように挙動するようである。

それ故、ヒト胚の性別を早期に決定するための第一段階
は、培養された羊水細胞の染色体分析法で構成されてい
る。しかしこのタイプの分析法は２〜３週間かかるので
、速やかに結果を与えることができる、別の性別迅速決
定法を提供することが必要であることが分かった。

すべてのＹ染色体が性分化に関与しているのではないと
いうことが確認された。それ故にＹ染色体に存在する塩
基配列を分析するのが論理的のようであり、この方向の
第１段階はＹ染色体のＤＮＡを分離しりＯ−ンすること
である。

かくしてＫ　ｕｎｋｅｌら（特に８　ｉｏｃｈｅｍ、、
　１８巻。

１５号、　３３４３−３３５３頁）は、Ｈａｅｌ［［、
ＥｃｏＲＩもしくはＥ　ｃｏＲＩＦのような制限酵素で
カップリングすることによってヒト雄ＤＮＡの３．４キ
ロベース（ｋｂ）のフラグメントを分離し、Ｙ染色体に
特異的な反復ＤＮＡ　（ＤＮＡ　　Ｙ−ｉｔ）がこれら
３．４ｋｂの分子に存在することを示した。しかし、Ｋ
　ｕｎｋｅｌらの研究は、各３．４ｋｂ分子内の、Ｙ染
色体に対して特異的なおよび非特異的な２つのタイプの
反復塩基配列の構成について有益な情報を提供している
が、性別決定に直接用いることはできない。

Ｂ　１ｓｈＯｐらの研究（Ｎ　ａｔＵｒｅ　、　　３０
３巻、　３０号。

１９８３年６月、　　８３１−８３２頁）は、マウスの
ベースにヒトＹ染色体だけを有する体細胞ハイブリッド
を用いてＹ染色体の部分ライブラリィを作製するのを目
的としたものであり、該ハイブリッドは、雄ヒトリンパ
球とマウス細胞系ＲＡＧとを融合させることによって得
られ、モーダル数（ｍｏｄａ　ｌｎｕｍｂｅｒ）は４ヒ
トＹ染色体／細胞である。これらの著者はそのハイブリ
ッドから高分子のＤＮＡ抽出し、制限酵１ＭｂｏＩで部
分消化を行い、得られた３５〜５０ｋｂのフラグメント
を、コスミドｐＪＢ８を用いてエシェリヒア・コリ（Ｅ
　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＩＩＩ菌にクローン
した。ヒトＤＩ’ＪＡ挿入物（Ｙ由来）を有するクロー
ンをマウスＤＮＡを有するクローンと識別するのを目的
として、コロニイが、反復塩基配列だけを検出して意図
するライブラリーを創製するため、９２Ｐで標識された
反復ヒトＤＮＡで低密度で試験された。著者らは、ヒト
ｙ染色体の構成を分子レベルで研究するため、組換え体
クローンからＹ由来の非反復ＤＮＡの塩基配列を選択し
た。この研究は、明らかに科学的に興味深いものである
が、やはり家畜の胚の性別を決定するのに直接使用でき
ない。

ヒト胚の性別を速やかに決定するいくつかの方法が、Ｙ
染色体に対して特異的なＤＮＡのａ基配列を用いるＫｕ
ｎｋｅｌらの研究に基づいて提案されてきた。特に１−
ａｕら（Ｔｈｅ　　１−ａｎｃｅｔ　、　１９８４年１
月　１日、　１４−１６頁）は、Ｙ染色体の異質染色質
由来の３．４ｋｂのヒト反復塩基配列から単離したプロ
ーブによってヒト胚の性別を決定する試験法（Ｋ　ｕｎ
ｋｅｌ　らの方法）を提案した。次いでこのプローブを
、０−２ｚｌの羊水由来の少数の細胞から単離したＤＮ
Ａにハイブリダイズした。このハイブリダイゼーション
の頻度は、雄ゲノムＤＮＡ　（羊水細胞から単離された
）の方が雌ゲノムＤＮＡの１０００倍も大きい。Ｇ　ｏ
ｓｄｅｎらによって提案されたいわゆるドツト・プロッ
ト法（ＤＯＴ　　８ＬＯＴ１１ｅｔｈＯｄ　　）　　（
Ｔｈｅ　　ｃａｎｃｅｔ　　、　　１９８４年　３月１
０日。

５４０−５４１頁）は、Ｙ染色体に対して特異的なプロ
ーブを用い、このプローブは１）ＨＹ２，１と呼ばれこ
れらの著者によって、以前に記載されていた。

このプローブは、雄ヒト胚からの絨毛組織の生検試料由
来のＤＮＡにハイブリダイズする。

Ｌ　ａｍａｒとＰａ１ｌｌｅｒ　　（Ｃｅｌｌ　　、　
　３７巻、　　１９８４年　５月。

１７１−Ｒ７頁ンは、マウスのＹ染色体のＤＮＡをクロ
ーンする一般的な方法を開発しようと試みた。

これらの著者が提案した方法は、雌マウスの肝臓のＤＮ
Ａを音波処理してフラグメントにし、雄マウスのＤＮＡ
をＭｂｏＩで完全に消化する方法である。フラグメント
にした雌ＤＮＡと消化した雄ＤＮＡとを１００：１の比
率で混合した。得られた混合物を変性し、適当な！Ｉｌ
ｌ液中で、１３２０のｃｏｔ値で再結合させる。これら
の条件下で９５％のＤＮＡは二重鎖の形態である。これ
らは均質のｆｆ１ｌＤＮＡ、両性に共通の塩基配列に対
応する異質の雄−雌二重鎮および雄に特異的なデユーブ
レックス（ｄｕｐｌｅｘ）で構成されている。その二ｆ
ｒ鎖は、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａ
ｔｉｔｅ）のカラムを用いるクロマトグラフィで単離さ
れる。それらはプラスミド１）ＢＲ３２２に組換えられ
る。得られた組換え体プラスミドは、受容能力があるエ
シェリヒア・コリＨａ　　１０１１ａ１菌を形質転換す
るのに用いられる。約１００，０００のクローン（Ａｌ
１１’−Ｔｅｔ　　）を試験したが、その内３０００が
Ｙ染色体に対して特異的である推定されるＤＮＡを含有
していた。これらのプローブの３つが雄マスウに対して
特異的であることが分かった。このことばその分子プロ
ーブの１ｉＤＮＡに対する種特異性を示すものである。

さらに精子の性を決定するために精子を選別するのにい
くつかの技術が提案されている。

電気泳動法（Ｓ　ｈｉｓｈｉｔｏら、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｆｅｒｔｉｌ　、　、　２０．１３−１６．１９７５年
）、ゲル濾過法、アルブミン勾配通過ａ　（Ｅ　ｒｉｃ
ｓｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

２４６巻、　　４２１−４２４．１９７３年）、遠心分
離法、さらにｐｅｒｃＯｌｌを用いる密度勾配遠心分離
法（Ｆ　ｅｒｔｉｌｉｔｙおよびＳ　ｔｅｒｉｌｉｔｙ
、　４０巻、　５号。

１９８３年１１月）、シよ糖の密度勾配を用いる超遠心
分離法などによって、Ｘ染色体とＹ染色体をそれぞれも
っている精子を分離するいわゆる物理的方法がある。

また種々の媒体く例えばアルブミンの勾配）内で、Ｙ染
色体をもつ精子とＸ染色体をもつ精子との移動度の差を
利用することによって、Ｙ染色体をもつ精子リッチのフ
ラクションおよび／またはＸ染色体をもつ精子リッチの
フラクションに、精液を分画する方法（米国特許第４，
００９，２θＯ号）と、Ｙ染色体の密度がＸ染色体の密
度より小さいという事実を利用することによる、！度に
よって分離させることができる精子分離方法（米国特許
第３．８９４．５２９号）とがあり、これらの方法には
静水学的力（米国特許第４，０９２，２２９号および同
第４．１５５．８３１号）や、ｐｅｒｃｏｌｌのような
適当な媒体の勾配中での遠心力ｗｉ法の応用が含まれる
。また、精子集団の弾性の電荷レジデントを利用し、静
電荷をもつ物質を用いて、精子集団を異なるフラクショ
ンに分離することも可能である（米国特許４．０８３，
９５７号）。これらの分離法と同じカテゴリーに入るも
のに、フラックス・サイトメトリ−（Ｎｕｘ　ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ）による細胞選別法があり、すナワチ、１１
８ｖｉ（７）ｌｆＲ１７）ＤＮＡｒＪｉｌｉ定すｔｔり
［ｌＷ！１ヲ電界によって偏向させて分離し、次いで他
の標識をつけたりガントの結合、光学顕微鏡もしくは電
子顕微鏡、生体外での機能試験などによって、前記選別
された細胞の検討を行う方法である（Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ、第２５
章。

４７１−　４８３頁、　１９８０年）。

また、Ｘ染色体もしくはＹ染色体をもつ精子と選択的に
反応する抗体を用いるいくつかの免疫学的方法がある。

この方法では、前記抗体は凝集され、失活され、その結
果前記抗体と反応した染色体とタイプが逆の染色体を均
質に有する精子のフラクションを放出する。また、抗体
と結合したフラクションは、特に抗体が、免疫吸着剤で
作製された固相に固着されている場合、その後、適当な
ときに抗体から放出させることができる。（米国特許第
４，１９１，７４９号、同第３，６８７，８０６号、同
４．０８５，２０５号）。

先に引用した方法が記載された刊行物は次のとおりであ
る。

５ｔｉｆＬＩＪＮＧ　Ｋ、　Ｘｎ　ｔ　”５ｅｘ−ｒａ
ｔｉｏ　ａ乞ｂｉｒｔｈ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒ　
Ｃｏｎｔｒｏｌ、”　（Ｃ，Ａ、　ＫＩＤＤＹ　ａｎｄ
　）ｆ、Ｄ、　）ＩＡＦＳ、　Ｅｄｓ）入ｍｅ　　Ｓｏ
ｃ、　　Ａｎｉｍａｌ、　　Ｓｃｉ、ｐｐ、　　７６−
８４　　（１９）１）ＭＥ！Ｓ？ＲＩＣＨＨ，Ｌ、　Ｊ
、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　ＩＬＱ、　２９
９−３１２　（１９７２）ＲＨＯＤＥ　　Ｗ、　　ａｔ
　　ａｌ、、　　Ｊ、　　　Ｒｅｐｒｏ、　　　Ｆ＠ｒ
ｔｉ１．　４ヱ、　　５８フー５９１ＳＴｇＫｍｌｏ　
０．ａｔ　　ａＬ、　　八ｎｄｒｏｌｏ（ｉｉａ＊　　
ヱ、　　９５−９７　（１９〕５）Ｂ）ＬＡ’ｆ’ｒＡ
ｃＨＡＲＹＡ　　Ｂ、Ｃ，ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｉｎｄ
、Ｊ、　　！ｘｐ、Ｂｉｏ１．．　１４ｔＳ）ｔＡＢｒ
ｘＹ　Ｐ、Ｒ，ａｔ　ａＬ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６
９．５８−６０　（１９７７）ＳＨＩＩ、ＩＪＮＧ　Ｅ
、、　ＴＨＯＲＭＡ）！ＬＥＮ　Ｄ、　Ｚｕｃｈｔｈｙ
ｇ、　ｐし１１３−１ｌ１１９）６）ＡＤＸ入入、ｅｔ
　　ａｌ、、　　八ｎｄｒｏｌｏｇｉａ　２，２８９−
２９２　　（１９７））Ｂ）ｔＡ？？＾ＣＨＡＲＹＡ　
　Ｂ、、Ｃ，ａｔ　　ａｌ、、　　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、
　　　Ｆｅｒｔｉｌ、、　　　２２゜ＳＣＨＩＬＩ、Ｘ
ＮＧ　　ｍ！、、　　丁ＨＯＲＭＡ）！ＬＥＮ　　Ｄ、
　　＾ｎｄｒｏｌｏｇｉａ、　　２．　７４−７８ＰＩ
！：ＲＴＯＦＴ’　Ｈ，ｅｔ　’ａ１．．　Ａｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８８．２７１−２８２（１９７Ｂ
） ＱＵｆｆ：ＮＬＩＶＡＮ％４．Ｌ、Ｑ、、　Ｆｅｒｔｉ
ｌ、　Ｓ員ｒｉ１．ａ　３４．３０７−３０８ＯｔＪＩ
ＮＬＩＶＡＮ　　Ｗル、Ｇ、　　　ｅｔ　　　ａｌｌ　
　Ｆｅｒｔｉｌ、　　　５Ｌｅｒｉｌ、　　　３フ。

ＣＯＲ８ＯＮ　ｇ、Ｌ−ａｔ　ａＬ、、　Ｆｅｒｔｉｌ
、　５ｔｅｒｉｌ、　４０．３８４−３８５ＫＡＮ！！
ＫＯＳ、　ａｔ　ａｌ、、　　Ｆｅｒｔｉｌ、　　５ｔ
ａｒｉ１４０．６６１−６６５ＢＥＡＬ　Ｗ、Ｅ、　　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　　Ａｎｉｍ、　　Ｓｃｉ、、　
　５８．　１４３２−１４３６ＫＡＸＥＮＯＳ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅａ、、シ１８７−１
９４　＋１９８４）ＲＯ５Ｓ　八−ｅｔ　ａｌ、Ｈａｔ
ｕｒｅａ　　２５３ｒ　　３５４３５５　　（１９７５
）’ＪＨＸＳＨ１丁Ｏ５，ｅｔａ１．．　　Ｉｎｔ、　
　Ｊ、　　Ｆｅｒｔｉｌ、、　　２０．　１３−１６Ｂ
ＲＯＥＲＫ、Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、、　　入ｎｄｒｏｌｏ
ｇｉａｚ　　２Ｊ　　フ４−７８　（１９）７）ＣＩＩ
ＯＷＳＫＩ　Ｗ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌｅ、　Ｐｅｒｔ、　
ａｎｄ　５ｔａｒｉ１．、３１．５２−５７０（ＪＩＮ
Ｉ、工％Ｆ７ｋＮ　Ｗ、Ｌ、Ｇ、　　ｅｃ　　ａｌ、、
　　Ｆｅｒｔｉｌ、　　５ｔｅｒｉ１．　３７゜５ＨＸ
ＲＡＸ　　　トＬ　　　ａｔ　　　ａｌ、、　　　’ｒ
’ｏｈｏｋｕ、　　　Ｊ、　　　Ｅｘｐ、　　　Ｍｅｄ
、、　　　　１１３ＭＯＯＲＥ　１４．Ｄ、Ｍ、　ｅセ
ミｔ、、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔｉｌ、、　４４．
３２９−３３２ＢＡＴ’ＴＡＣＨＡＲＹＡ　　Ｂ、Ｃ，
＊セ　ａｌｌ、工ｎＬ、Ｊ、　　Ｆｅｒｔｉｌ、　　２
’ＬＢＥＮＮＥＴＴ　　Ｄ、　　ａｎｄ　　ＢＯＹＳＥ
　　Ｅ、＾＊　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２４６．　３０８
−３０９ＢＥＮＮＥＴＴ　Ｏ，ｔｌｔ　ａｌ、　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２５７．２３７−２３８　（１９７５）ＳＸ
ＬＶＥＲ５Ｗ、に、　　ａｎｄ　　ＷＡＴＣ）ＩＥＬ　
　ｓ、５．、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９５゜ＨＡＮＣ
ＯＣＫ　Ｒ，Ｊ、Ｔ、、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、
、　１８．５１０−５１５　（１９７Ｂ）Ｓ）ＩＡＬＥ
Ｖ　　八、、　　Ｄｉｅｓ　　Ａｂｅｔ　　Ｂ、　　４
０．　５５３８　　（１９８０）ＨＥＤＧＥ　ＩＪ、Ｃ
，ｅ乞ａ１．Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２，
３５１−３５７（１９！３１） ＷＡＴＣＭＥ’ｒ　Ｓ、５．　Ｔｈａｒｉｏｇｅｎｏｌ
ｏｇｙ、　２４．４１９−４２９　（１９Ｅ１４）ＧＬ
ＥＤＨＩＬし　Ｂ、Ｌ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｉｎ
　　：　　Ｆｌｏｗ　　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　　ａｎｄ
Ｓｏｒｔｉｎｇ　（Ｍ、　　Ｍｅｌａｍｅｄ、　　ｐ、
　　ＭｕＬＬａｎｅｙ　ａｎｄ　Ｍｅｎｄ！１ｆｉｏｈ
ｎｌａｄｓ）　　Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　
　５ｏｎｓ、　　Ｉｎｃ、　　Ｎ、Ｙ、　　ｐｐ　　４
７１”４８４ＭＯＲｔＪＺＺＩ　Ｊ、Ｐ、、　Ｊ、　Ｒ
ｅｐ急１．Ｆｅｒｔ、　５７．３１９−３２３　（１９
７９）ＥＶＥＮＳＯＮ　　Ｄ、Ｐ、　　ｅｔ　　ａｌ、
、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２１０．　１１：３ｌ−１
１３３ＥＶＥＮＳＯＮ　　Ｄ、Ｐ、　　ｅｔ　　ａｌ、
、　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、　　７８．　２２５−２
３８ＧＲＯＧＡＮ　Ｗ、Ｍ、ｅｔ　Ｑｌ、、Ｊ、Ｈｌｓ
ｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、２９゜ＳＴＥＥＮ
）（、Ｂ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｙｔｏ＋ｎｅｔｒｙ、
　２．１２９　（１９８１）ＰＸＮＫＥＬ　Ｄ、　ｅｔ
　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１８．９０４−９０
５　（１９８２）ＰＩＮＫＥＬ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、　３−、　ｌ−９（１９８２）Ｂ
ＥＮＡＲＯＮ　ａｔ　ａｌ、、　ＣｙｔＯｍｓｔｒｙ、
　５　（１９８２）ＧへＲＮＥＲＤ、Ｌ、　　ｅｔ　　
ａｌ、　　　阻ｏ１．　　　Ｒａｐｒｏｄ、、　　　２
０．　　　：１１２−３２１ＧＬＥＤＨ工ＬＬ　　［１
，Ｌ、　　＠ｔ　　ａＬ、、　　１ｏｔｈ　　Ｉｎｔ、
　　Ｃｏｎｇｒ、　　Ａｎｉｍ。

ａｅｐｒｏａ− ＭＮＫＥＬ　　Ｄ＋　　ｅｔ　　ａｎ、、　　　Ｊ、　
　　八ｎｉｍ、　　　Ｓｃｉ、、　　　６０．　　１３
０３−１３０７ＪＯＨＮＳＯＮ　　　Ｌ、八、ｌ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　　Ｇａｍｅｔｅ　　Ｒｅ９．　　ｉｎ
　　ｐｒｅｓｓＪＯＨＮＳＯＮ　　Ｌ、Ａ、　　ａｎｄ
　　ＰＩＮＫＥｆ、　　Ｄ、、　　Ｃｙｔｏ＋ｎｅｔｒ
ｙ、　　ヱ、　　１ｎｐｒｅｓｓ　　（１９８６） ＪＯＨＮＳＯＮ　　Ｌ、Ａ、、　　　Ｂｅ１ｔａｖｉＬ
ｌｅ　　Ｓｙｍｐ、　　　八ｇｒｉｃ、　　　Ｒａｇ、
、　　　Ｘ。

（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）　Ｍ、　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　ｐｕｂ
Ｌ、　　（１９８６）ＳＨＥ’ＴＴＬＥＳ　　Ｌ、Ｂ、
、　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　Ｇｙｎａ＠ｃｏＬ、　　０
ｂｓｔｅｔｔ　　！ｌＤＯＷＮＩＮＧ　　Ｄ、Ｃ，ａｎ
ｄ　　ＢＬＡＣＫ　　Ｄ、Ｌ、　　　Ｆ＠ｒｔｉ１．　
　５ｔｅｒｉ１．、　　２７゜ＭＵＥＨＬ！ＪＳＰ、Ｍ
、　ａｎｄ　ＬＯＮＧ　Ｓ、Ｙ、　　Ｆ＊ｒｔｉ１．　
５ｔｅｒｉ１．、　２７゜ＰＯＲ８ＴＭＡＪＪＮ　　Ｔ
、　　ａｎｄ　　ＳＣＨＭＥＣ）ＩＴＡ　　）１．　　
Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　　Ｈｏｎａｔｓ−ｓａｃｈｒ、、
１６５，２８−３５　　（１９７９）ＢＡｊｕ、ＯＷ　
　Ｐ、　　　ａｎ！Ｉ　　ＶＯ６Ａ　　Ｃ，＋３．、　
　　Ｎａセｕｒｅ、　　　２２６．　　９６１−９６２
ＢＥＡＴＴＹ　　Ｒ，八、、　　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　
　ｃｅｌｌ　　Ｇｅｎ＊ｔ、、　　１８ｉ、　　３３−
４９ＥＲ４Ｃ５ＳＯＮ　Ｒ，Ｊ、　　ｅｔ　ａｌ、、　
　Ｉｎ　　：　　Ｃ１１ｎｉｃｓ　　ｉｎ　ＡｎｄｒＯ
ＬＯｑｙ＋ｖｏ１．　　工ｒ　　（Ｊ−Ｃ，Ｅｍｐｅｒ
ａｉｒｅ、　　Ａ、　　入ｕｄｅｂｅｒし、　　Ｅ、Ｓ
、Ｅ、　　Ｈａ−ｆｅｚ、　　　ｅｄｓ）、　　　Ｍａ
ｒｔｉｎｕｓ　　　Ｎｉコｈｏｆｆ、　　　Ｔｈｅ　　
ｌ（ａｇｕｅ　　ｐｐ　　９Ｂ−１１１（Ｌ９ＥＩＯ） にＩＤＤＹ　　Ｃ，Ａ、　　ａｎｄ　　Ｈ入ＦＳ　　Ｈ
，Ｄ、、　　　Ｓｅｘ　　ｒａｔｉｏ　　ａｔ　　ｂｉ
ｒｔｈ。

Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ、　　Ａ
ｍ、　　Ｓｏｃ、　　Ａｎｌｍ、　　Ｓｃｉ、　　ｐｕ
ｂｌ。

ＣＯυＲＯＴ　Ｍ、、　　Ｌｅ　ｃｈｏｉｘ　ｄｕ　　
５ｅｘｅｅｓｔ−４１ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｃｈｅｚｌｅ
ｓ　　　ｍａｍｍｉｆａｒｅｓ　　　？　　　Ｉｎ　　
　ｓ　　　’Ｌａ　　　Ｆ４ｃｏｎｄａｔｉｏｎ＠ｐｐ
　１１３−１３０．　Ｈａｓｓｏｎ　ｐｕｂｌ、　　（
１９７５）ＲＩＮＥＲＡＲＴ　’ｖｉ、、Ｓｅｘ　Ｐｒ
ｅｓａｌｅｃｔｉｏｎ　ｎｏｔ　ｙｅｔ　ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ。

Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｒｅｐｏｒｔｓ　５ｅｒｉｅｓ
　！　２　ｐｐ　１１　（１９７５）ＡＭＡＮＮ　　Ｒ
，Ｐ、ａｎｄ　　５ＥＸＤＥＬ　Ｇ、！、、Ｐｒｏｓｐ
ｅｃｔ　　ｆｏｒ　　ＳｅｘｉｎｇＭａｍｍａｌｉｎａ
　　　Ｓｐｅｒｍ、　　　ｐｐ　　　２８８　　　Ｃｏ
１ｏｒａｄｏ　　　入ｓａ、　　　Ｌｌｎｉｖ。

Ｐｒｅｓｓ、　ｐｕｂｌ、　　（１９８２）。

従来の技術に提案された精子選別法は、その信頼性につ
いて、比較的大きな不確実性を有するという欠点がある
。事実、その選別法では、一つもしくは他方の染色体の
１００％均質なフラクションは得られない。そのため、
その選別性能は、実際には、人工精液注入法を行うこと
によってのみチェックすることができる。そしてこの方
法は最終目標である（生体外での受精の効率は、実際に
はかなり低い）。さらに従来技術に推奨されている選別
法のいずれかひとつによって単離された精子のフラクシ
ョンと関連して、−性別の比率″の偏差が有意な値であ
るか否かを知るためには、統計的に有意な多くの回数の
精子注入を行うことが必要であり、これは費用と時間が
かかることは明らかである。

それ故に、従来技術で提案された選別法のひとつで得ら
れた精子のフラクションを用いて人工精液注入法を行う
段階で失敗する危険を抑制もしくはなくすために、この
フラクションを直ちにチェックできる手段を得ることは
欠くことのできないことである。

この発明のひとつの目的は、特にウシの亜科に属し、こ
とにボス属の反勇動物の雄ゲノムに対して特異的なＤＮ
Ａのプローブであって、雄の性に対して特異的なＤＮＡ
の塩基配列を表示する、分子プローブと、前記プローブ
を用いてこれらの動物の性を決定する方法とを提供する
ことであり、これらによって５００〜１０００を越えな
い少数の胚細胞から前記反芻動物の胚の性の決定が可能
になり、胚の性を、１００％の信頼性で発生の初期の段
階で決定できるならば、問題の技術分野の要望を充分満
足させる。

この発明のもうひとつの目的は、この発明の分子プロー
ブを用いて、いずれかの適切な選別法で分離された精子
集団のフラクション内の、Ｙ染色体を持つ精子の比率を
直接に検査する方法を提供することである。

この発明は、特にウシの亜科に屈しことにボス属の反搗
動物の雄ゲノムに対して特異的なＤＮＡの分子プローブ
に関し、該プローブは、これと適切な酵素で消化された
雄ゲノムのＤＮＡとハイブリッドを形成することによっ
て決定されるハイブリダイゼーションプロファイルを持
っている。そしてハイブリダイゼーションは、問題の反
芻動物の雄ゲノムに対して特異的な少なくともひとつの
バンドの存在を示す。特にハイブリダイゼーションプロ
ファイルが該プローブと、ＥｃｏＲＩで消化された雄ゲ
ノムＤＮＡとのハイブリダイぜ−ションで決定される場
合は、ボス属の雄ゲノムに対して特異的な７ｋｔｌのオ
ーダーのバンドの存在を示す。

この発明の分子プローブの有利な実施態様において、そ
のプローブは、下記の５　”　−３−ヌクレオチド配列
： とその相補的配列を有する４９の塩基対、または少なく
とも１１の連続したヌクレオチドを有する該配列のフラ
グメントもしくはこのフラグメントと少なくとも７０％
の相同性を示す他の任意の７ラグメントからなり、この
プローブをす、ｃ、　　１．　２゜と命名する。

この発明の分子プＯ−プの他の有利な態様によれば、そ
のプローブは、ボス属の雄ゲノム内で少なくとも２００
０回反復している。

そのヌクレオチド配列は、Ｍ　ａｘａａ＋と（３ｉ１ｂ
ｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
、　６５．　４９９．１９７７年）で決定される。

プローブｂ、ｃ、　　１．　２とＥｃｏＲＩで消化され
た雄ゲノムのＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、雌
ゲノムＤＮＡの存在しない７キロベース（ｋｂ）のバン
ドの存在を示す。

またこの発明は、特にウシの亜科に属し、ことにポス馬
の反芻動物の雄ゲノムに対して特異なＤＮＡの分子プロ
ーブの製造法に関する。

この発明のひとつの特徴によれば、−ａｍにされたゲノ
ムＤＮＡセグメントが、ｆｉＤＮＡが大過剰で存在する
（雄ＤＮＡ１部あたり　１００部のオーダー）、雄と雌
のＤＮＡの混合物から再結合されるこのタイプの分子プ
ローブの製造法は、次の工程で構成されている。

第１段階二前記反芻動物の雌ゲノムＤＮＡを、音波処理
で切断して２００〜５５０塩基対（ｂｐ）の７ラグメン
トとし、次いで同じ反芻動物の雄ゲノムＤＮＡと１００
：１のオーダーの比率で混合し、付着端を有し大きさが
４０〜６５０ｂｐの制限フラグメントを放出するために
エンドヌクレアーゼＳＡＵ　３Ａで消化し： 第２段階：前記のＤＮＡ混合物を、公知の方法で、フェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物で
抽出後、エタノールで沈澱させ、１００℃で変性させ、
次いで２ｍｏｌ／Ｒの（ＮＨａｌ　２５０４．５０ｍ５
ｏｌ／ｕのリン酸ナトリウム（ｐｉ（＝６．８）および
５　ｍ１ｏｌ／　ＱのＥＤＴＡ含有の緩衝液中、６８℃
で２２時間再結合させ：第３段ｊｉＩ：再結合して二重
鎖にされたＤＮＡを、まずエンドヌクレアーゼＢａ１ｌ
）−ＩＩで巻き戻し次いでアルカリホスフ？ターゼで脱
リン酸化して、プラスミドｐＵｃ　９（Ａｎ　　−Ｌａ
ｃＺ◆）のようなプラスミドと混合し、リガーゼＴ４の
存在下で１６℃で１６＠＠接触させることによって該プ
ラスミドにＤＮＡを挿入し：および 第４段階：第３段階で得た組換え体プラスミドを用いて
高度に受容可能にされたエシェリヒア・コリＩＩＩＷ！
ｉを形質転換して組換え体りＯ−ン（Ａｍｐ’−１ａｃ
ｚ−）が２ｙｌ（１）＠１１Ｂ１１懸濁ＨＧｌｅ＋　２
００りＯ−ンの比率で得られる 方法である。

この発明の分子プローブの製造法の有利な態様において
、エシェリヒア・コリの細菌細胞は、組換え体プラスミ
ドを挿入する前に、１０ｍ１ｏｌ／　Ｑのに−Ｍｅｓ　
（ｐ１４−６．２＞　、１００　ｍａ＋ｏｌ／　ＱのＲ
ｂ　Ｃｇ２．４５ｍａｏｌ／ＲのＭｎｃｊ２２および３
＋ｎｏｌ／Ωの［Ｃｏ　　（ＮＨ３）ｓ　ＩＣΩ３を含
有する培地で１０分間０℃で処理することによって高度
に受容しうる状態になっている。この発明の他の方法の
有利な態様において、形質転換されたｍ菌は、ジメチル
ホルムアミド中低濃度でアンピシリンとＸ−ガル（もし
くは５−プロモー４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ
−ガラクトビラノシド）とを含有するゲＯ−ス（ｇｅｌ
ｏｓｅ）培地上に流延され、単離された細菌のコロニイ
（ＡＩｌｌｌ）’−ＬａｃＺ−）を別々に予備培養し、
次いでミニライゼートを作製するために増幅させた。次
いで各々単離したプラスミドをエンドヌクレアーゼｐｖ
ｕ［で消化し、１以上の放射性同位体で標識を付け、前
記反芻動物起源のゲノムＤＮＡとハイブリダイズした。

次いでこれら動物のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩで消化して、種々の大きさの制限フラグメントを生
成させた。

この態様の有利な方法では、これらの７ラグメントはア
ガロースゲルでの電気泳動マイグレーシン法で分離され
る。

特にウシの亜科に属しと（にボス属の反芻動物の雄ゲノ
ムに対して特異的なＤＮＡの分子プローブの製造法のも
うひとつの特徴は、このタイプのプローブが合成によっ
て得られるということである。その合成法では、該プロ
ーブが有するヌクレオチド塩基配列が、同相でのホスホ
ラミダイト法（１）ｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ　）で合成される。

この発明の分子プローブの組成の一部を形成するオリゴ
ヌクレオチドの合成法の好ましい態様においては、実際
の合成に続いて、次のような精製工程が行われる。すな
わち、規定の大きさを有する所望のオリゴヌクレオチド
を分離し、中間の大きさのオリゴヌクレオチドと結合さ
せ、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付し、シリカ
ゲルでコートされたアルミニウムホイルによって所望の
耗オリゴヌクレオチドのバンド（これは２５４ｒｖで蛍
光を発する）を同定し、このバンドを切り取り、そのＤ
ＮＡを適当な溶液中で溶離させ、次いで純粋な合成ＤＮ
Ａが回収される。

この発明の分子プローブの合成法のらうひとつの好まし
い態様では、合成オリゴヌクレオチドは、ｆ’ａＷＡの
後、１以上の放射性同位体で標識が付される。

またこの発明は、特にウシの亜科に属し、ことにボス漠
の反芻動物の雄ゲノムに対して特異的なＤＮＡの分子プ
ローブの、該反易動物の胚もしくは胎児の性別を決定す
るための使用法に関する。

そしてその決定法においてこの発明のプローブは、公知
のしかたで予備ハイブリダイズされたフィルターにハイ
ブリダイズされ、そのとき、該プローブは、アガロース
ゲルの電気泳動法で分離したのち適当なフィルターに予
め移された、前記反芻動物（川と１１）のゲノムＤＮＡ
と再結合させると、雄ゲノムＤＮＡと排他的にハイブリ
ダイズし、このハイブリダイゼーションはオートラジオ
グラフィーおよび／または非放射性プローブにより、バ
ンド形のハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーシ
ョンシグナルの存在によって証明される（３ｏｕｔｈｅ
ｒｎ　Ｊ、　、　Ｍｏｌ、　１３ｉｏｌ　、　、　９８
．　５０３゜１９１５年）。

この発明の性決定法の有利な態様において、認識される
べきＤＮＡは上記反椙動物のリンパ球に含有されている
。

胎児に用いられるこの発明の性決定法のもうひとつの有
利な態様において、認識されるべきＤＮＡは、羊水もし
くは尿膜液または前記反芻動物の絨毛組織からでる細胞
に含まれている。

この発明によれば、上記反芻動物の前記細胞もしくは類
似の細胞、は、音波処理され後、液滴の形態で膜上にデ
ポジットされる（ドット−プロット）。

この発明の性決定法のもうひとつの有利な態様では、認
識されるべきＤＮＡは、中期段階で観察される、前記反
芻動物のＹ染色体に含まれており、この場合性はいわゆ
るｉｎ　５ｒｔｕハイブリツド形成法で決定される。

この発明の性決定の別のＨ様では、認識されるべきＤＮ
Ａは、開明の段階にある前記反芻動物の細胞の核内にあ
り、この場合性はいわゆる１ｎｓｉｔｕハイブリツド形
成法で決定される。

この発明のｉｎ　　５ｉｔｕハイブリツド形成法では、
前記反芻動物の胚由来の５〜２０の細胞の生検試料を、
１以上の放射性同位体で標識されたプローブかもしくは
非放射性の７０−ブとハイブリッド形成させることによ
って前記細胞に標識をつけるために、この発明の分子７
０−ブと接触させ、次いでそのハイブリッド形成が適当
な細胞免疫化学的方法によつ゛て明示される。

またこの発明は、特にウシの亜科に属しことにボス屈の
反芻動物の精子集団中の、Ｙ染色体を有する精子集団の
比率を、直接、直ちに検査する方法に関する。この方法
では、前記集団の精子を、適切に標識を付した前記プロ
ーブとハイブリッドを形成させることによって前記精子
に標識を付けるために、この発明の分子プローブと接触
させ、次いでそのハイブリッドが形成された精子は、適
当なＩＢ胞免疫化学的方法によって明示される。

この発明の検査法のひとつの有利な態様では、精子と特
異的なＤＮＡの分子プロニブとのハイブリダイゼーショ
ンは、精子と直接にそのままで行われる。

この発明の検査法のもうひとつの有利な態様では、ハイ
ブリダイゼーションは、特異的ＤＮＡの分子プローブと
、ボス属の反祁動物の精子から単離したＤＮＡとで行わ
れる。

ハイブリダイゼーションがそのままで行われる態様の有
利な方法では、精子はハイブリダイズされる前に、本質
的に３つの工程、すなわち低張ショック、蛋白分解消化
およびジスルフィド結合の還元からなる化学的デコンデ
ンセーシヨン法（ｄｅｃｏｄｅｎｓａｔｔｏｎ　）に付
される。

この発明の検査法のさらにもうひとつの有利な態様では
、１以上の放射性同位体で標識されたプローブまたは非
放射性のプローブが、特異的ＤＮＡの分子プローブとし
て用いられる。

この発明の、精子集団中のＹ染色体を有する精子の比率
を検査する方法によって、この集団に存在するＹ染色体
の比率を測定することが可能になる。

この発明によって、この発明の、特異的ＤＮＡのプロー
ブによって精子のＹ−特異性ＤＮＡの量を測定できると
いうことが、精子のＤＮＡ内容によってＸとＹの精子を
選別する方法の開発に利用され、この方法の榎々の分離
工程は、この発明の、反芻動物のＹ染色体に対して特異
的な分子プローブによって検査される。

その結果、この発明は、下記工程： （１）精子に含まれるＤＮＡに、ＤＮＡに特異的な生体
染料で標識を付け（例えばエチジウムプロミド、アクリ
ジン、ヘキスト染料３３３４２またはＤＡＰＩ）： （２）含有するＤＮＡの量によって、ＸとＹとの精子の
２フラクシヨンに、細胞蛍光定量法によって選別し； （３）この発明の方法にしたがって、選別によって分離
されたＹ精子のフラクション中のＹ染色体を有する精子
の比率を検査する方法を用いて、上記第２段階で行った
選別操作の質を検査し：（４）モノクロナルもしくはポ
リクロナル抗体を産生するために、誓歯動物（マウスも
しくはラット）を、検査済のフラクション（検査後再選
別してもよい）で免疫にし； （５）所望の性の染色体で制御されその精子の表面で発
現される抗原決定基を認識する特異的な免疫試薬（この
試薬はＸ染色体もしくはＹ染色体をもつ生精子を分離す
るのに用いることができる）を得るために、凝集法、精
子毒素法、間接的な蛍光抗体法およびフラックス・サイ
トメトリイ・テスト（ｆｌｕＸ　ｃｙｔｏｌｅｔｒｙｔ
ｅｓｔ　）　ｋ：よっテ、前記抗体の特異性を検査する
；および （６）精子集団中の、Ｘ染色体とＹ染色体をそれぞれも
っている精子のフラクションを前記免疫試薬で分離する ことからなる、精子集団中の、Ｘ染色体をもつ精子とＹ
染色体をもつ精子を選別する方法に関する。

この発明の選別法のひとつの有利な態様では、誓歯關乳
動物の免疫化は、前記選別法の第４工程を構成するもの
であるが、これに続いて、前記免疫化工程で得られたポ
リクロナル抗体が集められ、次いでこれらの抗体を、免
疫化で用いた精子と逆の性の精子上に吸収させ、これら
抗体の特異性が所望の性の精子上で検査され、次いで、
その抗体は適当なときにＭ製される。

この発明の選別法の他の有利な態様では、細胞蛍光定量
法によって分離されたＸとＹの精子は、ＸとＹとの染色
体に対して特異的なモノクロル抗体を作製するのに用い
られる。

さらにこの発明は、その免疫試薬を得るために用いられ
るＸ染色体もしくはＹ染色体によって制御され、および
精子表面に発現される抗原決定基を認識する特異的免疫
試薬に関する。この試薬は、前記方法を行うことによっ
て得られ、その特異性が試験され、適当なときに精製さ
れる。

前記事項に加えて、この発明は下記説明によって明らか
になや他の事項をも含有するものである。

この発明は、この発明をどのように実施できるかを示す
実施例を引用する下記説明によって一層明確に理解され
るであろう。

しかしこれらの実施例は、この発明の目的を例示するた
めにのみ提示されたものでいかなる限定も意味しないと
いうことは明確に理解されねばならない。

この発明によるプローブの作゛ 雄のゲノムに存在し雌のゲノムに欠けているＤＮＡはこ
の技術を用いてクローンされ得る。即ち雄ウシに対して
特異的なＤＮＡのライブラリーをビルドすることができ
た。

雄に対して特異的なＤＮＡのライブラリーの製造−Ｕ狙
月工組幻− 末梢リンパ球起源の雌ゲノムのＤＮＡ１ｍｇを音波処理
法により２００〜５５０塩基対（ｂｐ）片に切断する。

末梢リンパ球由来の雄ゲノムＤ　Ｎ　Ａ　１０μｇは、
エンドヌクレアーゼＳＡＵ３Ａ　（ベーリンガー社製）
で消化され約４０〜１６５０ｂｌ）の大きさで、粘着端
をもつ、制限フラグメントを放出する。

これら二種類のフラグメントを次の割合で混ぜる。：ｆ
ｉＤＮＡ　：ＪｉＤＮＡ−１００：　１フエノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールの混合溶媒で抽出し
、無水エタノールで沈澱させた後、この二種のＤＮＡの
混合物を、１００℃で１０分間加熱して変性させ、つい
で硫酸アンモニウム２ｍｏｌ／ｕ、燐酸ナトリウム５０
ｍｇ＋ｏｌ／　４２　（ｐＨ−ｅ、ａ）およびＥＤＴＡ
５ｎ＋ＩＩｏｌ／ｇ含有の緩衝液中６８℃、２２時間で
再結合させる。この再結合して二重鎖にされたＤＮＡの
一部（１μｇ）を、まず最初にエンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨ１（ベーリンガー）で巻き戻し、アルカリ性ホスフ
ァターゼ（ＣＩＰベーリンガー）で脱リン酸化し、プラ
スミドＤＵＣ９（Ａｍｐ’−ＬＡＣＺ＋）　１１００ｎ
　ト混合する。雄ウシＤＮＡのこのプラスミドへの挿入
はりガーゼＴ、（ビオラプス　Ｂｉｏｌａｂｓ）により
１６℃、１６時間で行われる。

この組換え体プラスミドを、Ｋ−Ｍｅ　Ｓ　（ＰＨ＝６
．２）　１０ｍｍｏｌ／　Ｑ　、　Ｒｂ　ＣＱ２１００
　ｍｍｏｌ／　Ｑ　。

Ｍ　ｎ　ＣＱ　２４５ｍｍｏｌ／　Ｑおよび［ＣＯ（Ｎ
Ｈ３）６　］ＣＱ　３３１ＩＩｌｏｌ／　Ｑ含有の媒体
で０℃で１０分間処理することによって高度に受容可能
にされたエシェリヒア・コリーＪＭ８３２ｆｆｆを形質
転換するのに用いる。このようにして形質転換された細
菌を、ジメチルホルムアミド中２％の低濃度でアンピシ
リン１００μｇ／ｌ！とＸ−ｇａｌ　　（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトビラノシド
）２　ｄ　／　１１とを含むＬＢ−寒天培地上に流延す
る。

約２００のクローン（Ａｍｐ　　−ＬａｃＺ−）が得ら
れた。

雄ウシＤＮＡ挿入体の存在を調べる為に各クローン体は
個別に二次培養して、その細菌からミニライゼート法（
ｍｉｎｉ　−＋ｙｚａｔｅ）によってプラスミドが単離
される。各単離されたプラスミドは、エンドヌクレアー
ゼＰｖｕＩＩ（ベーリンガー）で消化され、１％アガロ
ースゲル中（３０ボルド一１６時間）の電気泳動で分析
される。

分析した２００のクローン体の５０は、（挿入した）ウ
シＤＮＡを含有している。

この方法で生成した挿入体の特異性は、エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）で消化され、電気泳動
にかけた後で、サウザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）法に
よりＤＢＭ［もしくはＨＹＢＯＮＤ膜（Ａ　ｍｅｒｓｈ
ａｍ　＞上に移された雄及び雌のゲノムＤＮＡ　（リン
パ球）とのハイブリダイゼーションで示した。

プローブｂ、ｃ、　　ｉ、　　２．とＥＣＯ■で消化さ
れた雄ゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、盾
ゲノムＤＮＡには存在しない７．０キロベース（Ｋｂ　
）のバンドの存在を示す。この結果は、１２の雄及び１
３の雌の動物で確かめられた（Ｐｏｔｏ’）。

雄と雌のウシＤＮＡは５×１０７末梢リンパ球から精製
される。その細胞は４２℃で１８時間、ゆっくり撹拌し
逸がら、溶解溶液（１ｙｓｉｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）［
トリス−塩酸１０ａ＋ｍｏｌ／　（：ｌ　（ＰＨ７，５
）　、ｘチレンシ７ミ＞四ＭＦａｔ　ト’Ｊ　＋’７ム
ー（Ｅ　Ｄ　ＴＡ　）　１０ｍｍｏｌ／Ω、食塩５０ｎ
ｍｏ　ｌ　／Ω、０．４％のドデシル−硫酸ナトリウム
にブロテイナーゼＫ〈ベーリンガー）２■を加えたちの
１の１０　ｉｆ中で培養される。リボヌクレアーゼＡ（
ベーリンガー）１１１１ｇを、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ／　
Ｑ含有の１０　ｍＭ　トリス−塩酸（ＰＨ７，５＞緩衝
液中に３７℃で１時間かかつて加え、ついでブロティナ
ーゼＫ（１ｍｖ、１時間、４２℃）で第二の消化を行う
。溶解物を、フェノール、クロロホルムおよびイソアミ
ルアルコール（３：　３　：　　０，０１ｖ／ｖ）の混
合溶媒１５１ノで３回抽出し、０．２ｍｏｌ　／Ωのト
リス−塩酸ＰＨ７，５で飽和する。この水をクロロホル
ム／イソアミルアルコール溶液（１：０．０４　）で３
回洗浄する。このＤＮＡを食塩１５０ｉ＋ｎｏｌ／　Ｑ
の存在下で無水エタノール２容量で沈澱させ、次いで８
０％のエタノール水溶液で洗浄する。

エン゛ヌクレアーゼによる゛ ウシＤＮＡの試料１５μｇを、トリス−塩酸ｉｏ。

ａｌｌｏｔ／　ｇ、食塩５０ｍｍｏｌ／　Ｑ　、　Ｍ　
（Ｊ　ＣＱ　２１０■０１／Ωを含有する培養緩衝液（
ＰＨ７，５＞中で、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
（ベーリンガー゛）によって３７℃で１８時間消化する
。ＤＮＡのμｇ当り全部で６〜１０単位を３回に分けて
加えることによっ″て完全に消化される。消化されたＤ
ＮＡ片は、トリス−酢ｉ１１　（ＰＨ８＞　　０．０４
ｍｏｆ／ｕ、！：ＥＤＴＡＯ，００２ｍｏｌ／　（：Ｉ
とを含有の緩衝液の０．７％アガロースゲル中で電気泳
動に付される。このゲルはＨｉｎｄｎＩにより消化され
たファージラムダＤＮＡ試料を含ませることによって目
盛りがつけられる。

ゲル中に含有のＤＮＡフラグメントを０．２５　Ｍ塩酸
中ｖ１で１５分間脱プリン化し、０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウム＋１．５Ｍｍ塩中で変性を起させ、ついで酸緩衝溶
液の１．５Ｍ　ｐＨ５，５（１５分間、３回）と０．１
５　ＭｐＨ５，５＜１５分間、３回〉をＮ続して通過さ
せて中和する。ついでこのゲルの上に「ナイロンＪ　Ｉ
Ｉ　（Ｈｙｂｏｎｄ　−Ｎ　　Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ又は
ｐａｌｌ　−３１ｏｄｙｎｅ　７Ａ　　Ｆ　１ｏｂｉｏ
　）を置くと、ゲル中に含有のＤＮＡフラグメントは毛
管現象で膜上に転移する。転移を２０ｘＳＳＣ中で１６
時間かけて行いその後膜を２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで洗浄し風
乾しついで８０℃のオープンに２時間入れる。

重ｌが１００〜２０００ｇで容積が１〜５Ａのプローブ
ｂ、Ｃ，１，２，を、次の反応混合物に加える＝５０μ
ｓｏｌのｄＡＴＰ　（ＩＪ＞　、５０μｍｏｌのｄＴＴ
Ｐ　（１４）　、５０μｍｏｌのｄＣＴＰ（１Ａ）、−
見 ５０μＣ１のα　　Ｐ−ｄＧＴＰ　（５Ａ）ならびにト
リス−塩酸ｐｓ　７．５　５００ｍａ＋ｏｌ／ｇ１ＨＯ
Ｃｎ２５００ａｍ＋ｏｌ／　Ｑおよびβ−メルカプトエ
タノール１００　ａ＋ｍｏｌ／　Ｑを含有の反応！１！
ｌｉ液２Ａ６゛反応は１６℃で１．５時間行われ、つい
でトリス−塩酸（ｐＨ７，５）　１０ｍｍｏｌ／　Ｍ　
、　Ｅ　Ｄ　ＴＡ８０ｍｍｏｌ／　Ｑおよび０，５％ド
デシル硫酸ナトリウム含有の溶液２００Ａを加えて反応
を止める。

放射性ラベルしたプローブはセファデックスＧ１００　
（Ｐ　ｈａｒｉａｃｉａ社製）のカラム（１０３Ｘ　１
３　）を通過させてヌクレオチドから分離され、トリス
−塩酸（ｐＨ７，５）　１０１１０１／、ｕ及びＥ　Ｄ
　ＴＡ　１　ｍｍｏｌ／ｇを含む緩衝液で溶離する。つ
いで最大の放射能を有する溶出液のフラクションをプー
ルする。

（以下余白） 備ハイブリッ゛乏成　びハイブリラドン５０％ｖ　／ｖ
　ｐＡイオン化したホルムアミド、食塩１１１１０１／
ρ、０．２％［）　ｅｎｈａｒｔ氏液、２．５％デキス
トラン硫酸、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム及び音波
処理したサケの精液Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５ｍｇ／ｘｌの混
合物でフィルタ＝（ｂｌｏｔｓ　）を４２℃で４〜１０
時間、予備ハイブリッド化する。

デキストラン硫酸が５％で、食塩が０．５　ｍｏｌ／Ω
である以外同じ混合物でハイブリッド形成が行われる。

　Ｐ−放射性標識したプローブを１００℃、１０分間変
性し、ＩＸ　１１０８Ｃｐ　／１１の比率でハイブリッ
ド形成混合物に加えるが、このプローブは１！当り約１
０ｎｇに相当する。ハイブリッド形成は４２℃で少なく
とも１８時間行われる。ハイブリッド形成後、このフィ
ルターを、最初、２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウムＱ、３ｍ
ｏｌ　／ｌおよびクエン酸ナトリウム０．０３ｍｏｌ／
　Ｑ　）　＋０．１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　金含有（１）ＩＩ
Ｉ衝Ｗｌ中で６５℃で３０分間洗浄し、ついで１０倍に
稀釈した同緩衝液（０，２ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）中で３０分
間洗浄する。

ついでこのフィルターを°’　Ｃｒｏｎｅｘ　”増圧機
（ＤＵＰＯＮＴ社製）をつけたカセットに入れる。

このカセットは、コダックＸＡＲ−５フィルムと接触し
ており、−７０℃で６〜２４時間の間放射能写真撮影す
る。

１へＬ乙ＬＬ丘監 この反応は３７℃、３０分間０．４Ｍ水酸化ナトリウム
で、ついでＱ、２ｍｏｆ　／　Ｑ　トリス−塩酸ｐＨ７
，５，０，１％（Ｖ　／Ｖ　）ドデシル硫酸ナトリウム
および０、ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ含有の溶液中でフィルター
を洗浄することにより行われる。

°ットープロット（ＤＯＴ−８０ＴＳ）の　゛（１）ゲ
ノムＤＮＡ　　ドット−プロット雄と雌ウシのゲノムＤ
ＮＡを５分間音波処理しくＢａｎ５ｏｎ　５ｏｎｉｆｉ
ｅｒ　Ｂ−１５）　、ライでデポジットされるＤＮ’Ａ
の全量が２μｇになるような比率で、音波処理したサケ
、の精液ＤＮＡで希釈する。

ウシＤＮＡの濃度の範囲は１Ａのデポジットに対してＩ
Ｊ、ｌｌ、０．５μＱ、０．２５μり、０．１μｇおよ
び０．０５μｑであった。

ｐａｌｌ　−Ｂｉｏｄｙｎｅ　　Ａ膜上にＤＮＡをデボ
ジットサｔ　ｔ；−後、コノ膜を０．５Ｎ　　Ｎａ　Ｏ
Ｈ＋　１．５ＮＮａ（１２で５分間処理し、ついで１．
５Ｍリン酸緩衝液ＰＨ５，５で５分間、２回、ざらに０
８３Ｍリン酸！ｌ衝液ｐＨ５，５で５分間中和する。そ
の後この膜ヲＷｈａｔｌｌｌａｎ　　３ＭＭ上で乾燥し
、ついでＤＮＡを８０℃で２時間固定する。このように
作製したフィルターは予備ハイブリッド化溶液中に４℃
で貯えられる。

（２）ウシ細胞のドット−プロット 雄及び雌ウシの末梢リンパ球を６分間音波処理し、つい
で４２℃で１時間プロティナーゼＫ（べ−リンガ−社製
）で処理する。希釈範囲は、２膚中ｌＸ１０’　、　　
５Ｘ１０’　、　　ｌＸ１０’　、　　５ｘ１０’　、
　　１Ｘ１０’および５Ｘ　１０３の１ａｌ胞に相当す
る。音波処理したサケの精液ＤＮＡは、全ＤＮＡＩＩが
２μｇになるように加えられる。

Ｐａ１ｌ　−Ｂｉｏｄｙｎｅ　　Ａ膜上にＤＮＡをデポ
ジットさせた後、ゲノムＤＮＡ　　ドット−プロットと
同じように処理する。

ドット−プロットのハイブリッド化とそのシグナルの可
視化は、一般のプロットと同様に行われる。

予め決定された配列に対応するオリゴヌクレオチドの化
学合成は固相でホスホラミダイト法により’　Ａ　ｐｐ
ｌｉｅｄ　　３１ｏｓｙｓｔｅ＋ｎｓ　”自動合成機を
使って行われた。

反応は各段階で９５〜９７％の効率なので最終生成物（
ブ０−ブｂ　、　Ｃ、１，２，−４９ｍａｒ　）は中間
体のオリゴヌクレオチドを除去して精製する必要がある
。水６０Ａ中オリゴヌクレオチドの混合物的７１ｍｇを
、７００．３ｇ１１Ａ、３時間で、２０％のポリアクリ
ルアミドと８ｍｏｌ／ｌの尿素含有のゲルの電気泳動に
付して分離する。４９１１１８ｒに相当するバンドがシ
リカゲルでコートされたアルミホイルで同定され、これ
は２５４ｎｌｌｌに蛍光を発する（メルク社）。ゲルの
この部分を切り取り、ついで酢酸アンモニウム０．５　
ｍｏｌ／ρとＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　５　ｍｍｏｌ／ρとを
含有の溶液１．５　ｙｆ中で、３７℃、１６Ｒ間撹拌し
ながら、ＤＮＡを溶離する。

上澄液を約３０Ｍまで濃縮し、次いでトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５）　１０ｍｍｏｌ／ｌ＋ＥＤＴＡ　　１ｍｍｏ
ｌ／ρ含有の緩衝液で平衡にされたセファデックスＧ−
５０（ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラム＜　１０ｃ
ｍ　Ｘ　　Ｉｃｍ　）を用いて尿素を除去する。この方
法で単離されたＤＮＡは凍結乾燥し一２０℃で貯えられ
る。

プローブｂ、ｃ、　　１．　２．１０〜２０ｐｍｏ　ｌ
　／　３ρを反応混合物２３ｄ中に加える。この反応混
合物は、１００ｍｃａｌ／　Ｑジチオトレイトール（２
，５，Ｊ　）　、　１０ｍｍｏｌ／＊スペルミジン（２
，５，１１１２）、及び５００Ｉｌ１ｍｏ　ｌ／Ｒトリ
ス−塩１ｇｐＨ７，５と１００ｍｍｏｌ／　４塩化マグ
ネシウム＜２．５ｄ）を含む培養緩衝液、アデノシン三
リン酸　１００μｃｉ（γ−３２Ｐ）−Ａ下ｐ　３００
０ｃ　ｉ／　ｍｍｏｌ　（Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ社製〉−
及びＴ４ポリヌクレオチド　キナーゼ２０Ｕ（ベーリン
ガー社製）からなる。３７℃で３０分培養した後、反応
を４ｏｎｍｌｖｌ　Ｅ　ＤＴＡ２ｄで止めて、標識化し
たオリゴヌクレオチドをセファデックスＧ−５０のカラ
ムクロマトグラフィにより前記ＡＴＰから分離する。

ａ）下位の鎖（方向３−→５−） プラスミドｂ、ｃ、　　１．　２．の３θμｇをエンド
ヌクレアーゼ）−１ｉｎｄｌｌにより３時間、３１℃で
（切断）消化する。フェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール混合物（３：　　１：　　Ｑ、０１　　
ｖ／ｖ　）で抽出して、酵素を除く。その盪、０，３　
ｍｏｌ／　４酢酸ナトリウムの存在下、イソプロパツー
ル１容中に、ＤＮＡを沈澱させ、ついで８０％エタノー
ル水溶液で洗浄する。

巻き戻されたプラスミドのＤＮＡは、末＠酵素トランス
フェラーゼを用い、アメルシ７ム社製のキット（ｋｉｔ
　）　Ｎ４０２０号の方法により、３−位に、Ｐ−ジデ
オキシアデノシン三リンＭ　（ＳＡ−３０００ｃｉ／’
　ｍｍｏｌ　）で標識をつける。

プラスミドのＤ　Ｎ　Ａ　　　　　　　　４０．Ｊｄｄ
Ａ丁Ｐ　（１２５μｃｉ）　　　　　　　１３貸アメル
シＶム社製緩衝液Ｘ１０　　　１０．！！蒸留水　　　
　　　　　　　　　　９５Ａアメルシャム社製醇素溶液
　　　　５Ａ培養：３７℃でｉｉ間 次いで標識プラスミドを、セファデックスＧ７５を通過
させることによって、ヌクレオチドから分離し、ついで
エンドヌクレアーゼｌ：ｃｏＲＩで消化され、それぞれ
大きさが２．６及び０．１ｋｆｉのフラグメントを生成
する。０．１ｋｂのフラグメントは挿入したす、ｃ、　
　１．　２．を含み、２％アガＯ−スゲル中電気泳肋に
付して単離される。ついでグラスウールを通し、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物で抽
出して精製する。

精製したフラグメントはマクサム−ギルバート法のＮ、
Ｅ、Ｎ、社による変法により配列される。

配列されるべきフラグメントは、マクロホールＦ　Ｍ　
ａｃｒｏｐｈｏｒｅ　）　Ｌ　Ｋ　８細胞（Ａ　ｎａｌ
、　　３１ｏｃｈｅａ＋、、　１１５　（４５０〜４５
７）　１９８０．　ＧａｒｏＨ及びＡ　ｎｓｏｒｇｅ）
上で、ポリアクリルアミドを５％、　８％、１２％含有
のゲル０．２Ｈの電気泳動法により分析される。濃度に
より移動時間が６〜７時間と２時間であった。

ついでこのゲルを１０％酢酸で１０分間固定し、水で洗
浄して、’ｌで乾燥する。

ゲルのオートラジオグラフィは、ＵＲＮＯＨ８９０フイ
ルム上で露出時間が２４．４８および７２時間で行われ
る。

ｂ）上位の鎖（方向５′→３−） １番目の消化酵素がＥＣ０Ｒｒで２番目がＰＶＵ■であ
ることを除けば、この方法は同じである。

ボス舅の咥乳類の末梢リンパ球から得られるプローブｂ
、ｃ、１．　２．のヌクレオチド配列は、次のような４
９塩基対： ユニ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ユニ
ＡＴＣＡＧ　ＴＣＣＡＧＧＧ　ＡＣＣＧＡＧ　Ａ　ＴＧ
ＴＧ　ＣＴＣＣＡ　Ａ　ＧＧ　Ａ　ｃ’ｒｃＴ’ｒ’ｒ
Ａ　ＴＣＧＧ　ＣＴＧ　ＣＴｓ で構成されているが、この配列が決定されたことによっ
て、上記実施例４に記載したようにプローブを合成する
ことが可能になったのである。

この発明によるプローブｂ、ｃ、　　１．　２．は高度
な感受性を有し、ＰＡＬＬ　　ＢＩＯＤＹＮＥＩＩＩで
行われるテストでウシのＤＮＡは５０ｎｑｌで十分に陽
性のシグナルを与える。

実施例６ Ａ、ウシ精液由来のＤＮＡ製造 約１５〜２０Ｘ　１０’凍結精子を含有するストロ−を
各々、３１℃で約３０秒間水浴に直接つける。ついで各
ストロ−の内容物を無菌のＰＢＳ　（リン酸緩衝液）　
１〜２ｍｌで希釈する。台管はｓｏｏｇで１０分間遠心
分離する。上澄液を除き、残渣を無菌のＰＢ５１〜２１
ノ中に採取する。この洗浄工程を４回くり返す。最後の
遠心分離後、精子の残漬を０．０１ａ＋ｏｌ／ｇトリス
ー塩Ｍｐｓ　　８．Ｑ、　　０．１ｍｏｌ　／ｌ塩化ナ
ト’）’）ム、　　０．Ｏ１ｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ、　　
１％ＳＤＳ及び２％β−メルカプトエタノール含有の溶
解！１暫液１０１！に再懸濁する。この緩衝液は予め５
０℃に加熱しておく。５０℃で３０分培養した後、２ｍ
ｇのブロテイナーゼＫ（最終濃度＝２００μｇ／ｘｌ）
を多管に加え５０℃で２ｔｊ：ｆ間ゆっくり撹拌しなが
ら培養を続ける。

ついで０．２１オ／ｌトリスＰＨ７，５で飽和したフェ
ノールの５０％と、クロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２４：１）の５０％とからなる溶液１５１！で、上
記混合物を空温で１５分間抽出する。下層の有機相を除
き抽出をさらに２回くり返す。

ついで水相をクロロホルム／イソアミルアルコール混液
（２４：１）で室温、１５分間、２〜３回抽出する。最
後の抽出後、水相を２０００ｇで３０分遠心分離にかけ
て全クロロホルムと沈澱した蛋白質を除去する。ついで
、透明にされた上澄液を予め一２０℃に１５分間冷却し
た無水エタノール２Ｔ容と混合する。ＤＮＡが沈澱する
と、無菌のピペットで回収し、７０％エタノール内で５
分間洗浄する。過剰のアルコールを留去しＤＮＡを０．
００１ｍｏｌ　／ρトリスー１酸ＰＩ−１８，０と０．
０ＯＯｉＩｌｏｌ／　Ｑ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有の無菌緩
衝液に溶解する。

Ｂ、制限エンドヌクレアーゼによる消化ウシ精子ＤＮＡ
の試料１５μ９を３７℃で１８時間１００１０１／ｌト
リス−塩酸、　５０！ｍｏｌ／　（：ｌ塩化ナトリウム
および１０ｍｍ＋ｏｌ／　０塩化マグネシウム含有の培
養緩衝液、　ＰＨ７，５中、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ（ベーリンガー社製）で消化する。ＤＮＡのμ
ｇ当り６〜１０単位を３回に分けて添加することによっ
て完全な消化がなされる。消化されたＤＮＡフラグメン
トは、０．０４ｔａｏｌ／　Ｑ　トリス−酢酸ｐＨ８と
０．００２１０１　／　ｕ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有の緩衝
液中０．７％アガＯ−スグルの電気泳動に付される。こ
のゲルはＨｉｎｄＩ［Ｉで消化されたλフアージＤＮＡ
試料を含有させることによって目盛りが付けられる。

転　　移 このゲルに含有されるＤＮＡフラグメントは、０．２５
　Ｍ塩酸中室温で１５分間脱プリン化し、０．５Ｍ水酸
化ナトリウム＋　１．５Ｍ塩化ナトリウムで変性し、つ
いで１．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，５（１５分。

３回ンを連続して、ざらに０．１５　ＭＰＨ５，５（１
５分。

２回）を通過させて中和する。このゲルの上に［ナイロ
ンＪ　１１！　（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　　７メ）Ｌｔシｖ
ム社Ｈ又はＰ　ａｌｌ−Ｂ　１ｏｄｙｎｅ　−Ａ　　フ
ロビオ社製）を１き、ゲルに含有されているＤＮＡフラ
グメントは毛管現象で膜上に転移する。１６時間、２０
ｘＳＳＣ中で転移した後、膜を２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで洗浄
し、風乾後、８０℃のオーブンに２時間入れる。

プローブの３２ｐによる標識化 プローブｂ　、　ｃ　、　　１．２．１００〜２００ｎ
ａ／　１〜５Ａを下記の反応混合物に加える： ５０μｍｏｌ　　ｄＡＴＰ　　　　　　　　　１肩５０
μｎ＋ｏｌ　　ｄＡＴＴＰ　　　　　　　　１Ａ５０μ
ｍｏｌ　　ｄＣＴＰ　　　　　　　　　１Ａ５０μｃｉ
　　α−”Ｐ−ｄＧＴＰ　　　　　　５膚反応ｔ１衝液
　　　　　　　　　　２４５００ｍａ＋ｏ　ｌ　／ρ　
トリス−塩酸　ｐＨ７，５５００ｍｇ＋ｏｌ／　４　　
塩化マグネシウム１００ＩＩＩＩＩＯ１／ｇ　　β−メ
ルカプトエタノール反応は１６℃で１．５時間行われ、
１０メｍｏ　ｌ　／ρトリスー塩ｙ１．Ｈ７，５，８０
ｍｍｏｌ／　Ｑ　Ｅ　Ｄ　Ｔ△および０．５％ドデシル
硫酸ナトリウム含有の溶液２００Ａを加えて反応を止め
る。

放射能で標識を付したプローブを、セフ？デツクスＧ１
００（ファーマシア）のカラム（１０ａａＸ１０）を通
過させることによってヌクレオチドから分離して１０８
１１００１／　ｕのトリス塩酸ｐ１４７．５と１ｍ１Ｉ
Ｏｌ／ｌのＥＤＴＡ含有の緩衝液で溶離される。ついで
もつとも放射能の高い溶出液のフラクションをプールす
る。

Ｃ１予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成フィル
ター（プロット〉を、５０％Ｖ／Ｖ脱イオン化したホル
ムアミド１ｍｏｌ　／ρ塩化ナトリウム。

０．２％デンハルト氏液（Ｑ　ｅｎｈａｒｔ）　、　　
２．５％デキストラン＠５ｇ、　　０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム及び０．５ｒＡＱ／’１１音波処理したサ
ケ精子ＤＮＡ含有の混合物で、４２℃、４〜１０時間予
備ハイブリッド形成が行われる。

デキストラン硫酸が５％で、塩化ナトリウムが０．５ｍ
ｏｌ　／　Ｑ以外同じ混合物内でハイブリッド形成を行
う。　Ｐ−放射性標識をつけたプローブを、１００℃で
１０分間変性させ、ＩＸ　１０’　ＣｐＨｌ　／１１の
比率で前記ハイブリッド形成混合物に加える。この比率
は１！当り約ｉｏｎｇのプローブを示す。ハイブリッド
形成は４２℃で少くとも１８時間行われる。ハイブリッ
ド形成させた後、フィルターをまず２ｘＳ３　Ｃ（０，
３ｍｏｌ　／　Ｑ塩化ナナトリウムび０．０３ｍｏｌ／
１２クエン酸ナトリウム）＋０．１％ＳＤＳ含有の緩衝
液で６５℃で３０分洗浄し、さらに同じ緩衝液を１０倍
希釈した液（０，２ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）で３０分間洗浄す
る。ついで得られたフィルターを’　ＣｒｏｎｅＸ　”
増圧機（デュポン社）を備えたカセット内に入れ、−７
０℃で６〜２４時間、オートラジオグラフィ用のコダッ
クＸＡＲ−５フィルムに接触させる。

Ｄ。結果 制限酵素ＥｃｏＲｒで消化し、放射性標識をつけたプロ
ーブｂ、Ｃ，１，２’、とハイブリッド形成させたウシ
精子ＤＮＡは、本発明者らがテストした他のウシの細胞
で得られたのと類似したハイブリダイゼーシヨン・プロ
ファイルを有する。

実施例７ ＡＮＤごチオン標識プローブ（非放射性プローブ）゛Ａ
、細胞の作製 使用する細胞は７〜８日令のウシ胚由来のものである。

解剖後、細胞をスライドに載せ、アルコ゛−ル／酢Ｈ（
３：　ｌｖ／ｖ　）混液のような、固定溶液中で１０〜
１５分培養し、風乾する。このスライドはすぐ使用する
か又は後で性決定する場合には、はこりから保護し、−
４℃で保管しておく。

Ｂ、ビチオンによるプローブの標識化 挿入す、ｏ、　　１．　２．を含有するプラスミドｐＵ
ｃ９のフラグメントが使用され、全フラグメトは３５０
ｂｐになる。この３５０ｂｐフラグメントは、制限酵素
ｐｖｕｍで消化し、アガロースゲルの電気泳動で７ｔＨ
製し、ゲルからＤＥＡＥ　　ＮＡ４５膜（３ｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ、　　５ｃｈｕｅｌ１社製）上に吸収させて抽
出することによって得られる。

最終容積が０，０５０ｚｆの下記成分の組成物を用いる
、ニックトランスレーション法によって、ビオチンでプ
ローブに標識を付けた。

ｄＡ　Ｔ　Ｐ　、ｄＧ　Ｔ　Ｐ及びｄｃＴＰ　　各々Ｑ
、２ｍｍｏｌＢＲＬ　　ＤＮＡポリメラーゼＩ　　Ｏ，
４ｕｎｉｔ／、ＪＤＮアーゼＩ　　　　　　　　　　　
４ｏｐｇ／’ｄ標識をつけるべきＤＮＡ　　　　　　　
　１μＱビチオンで標識をつけたｄＵ　Ｔ　Ｐ　　　Ｏ
，４ｍｍｏ１１５℃で９０分間培養をして、３００ｍｍ
ｏ　Ｉ　／ΩＮａ２ＥＤＴ△＋５％ＳＤＳ　（ＢＲＬ　
ｐｒｏ℃ｏｃｏｌ）テ反応を止める。

標識をつけた後、プローブをセファデックスＧ−１００
カラムのゲル濾過法で精製する。集めた種々のフラクシ
ョンを、ストレブトアどジン−アルカリ性ホスファター
ゼ　システム（ＤＮＡ検出システム　ＢＲＬ参照番号　
Ｂ２３９ＳＡ）により別々に分析する。

陽性のフラクションを混合して、このプールしたものの
活性をごオチン標識したＤ　Ｎ　Ａの既知量と比較して
測定する。

Ｃ，スライド上でのハイブリッド形成方法スライドをハ
イブリッド形成液９０〜１００Ａとともに培養し、プラ
スティックフィルムで覆う（蒸発を防ぐため）。

１００℃のオーブンで１０分間変性した後、スライドを
湿り槽の中に入れ４２℃で１６時間培養する。。

ハイブリッド形成液の最終組成は次のとおりである。

４ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｇ Ｉｍｍｏｌ／４　　ＥＤＴＡ ２Ｓｒｓｒｎｏｌ／　（ｌ　　ト’Ｊ　ス塩ＭＰＨ７，
３１×デンハルト氏液 １０％デキストラン ５０％脱イオン化したホルムアミド プローブ：　８０ｎｇ／　ｘｌハイブリッド形成培地（
ｌＸ５ＳＣ＝　０．１５　Ｍ塩化ナトリウム、　　ｏ、
ｏｉｓＭクエン酸ナトリウム）（１×デンハルト氏液＝
０．０２％ＢＳＡ又は０．０２％スキムミルク粉末。

０．０２％ポリビニルピロリドン及び０．０２％Ｆｉｃ
ｏｌｌ） プラスティックフィルムを除いてスライドを次の溶液で
連続して洗浄する：　　２ＸＳＳＣ＜１ｆｆｉで３０分
）、次に　０，１ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（４２℃で３０分）、
２×ＳＳＣ（空温で１５分）最後に０．１％ｖ／ｖトリ
トンＸ　−１００と０．５％（Ｗ／Ｖ）スキムミルク粉
末（Ｒｅｇｉｌａｉｔンを加えたＰｕｓ　　ｐＨ７’、
４゜Ｄ１発生（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ） 過剰の液体を除去後、まだ湿り気のあるスライドをアン
チビオチンヤギ抗体又はアンチビオチンラビット抗体と
３７℃で１時間培養する。この抗体はアフィニティ　り
ロマトグラフイーでＩＩＩした状態で販売されティて（
Ｖ　ｅｃｔｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ参照番号
　Ｓ　Ｐ　−３０００）　、本願発明者らのテストでは
、０．１％（ｖ／ｖ　）　トリトンＸ−１００と０．５
％（Ｗ／Ｖ）スキムミルク粉末を加えたＰＢＳｓ＋７．
４で１：３５０に希釈したものを使用する。

０．１％（ｖ／ｖ　）　トリトンＸ　−１００と　０．
５％（Ｗ／Ｖ　）スキムミルク粉末を加えたＰＢＳｐ４
１７．４中で空温１５分洗浄した後、スライドを、０．
１％トリトンと０．５％スキムミルク粉末を加えたＰＢ
Ｓｐ１４１．４で１＝４０に希釈した、ペルオキシダー
ゼ（“Ｂ　１ｏｓｙｓ参照番号　８１２４０３）とカッ
プリングした通常のアンチヤギ抗体もしくは通常のアン
チラビットヤギ抗体と共に３７℃で１時間培養する。

ついでスライドをＰＢＳＰＨ７，４中、１５分間ずつ２
回洗浄し、この時ＰＢＳは０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含んでおり、ＲｖｌにはＰＢＳｐ１４７．４中
で５分間洗浄する。

このスライドを、０．０１％の過酸化水素を含むＰＢＳ
Ｐ１４７．４中に０．５１１１（１／　Ｑのジアミノベ
ンチジン（ＤＡＢ　　ＳＩＧＭＡ参照番号　□　ａｏｏ
ｉ　）を含有する溶液と共に、室温で５〜８分間培養す
る。

ペルオキシダーゼとＤＡＢの反応によって形成される沈
殿物の量は、Ｂ　ｕｒｎｓらの記載の方法に従って金や
銀塩の連続沈澱法により増加する（Ｊｏｕｒｎａｌ　　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｏｙ、　　１９８５
．３５゜１０８５−１０９２　）。

第一工程では、２．５１Ｍ塩化金酸ナトリウム（Ｎａ　
Ａｕ　Ｃｌ　４　　ＢＤＨ参照番号３０１２５２Ｒ’）
溶液５０〜１００ｄを各スライドの上にデポジットし、
そのスライドを５分間ｖ温で培養する。蒸溜水中で５分
間洗浄後、スライドを硫化ナトリウム（Ｎａ　２　Ｓ、
Ｓ　ＩＧＭＡ参照番号　５２００６）（１）０．１Ｍ溶
液５０〜１００ｄと共に空温で５分間培養し、蒸留水で
５分間ゆすぎ、恨試薬１００〜３００．Ｊと共に４〜８
分間培養する。

銀試薬の組成は次のようである： Ａ　　ｒＡ酸ｉ−ト’）　ラム０．２４ｍｏｌ／　Ｑ（
ＳＩＧＭＡ　　参照番号　Ｓ　４１３２　）Ｓｔ硝酸ア
ンモニウム　　　　１３ｍｍｏｆ／　Ｑ（ＳＩＧＭＡ　
　参照番号　Ａ　９６４２　）Ｂ２硝酸銀　　　　　　
　　　６ＩＩＩｌｌＯＩ／ｇ（ＢＤＨ参照番号　３０３
８７３Ｎ　＞Ｂ３ドデカ珪タングステン酸　　１，５■
ｏｌ／　Ｑ（ＢＤＨ参照番号　３０５４５３Ｒ） ８４３７％ホルムアルデヒド　　　０．６ｄｌ／１１（
ＳＩＧＭＡ　　参照番＠ｌ”１６３５）銀試薬は、撹拌
しながらＢＬ　、　Ｂ２　、　Ｂ３　。

Ｂ４を連続的に混合して調製される。得られた混合物を
Ａ溶液に　１＝１の割合で加え、このようにしてｌ！Ｉ
′！！Ｊされた混合物が直接使用に供される。

銀試薬で処理した後、スライドを蒸留水で１５分間洗浄
し、ついで１％（Ｖ／Ｖ　）酢酸中で１５分ずつ２回、
最後に１％ｐｙｒｏｎｉｎ　　Ｙ　（Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ参
照番号　Ｐ４Ｏ１０）水溶液で１分間染色し、蒸留水で
数秒間ゆすぎ、熱風乾燥し、ＤＰＸｌ、：載せる。

Ｅ、精子の結果 ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成後、特異的標識の存在
が、精子上に検出できる。バックグラウンドはＭ？ｌＩ
できる。精子の頭部の容積の増加は精子のデコンデンセ
ーシヨン（ｄｅｃＯｎｄｅｎｓａｔ　ｉｏｎ　）の証拠
である。

ｉｎ　５ｉｔＵハイブリツド形成後、この標識の存在は
光学顕微鏡で観奈される。この特異的標識は雄細胞の約
８０〜１００％に検出でき、雌細胞には全く存在しない
。この標識は、雄細胞レベルの核のところに黒褐色の沈
澱としてあられれる。

１１匹１列１Ｌ Ａ、細胞の製造 用いた細胞は凍結された雄ウシの精子で液体窒素内に保
存されている。１ストロ−すなわち約１３．０００，０
００の生精子が解凍される。数ストロ−を３０秒間３７
℃で再加熱しその精子を１１！の殺菌ＰＢＳで希釈する
。

凍結媒体を最大限に除去するため、一連の遠心分離が行
われる。精子のＰＢＳ懸濁液をまず１０分間５００ｇで
遠心分離し、上澄を吸引除去し、得られた精子を１１１
の０．１１　Ｍクエン酸ナトリウム溶液に採取する。得
られた混合物をｓｏｏｇで１０分間遠心分離し、上澄を
吸引除去し、残漬を０．１１　Ｍクエン酸ナトリウム＋
　５％ＤＭＳＯの１鱈に採取し、得られた混合物を１０
分間５００ｇで遠心分離する。上澄を吸引除去し、残渣
を、０．１１　Ｍクエン酸ナトリウム＋１５％ＤＭＳＯ
の１１！に・再懸濁させる。ＷＩられた混合物を１０分
間５００ｇで遠心分離する。上澄を吸引除去し、残渣を
、０．ｉｔ　Ｍクエン酸ナトリウム＋５０％ＤＭＳＯの
１１！中に再懸濁させる。得られた混合物を１０分間５
０００で遠心分離する。上澄を吸引除去し、残漬を０．
１１　Ｍクエン酸ナトリウム含有の０．ＩＭ　トリス・
塩１ｐＨ７，４の１１ｊ中に再懸濁させる。得られた混
合物を１０分間５００ｇで遠心分離する。上澄を吸引除
去し、残渣を同じ！ｌ衝液の２５０Ａ中に再懸濁させる
。

この段階において、細胞はスライド上にデポジットさせ
て（各スライド上に３０〜４０．、Ｊの精子懸濁Ｆ＆）
、ビオチンで標識をつけたプローブで、１ｎｓ１℃Ｕ′
ハイブリッド形成法によって処理するか、又はフィルタ
ー上にデポジットさせ、ドット−プロット法によって１
つの放射性ヌクレオチドで標識が付されたプローブとハ
イブリッドを形成させる。

Ｂ、　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成用スライドの予
備処理 精子をデポジットさせた後、スライドを風乾し、下記手
段によってデコンデンスされる。

１）スライドは、塩化カリウムの０．０８　Ｍ溶液を用
いて、５分間空温で低張ショック法に付される。次いで
精子はメタノール／酢酸混合物（３：１）中で３０分間
固定される。内在ペルオキシダーゼの活性を除くために
、スライドをメタノール＋３．３％のＨ２Ｏ２で３０分
間処理し、次いで無水エタノールで１０分間、キシレン
で１０分間および無水エタノールで１０分間すすぐ。

２）風乾後、４０１Ｊのバパインノ溶液（２ｍｍｏ　Ｉ
　ｖＬ化ナナトリウム含有０．１Ｍトリス９Ｈ８，６で
活性化されている）　（またはブロティナーゼにもしく
はトリプシン）を各々スライド上にデポジットさせる。

３）３７℃で１５分間培養後、スライドをＰＢＳ中でか
るくすすぎ、次いで１％のＤＭＳＯもしくはＳＤＳと、
ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノールなどの
ようなジスルフィド結合の還元剤の４０ｍｍｏ　Ｉを含
有するトリスの０．１Ｍ溶液ｐＨ８，６中、空温で１５
分間塔培養る。次いでスライドをＰＢＳ内で５分間ずつ
３回洗い風乾する。この段階でスライドは変性およびｉ
ｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成させることができる。

Ｃ，スライド上でのハイブリッド形成 前記スライドを９０〜１００Ａのハイブリッド形成液中
で培養し、プラスチックのフィルムで覆う（蒸発を防止
するため）。

１００℃のオー７２９１０分間変性させ、スライドを湿
り箱内に置いて４２℃で１６ＦＲ間培養する。

ハイブリッド形成液の最終的な組成は次のとおりである
。

４Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ １ｔａｍｏ１／　ＱのＥＤ丁Ａ ２５ｍｍｏｌ／　Ｑのトリス・塩１１ｇＰＨ７，３１×
デンハート氏液 １０％のデキストラン ５０％の非イオン化ホルムアミド プローブ：８０ｎｇ／ｚｆハイブリッド形成培地注：　
　１ｘＳＳＣ−０，１５ＭＮａ　Ｃ１、０，０１５Ｍク
エン酸ナトリウム １×デンハ一ト氏液−０，０２％の８３Ａもしくは０．
０２％の脱脂乳、　　０．０２％ポリビニルとロリドン
および０．０２％のｌ”１ｃｏｌｌプラスチツクフイル
ムを除き、スライドを下記の溶液で連続して洗浄する。

すなわち２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（室温で３０分間）、０．１
ｘｓｓｃ（４２℃で３０分間）、２ｘＳＳＣ（室温で１
５分間）および最後にＰＢＳｐＨ７，４（これには０．
１％　ｖ／ｖのトリトンＸ　−１００と０．５％（Ｗ／
Ｖ）の脱脂乳粉末（レジレイト、　Ｒｅｇｉｌａｉｔ　
）を添加しである〕で洗浄する。

Ｄ１発生 過剰の液体を除去した湿ったスライドを、アンチビオチ
ン（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｎ）ヤギ抗体もしくはアンチビ
オチンラビット抗体とともに３１℃で１時間培養した。

この抗体は親和性クロマドグうフィで精製した形態で販
売されており（ベクトル・ラボラトリイズ参照番号　５
Ｐ−３０ｏＯ）　、ＰＢＳＰ１４　７．４＋０．１％（
Ｖ／Ｖ　）のトリトンＸ　−１００＋　　０．５％（Ｗ
／Ｖ　）の脱脂乳粉末混合液で１　：　３５０に希釈し
て本願の試験に用いられる。

ＰＢＳｐｓ　　７，４＋　０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリト
ンＸ−１０＋　０．５％（ｗ／ｖ）の脱脂乳粉末中で室
温で１５分間洗浄した後、スライドを、ペルオキシダー
ゼ（Ｂ　１ｏｓｙｓの参照番号Ｂ　Ｉ　２４０３）にカ
ップリングされた通常のアンチヤギラビット抗体もしく
は通常のアンチラビットヤギ抗体をＰ　Ｂ　Ｓ　ＰＨ７
，４＋０．１％トリトン＋０．５％脱脱脂粉乳台物で１
：４０に希釈したものとともに、３７℃で１時間培養す
る。

次いで得られたスライドをＰＢＳｐＨ７，４内で１５分
間ずつ２回洗浄する。この場合ＰＢＳｐ８７．４は・０
．１％（Ｖ／Ｖ　）のツイーン２０を含有し、最後にＰ
８ＳＰＨ７，４中で５分間洗浄する。

得られたスライドを、ジアミノベンチジン（ＤＡＳ　　
シグマ、社参照番号　［）　８００１　）を０．５１１
１ｇ／′Ｉ！含有する、０．０１％Ｈ２Ｏ２含有のＰＢ
ＳｐＨ７，４の溶液とともに室温で５〜８分間培養する
。

ペルオキシダーゼとＤＡＢの反応によって形成された沈
澱の量は、３　ｕｒｎｓら（Ｊ　ｏｕｎａｌＣｌｉｎｉ
ｃａｌ　　Ｐａｔｈｏｌｏａｙ、　　１９８５　、≦１
１０８５−１０９２）が記載の方法にしたがって金と銀
の塩を連続的に沈澱させることによって増大される。

第１段階で塩化金酸ナトリウムの （Ｎａ　Ａｕ　Ｃ１、、ＢＤＨ社参照番号３０１２５２
Ｒ”）２．５　ｍＭ溶液の５０〜１００Ａを、各スライ
ド上にデポジットし、次いでそのスライドをＭｍで５分
間培養する。蒸留水で５分間洗浄後、スライドを、ナト
リウムスルフィド（Ｎａ　２　Ｓ、シグマ社参照番号３
２００６）の０，１Ｍ溶液の５０〜１００４とともに室
温で５分間培養し、蒸留水で５分間すすぐ。次いで１０
０〜３００ｄの銀試薬とともに４〜８分間培養する。

ｍ試薬の組成は次のとおりである。

Ａ　炭酸ナトリウム　　　　　０．２４ｍｏｌ／Ω（シ
グマ社　参照番号　３４１３２　）Ｂ１硝酸アンモニウ
ム　　　　１３ｒａｒａｏＩ／　Ｏ（シグマ社　参照番
号　Ａ　９６４２　）Ｂ２硝酸銀　　　　　　　　　６
ｍｍｏｌ／ｌ（ＢＤＨ社　参照番号　３０３８７３Ｎ　
＞Ｂ３ドデカ珪タングステン酸　　１．５ｍｍｏｌ／　
Ｑ（ＢＤＨ社　参照番号　３０５４５３Ｒ）８４３７％
ホルムアルデヒド　　０．６４／ｘｉ（シグマ社　参照
番号　Ｆ　１６３５　）銀試薬は、溶液Ｂ１．８２．Ｂ
３およびＢ４を撹拌しながら連続的に混合して作製され
る。得られた混合物を溶液Ａに　１：１の比率で添加し
、このようにして作製した試薬を直ちに使用する。

銀試薬で処理した後、スライドを蒸留水で１５分間洗浄
し、次いで１％（Ｖ／Ｖ　）酢酸中で１５分間ずつ２回
洗浄し、最後に、ビＯニンＹ　（ＰｙｒｏｎｉｎＹ、シ
グマ社参照番号Ｐγ０１γ）の１％水溶液中で１分間染
色し、蒸留水中で数秒間すすぎ、熱屓乾燥し、ＤＰＸ上
にのせる。

上記の記載事項は特に、人工精液注入法に精子を用いる
ために、ウシの胚の性を決定し、精子集団中のＹ染色体
の存在を検査し、前記集団を、Ｙ染色体とＸ染色体とを
それぞれ含有する２つのグループに分離する際のプロー
ブｂ、ｃ、　　ｉ、２゜の機能について言及しているが
、他の動物が、前記ウシの胚の配列に類似の、雄の性に
対して特異的な［）ＮＡの配列を示すならば、この他の
動物にこの機能を広げることができ、その上、上記のプ
ローブｂ、ｃ、　　１．　２．の機能は制限なしの例に
よってのみ与えられ、その雄の性に対して特異的な他の
配列の研究に広げることができることは容易に理解でき
るであろう。

前記記載から明らかなように、この発明は、より明確に
記載された実施例や応用例の方法に決して限定されるも
のではなく、それどころか、この発明の範囲から逸脱す
ることなく当業者が考えうるすべての変形も含むもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特にウシの亜科に属し、ことにボス属の反芻動物の
   雄ゲノムに対して特異的なＤＮＡの分子プローブであつ
   て、適切な酵素によつて消化された雄ゲノムＤＮＡとの
   ハイブリダイゼーシヨンによつて決定されるハイブリダ
   イゼーシヨン・プロファイルを有し、このプロファイル
   によつて問題の反芻動物の雄ゲノムに対して特異的な少
   なくともひとつのバンドの存在が明示され、特に、前記
   ハイブリダイゼーシヨン・プロファイルが、該プローブ
   とＥｃｏＲ　 I で消化された雄ゲノムＤＮＡとのハイ
   ブリダイゼーシヨンで決定され、そのハイブリダイゼー
   シヨン・プロファイルによって、ボス属の雄ゲノムに対
   して特異的な７ｋｂのオーダーのバンドの存在が明示さ
   れる分子プローブ。 ２、下記の５′−３′ヌクレオチド配列： 【ヌクレオチド配列があります】 とその相補的配列とを有する４９の塩基対、または少な
   くとも１１の連続したヌクレオチドを有する前記配列の
   フラグメントもしくはこのフラグメントと少なくとも７
   ０％の相同性を示す他のいずれかのフラグメントからな
   り、ｂ、ｃ、１、２、と命名される特許請求の範囲第１
   項の分子プローブ。 ３、前記プローブがボス属の雄ゲノム中に少なくとも２
   ０００回反復されている特許請求の範囲第１項の分子プ
   ローブ。 ４、下記段階 第１段階：前記反芻動物の末梢リンパ球由来の雌ゲノム
   ＤＮＡを音波処理で切断して２００〜５５０塩基対（ｂ
   ｐ）のフラグメントとし、次いで同じ反芻動物の雄ゲノ
   ムＤＮＡと１００：１のオーダーの比率で混合し、付着
   端を有し大きさが４０〜１６５０ｂｐの制限フラグメン
   トを放出させるためにエンドヌクレアーゼＳＡＵ３Ａで
   消化し； 第２段階：前記のＤＮＡ混合物を公知の方法で、フェノ
   ール／クロロホルム／イソアミルアルコールの混合物で
   抽出後、エタノールで沈澱させ、１００℃で変性させ、
   次いで２１ｍｌ／ｌの（ＮＨ＿４）＿２ＳＯ＿４、５０
   ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝６．８）およ
   び５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ含有の緩衝液中、６８℃で
   ２２時間かけて再結合させ；第３段階；再結合して二重
   鎖にされたＤＮＡを、まずエンドヌクレアーゼＢａｍＨ
   I で巻き戻し次いでアルカリホスファターゼで脱リン
   酸化して、プラスミドｐＵＣ＿９（Ａｍｐ＾ｒ−Ｌａｃ
   Ｚ＾＋）のようなプラスミドと混合し、リガーゼＴ＿４
   の存在下で１６℃で１６時間接触させることによつて該
   プラスミドにＤＮＡを挿入し；および 第４段階：第３段階で得た組換え体プラスミドが、高度
   に受容可能にされたエシユエリヒア・コリ細胞を形質転
   換するのに用いられ、組換え体クロン（Ａｍｐ＾ｒ−Ｌ
   ａｃＺ＾−）が、２ｍｌの細菌細胞懸濁液当り約２００
   クローンの比率で得らることからなる、 一重鎖にされたゲノムＤＮＡセグメントが、雌ＤＮＡが
   雄ＤＮＡ１部あたり１００部のオーダーの大過剰で存在
   する、雄と雌のＤＮＡの混合物から再結合される、特に
   ウシの亜科に属し、ボス属の反芻動物の雄ゲノムに対し
   て特異的なＤＮＡの分子プローブの製造方法。 ５、エシユエリヒア・コリの細菌細胞が、組換え体プラ
   スミドを挿入する前に、１０ｍｍｏｌ／ｌのＫ−Ｍｅｓ
   （ｐＨ＝６．２）、１００ｍｍｏｌ／ｌのＲｂＣＩ＿２
   、４５ｍｍｏｌ／ｌのＭｎＣＩ＿２および３ｍｍｏｌの
   〔Ｃｏ（ＮＨ＿３）＿６）ＣＩ＿３を含有する培地で１
   ０分間０℃で処理することによって高度に受容可能にさ
   れる特許請求の範囲第４項の方法。 ６、形質転換された細菌が、ジメチルホルムアミド中、
   低濃度のアンピシリンとＸ−ｇａｌ（もしくは５−ブロ
   モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトビ
   ラノシド）を含有するゲロース培地上に流延される特許
   請求の範囲第４項の方法。 ７、単離された細菌のコロニイ（Ａｍｐ＾ｒ−ＬａｃＺ
   ＾−）を別々に予備培養し、次いでミニライゼートを作
   製するために増幅させ、次いで単離した各プラスミドを
   エンドヌクレアーゼＰｖｕII消化し、１以上の放射性同
   位体で標識を付け、前記反芻動物起源のゲノムＤＮＡと
   ハイブリダイズさせ、次いでこれら動物のＤＮＡをエン
   ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化して、種々の大きさの
   制限フラグメントを生成させる、特許請求の範囲第４項
   の方法。 ８、得られた種々の大きさの制限フラグメントがアガロ
   ースゲルでの電気泳動マイグレーション法で分離される
   特許請求の範囲第４項の方法。 ９、前記プローブが固相でのホスホラミダイト法で合成
   される、特にウシの亜科に属しことにボス属の反芻動物
   の雄ゲノムに対して特異的なＤＮＡの分子プローブの製
   造方法。 １０、分子プローブの組成の一部を形成するオリゴヌク
   レオチドの合成に続いて、 オリゴヌクレオチドを分離し、中間の大きさのオリゴヌ
   クレオチドと結合させ、ポリアクリルアミドゲルの電気
   泳動に付し、シリカゲルでコートされたアルミニウムホ
   イルによつて、所望の純オリゴヌクレオチドの２５４ｎ
   ｍで蛍光を発するバンドを同定し、このバンドを切取り
   、そのＤＮＡを過当な溶液中で溶離させ、次いで純粋な
   合成ＤＮＡを回収することからなる精製を行う特許請求
   の範囲第９項の方法。 １１、合成されたオリゴヌクレオチドが、精製後１以上
   の放射性同位体で標識が付けられる特許請求の範囲第１
   ０項の方法。 １２、プローブが公知の適切なしかたで予備ハイブリダ
   イズされたフィルターにハイブリダイズされ、そのとき
   プローブが、アガロースゲル上で単離された後適当なフ
   ィルターに移転された反芻動物のゲノムＤＮＡ（雄と雌
   ）と再結合させると、プローブは雄ゲノムＤＮＡにハイ
   ブリダイスし、このハイブリッド形成が、オートラジオ
   グラフィおよび／または非放射性プローブにより、特異
   的な７ｋｂのバンドの形態のハイブリッド形成シグナル
   の存在によって明示されることからなる特にウシの亜科
   に属しことにボス属の反芻動物の胚もしくは胎児の性を
   決定する特許請求の範囲第１項の分子プローブの利用法
   。 １３、認識されるべきＤＮＡが前記反芻動物のリンパ球
   に含有されている特許請求の範囲第１２項の利用法。 １４、認識されるべきＤＮＡが、前記反芻動物の羊水も
   しくは尿膜水もしくは絨毛組織から発する細胞に含有さ
   れている特許請求の範囲第１２項の利用法。 １５、認識されるべきＤＮＡを含有する細胞もしくは類
   似物が膜（ドット−プロット）または適当なフィルター
   上にデポジットされる特許請求の範囲第１２項の利用法
   。 １６、認識されるべきＤＮＡが、前記反芻動物のＹ染色
   体に含有され、中期の段階に観察され、その場合に、性
   がいわゆるｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法で決定さ
   れる特許請求の範囲第１２項の利用法。 １７、認識されるべきＤＮＡが、周期の段階にある前記
   反芻動物の細胞の核内にあり、その場合に、性がいわゆ
   るｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法で決定される特許
   請求の範囲第１２項の利用法。 １８、前記ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法において
   、前記反芻動物の胚由来の５〜２０の細胞の生検試料を
   、１以上の放射性同位体で標識をつけた前記プローブも
   しくは非放射性プローブとハイブリダイズさせることに
   よって前記細胞に標識をつけるため分子プローブと接触
   させ、次いでこのハイブリッド形成が適切な細胞免疫化
   学的方法によつて明示される特許請求の範囲第１２項の
   利用法。 １９、プローブが公知の適切なしかたで予備ハイブリダ
   イズされたフィルターにハイブリダイズされ、そのとき
   プローブが、アガロースゲル上で単離された後適切なフ
   ィルターに移転された反芻動物のゲノムＤＮＡ（雄と雌
   ）と再結合させると、プローブは雄ゲノムＤＮＡにハイ
   ブリダイスし、このハイブリッド形成が、オートラジオ
   グラフィおよび／または非放射性プローブにより、特異
   的な７ｋｂのバンドの形態のハイブリッド形成シグナル
   の存在によって明示されることからなる、特にウシの亜
   科に属しことにボス属の反芻動物の胚もしくは胎児の性
   を決定する特許請求の範囲第２項の分子プローブの利用
   法。 ２０、認識されるべきＤＮＡが前記反芻動物のリンパ球
   に含有されている特許請求の範囲第１９項の利用法。 ２１、認識されるべきＤＮＡが、前記反芻動物の羊水も
   しくは尿膜水もしくは絨毛組織から発する細胞に含有さ
   れている特許請求の範囲第１９項の利用法。 ２２、認識されるべきＤＮＡを含有する細胞もしくは類
   似物が膜（ドット−プロット）もしくは適切なフィルタ
   ー上にデポジットされる特許請求の範囲第１９項の利用
   法。 ２３、認識されるべきＤＮＡが、前記反芻動物のＹ染色
   体に含有され、中期の段階に観察され、その場合に、性
   がいわゆるｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法で決定さ
   れる特許請求の範囲第１９項の利用法。 ２４、認識されるべきＤＮＡが、間期の段階にある前記
   反芻動物の細胞の核内にあり、その場合に、性がいわゆ
   るｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法で決定される特許
   請求の範囲第１９項の方法。 ２５、前記ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法において
   、前記反芻動物の胚由来の５〜２０の細胞の生検試料を
   、１以上の放射性同位体で標識をつけた前記プローブも
   しくは非放射性プローブとハイブリダイズさせることに
   よって前記細胞に標識をつけるために分子プローブと接
   触させ、次いでこのハイブリッド形成が適切な細胞免疫
   化学的方法によつて明示される特許請求の範囲第１９項
   の方法。 ２６、精子を、適切に標識を付された前記プローブとハ
   イブリダイズさせることによつて精子に標識をつけるた
   めに、精子集団の精子を、ことにボス属の反芻動物の雄
   ゲノムに対して特異的なＤＮＡのプローブと接触させ、
   そのプローブがハイブリダイゼーシヨン・プロファイル
   を有し、このプロファイルが、プローブと適当な酵素に
   よって消化された雄ゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼー
   シヨンによつて決定され、雄ゲノムもしくは問題の反芻
   動物に特異的な少なくともひとつのバンドの存在を明示
   し、特にこのハイブリダイゼーシヨンプロフアイルがプ
   ローブと、ＥｃｏＲ　 I で消化された雄ゲノムＤＮＡ
   とのハイブリダイゼーシヨンにより決定される場合に、
   ボス属の雄ゲノムに対して特異的な７ｋｂのオーダーの
   バンドの存在を明示し、 次いでハイブリダイズされた精子が適当な細胞免疫化学
   方法で明示されることからなる、特にウシの亜科に属し
   ことにボス属の反芻動物の精子集団内のＹ染色体をもつ
   精子の比率を直接かつ直ちに検査する方法。 ２７、精子と、特異的ＤＮＡの分子プローブとのハイブ
   リダイゼーシヨンが、精子とそのまま直接に行われる特
   許請求の範囲第２６項の検査方法。 ２８、ハイブリダイゼーシヨンが、特異的ＤＮＡの分子
   プローブとボス属の反芻動物の精子から単離されたＤＮ
   Ａとの間で行われる特許請求の範囲第２６項の検査方法
   。 ２９、精子が、ハイブリダイゼーシヨン工程の前に、本
   質的に３つの工程、すなわち低張ショック、蛋白分解消
   化およびジスルフィド結合の還元からなる科学的デコン
   デンセーシヨンに付される特許請求の範囲第２８項の検
   査法。 ３０、精子を、適切にラベルされたプローブとハイブリ
   ダイズさせ次いでこのハイブリダイズされた精子を適切
   な細胞免疫化学方法で明示するために、精子集団を、特
   にボス属の反芻動物の雄ゲノムに対して特異的なＤＮＡ
   のプローブと接触させることからなり、 そのプローブが、下記５′−３′ヌクレオチド配列： 【ヌクレオチド配列があります】 とその相補的配列とを有する４９の塩基対、または少な
   くとも１１の連続したヌクレオチドを有する前記配列の
   フラグメントもしくはこのフラグメントと少なくとも７
   ０％の相同性を示す他のいずれかのフラグメントからな
   り、そのプローブがｂ、ｃ、１、２、と命名され、 ウシの亜科のことにボス属の反芻動物の精子集団中のＹ
   染色体を有する精子の集団を直接かつ直ちに検査する方
   法。 ３１、精子と、特異的なＤＮＡの分子プローブとのハイ
   ブリダイゼーシヨンが、精子とそのまま直接に行われる
   特許請求の範囲第３０項の検査法。 ３２、ハイブリダイゼーシヨンが特異的ＤＮＡの分子プ
   ローブとボス属の反芻動物の精子から単離されたＤＮＡ
   との間で行われる特許請求の範囲第３０項の検査法。 ３３、精子が、ハイブリダイゼーシヨン工程の前に、本
   質的に３つの工程すなわち、低張ショック、蛋白分解消
   化およびジスルフィド結合の還元からなる科学的デコン
   デンセーシヨンに付される特許請求の範囲第３２項の検
   査法。 ３４、１以上の放射性同位体で標識が付されている特許
   請求の範囲第１項のことにボス属の反芻動物の雄ゲノム
   に対して特異的なＤＮＡの分子プローブ。 ３５、非放射性プローブである、特許請求の範囲第１項
   のことにボス属の反芻動物の雄ゲノムに対して特異的な
   ＤＮＡの分子プローブ。 ３６、１以上の放射性同位体で標識が付される、特許請
   求の範囲第２項のことにボス属の反芻動物の雄ゲノムに
   対して特異的なＤＮＡの分子プローブ。 ３７、非放射性プローブである、特許請求の範囲第２項
   のことにボス属の反芻動物の雄ゲノムに対して特異的な
   ＤＮＡの分子プローブ。 ３８、下記工程； １）精子に含まれるＤＮＡに、ＤＮＡに特異的な生体染
   料で標識を付け； ２）含有するＤＮＡの量によって、ＸとＹとの精子の２
   フラクシヨンに、細胞蛍光定量法によって選別し； ３）特許請求の範囲第２６項に記載したのと同様にして
   、選別によって分離されたＹ精子のフラクシヨン中のＹ
   染色体を有する精子の比率を検査する方法を用いて、上
   記第２段階で行った選別操作の質を検査し； ４）モノクロナルもしくはポリクロナル抗体を産生する
   ために、齧歯動物（マウスもしくはラット）を、検査済
   のフラクシヨン（検査後再選別してもよい）で免疫にし
   ； ５）ＸもしくはＹの染色体で制御されその精子の表面で
   発現される抗原決定基を認識する特異的な免疫試薬（こ
   の試薬はＸ染色体もしくはＹ染色体をもつ生精子を分離
   するのに用いることができる）を得るために、凝集法、
   精子毒素法、間接的な蛍光抗体法およびフラックス・サ
   イトメトリイ・テストによって、前記抗体の特異性を検
   査し、；および ６）精子集団中の、Ｘ染色体とＹ染色体をそれぞれもっ
   ている精子のフラクシヨンを前記免疫試薬で分離するこ
   とからなる、 精子集団中の、Ｘ染色体をもつ精子とＹ染色体をもつ精
   子を選別する方法。 ３９、前記選別法の第４工程を構成する齧歯動物の免疫
   化工程に続いて、前記免疫化工程で得られたポリクロナ
   ル抗体が集められ、次いでこれらの抗体を、免疫化で用
   いた精子と逆の性の精子上に吸収させ、これら抗体の特
   異性が所望の性の精子上で検査され、次いで、その抗体
   が過当なときに精製されることからなる特許請求の範囲
   第３８項の選別法。 ４０、細胞蛍光定量法で分離されたＸとＹの精子を、Ｘ
   とＹの染色体に対して特異的なモノクロナル抗体を製造
   するのに用いる特許請求の範囲第３８項の選別法。 ４１、免疫試薬を得るために用いられるＸ染色体もしく
   はＹ染色体によって制御され、かつ精子表面に発現され
   る抗原決定基を認識する特異的免疫試薬であって、特許
   請求の範囲第３８項に記載の方法を行うことによって得
   られ、その特異性が試験され、適当なときに精製される
   抗体で構成される免疫試薬。 ４２、下記工程； １）精子に含まれるＤＮＡに、ＤＮＡに特異的な生体染
   料で標識を付け； ２）含有するＤＮＡの量によつて、ＸとＹとの精子の２
   フラクシヨンに、細胞蛍光定量法によつて選別し； ３）特許請求の範囲第３０項に記載したのと同様にして
   、選別によつて分離されたＹ精子のフラクシヨン中のＹ
   染色体を有する精子の比率を検査する方法を用いて、上
   記第２段階で行つた選別操作の質を検査し； ４）モノクロナルもしくはポリクロナル抗体を産生する
   ために、齧歯動物（マウスもしくはラット）を、検査済
   のフラクシヨン（検査後再選別してもよい）で免疫にし
   ； ５）ＸもしくはＹの染色体で制御されその精子の表面で
   発現される抗原決定基を認識する特異的な免疫試薬（こ
   の試薬はＸ染色体もしくはＹ染色体をもつ生精子を分離
   するのに用いることができる）を得るために、凝集法、
   精子毒素法、間接的な蛍光抗体法およびフラックス・サ
   イトメトリイ・テストによって、前記抗体の特異性を検
   査し、；および ６）精子集団中の、Ｘ染色体とＹ染色体をそれぞれもつ
   ている精子のフラクシヨンを前記免疫試薬で分離するか
   らなる、精子集団中の、Ｘ染色体をもつ精子とＹ染色体
   をもつ精子を選別する方法。 ４３、前記選別法の第４工程を構成する　歯動物の免疫
   化工程に続いて、前記免疫化工程で得られたポリクロナ
   ル抗体が集められ、次いでこれらの抗体を、免疫化で用
   いた精子と逆の性の精子上に吸収させ、これら抗体の特
   異性が所望の性の精子上で検査され、次いで、その抗体
   が適当なときに精製されることからなる特許請求の範囲
   第４２項の選別法。 ４４、細胞蛍光定量法で分離されたＸとＹの精子を、Ｘ
   とＹの染色体に対して特異的なモノクロナル抗体を製造
   するのに用いる特許請求の範囲第４２項の選別法。 ４５、免疫試薬を得るために用いられるＸ染色体もしく
   はＹ染色体によって制御され、かつ精子表面に発現され
   る抗原決定基を認識する特異的免疫試薬であつて、特許
   請求の範囲第４２項に記載の方法を行うことによって得
   られ、その特異性が試験され、適当なときに精製される
   抗体で構成される免疫試薬。