JPH07509136A - インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）・ハイブリダイゼーションのための母体血液中の胎児細胞の富化と同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インサイチェ（ＩＮ　５ＩＴＵ）・ノｈイブリダイゼーンヨンのための母体血液 中の胎児細胞の富化と同定技術分野 本発明は母体血液中の胎児細胞を富化する方法と、そのような胎児細胞を同定す る方法に関してし）る。そして更にそのような細胞を、医療上の関心から核酸自 己Ｊｌをキ灸出する、例えば胎児の性別を同定したり、胎児細胞の遺イ云的異常 性や、又はウィルス感染を検出するためのインサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）　・ハ イブリダイゼーションにおける被検体とする方法に関するものである。

背景技術 人間の胎児の性別や、ある種の胎児の染色体の異常番よ、胎児細胞の染色体を細 胞遺伝学的解析で直接検査したり、核酸分析法を使い染色体中の特定のＤＮＡ配 り１］を調べたりして、通常検出あるいは確認していた。かつてこの様なテスト は、母体や胎児にある程度の危険を伴う、外来患者の外科的処置で採取した生き た細胞の培養が必要であった。

胎児から剥離したこの様な細胞は、羊水穿刺法で得ること力咄来る。羊水穿刺は 針を腹壁を通し子宮Ｇこ刺し、少量の羊水を取り出す事を意味する。もう一つの 方法は頚部あるいは腹部にカテーテルを通し、胎盤の表面から絨毛組織を採取す る方法である。しかしながら、自発的な流産やその他の重大な事態が、はぼ羊水 穿刺法で０．５％と絨毛採取法で１％の確率で起こる危険がある。羊水穿刺や絨 毛採取で集めた胎児細胞は、通常は数日間培養育成し、次いでその異常性を検査 する。

色々の種類の胎児細胞の特徴づけが行われた。胎児細胞とは胎児性赤血球、リン パ球、トロホブラスト（栄養芽層）を含むが、これに限定されるものではない。

トロホブラスト（栄養芽層）は細胞栄養芽層、シンジチオトロホブラスト（合胞 体栄養細胞）、試験管内で培養した胚（インビトロ受精技術）から採取した細胞 等を含んでいる。此処で使用されるエリスロサイト（赤血球）なる言葉は、特に ことわらないかぎり、赤血球のみならず赤芽球、正常芽球、網状赤血球を含んで いる。

少量の胎児細胞が母親の血液中を循環していることが知られている。母体の循環 血液中で、４０００から７０００の胎児性赤血球の内の約１つのが、胎児性有核 赤血球である。ある種の胎児細胞を検出する方法及び／又は、それらを母体の血 液から分離する方法が報告されている。例えば、Ｓ、Ｃ，Ｙｅｏｈら、Ｐｒｅｎ ａｔａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　１１　：　１１７−１２３（１９９１）　；　 Ｕ、Ｗ、Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ　３３６　：　１９７２００　（１９ ９０）；ＰＣＴ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、Ｗｏ。

９１１０７６６０　幼児メディカルセンター会社、ＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ　Ｎｏ、　Ｗｏ、９１／　１６４５２　Ｃｅ１ｌｐｒｏ株式会社；　米国特許 　Ｎｏ、５，１５３，１１７などである。

核酸遺伝試験法の背景については、例えばＰ、Ｇ、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ、　Ｓｅ ｇ＋、Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、９：　２５０−２５６　（１９５Ｂ）とり。

Ｇ、　Ｂｕｔｌｅｒ　ら、　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｇ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　５ １　：　３７５−３８６等を参照。

核酸ハイブリダイゼーション技術は、単一鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡが、相補性核 酸鎖とペアー（対）を組む、すなわちハイブリダイズする能力に基礎を置いてい る。このハイブリダイゼーション反応は特異的プローブあるいはプローブ集団の 発展を来たし、これにより特異性遺伝子（ＤＮＡ）、或いはポリヌクレオチット 配列、或いはそれら遺伝子（ＲＮＡ）の転写と発現を同定することを可能にする 。

特異性核酸（ＲＮＡあるいはＤＮＡ）プローブを使い、胎児の性別、或いはその 他の胎児の遺伝的特徴に対する遺伝マーカー、或いは感染やその他の病的状況に 対するマーカーを検出できる。ある種の遺伝上の病気は、正常組織にはない遺伝 子の存在が特徴的である。その他の病的状況は、正常細胞には発現しないＲＮＡ ５或いはＲＮＡの翻訳物質（すなはちペプチノドあるは蛋白質）の発現によって 特徴づけられるものもある。いくつかの病的状況は、ある遺伝子や遺伝子の部分 の欠如、遺伝子生産物や蛋白質の欠如又は発現の変質によって特徴づけられる。

更に動物の胎児、例えば牛の胎児の性別を、人間の場合と同様に、特徴づける事 がしばしば望まれる。

ハイブリダイゼーション反応の前に、細胞を破壊し、細胞から核酸を分離するこ とを要する溶液ハイブリダイゼーション法は、細胞の無傷性や立体的分割や検出 の鋭敏性を犠牲にする。母体の血液中に循環する胎児細胞の様な、分離に比較的 少量の細胞しか利用できないときは、溶液ハイブリダイゼーション法は不可能で ある。

ポリメラーゼ鎖反応などによる核酸の増幅は既知の技術であるが、好適なスピー ドと効率を妨げるという、ある知られた欠点を持っている。例えばこの様な技術 は、細胞の熔解を起こし、この技術の鋭敏性のために偽陽性を示し、低コピー数 において標的（ターゲソ日を検出する為に高いレベルの増幅が必要となり、特異 性を失う様になる危険がある。更に増幅した標的のハイブリダイゼーションが必 要となり、何時の場合にも増幅する時に、時間の掛かる多数のステップが必要と なる。

インサイチュ（ｉｎ　５ｉｔｕ）・ハイブリダイゼーションは、単一細胞のレベ ルで、組織中の核酸（ＤＮＡとＲＮＡ）の同定と定量の技術を提供する。このよ うなハイブリダイゼーション技術は、単一細胞のレベルで、そこに特異性遺伝子 が存在するかしないかの検出と、遺伝子生産物の発現の検出にも又利用できる。

ｉｎ　５ｉＬｕ　・ハイブリダイゼーションは、米国特許Ｎｏ。

５．２２５，３２６と係属米国特許出１ｉＪＮｏ、０７／６６８．７５１に公開 されている。

この出願明細書中に明示した各特許、出願特許、出版文献の開示は文献目録にま とめて示した。

前に述べた知見にもかかわらず、先行技術の方法は母体の子宮に侵入損傷するこ となしに、通常のベースで胎児の性別を決定したり胎児の異常性を検出する、真 に迅速、鋭敏、効率的でかつ実用的な方法に欠けている。従って本発明は、この 分野で長年感していた要望を充足させるものである。

発明の開示 本発明の一連の具体例の中で、被検体中の胎児の性別を同定する方法を提供した 。これらの具体例で、細胞は母親の末梢血液、齋幣の血液、絨毛のサンプルなど から採取できる。細胞サンプルは、そのまま使っても或いは別に述べるように、 分析に先立って胎児細胞を増殖して富化（即ち、４度を高める）しても良い。細 胞は通常の沈降性固定液や架橋（交差結合）性固定液で固定してもよく、固定す ることなく以降のテストに使ってもよい。操作は、顕微鏡用スライドガラスの様 な固体支持体上に置いた細胞で行ってもよく、懸濁した細胞で行ってもよい、使 用に先立って、懸濁液中の細胞を冷却したＰＢＳで洗浄し、確実に単細胞状懸濁 液にする為に徹底的に混合してもよい。

この方法は胎児細胞を含む被検体を得るステップと、サンプル中に共存する母体 細胞から胎児細胞を識別するマーカーを検出するステップを含んでいる。

本発明に従って、細胞を胎児細胞として同定する最も望ましい方法は、胎児性ヘ モグロビン（ＨｂＦ）やα−フェト１白質の様な胎児性蛋白質のＲＮＡの存在を 検出することである。このようなＲＮＡは通常メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ ）であるが、代わりに或いはそれに付加して、異種細胞核のＲＮＡ　（ｈｎＲＮ Ａ）やリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）を含むことがある。このことは胎児性蛋 白質の遺伝子が、転写されて発現することを示している。この検出は、ｉｎ　５ ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーションで、実質的に無傷の細胞膜中で行うことが望 ましく、また胎児性蛋白質ＲＮＡに向かう合成りＮＡプローブを使うことが望ま しい。

好適な具体的例では、合成りＮＡプローブが使われ、そのプローブに色素蛍光体 が共有結合で付着している。このプローブの細胞内での胎児細胞特異性ＲＮＡと の結合は、明るい蛍光として顕微鏡で見ることが出来るし、又は蛍光測定装置で 検出する事も出来る。ここで゛°蛍光”とは、放射される波長と違う波長の照射 で励起し、放出される検出可能な放射をいう。励起による放射は、通常紫外線か 可視光線であるが、赤外線かその他の電磁気性放射のこともある。

もう一つの望ましい具体例は、直接標識するか、アルカリフォスファクーゼの様 な酵素で間接的に標識した、合成りＮＡプローブを使う事である。胎児ＲＮＡと このプローブとの結合は、検出可能な物質（例えばＮＢＴとＢＣＩＰとの反応で 、青あるいは紫の固体が沈殿する）を作りだす基質と酵素を反応させ顕微鏡で見 ることが出来る。

このような検定で得られる情報は、以下で更に特別に論するが、胎児の状態を同 定するのみならず、検出された胎児の赤血球数に基ずく、胎児のヘモグロブリン の評価、例えばＲｈ不適合の場合の胎児−母性の出血量の査定を可能にする。投 与すべき抗Ｒｈ（Ｄ）を含む特異性ガンマグロブリンの量は、この測定から計算 され、母親の血液循環系に入る胎児の赤血球細胞に対する母親の免疫反応を抑制 する。

本発明のもう一つの具体例は、細胞中の少なくとも２つの相異なるＲＮＡ５の存 在を検出する事である。胎児細胞は、通常特別なｍＲＮＡ種を持たない細胞中で 生産される特異なｍＲＮＡ５或いはｍＲＮＡ種を持っている。これらのＲＮＡ５ の検出は、メツセンジャーＲＮＡ５として或いはヘテロ核ＲＮＡ５　（ｈｎＲＮ Ａｓ）として検出されるにかかわらず、細胞を、あるいは単細胞フラクションを 発生的に胎児性あるいは胚として同定するのに役立つ、ある種のＲＮＡ集団が大 変豊富に存在するのに対しく例えば胎児性赤血球細胞核のヘモグロビン）、その 他の胎児特異性或いは胚特異性のＲＮＡ５はどちらか１つか、或いは胎児特異性 ＲＮＡ５の集団として考える時でさえ、少量しか存在しない。さらにあるＲＮＡ 種は、ある胎児細胞で生産されるのにかかわらず、ある母体細胞中で生産するこ とが可能である。しかしながら、同しソース（源）の母体細胞が、同−細胞中に ２つのＲＮＡ種を持たない時にも、胎児細胞は同−細胞中に２乃至それ以上の特 有のＲＮＡ５を発現するような状況にある。同−細胞中で同時に多数のｍＲＮＡ やｈｎＲＮＡ種を検出する能力は、それによって非胎児性細胞（例えば母体）か ら胎児細胞を識別する能力を高め、特定のシグナルを検出するために、他にない ＲＮＡ５が存在するときに生産されるシグナルを結び付ける手段を提供し、それ が特有の胎児細胞を同定することになる。

胎児細胞を同定するもう一つの方法は、サンプル中に存在する、胎児細胞にある が母体血液細胞にはない物質を検出することである。このような検出に特にを効 な物質の１つはサイトケラチンであり、それに対する抗体を使い検出することが 出来る。もう一つのこの種の物質はペプチッド胎児性ヘモグロビンであり、それ は酸性へマドキシリンとエオシンＢのような染料物質（例えば、Ｓｉｇｍａ　Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｐ、０．　１４５０８、ＳＬ、Ｉ−ｏｕｉｓ、　Ｍ０ ６３１７８　、　ｃａｔ、ｎｏ。

２８５、）や胎児性ヘモグロブリンに対する抗体で検出できる。

しかしながら、更にもう一つの胎児細胞を同定する方法は、胎児細胞やペプチノ ドに存在する、一つのＲＮＡを検出することである。このＲＮＡは核酸ハイブリ ダイゼーション法で検出可能であり、ベプチノドはそこの抗体の結合か染色で検 出することが出来る。

本発明の更なる具体例は、他の細胞例えば母体細胞と比較して、被検体中の胎児 細胞の比率の富化法を含んでいる。

このような富化は、母体細胞を選択的に除去することで起こさせるのが好ましく 、例えばサンプルから選択的に除去することが出来る配位子（リーガンド）を持 つサンプルを、細胞の表面成分に接触させることにより起る。配位子は、母体血 液細胞に通常存在する抗原に対する抗体であるのがよい。サンプルを保有する液 体から分離する為に、配位子は固体マトリックスに結合していることが望ましい 。好ましくはマトリックスは磁性ビーズである。マトリックスはあるいは、細胞 膜ＦＡｆｉ、が通過するカラムの形でもよい。

好ましい具体例では、抗体はＣＤ４５に対するモノクローナル抗体を含んでいる 。この抗体は、すべての白血球で発現するイソタイプのヒト白血球の通常の抗体 （ＬＣＡ）ファミリーの総てに発現するエピトープに選択的に結合する。胎児性 赤血球はこのように富化されるのが好ましい。

抗ＣＤ−４５と共に、あるいはそれの代わりに使用出来るその他の抗体は抗ＣＤ −１３、抗ＣＤ−３４、抗ＣＤ−４４と抗ＣＤ−３１がある。好ましくは、使用 する抗体の量は、サンプル中の１００万白血球当たり約２から２０μｇである。

かわりに、あるいは前記の方法に付加して胎児細胞は密度勾配遠心分離法で濃度 を高める（富化する）ことが出来る。胎児性赤血球やリンパ球やトロホブラスト （栄養芽層）はこのように富化されるのがよい。続いて、胎児細胞は通常これま でに述べたようにして検出される。

本発明のもう一つの具体例では、被検体の胎児細胞の新しい同定法を提供してい る。この方法は胎児細胞を含む被検体の採取、器具を使用して検出可能な蛍光標 ！（ラベル）で、胎児細胞を予め標識する工程を含んでいる。続いてこの胎児細 胞をフローサイトメトリーで濃縮（富化）する。

本発明のもう一つの具体例では、実質的に無傷の細胞膜を有する胎児細胞の核酸 配列を、ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション法で検出する、新しい方法 を提供している。この方法は該胎児細胞を、沈殿剤と架橋（交差結合）剤からな るグループから選ばれた少なくとも一つの薬剤を含むメディラムで固定し、この 固定した試料を、変性剤、ハイブリッド安定化剤、緩衝液、選択的膜孔隊形成剤 と、検出すべき標的ヌクレオチット配列に対し、少なくとも実質上相補性のヌク レオチット配列を持つ、一つの合成オリゴヌクレオチンドブローフ゛からなるハ イブリダイゼーション溶液に接触させる工程から成る。この接触は、少なくとも 一つの検出可能ラベルの存在下で、温度が１５°Ｃから８０°Ｃで、約５から２ ４０分間のハイブリダイゼーション条件で行う。

そして前述のラベルでハイブリッド形成を検出する。

さらに本発明の具体例では、実質的に無傷の細胞膜を有する胎児細胞の核酸配列 を、ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション法で検出する、新しい方法を提 供している。この方法は該胎児細胞を、変性剤、ハイブリッド安定化剤、緩衝液 、膜孔隊形成剤と、検出すべき特定の標的ヌクレオチット配列に対し少なくとも 実質上相補性のヌクレオチット配列を持つ、一つの合成オリゴヌクレオチットプ ローブからなる溶液に、前述の胎児細胞を接触させる工程（この接触は、少なく とも一つの検出用ラベルの存在下で行う）、次いで前述のラベルを使いハイブリ ッド形成を検出する工程からなる。ハイブリダイゼーションメディウムは固定剤 を含んでもよい。

さらにもう一つの本発明の具体例では、被検体中の胎児細胞の同定用キ７）を提 供する。

本発明のもう一つの具体例では、血液性試料中の胎児細胞を富化するキットを提 供する。これは目的の胎児細胞を分離するため、密度勾配を作る方法を含んでい る。

さらに本発明のもう一つの具体例では、望ましくは母体の末梢血液の様な被検体 から、胎児細胞を富化し、この胎児細胞中の核酸配列を検出する新しいキットを 提供する。

このキット４Ｌ−多くのあるいは総ての成人の白血球に存在する、細胞表面の抗 原に対する杭木を含んでいる。そしてこの抗体は分離を促進するマトリックスに 結合することが出来る。このキットはさらに、変性剤、ハイブリッド安定化剤、 緩衝液や膜孔隊形成剤を含むハイブリダイゼーション溶液を含んでいる。さらに このキットは、標的胎児性ＲＮＡヌクレオチット配列とハイブリダイズ可能な、 オリゴヌクレオチットプローブの供給を含んでいる。この種のキットはまた、医 療上の関心のある核酸配列にハイブリダイズ可能な、もう一つの別の検出用プロ ーブを持っていると有利である。

色々な種類の胎児細胞は、細胞の形態から特徴づけられる。好ましい具体例では 、本発明は胎児性有核赤血球に関連している。あるいは本発明は、胎児性トロホ ブラスト（栄養芽層）を含むことが出来、この胎児性栄養芽層なる言葉は、サイ トトロホブラスト（細胞栄養芽層）とシンジチオトロホブラスト（合胞体栄養細 胞）を含む、胎児細胞は母体細胞の配位子結合、あるいは密度勾配遠心法で、母 体の末梢血液から分離できる。しかしながら、本発明の工程は、母体の末梢血液 を採取する有利性を特に必要としない時は、へその緒の血液の経皮的採取、羊水 穿刺、絨毛採取やその他の方法で得たサンプルのどれかを使用出来る。

以上に述べたような胎児細胞の富化に続いて、細胞を胎児細胞の抗原の認識や、 例えばサイトケラチンや胎児性ヘモグロビンに対する標識を付けた抗体による染 色、胎児性ヘモグロビンに対する染色、あるいは好ましくは、このような胎児細 胞にあり母体血液細胞には無い、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列に対 するＤＮＡプローブを使うｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション法で、母 体細胞から認識あるいは分離出来る。

種々の抗体が胎児細胞と母体細胞を識別するために使われる。蛍光ラベルが付着 したサイトケラチンに対する抗体の使用は、本発明による核酸ハイブリダイゼー ション法を妨害せず、特に望ましい。

しかしながら本発明による好ましい方法は、プローブを使い、母体の末梢血液か ら得た細胞上で、母体血液細胞では転写されなく胎児細胞では転写されるメンセ ンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）ヘアリング配列を選別する様な条件で、ｉｎ　５ ｉＬｕ　・ハイブリダイゼーション法を用いる事である。

本発明によれば、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）に対するｍＲＮＡは、ｉｎ　５ ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション法による検出に対し、特にこの様な細胞の良 いマーカーであることが判った。

あるいは本発明は、試験管中（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で培養（受精）した胎児細胞 や、母体細胞から分離したり識別したりする必要がない、受胎産物も含むことが できる。

本発明の好ましい具体例に於けるハイブリダイゼーション技術の有利性は、遺伝 子あるいはウィルスのＤＮＡを検出する際と似た条件（出来れば同しような）で 、胎児性ｍＲＮＡの配列を検出するハイブリダイゼーションを行えることである 。更に、最も好ましい具体例では、ｍＲＮＡに対するプローブとＤＮＡに対する プローブが、ハイプリダイゼーンヨン力りテールに存在する一般のインキュベー ション工程ですむことである。

本発明のｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション技術では、−個の細胞の一 個の遺伝子の異常さえも検出出来る。本発明によると、インキュベーションは約 １２０分以下が望まし２く、又約５分から３０分の間が良い。もし塩基数で１５ ００以下くらいの遺伝子異常を検出しようとすると、必要な結果を得るのに、イ ンキュベーション時間が増え、２４０分を越すことさえある。

本発明のもう一つの要旨は、付加、欠失、転座、再配列等の遺伝子異常を、これ らは１５塩基対程度のヌクレオチノド配列として特徴ずけられるが、検出するこ とである。

この観点から本発明は、このような胎児細胞の遺伝子異常の検出に限定されない ばかりか、実質的に他の取得源からの核酸にも適用される。標的核酸分子を持つ 細胞とは、真核細胞（例えば、血液、皮膚、骨、肺、神経系、肝臓、子宮、翠丸 、前立腺、粘膜の様な人間の細胞、又は総して外胚葉、中胚葉、内胚葉のいかな る部分も）、原核細胞（例えばバクテリア）、植物細胞、その他のいかなるタイ プの細胞でもよい。それらはイースト（酵母）の様な単一の真核細胞でも、人間 から得られる様な、真核細胞コンブレンクスでもよい、更に本発明は、細胞性Ｄ ＮＡやＲＮＡと同様に、いろいろのウィルスの株の識別に用いられる。その場合 、核酸の標的鎖（ストランド）は非被覆ウィルスや被覆ウィルス（脂質蛋白質膜 のような非被覆膜を持つ）の中にある。

図面の簡単な説明 図１は通常の雄のアムニオサイト（羊水細胞）の染色体Ｘ、Ｙと１８の数を測定 するために、ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーションの使用を示している。

図２はアムニオサイトと白血球細胞のＸ染色体とＹ染色体とを同時に検出する方 法を示している。

図３は本発明により、母体血液から胎児性赤血球を富化するため、好ましい技術 の概略的図式を示す。

図４は本発明により、母体血液から胎児性トロホブラスト（栄養芽層）を富化す るため、好ましくは使用される技術の系統図を示す。

図５は胎児性赤血球を同定するために、胎児性ヘモグロビンのメソセンジャーＲ ＮＡに対するプローブの使用を示している。

図６は母体血液中の胎児細胞を同定するために、抗サイトケラチン抗体の使用を 示している。

図７は胎児性トロホブラスト（栄養芽層）中のＹ染色体の検出を示す。それは抗 サイトケラチン抗体を使い、同定し、母体血液から分離したものである。

図８は、抗サイトケラチン抗体を使い、同定した胎盤性トロホブラスト（栄養芽 層）の染色体Ｘ、Ｙと１８の数を測定するために、ｉｎ　５ｉＬｕ　・ハイブリ ダイゼーシヨンの使用を示している。

図９は、アムニオサイトと栄養芽層を同定するために、胎児細胞特異性ｍＲＮＡ に対し、ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション法の使用を示す。

図１Ｏは胎児細胞特異性ｍＲＮＡと胎児性赤血球中の染色体Ｘ、Ｙに対し、ｉｎ 　５ｉＬｕ　・ハイブリダイゼーション法の使用を示す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法は、広範囲の被検体中の、胎児細胞を同定するために使用出来る。

このような被検体の代表的例は、母体の末梢血液、胎盤組織、絨毛、羊水と胎児 性（胚）組織である。前に述べた理由により、母体の末梢血液は好適な被検体で あり、以前は、母体細胞（それはあらゆる胎児性核酸の測定を妨害する）と胎児 細胞間の高比率のため、信転性のある矛盾の無い結果を得ることは、最も難しか った。

本発明の方法は、被検体中の胎児細胞の数を検出するために使用できる。このよ うな胎児細胞の代表的例として、トロホブラスト（栄養芽層）、真核赤血球細胞 （ｅｒｙｔｈｒｏｃｙＬｅｓ）　、胎児性上皮細胞、胎児性中皮細胞、胎児性リ ンパ球と胎児性胚芽細胞を含む。

本発明の方法は、胎児細胞中の胎児細胞特異性ポリヌクレオチットの配列、それ はオリゴヌクレオチソドであるが、の検出に使用できる。本発明を限定する事な く本発明の新しい方法は、ウィルスあるいは胎児細胞中の染色体を検出出来る。

本発明により検出出来るウィルスの代表的例は、人間の免疫不全性ウィルス、肝 炎ウィルスとヘルペスウィルスである。本発明で検出された染色体の代表的例は 、人間のＸ染色体、Ｙ染色体と１．１３．１６．１８．２１染色体である。

本発明のｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション技術の感度は、１個の細胞 中に存在する１個の遺伝子配列の単一のコピーで、視覚（肉眼）・写真的な検出 が出来る程である。

限定の意味でない例示として、長さ約２５塩基の各プローブに一個の蛍光団を付 けたものを使用し、塩基数約６．０００の遺伝子配列を、標準的蛍光顕微鏡を使 い見ることで、確かに検出できる。−プローブに４つの蛍光団を付着させると、 ここで指示したインキュベート時間で、塩基数約１５００の遺伝子配列の有無を 確実に検出出来る。更に、核酸の２本鎖（二重ストランド）の「感作Ｊ　（ｓｅ ｎｓｅ）ストランドと「抗感作Ｊ　（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）ストランドの両者 のうちの対応する配列に対するプローブを使うと、そこに記載されたインキュベ ート時間内で、塩基対約７５０程度の、短い配列の有無を検出できる。あるいは 画像分析法で、塩基対１５から２０と短い物の検出の可能性もある。

同様にもし５人間の免疫不全性ウィルス（ＨＩＶ）のようなウィルスに、胎児細 胞が感染すると、胎児細胞の核酸配列に合体（インコーホレート）シたウィルス 性核酸（ＲＮＡあるいはＤＮＡ）は、本発明のｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイ ゼーション技術で検出できる。

本発明は単一細胞のサンプルを使い、同時に多くの標的をテスト出来る。この事 は１個のサンプルがら最大限の情報が得られ、数多くの胎児性細胞サンプルの必 要性を最小にし、従って母体と胎児双方の安全性を増し、細胞の純度と分別の必 要性を極小化する。

１日　からの　の−■ 胎児細胞の同定や、胎児細胞内の遺伝的異常の検出には、母体細胞から胎児細胞 を分離し、識別する必要がある。この要件は、胎児細胞の数量割合が低い母体末 梢血液から、細胞サンプルを採る時に特に必要である。総じて、胎児細胞の正確 な分離と同定を保証する方法ならいかなる方法も、本発明の方法で使うことが出 来る。技術に練達した人（当業者）は、抗体による陽性（積極的）及び陰性（消 極的）分離方法が、胎児細胞の同定と分別に使えることを認めるであろう、ここ で使われる、抗体による陽性分離と陰性分離とは、胎児細胞の抗原に特異的に結 合し、母体細胞の抗原には結合しない抗体と（陽性分離）、母体細胞の抗原には 特異的に結合して、胎児細胞の抗原に特に結合しない抗体を（陰性分＃）含む。

この抗体は、物理的あるいは化学的結合により、数多くの固体表面や支持物質（ 容器、カラム、穴、ビーズと球体（粒子）のような基体）に結合する。

また一方では、抗体は、選択的分離工程を促進する物質に、結合することが出来 る０例えば抗体は、蛍光マーカーで標識し、通常の工程により、細胞分別装置で 分離することが出来る。

総じてこのような抗体は、標的とする細胞１００万に対し約２−２０μｇの量を 使うときに効果的である。即ち、認識し白血球に結合する抗体は、予想されるサ ンプル中の白血球数に基ずいて、前述の量を加える。また一方では、認識し栄養 芽層に結合する抗体は、予想されるサンプル中の栄養芽層数に基ずいて、前述の 量を加える。

本発明の好ましい具体例では、陰性分離が使われる。特に好ましい陰性分離は、 ＣＤ４５に対する抗体を使い行う。

この後、抗−ＣＤ４５は白血球と選択的に結合する。

抗−ＣＤ４５は、磁気ビーズの様な固体支持体に都合良く結合する。そしてそれ を試験管に入れ、サンプルと共に振る。次いで磁場の作用で試験管の片側に磁気 ビーズを寄せ、その間に結合しないサンプルを含む液体を除去する。

このようなビーズは、抗−ＣＤ４５免疫性磁気ビーズ、カタログＮｏ、１１７８ ．Ａｗａｃ、Ｉｎｃ、、１６０８Ｂ　Ｌａｒｒａｂｅｅ　Ｒｏａｄ、　Ｗｅｓｂ ｒ。

ｏｋ、ＭＥ　０４０９２として入手できる。

また一方では、Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ　、１０９３３　Ｎ、Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐ ｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ、から、非コート物　カタロ グＮｏ、４００９９５、ストレプトアビヂンでコート（被覆）した物　カタログ Ｎｏ、４００９９６　として、免疫性磁気ビーズを入手出来る。

このようなビーズを、胎児細胞から除去されることが望まれる（陰性選別が使わ れるとき）、あるいは濃縮されることが望まれる（陽性選別が使われるとき）、 胎児細胞の様なタイプの細胞に見いだされた、細胞表面抗原に対する抗体で、ユ ーザーがコートする事が出来る。抗体でコートされるもう一つのビーズは、カル ボキシル基を与えるようにコートされた酸化鉄粒子の水性懸濁液であり、そして それは、生化学的に活性な分子と共有結合をする事が出来る。

このビーズと使用説明書はＢｉｏＭａｇ　Ｃａｒｂｏｘｙｌ　Ｔｅｒｍｉｎａｔ ｅｄ、ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ、８−４１２５．Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭａｇｎｅＬ ｉｃｓ、Ｉｎｃ、、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＭＡ　（６１７）４９７−２０７０と して利用できる。

もし望むなら、白血球細胞はＣＤ４５．ＣＤ１３．ＣＤ３４に対する抗体との結 合で、さらにずっと効果的に除去される。抗−ＣＤ４４はまた、汚染母体赤血球 を除去するために混合物中に含有される。抗−ＣＤ３１の添加は、汚染血小板を 特異的に除去できる。このような抗体は３次の色々な所から入手出来る。Ａｍａ ｃ、　Ｉｎｃ、　（上を参照）　、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎ ｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ、ＮＪ　０７４１７−１８８４．Ｚｙｉ＋ｅｄ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓＩＩｎｃ、、４５８　Ｃａｒｌｔｏｎ　Ｃｏｕｒｔ、５ｏｕｔ ｈ　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ。

参照　Ｚｙ＋＋ｅｄ’ｓ　１９９２カタログｐ　１０−１とＰ７１−７２．以下 も参照のこと、Ｗ、Ｋｎａｐｐ、　１１の白　の　１　に　る４０１、ワークシ ョンブとコンファランス、０ｘｆｏｒｄ　ＵｎｉｖｅｒｓｉＬｙ　Ｐｒｅｓｓ、 １９８９；　Ｄ、Ｆ、Ｋｅｒｅｎ、　、鰺　におけるフローサイトメトリー、ｐ ４１−８７　ＡＳＣＰ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、１９８９゜胎児細胞は母 体末梢血液から、密度勾配遠心（分離）法かフローサイトメトリーによりに、分 離できる。例えばまず、胎児細胞の抗原に特異的な標識を付けた抗体によるか、 例えば胎児性細胞ＲＮＡに対しハイブリダイズ可能な合成オリゴヌクレオチント ・プローブの様な、核酸特異性プローブにより、フローサイトメトリーを使い、 胎児細胞を同定・分類出来る。

血゛　の　１日　・・血°の′ 胎児性有核赤血球液（エリスロサイト）の分離例を３Ａと３Ｂ部分からなる図３ に示した。各ステップは、番号を付けた囲みで図式的に説明し、１ステップ以上 に出る部品や容器は、同じ参照番号で明らかにした。

ステップ１０で、母体末梢血液１８の２０ｄを採り、例えば減圧式注射管（Ｖａ ｃｕｔａｉｎｅｒ　ｔｕｂｅ）のような、通常２本のｌＯ−〇ＥＤＴＡを入れた 、抗血液凝集性採取チューブ１２と１４に入れる。又は、請帯（へその緒）血液 １０ｍｇを入れてもよい。血液は５０ｄの遠心チューブ１６に移す。

ステップ２０では、血液サンプル１日は１５Ｗ１の細胞緩衝液Ａに混合し、緩衝 サンプル２４（次の代表的溶液を参照）と成る。良く混合する。

ステップ３０で、例えば旧５ｔｏｐａｑｕｅ　１０８３のような、約１．０８３ の密度の１５ｄの密度−勾配性分離溶液３２を、１５ｄの三角チューブ３４に入 れ、緩衝液２４を２０厩迄、密度性分離溶液の上に注意深く重ねる。密度性分離 試剤は約１．０７５から約１．０９５、好ましくは１．０８と１．０９の間の密 度を持つ。

ステップ４０で、三角チューブ３４はスインギングパケットローター３６で、室 温下７００Ｘｇで３０分間遠心分離する。矢印３８は、図に示すようにチューブ ３４に掛かる、遠心力の方向を示している。もしも２つの血液サンプル容器を最 初に用意したなら、残りの２０ｄの希釈血液のために第２の密度性分離チューブ を用意し、第２のチューブについて、ステップ３ｏと４０を繰り返す、もしもサ ンプルがへその緒の血液なら、このようなチューブは１個でよい。

ステップ５０に於いて、上層の血清／ＩＮ衝液層５４を吸引し、除去する。この 不要物は廃棄する。軟層５６は密度性分Ｍ溶液５２の上部との境界層であり、母 体、及び胎児の白血球、有核赤血球細胞とエリスロブラスト（赤芽細胞）を含ん でいる。軟層５６をピペット５８で集め、新しい５０ＩＩｒ１の三角チューブ６ ２に移す、もしも複数ケの密度法分離物質用チューブ３４を１人の患者に用意し たなら、全ての境界層５６を１本の５０−三角チューブ６２に入れる。

ステップ６０で、集めた細胞層をセルバッファーＡを加えたセルハッファアーＡ ２２で洗浄し、容量５０ｄとする。

ステップ７０では、チューブ６２の細胞を１１００Ｏｒｐで１０分間室温で遠心 分離して、ペレット化する。

ステップ８０では、今度は１Ｍ１のセルバッファーＢ８２で細胞を再び懸濁する 。

ステップ９０では、次に述べるような無菌技術を使い、１００μｌの抗−ＣＤ４ ５磁気ビーズ９４を、２ｍのマイクロ遠心分離管９２に調製する。（ビーズの準 備については、図に示されてない。）ビーズをマグネットでチューブの片側に寄 せて、１．４ｄのセルバッファーＡで洗浄する。

そのチューブを５分間静置する。洗浄液をピペットで注意深く除く。マグネット も取り去る。ステップ９０の図に示したように、ステップ７０によるチューブ６ ４の再懸濁細胞をチューブ９２に入れる。穏やかに混合しながら室温で１０分間 インキュベートする。

ステップ１００で、マグネット１０２として図示した磁気支持ブロックのような マグネットで、ビーズ９４をチューブ９２の反対側に保持する。

ステップ１１０で、溶液をピペット１１２で取り除き収集する。ピペット１１２ の細胞懸濁液１１４は、胎児細胞を含んでいる。ビーズ９４に残る細胞状物質１ １８は、主として母体白血球を含んでいる。

ステップ１２０は、ピペット１１２から顕微鏡スライド１６２上に、ピペット液 １１４を移す様子を図示したものである。このような移動は通常ピペットで行う 。もし懸濁液中でハイブリダイゼーションを行う時は、代わりに、洗浄した胎児 細胞懸濁液を新たなチューブ（図示せず）に入れる。

あるいは、例えばそこに結合した抗−ＣＤ４５の付いたビーズを使う（直接陰性 選択）代わりに、被検体を溶液中の抗−ＣＤ４５と反応させ、抗−ＣＤ４５と抗 原−抗体配位子（リーガンド）に侵入した白血球を、この種の抗体を分離するい ずれかの手段、特にＣＤ４５分子のエピトープ（ｅｐｉＬｏｐｅ）に対する抗体 を用いて除去する（間接陰性選択）、抗−ＣＤ４５がマウスの抗体では、このよ うな配位子形成性抗体は、例えば基体に結合した羊−抗マウスＩｇＧ抗体であり 、それは概して、固体か、あるいは抗体で被覆した磁気ビーズや、コートした容 器壁のような、溶液から容易に配位子複合体を移すことの出来るものである。

久ｉ不上皇作底 スライドを作るときは、通常の細胞スピン法で容易に作ることが出来る。あるい は、有機シラン化スライドとして作成出来る。

細胞スピンスライドを作るには、ステップ１１０から２００μｍの細胞懸濁液１ １４を各スライド上に置き、５００　ｒｐｍで５分間細胞スピンする。細胞スピ ンスライドを冷却した８０％エタノール／水（Ｖ／Ｖ）に５分間浸す。風乾する 。

あるいは、直接３０μｍのエタノール／メタノール（３：　１　ｖ／ｖ）を各ス ライドにかけ、細胞スピンしたスライドを直接固定する事も出来る。

有機シラン化スライドを作るには、きれいなスライドを、新たに調製した３−ア ミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＯ）の様な有機シランの２％（Ｖ／Ｖ ）アセトン溶液に、２分間浸す、スライドを２回水で洗い、風乾する。

サンプルとして使用する、２（ｌｄの母体血液や１０ｄのへその緒の血液の各々 に対し、例えば８０％エタノール／水か、３：ｌエタノール／メタノールの５０ ｕ１の定着液で、細胞ベレットを再懸濁する。この懸濁液の５０ｔｌＩをスライ ド上に落とし、サンプルを風乾する。

フローサイトメトリー コールタ−プロファイル■型サイトメタ−が、セツティングｌ１００のＰＭＴＩ とセンティング９００（７）ＰＭＴ３を使い、胎児細胞中の核酸の検出に使用さ れる。ＰＭＴＩ−ＰＭＴ３の色補償は１５％である。エピックスエリート法が母 体血液のような被検体から、胎児細胞を選別するのに使われる。

フルオレセイン（通常ＦＩＴＣ）がプローブであるときは、染料はまず波長４８ ８ｎｍの光に励起し、次いで放射光が測定される。放射光の測定には（ＬＦＬＩ に対し）、即ち５２０ｎｍから５６０ロ■の間の波長のみ通過する５４０ｂｐ　 （４０）フィルターが使われる。ＬＦＬ３に対するフィルターは、波長６３５ｎ ｍ以上が通過する、６３５長波長通過フィルターである。

マーカーは細胞を、例えば栄養芽層のような胎児細胞として明確にするために使 われる。栄養芽屡の表面で見つかるいろいろな抗原は知られており、このような 抗原に対する抗体は、この細胞を母体血液、その他の母体細胞や胎盤組織のよう な細胞から、同定し分離する標識として使われる。本発明では、サイトケラチン に対する抗体は、好ましい栄養芽層に対する胎児性細胞マーカーである０例えば 、（１）サイトケラチン、（２）絨毛性ゴナドトロピンのβ−サブユニット、（ ３）胎児性ヘモグロビン蛋白質、（４）絨毛体乳腺刺激ホルモン蛋白質〔胎盤ラ クトジエン（胎盤刺激泌乳ホルモン）〕、（５）妊娠−特異性β−糖蛋白質、（ ６）α−フェト蛋白質等である。サイトケラチンに対する種々の標識を付けた抗 体が利用できる。これらはＣＡＭ５．２Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カ タログＮｏ、９２−０００５　；と抗−サイトケラチン１８−ＦＩＴＣＳｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ＋ｍｐａｎｙ、カタログＮｏ。

Ｆ−４７７２（サイトケラチン１８に対する抗体）；を含んでいる。もっとも好 ましいものは、蛍光＋ａｏｉｅＬｙでラベルした、サイトケラチンに対する抗体 である。

更に好ましくは、胎児細胞特異性ＲＮＡ配列が、胎児性細胞のマーカーとして使 われる。このような配列は、例えば胎児性ヘモグロビン遺伝子、サイトケラチン 遺伝子、絨毛性ゴナドトロピンβ−サブユニット遺伝子、絨毛体乳腺刺激ホルモ ン遺伝子（胎盤刺激泌乳ホルモン）、妊娠−特異性β−糖蛋白遺伝子、胎児性細 胞ヘモグロビン遺伝子、α−フ二二帯蛋白遺伝子の転写である。これらの遺伝子 やその他の遺伝子配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａ ｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋ、６９．０版から入手できる。これらの配列を包含するプ ローブやプローブの集団は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ、Ｉｎｃ 、、Ｆ。

５ｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、ＣＡ、から供給される、モデル３８０Ｂの様なりＮＡ市販 合成試薬及び同社からの他の試剤を用いてオリゴデオキシヌクレオチットとして 合成する。プローブは、天然ヌクレオチットベースや天然ヌクレオチットベース の既知の類似物を含み、標識部分に結合できるように改造した物も含んでいる。

密度勾配遠心分離法を使い、被検体中の胎児細胞を同定する新しい方法は、密度 勾配溶媒を使う。もっとも好ましくは、密度勾配溶媒はコロイド性ポリビニルピ ロリドンでコートしたシリカ（例えばパーコール）、ナイコデンツ、非イオン性 多Ｉｉ類（フィコール）単独か、あるいはヂアトリゾエイトソーダ（Ｆｉｃｏｌ 　Ｉ−Ｐａｑｕｅあるいは旧５ｔｏｐａｑｕｅ）やそれらの混合物を含む、試薬 の密度は、目的の胎児細胞をその他の血液成分から都合良く分離するものから選 ぶ。

本発明は、最小の胎児細胞数で、遺伝子異常を検出できる。胎児細胞は、羊水穿 刺、絨毛サンプリング、その他の当該技術分野で知られた標準法で、得ることが 出来る。本発明の一つの具体例では、しかしながら、胎児細胞は、子宮腔への侵 入をせず、母体や胎児を損傷をしないように、母性末梢血液から採取する。もう 一つの本発明の具体例では、へその緒の血液を経皮的に採取する。本方法の感度 はよく、通常の胎児細胞の分離や検出技術で必要とする量より少なく、たとえば 好ましくは１−２１、選択的には０゜２１はどの少量のへその緒の血液でよい。

遺伝煎異棗■検班 本発明で検出される遺伝的異常は、欠失、付加、増幅（拡大）、転座あるいは再 配列である。

たとえば欠失は、標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーシラン可能な結 合の欠落を検出することで同定される。遺伝子配列の欠如を検出するには、通常 の胎児細胞にはあり、異常な胎児細胞にはない核酸配列に相補性のプローブ集団 を調製する。もし試験する細胞の配列にプローブがハイプリライズするなら、そ れで配列は検出され、該細胞はその配列について正常である。もしもプローブが 細胞の核酸とハイブリライズしなければ、それで配列はその細胞中に検出されず 、一方、Ｘ染色体のようなコントロール（基準）配列が細胞中に検出されたなら ば、細胞は異常と認められる。

付加は、染色体のポリヌクレオチットの繰り返し部分に対する標識プローブの結 合の検出で同定される。染色体への挿入、あるいはダウン症候群を示す染色体２ １のトリソミー（三染色体性）のような抜型異常などの遺伝子配列の付加を検出 するには、問題の遺伝子配列に相補性のプローブ集団を調製する。ダウン症候群 の例については、もし染色体２１に相補性のプローブが、細胞中の染色体２１に 出現する３回の配列（Ｌｈｒｅｅ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ）にノ＼イブリライ ズするならば、染色体２１の配列の３回の像出現（ｔｈｒｅｅ　ｏｃｃｕｒｒｅ ｎｃｅｓ）が検出され、ダウン症候群の３染色体性状態が明らかになる。もし例 えば、検出手段が蛍光染料なら、細胞中に見える明確な３つの蛍光点が、三染色 体性状態を示すであろう。

例１４で説明したように、特定のＤＮＡフラグメント（断片）に増幅が存在する と、増幅を受ける配列に対応する標識プローブからのシグナル強度が増加する。

幾つもある画像解析法（ｉｏ＋ａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　５ｙｓｔｅａ＋）の どれかを使い、シグナルを計量し、基準と比較し特定の増幅性変異があるかどう かを決定する。

転座あるいは再配列は幾つかの方法で同定される０例えば第一の標識プローブは 、転座しない染色体のマーカー領域に結合する。第二の標識プローブは次いで、 同じ染色体の第二の領域（再配列のため）、あるいは第二の染色体（転座のため ）に結合する。そしてそれにつずいて、第一と第二のプローブの結合を検出する 。あるいは転座は、まず転座あるいは再配列を起こす染色体のポリヌクレオチッ ド部分のマーカー領域に、Ｉ！！ｉプローブが結合する事により同定される。そ れにっずいて、標識プローブの結合が検出される。

例えば、転座を検出するには、問題とする染色体のマーカーを同定し、それにハ イブリダイズする集団プローブを調製する。それらは、特定の波長で蛍光を出す 染料のような、検出可能な標識でマークしである。試験する異常な転座や再配列 による配列もまた同定し、それを同定する第二の集団プローブを調製する。第二 の集団プローブは、最初の一連の標識プローブと違う波長で蛍光を出す染料のよ うな、際立って異なる標識でマークされである。ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダ イゼーションは両方の集団プローブを使って行われ、各々の集団プローブのハイ ブリダイゼーションの結果が比較される。もしも、第一と第二の標識が実質的に 総ての細胞サンプルで一致するなら、転座は起きていない。

もしも、サンプルの重要な分画で、第一の標識が第二の標識と一致しないことが 見っがるならば、転座や再配列が起きている。たとえば、Ｆ、５ｐｅｌｅＩｌｌ ａｎ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４１（４）＋１６９−１７４（１ ９９１）；　Ｊ、Ｗ、Ｇｒａｙ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　１ｎｃＩｉｎｉｃａｌ　ｇ 　Ｂｉ。

１　、Ｒｅｓ、３７２：３９９−４１１　（１９９１）を参照。

ハイブリダイゼーション エタノール、たとえば８０％エタノール／水（Ｖ　／　Ｖ　）は、ｉｎ　５ｉｔ ｕ　・ハイブリダイゼーションに於ける細胞処理の定着剤として、都合良く使う ことが出来る。その他の好適な沈殿定着剤としては、酢酸、メタノール、アセト ンと、例えばエタノール／メタノール混合物（３：１）のような、それらの組み 合わせもある。その他の有用な定着剤については、当業者には明らかである。定 着剤と定着した細胞のハイブリダイゼーションについては、総じて米国特許Ｎｏ 。

５．２２５，３６２．で述べられである。定着剤は、良好な細胞形状の保存、抗 体の保存とアクセス性、高いハイブリダイゼーション効率を提供しなければなら ない。幾つかの塩類、例えば塩化第二水銀、塩化ソーダ、硫酸ソーダ、重クロム 酸カリウム、リン酸カリウム、アンモニウムブロマイド、塩化カルシウム、酢酸 ソーダ、塩化リチウム、酢酸セシウム、酢酸カルシウムあるいはマグネシウム、 硝酸カリウム、重クロム酸カリウム、クロム酸ソーダ、沃化カリウム、沃素酸ナ トリウム、チオ硫酸ソーダ、そしてスライドを炎の上で振るような、極度の温度 もまた定着剤として作用する。

定着剤は例えば、パラフォルムアルデヒド、グルタルアルデヒドやフォルムアル デヒドのような、これらの物質を共に架橋（交差結合）し、細胞成分を定着させ る化合物を含む事が出来る。架橋剤は、超微細構造（限外構造）を保存するが、 補集する核酸と抗原でネットワークを作り、それらをプローブや抗体に近すき難 くして、ハイブリダイゼーションの効率をしばしば低下させる。ある架橋剤はま た核酸と共有結合して、以後のハイブリッド形成を妨害する。

ハイブリダイゼーションにンの　へ ハイブリダイゼーション溶液は、代表的にはカオトロピック変性剤、緩衝液、孔 隙形成剤、ハイブリ化安定剤を含んでいる。カオトロピック変性剤としてはフォ ルムアミド、尿素、チオンアネート、グアニジン、トリクロロ酢酸、テトラメチ ルアミン、過塩素酸塩と沃化ナトリウムが挙げられる。ｐＨを少なくとも約６． ０から約８．５の間に、好ましくは７．０から８．０に保つ緩衝液ならば利用で きる。

孔隙形成剤は、例えばＢｒ１ｊ３５．　Ｂｒ１ｊ５８．　ドデシル硫酸ソーダ、 ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、５ａｒｋａｓあるいはＴｒｉｔｏｎＸ　−１００のよ うな、界面活性剤である。標的とする核酸の位置によりプローブが、プラズマ（ 血漿）や細胞核膜や細胞隔壁構造を通し侵入出来るように孔隙形成剤を選択する 。例えば、０．０５％Ｂｒ１ｊ３５や０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００は、 プローブがプラズマ膜は通るが細胞核膜は通らない様にする。その一方でデオキ シコール酸ソーダは、プローブが細胞核膜を通れるようにする。このように、細 胞質核酸の標的に対するハイプリント形成を制限するため、細胞抜脱孔隙形成剤 は避けるようにする。このような選択的な細胞の位置の限定は、標的核酸が細胞 質中にあるとき、相補性核酸配列に対するプローブのハイブリダイゼーションを 除外し、測定の特異性と感度に貢献する。固定剤や塩類のような界面活性剤以外 の薬剤は、この反応を助けることが出来る。

１価あるいは２価化のカチオンを持つ塩類のようなハイブリッド安定剤は、ハイ ブリダイゼーション溶液中に含まれ、プローブの相補性配列とその標的核酸との 間の水素結合の形成を促進する。好ましくは０．１５ＭからＩＭの濃度の塩化ナ トリウムが使われる。核酸プローブの非特異的結合を防ぐため、標的核酸に関連 しない核酸は、出来ればハイブリッド化溶液中に加えると良い。

多くのタイプの固形支持材が、本発明を実施するために利用される。利用される 支持材は、限定されるわけではないが、ガラス、スコッチテープ（３Ｍ）、ナイ ロン、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ（Ｎｅｉｕ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ）とニトロセルローズを含む。もっとも好ましくは、顕微鏡用スライドガ ラスが使われる。これらの支持材の使用と被検体をその上に置く方法は、当業者 には明白なことである。支持材の選択は、細胞を観察する方法と定量する方法に よる。幾つかのフィルター材は厚みが不均一で、従ってｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイ ブリダイゼーション中の収縮と膨張は均一ではない。さらに付は加えると、自発 蛍光する幾つかの支持材は、低レベルの蛍光の定量を妨害する。顕微鏡用スライ ドガラスは、高いノイズ対シグナル比を持ち、良く組織を保持するから、最も好 ましい固形支持材である。

この工程の具体例は、標的細胞を固体表面（特にスライトガラス）上に固定する 。もう一つの例では、標的細胞は全工程中で液中に懸濁され、固体表面に固定さ れない１通常のフローサイトメトリー測定器の使用は、特にこの発明を容易にす る。

工程は次のステップからなる。

（１）当該細胞中又はその上の標的分子に結合するプローブを含有する溶液に、 該細胞を接触させる。この接触はそのプローブを細胞結合プローブとするために 、前記の標的分子に結合する方法で行われ、かつ前記プローブはレポーターグル ープを持っている。

（２）細胞をレポーターグループの構造類似体を含む溶液に接触させる。

（３）細胞に結合したプローブ上のレポーターグループを検出し、細胞に結合し た類似体は検出しない、−ないしそれ以上の工程を行う。

そこで、ステップ（２）の前にあるいはステップ（２）の後にあるいはステップ （２）の間に、ステップ（１）が行われる。

同一溶液中にプローブと類似体が存在するとき、ステップ（１）とステップ（２ ）は同時に起きると考えられる。

好ましくは、同一溶液中にプローブと類似体を存在させ、ステップ（１）とステ ップ（２）を同時に行う、好ましい具体例では、多くの標的配列に対する多くの プローブを、同時にハイブリダイズさせる０例えば、好ましくはＨｂｆｍＲＮＡ と人の染色体２１に対するプローブを接触工程で含有させると、ＨｂｆｍＲＮＡ に対するプローブのレポーターグループは、人の染色体２１に対するプローブの レポーターグループと、検出可能なほど相違する。

本発明の亜属的要旨から見ると、レポーターグループは環状化合物である。この 発明の更なる亜属的要旨から見ると、環状グループは不飽和結合を含む、この発 明の更に狭い亜属的要旨から見ると、環状グループは芳香酸化合物（−ないしそ れ以上のベンゼン環）である。

レポーターグループに関して、モルベースで類（以体は過剰にある事が望ましく 、類似体は少なくともレポーターグループより１０倍あるこ七が、特に望ましい 。

類似体はレポーターグループと非特異性結合点で競合する。核酸プローブと一緒 にして使うオーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）の場合、付加的なメカニズムは、 レポーターグループに結合する蛋白質の活性点に対する、ＡＴＡの結合を含んで いる。類似体はレポーターグループのほとんどあるいは総ての、構造的特徴を保 つように、選択することが望ましい、類似体はプローブに存在しない構造的特徴 を、付加的に有する。

好ましくは、類似体は細胞やウィルスを浸透すべきである。オーリン誘導体（ロ −ダミ誘導体）である類似体の場合は、類似体は、ＡＴＡに加えて、芳香族性基 に−Ｃ○、　、−ＮＨ２、ＯＨ，あるいは−３Ｏｚ基のような極性反応基を持つ ことが望ましい０例としては、クロモキサチンシアニンＲとクロームアズロール Ｓ等がある。

好ましい類似体のサブグループとしてリジンのＮＨ，１をブロックしたものがあ る。

蛍光性レポーターグループはレポーターグループにエネルギーを吸収させ、次い で吸収エネルギーの幾らかを放出させることでその放出エネルギーを検出する； 化学発光性レポーターグループは、それらをエネルギーが光の形で放出する酵素 反応のような反応をさせることで検出される。

ビオチンのような他のレポーターグループは、それらがストレプトアビジンのよ うなグループと結合することで検出される。ストレプトアビジンは、検出可能な 反応を触媒出来る、アルカリホスファターゼや西洋わさびパーオキシダーゼのよ うな酵素に、直接あるいは間接に結合する。

この工程が利用できる蛍光グループは、フロレセン（あるいはＦＩＴＣ）　、ク マリン、ローダミンとテキサスレッドとフィコエリトリン（藻紅素）を含むロー ダミン誘導体である。

この工程が利用できる化学蛍光グループは、イソルミノール（あるいは４−アミ ノフタールヒドラジソド；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ＋ａｐａ ｎｙ　あるいはＭｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、のカタログを参照 ）を含む。

この工程の一つの好ましい具体例では、レポーターグループがフロレセンのとき 、ステップ（４）は約５２０ｎ履き５６０１間の波長（特に約５２０ｒｖ＋）で 放出された光の測定を含んでおり、最も好ましくは、チップ（３）の吸収波長は ５２０ｎｍ未満である。

蛍光測定工程の好ましい具体例は、更にステップ（２）と（３）の間に洗浄工程 を含んでいる。洗浄工程は懸濁した液から遠心分離で細胞を取り出し、次いで洗 浄液に懸濁し、そして次いで遠心分離で細胞を取り出す、洗浄液は通常プローブ を含まない。

この工程の特別な具体例では、ステップ（２）で使われる溶液は、プローブ（レ ポーターグループはを含む）、レポーターグループの類似体、フリーラジカル消 去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）と固定剤を含んでいる。

標的分子に結合する蛍光性プローブは、高度に特異性のあるその標的に結びつく ものがよい、好ましくは、蛍光性プローブは、核酸分子、抗体、あるいは特異的 に標的分子に結合できるその他の分子に、共有結合で結びつく蛍光性染料である 。

類似体が混合液（カフテール）に添加されるとき、好ましい濃度は０．０１％か ら０．５％ｗ／ｖ（特に約０．０１から０．０５％）である。

本発明のもう一つの要旨は被検体中の胎児細胞中の核酸を検出するキットである 。このようなキットは次のものを含んでいる。

（１）固定／ハイブリダイゼーション用混合液と、−ないしそれ以上の標識プロ ーブを含む溶液。例えば、限定するものではないが、この溶液は５０＋＊Ｈのグ アニジンイソシアｔ、−ト、２５−４０％フォルムアマイド、３１％ＰＥＧ　。

０、　４ＭＤＴＴ、　１５　Ｘフィコ−／し／ＰＶＰ、５０２＋ｏＭ　ＥＤＴＡ 、　ｌａｇＺ■１鮭の精子のＤＮＡ、５０ｍＭ）リスアセテートＣｐＨ１−８） 、約５％のＴｒｉｔｏｎ　ｘ−１００と約２０　ｐｇ／ｍＩのレポーター分子で 直接標識した合成オリゴヌクレオチフドプローブを含有する。この溶液とプロー ブの特性と、細胞と標的配列に対する反応性は前もって測定確認しておく、そし て（２）本発明のハイブリダイゼーション反応を行う手段と装置。

あるいは、キットはまた以下のものを含むこと力咄来る＝（１）プローブあるい はプローブ−標的ハイブリッドと反応する第二の検出可能なレポーターグループ システム；（２）そのまま使用するが洗浄液として充分に薄める、濃縮ストック 溶液 （３）固体支持体（たとえば顕微鏡用スライド）、前記の支持体に細胞を固定す る装置、あるいは、被検体のインキュベーションや洗浄にも役立つ器具のような 、本発明を実施する上で、必要あるいは有用な機械的部材；そして所望により、 （４）本発明で実施される検定の結果を記録する、写真フィルムやエマルジョン 。

本発明のもう一つの要旨は、母体血液細胞を分離すること無く、被検体中の胎児 性ヘモグロビンを検出するキットを提供することである。

このキットの好適な態様は、胎児細胞のＨｂＦｍＲＮＡを検出できる手段を含む 。用意されたものは、毛細管で血液をなすり付けるマウンチングスライドガラス 、望ましくはスライドマウントＡ、スライドマウントＢ１とスライドマウンチン グ用溶液である。

更に用意されたものは、濃縮洗浄液Ａ、濃縮洗浄液Ｂと胎児性ヘモグロビン検定 用溶液である。ここで述べた濃縮液は、使用に際し代表例で以下に述べる溶液濃 度に、大体薄める。

本発明のもう一つの要旨は、母体血液あるいはへその緒の血液のような、血液被 検体中の胎児細胞を富化し検出する、キットを提供することである。このように キットが含有するのは： （１）胎児細胞の濃度を高める密度勾配を作るーないしそれ以上の試薬； （２）胎児細胞と／あるいは、胎児細胞のｍＲＮＡに特異性のプローブを（好ま しくは胎児性ヘモグロビンのｍＲＮＡ）検出あるいは分離する標識抗体；そして （３）胎児細胞の富化をするための手段と説明書あるいは、キットは以下のもの を含むことが出来る：（１）望ましくは固体支持材に結合し、好ましくは胎児性 赤血球の陰性選別のための抗ＣＤ−４５を含み、好ましくは被検体中の胎児細胞 を陽性あるいは陰性に濃縮するため、磁気ビーズに結合するーないしそれ以上の 抗体；そして （２）胎児細胞を検出するために、胎児細胞のｍＲＮＡに特異性のプローブ；そ して （３）密度勾配遠心分離かフローサイトメトリーで胎児細胞を富化する手段と説 明書：そして所望により（４）胎児細胞を濃縮する密度勾配を作る、−ないしそ れ以上の試薬。

都合のよいことに、直ぐ上で述べたこのような二つのキットのどちらかは、更に 以下のものを含むことにより、胎児細胞内の−ないしそれ以上の標的核酸配列の 検出の手段を備え提供できる： （２）プローブあるいはプローブ−標的とハイブリッド反応する第二の検出可能 なレポーターシステム（３）そのままで使用するか、充分に稀釈して洗浄液とす るｉｆｆ縮ストック溶液；そして所望により（４）固体支持体（たとえば顕微鏡 用スライド）、前記の支持体に細胞を固定する装置、あるいは、被検体のインキ ュベーションや洗浄に役立つ器具のような、本発明を実施する上で、必要あるい は有用な、あらゆる機械部材（５）本発明で実施される検定の結果を記録する、 写真フィルムやエマルジョン。

このようなキ・７トは、本発明の総ての方法を実施するための、自動化システム に使う試薬と材料を、オプションとして提供する。

表１は明細書中で述べたいろいろの化合物と染料の略語と個有名を示す。

紅 人　と汎Ｓの　８五と ８五あるいは　±企批 Ｔｅｍｐｏ　２，２，６．６−チトラメチルピベリジンーＮ−オキシル［ＣＡＳ 　＃　２５６４−８３−２コＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 ＤＭＦ　ジメチルフォルムアミド ＤＭＳＯジメチルスルフオキシド ＤＴＴ　ジチオスレイトール ＰｖＰ　ポリビニルピロリドン ＰＥ６４０００　ポリエチレングリコール（約４０００　モル、重量、） ＰＢＳ　燐酸−緩衝　生理食塩 ＡＴ八へ−リントリカルホン酸［ＣＡＳ　＃　４４３１−００−９　］ＣＨＡＰ Ｓ　３−　［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパン −スルフォネート［ＣＡＳ　＃　７５６２１−０３−３］ フォトビオチン　Ｎ−（４−アジド−２−ニトロフェニル）−Ｎ′−（３−ビオ チニルア　アミノプロピル）−Ｎ′−メチル−１，３−プロパンジアミン［ＣＡ Ｓ　＃９６０８７−３７−５１　］ Ｆｉｃｏｌｌ　非イオン性ポリシュクロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｈｉｓｔｏ ｐａｑｕｅ　１０８３　フィコールを含む無菌的に濾過した溶液非イオン性　ポ リシュクロース（タイプ４００）とジアドリゾエートナトリウム、密度１．０８ ３ Ｐｅｒｃｏｌｌ　コロイド性ｐｖｐ被覆シリカＮｙｃｏｄｅｎｚ　５−　（Ｎ　 −２，３−ジヒドロキシプロピルアセタミド）−２，４，６−）リョードーＮ、 Ｎ’　−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）イソフタ−ルアミド［ＣＡＳ　 ＃　６６１０Ｂ−９５−０１ＴＩＩＩｅｅｎ　脂肪酸のポリオキシエチレンソル ビタン塩５ａｒｋａｓｙｌ　Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩［ＣＡＳ＃ 　７６３１−９８−３　］ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００オクチルフェノキシポリエチレングリコール（ポリオ キシエチレンエーテル）　［ＣＡＳ　＃　９００２−９３−１］ Ｂｒ１ｊ　３５　ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル［ＣＡＳ　＃　９０ ０２−９２−０　］。

Ｂｒ１ｊ５８　ポリオキシエチレン２０セチルエーテル［ＣＡＳ＃　９００４− ９５−９　］ Ｔｒｉｓ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン［ＣＡＳ　＃　７７−８６ −１コ ｉｎｓｏｌｕｍｉｎｏｌ　４−アミノフタールヒドラジッド［ＣＡＳ　＃　３６ ８２−１４−２　］ ＡＰＴＯ３−アミノプロピルトリエトキシシラン［ＣＡＳ＃　９１９−３０−２ ］ ＤＡＰＩ　４’、６−ジアミノノー２−フェニルインドール塩酸塩［ＣＡＳ　＃ 　２Ｂ７１Ｂ−９０−３］ＢＣＩＰ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル 燐酸塩［ＣＡＳ　＃　１０２１８５−３３−１コ象料■監益 東ｎ１号　叉皿皇束料至　リ １２　ナフトールブルーブラック　ナフトールＢ１、ＢＩＫ。

１３　パラチンファーストブランク　パラチンＦ−ＷＡＮ　Ｂ　ＷＡＮ ２０　スルフナローダミン１０１水和物　スルフォロー［ＣＡＳ　＃　６０３１ １−０２−６］　ダミン１０１Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　スルフナローダミン１０１ 塩酸塩［ＣＡＳ　＃　８２３５４−１９−６］Ｄｉｒｅｃｔ　Ｂｌｕｅ　５３　 工ヴアンスブルー［ＣＡＳ　＃　３１４−１３−６］ フルオレセン　インチオシアネ　ＦＩＴＣ−ト Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８　２　’　−［４−ヒドロキシフェニル］−５−［ ４−メチル−１− ピペラジニル］−２，５′−ビ ーＩＨ−ヘンジイミダゾール トリ塩酸塩［ＣＡＳ　＃　２３４９１−４５−４］ＮＬｕｒａｌ　Ｂｌａｃｋ　 １　ヘマトキシリン［ＣＡＳ　＃　５１７−２８−２］ Ａｃ１ｄ　Ｒｅｄ　９１　エオシンＢ　［ＣＡＳ　＃　５４８−２４−３コＳｉ ｇｍａ　８４０−１０　ニトロブルーテトラゾリウム　ＮＢＴ畏亘血釡瓜 以下の溶液が本発明の実施に使われる。

細胞緩衝液Ａ（使用のために希釈）：ＰＢＳ中に０．８％ＢＳＡ、　０．１％デ キストローズ、０．１％アジドナトリウム。

細胞緩衝液Ｂ（使用のために希釈’）：Ｐ’ＢＳ中に２％ＢＳＡ。

０．１％デキストローズ、０．１％アジドナトリウム。

固定溶液：４容量のエタノール、５容量のＰＢＳ、１容量の氷酢酸。

ハイブリダイゼーション用混合液：　５　Ｘ５ＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣＬ　、 ０．０７５　Ｍ　クエン酸ソーダ）；３０％フォルムアミド（ｖ／ｖ）　；３　 ％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００（Ｖ／Ｖ）　；０．４Ｍグアニジンイソチオシアネ ート；０．１６Ｍ　燐酸ナトリウム（ｐＨ６）　；　１５ＸＦｉｃｏｌｌ／ＰＶ Ｐ　；　Ｉ　Ｂ／ｍｌ引き裂いた鮭あるいはニシンの精子ＤＮＡ　；　１０ｍＭ 　ＥＤＴＡ；２５ｍＭ　ＤＴＴ；３１％ＰＥＧ　４０００゜ 核酸プローブと共に使うハイブリダイゼーション用混合液にとって、ハイブリダ イゼーション反応時間は約２０℃と約９０℃の範囲にあり、好ましくは約３７℃ と約８５℃の範囲、最も好ましくは約４０゛ｃと約４６°Ｃの範囲である。

ハイブリダイゼーション反応時間は、５分から１６時間の間にあり、好ましくは ４時間以下である。更に好ましくは、ハイブリダイゼーション反応時間は１２０ 分以下であり、いま一層好ましくは、６０分以下である。最も好ましくは、反応 時間は３０分以下である。

洗浄ａ＃ｌは以下の組成を有する：０．４Ｍ　グアニジンイソチオシアネート； ０．１％ＴｒｉＬｏｎ　Ｘ　−１００（Ｖ／Ｖ）；　と脱イオン水中の０．　Ｉ 　Ｘ５ＳＣ。

洗浄液＃２は以下の組成を有する：０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００（Ｖ／ ｖ）　；　と脱イオン水中の０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣ、（ＳＳＣは以下の組成を有す る：０．１５Ｍ　ＮａＣ１、０，１５Ｍ　クエン酸ソーダ、ｐＨ７，０゜２ｘＳ ＳＣは１：ｌに水で希釈すると、ＳＳＣに成るように作られである；　ｌ０ＸＳ ＳＣは１：ｌＯに水で希釈すると、ＳＳＣに成るように作られである。）ＰＢＳ の組成は０．１３６　Ｍ　ＮａＣｌ　、　０．００３　Ｍ　ＫＣＩ、　０．００ ８　ＭＮａ、）ＩＰＯ，・７ＨｚＯ，０，００１Ｍ　ＫＨ，ＰＯ，、もし染料で 標識をつけた抗体をプローブとして使うなら、あるいは牛の血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）を追加し、プローブをＰＢＳに溶解し、ついで好ましくは４°Ｃから３４ °Ｃの温度範囲で標的細胞と反応させる。細胞を固定する必要はなく　（例えば 、抗体の標的が細胞表面抗原の場合）、あるいはプローブ−標的のインキュベー ションが終わった後か、プローブ−標的インキュベーションの前か最中に固定し てもよい。

マウント（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）用溶液は５０％ＰＢＳ１５０％グリセロール（Ｖ ／Ｖ）、０．１％１，４−フェニレンジアミン（線色防止剤として）とｌμｇ／ ａｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５ＢあるいはＤＡＰＩ（染料）である。

プローブ プローブはＤＮＡやＲＮＡ、あるはＤＮＡやＲＮＡに対する合成類似体である。

プローブは相補性あるいは鏡像の標的細胞遺伝子配列に、通常水素結合形成によ り、一つないしそれ以上のタイプの化学結合で結合できる。通常ＤＮＡあるいは ＲＮＡプローブは、アデノシン、ウリジン、チミジン、グアニン、シトシン、あ るいはそれらの天然や合成化学誘導体をベースに作られている。燐酸骨格はリボ ース、デオキシリポースやそれらの類似体あるいは誘導体とリンクしている。核 酸プローブは当業者に知られた色々の方法で調製出来る。プローブは推奨された Ａ、Ｂ、１．試薬を使い、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ（Ａ、Ｂ、 １．）のＤＮＡ合成剤モデル３８０上に合成したオリゴヌクレオチットである。

合成の最終段階では、アミノへキシル燐酸塩リンカ−が、望ましくは胎児性細胞 特異性マーカーに対するプローブの５′末端に付着する。そして好ましくは、検 出すべき染色体配列のようなその他の配列に対するプローブの、５′と３′双方 の末端に付着することが望ましい。５′−あるいは５’、３’　−アミノへキシ ル　オリゴヌクレオチットは、次いで、選んだ染料に各々結合（ｃｏｕｐｌｉｎ ｇ）　Ｌ／、ＨＰＬＣで精製される。以下の例で説明するように、はんの只−個 の蛍光標識がプローブに結びついても、蛍光は顕微鏡の目視で検出される。

精製した一本鎖のＤＮＡプローブが、−重鎖のファージＭ１３あるいはこのファ ージのプラスミド誘導体、あるいは精製ＲＮＡの鋳型の逆転写により作られる。

挟隅匹≦仁り屯 検出可能な標識は検出されうる総ての分子で可能である。

通常使われる検出可能な標識は、制限されるものではないが、３２Ｐ、目ｃ、　 ＋２５　１、コＨと’ｉｂＳを含む放射性標識である。ビオチンで標識したヌク レオチットは、ニックトランスレーションや酵素あるいは化学的手段で、ＤＮＡ あるいはＲＮＡ中に取り込むことが出来る。ビオチンで標識したプローブは、ハ イブリダイゼーション後に、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光、酵素あるい はコロイド性金接合体を使い検出する。核酸はまた、他の蛍光性化合物、免疫検 出性蛍光誘導体やビオチン類伯体で標識される。核酸はまた蛋白質の付着で標識 される。放射性あるいは蛍光性ヒストン旧、酵素（アルカリフォスファターゼと パーオキシダーゼ）や−重鎖結合（ｓｓＢ）蛋白質と架橋結合した核酸も、また 使用することが出来る。コロイド性金やパーオキシダーゼ産生物の検出感度を高 めるため、銀溶液を使う数多くの増強あるいは拡大法が使われる。

間接的な蛍光免疫細胞化学手段がまた利用できる（Ｒｕｄｋｉｎ　ａｎｄ　５ｔ ｏｌｌａｒ（１９７７）　Ｎａｔｕｒｅ　２６５：４７２；　Ｖａｎ　Ｐｒｏｏ ｉｊｅｎ、ｅＬ　ａｌ（１９Ｂ２）　Ｅｘｐ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、　１４１：３ ９７）　、ポリクロナール抗体は、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）の動物への注入 により、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して増強される。ＤＮＡプローブは細 胞とｉｎ　５ｉＬｕにハイブリダイズし、ハイプリントはＲＮＡ−ＤＮＡハイブ リッドに対する抗体とインキュベートすることで、検出できる。

プローブはハイブリダイゼーション溶液に添加する前に、検出できるように標識 化される。あるいは、ハイブリダイゼーション形成物に結合する、検出可能な標 識を選別する。

本発明の実施使用に当たり、検出可能なあらゆるグループでプローブを標識出来 る。このような検出可能なグループとしては、検出可能な物理的あるいは化学的 特性を持つ、あらゆる物質が可能である。このような検出可能な標識は免疫検定 の分野で著しく進歩してきた。そして通常、この方法で有用ないかなる標識も本 発明に適用出来る。

特に有用なのは、酵素的に活性なグループである。例えば酵素（ＣＩｉｎ、Ｃｈ ｅｍ、、２２：１２４３（１９７６）参照）１酵素の基質（英国特許５ｐｅｃ、 ｌ、５４８，７４１参照）、助酵素（米国特許Ｎｏ、４゜２３０．７９７と４， ２３８，５６５参照）；酵素抑制因子（米国特許Ｎｏ。

４、１３４，７９２参照）；蛍光剤（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、　、２５：３５３（ １９７９）参照）；発色団；化学ルミネソサーとバイオ性ルミネッサーのような ルミネノサー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、、２５：５１２（１９７９）参照）；特異 結合性配位子；　基部間ｉ１対；　ト’Ｈ，”Ｓ、”Ｐ、”’Ｉ　ト”Ｃのよう な、放射性同位元素である。

プローブのサイズと　・とゞ庁 プローブの長さは、その拡散速度、ハイブリッド形成速度とハイブリッドの安定 性に影響する。本発明によれば、小さなプローブ（１５−２００塩基、好ましく は１５−１００塩基、最も好ましくは１５−３０塩基）が、最も鋭敏で早く安定 なシステムを生み出す、検出すべき標的核酸の全長に掛かる、前記の小さなプロ ーブの混合物を調製するのが望ましいことである。例えば、標的核酸が１０００ 塩基はどの長さならば、２５塩基の約４０の異なるプローブが、標的核酸の全領 域を完全にカバーするための、ハイブリッド形成溶液で使うことが出来る。

プローブの特に有利な立体配置は、次のように、選別した標的配列に対するプロ ーブ集団を、調製することである二最初のプローブは、配列が塩基数１から２５ にハイブリダイズする。第二のプローブは配列が塩基数３１から５５にハイブリ ダイズする。第三のプローブは配列が塩基数６１から８５にハイブリダイズする 。そしてそのように、各々に続くプローブの開始点は、先行するプローブの末端 から、５塩基離れる。各々の２５塩基毎に５塩基飛ぶこのような立体配置は、本 発明によるハイブリダイゼーションに使われる時、最適のハイブリッド形成結果 とシグナルを提供することが分かった。

プローブの濃度は、ｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーション反応の、幾つか のパラメーターに、影響を与える。拡散を高め、ハイブリダイゼーション反応時 間を減んじ、利用可能な細胞配列を飽和させるため、高濃度が使われる。高いシ グナル対ノイズ比を保ちながら、早い反応速度を得るため、０．００５−１００ 　ｐｇ　／ｍｌのプローブ濃度が好ましい。

パ云　の 本発明の試験で検出できる遺伝子異常性は、ダウン症候群〔トリソミ−（三染色 体性２１））、チューナー症候群（ｘＯ染色体性）、クリネフェルター症候群（ ｘｘｙ三染色体性）、ニドワード症候群（三染色体性１Ｂ）とパタウ症候群（三 染色体性１３）である。

次の例は説明のために出したもので、いかなる方法においても、本発明を制限す るつもりはない。

尖施斑土 羊膜細胞の特異性染色体の数的状況を決定する染色体特異性プローブの使用 豊凶■■製 羊水２ｍｌをＰＢＳで１０ｍ１に薄め、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離する 。出来た細胞ペレットを１０００μｌのエタノールとメタノール（ｖ／ｖ、３　 ：　１）に懸濁する。試料の２００μｍを細胞スピン法で各々のスライドに置く 。

プ三二ｊ公星製 幾つかの、２５塩基の合成オリゴヌクレオチット　プローブが、表２のＤＮＡ配 列の各々のから調製された。

紅 プローブ　染色体　遺伝子バンク 名称　検出した　位置塩 α−セントロメリックリピート　Ｘ　ＨＵＭＳＡＴＡＸα−セントロメリックリ ピート　Ｙ　ＨＵＭＳＡＴＢα−セントロメリックリピート　１８　ＨＵＭＲＥ ＰＡ８４プローブのｇ　ヒ オリゴヌクレオチットは、推奨されたＡ、Ｂ、１．試薬を使い合成された（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ　、　Ｄ　Ｎ　Ａ合成剤　モデル３ ８０Ｂ）　、そして最終段階でアミノへキシル燐酸塩リンカ−が５′末端に付け られた。５′−アミノヘキシルオリゴデオキシヌクレオチンドは、次いでＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、１ｎｃ、からのローダミン染料に結合する。そし てベースライン８１０クロマトグラフイー装置を使い、ＨＰＬＣ（水）で精製し た。

ハイプリ　゛イゼーション ハイブリダイゼーション工程の為に、細胞をスライドの上に置いた。３０％フォ ルムアマイド、５　ｘＳＳＣ，０，１Ｍ燐酸ソーダ緩衝液、ρ）１７．４．１０ ０μｇ／ｍｌの低分子量の、変成した鮭あるいはニシンの精子ＤＮＡ、１０％（ ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−１００，１０％ＤＭＳ０．１５　ＸＦｉｃｏｌｌ／ ＰＶＰ、　０．４　Ｍ　グアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭ　ＤＴＴ、と ０．０２５　Ｍ　ＥＤＴＡとプローブからなる、２０から２５μｌのハイブリダ イゼーション混合液を、２０μｇ／ＩＩＩの濃度になるように加えた。変成とハ イブリッド形成は、スライドを保温器に８５°Ｃで１５分間１き、同時に行った 。

三つの別々のハイブリダイゼーション溶液を調製した。

最初の溶液はＸ染色体に対するプローブを：第二はＹ染色体に対するプローブを ；第三は染色体１８に対するプローブを含む。

ハイブリダイゼーション反応の後にスライドを洗浄することは、プローブの非特 異性結合にもとすくバックグランドを除くために有効である。ハイブリッド形成 後、スライドをＣｏｐｌｉｎジャーに入れ、１００ｍ１の洗浄液＃１を加えた。

溶液を攪拌し、２分間この溶液中に保持した。この洗浄液を除去し、洗浄液＃２ を加えた。この第二の洗浄液を５秒間撹拌し、そそぎ出した。洗浄液＃２による 洗浄工程を６回繰り返した。次いで５０％グリセロール中の０．１％１．４−フ ェニレンジアミン（褪色坊止剤として）と１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ　３３ ２５Ｂ（対比染色用染料）を含むマウンチング溶液１５μｌを添加した。

１光■檎棗 光学顕微鏡写真を蛍光検出装置付きのオリンパスＢＨＩＯ顕微鏡で、コダックエ クタクロームＥＥＳ−１３５（ＰＳ　８００／１６００）を使い露光し、ＡＳＡ 　１６００でブツシュ現像した。総ての撮影した光学顕微鏡写真を直接比較する ため、常に３０乃至６０秒の露光時間を使った。

図ＩＡ示すように、Ｙプローブを使ったとき、１点（ｌドツト）の蛍光が男性の 羊膜細胞の核に見る事が出来る。

図ＩＡ：上のパネルは、２つのＨｏｅｃｈｓｔ染色した細胞核の写真（４０倍） であり、下のパネルは、これら同じ２つの細胞の蛍光写真（１００倍）である。

図ＩＢはＸプローブを使ったとき、細胞核に２ドツト見える男性の羊膜細胞を示 している：上のパネルはＨｏｅｃｈｓＬ染色した細胞核の写真（４０倍）であり 、下のパネルは蛍光でみた、この同し細胞の写真（１００倍）である。染色体１ ８に対するプローブを使ったとき、細胞核中に二つのドツトがある（図ＩＣ）。

図ＩＣ：上のパネルはＨｏｅｃｈｓｔ染色した細胞核の写真であり、下は蛍光で 見たものである。このようにしてこれらの羊膜細胞には、正常なＸ、Ｙ及び１８ 染色体がある。

裏施斑又 羊膜細胞と末梢血液の単核細胞中のＸとＹ染色体数の状況の同時検出法 豊ｍ里袈抜 ２１の羊水をＰＢＳで１０ｍ１に薄め、１２０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離する 。出来た細胞ベレットを８００μｍのエタノールとメタノール（ｖ：ｖ、３：１ ）に懸濁した。サンプルの２００μｌを、細胞スピン法で各々のスライド上に載 せた。更に、正常な男性から得た約５，０００の末梢血液単核細胞を、細胞スピ ン法でスライドの上に載せた。

プＰ：ぢＵ囚１裂 幾つかの２５塩基数の合成オリゴヌクレオチット　プローブは、表３に掲げた各 々のＤＮＡ配列から調製した。

紅 プローブ　染色体　遺伝子バンク　蛍光名称　検出した　位置名　ラベル α−セントロンリンクリピート　Ｘ　ＨＵＭＳＡＴＡＸ　ローダミンα−セント ロメリックリピート　Ｙ　ＨＵＭＳＡＴＢ　蛍光オリゴデオキシヌクレオチット を前記のように合成し、最終段階で、アミノヘキシル燐酸塩リンカ−を５′末端 に付けた。上記の染色体の各々に対する５′−アミノへキシルオリゴデオキシヌ クレオチノドブローブを、上記の表３に示した色々の蛍光染料に結合させた。蛍 光染料はＭｏ１ｅｃｕｆａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、から入手できた、そして ベースライン８１Ｏクロマトグラフイー装置を使い、ＨＰＬＣ（水）で精製した 。

ハイブリダイゼーションと′パ　と これらのステップは、実施例１で行われた。

猜果 この実験ではＸ染色体プローブをローダミンで標識し、一方ではＹ染色体プロー ブはＦＩＴＣで標識した、そして両方のプローブを同しハイブリダイゼーション 混合液に加え、前記の工程を行った。図２Ａでは、上のパネルはＨｏｅｃｈｓｔ 染色した羊膜細胞の核の写真であり、下のパネルは細胞核中の、１個の明るいド ツト（Ｘ染色体）と１個の明るいドツト（Ｙ染色体）を表す蛍光写真である。図 ２Ｂは図２Ａの写真のように、その他の３つの羊膜細胞の写真である。

図２０は、これと同しハイブリダイゼーション混合液と正常な男性の末梢血液の 単核細胞を使い、トリップルハンド（ＤＡＰＩ−ＦＩＴＣ−ローダミン）フィル ターセントを通し写真を取ったときに、得られる結果をしめす。この写真もまた 、χとＹ染色体に対し１個と１個の明るいドツトを、各々、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色 した背景に示している０図２Ｄは、画像分析システム（ＢｉｏＳｃａｎ　Ｏｐｔ ｉｍａｓ”、Ｅ６ｍｏｎｄｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使った、図２Ｃ中の細 胞の偽カラー表示の写真である。

叉崖貫主 試験管培養のために用意した胚、あるいは絨毛から得た胎児細胞中の、染色体数 を決定するための染色体−特異性プローブの使用 廠凰■皿製 試験管培養のために用意した非生状（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）胚から得た細胞、 受精物からの細胞、と絨毛からの細胞を、通常のやり方で入手し、そしてスライ ドガラスの上に置いた。

１三ニズ皇廻袈 幾つかの２５−塩基数の合成オリゴヌクレオチットプローブは、表４として下に 表記した各々のＤＮＡ配列から調製される。

犬」− プローブ　染色体　遺伝子バンク　蛍光名称　検出された　位置名　標識 α−セントロメリンクリピート　Ｘ　ＨＵＭＳＡＴＡＸ　ローダミンα−セント ロメリックリピート　Ｙ　ＨＵＭＳＡＴＢ　蛍光α−セントロメリ・７クリビー ト　１８　ＨＵＭＲＥＰＡ８４　クマリンα−セントロメリックリピート　１６ 　ＨＵＭＡＳＡＴＤ　ローダミンアミロイド　２１　ＨＵＭＡＭＹＢ　ローダミ ンコラーゲン　タイプＩＶ　１３　ＨＵＭＣＯＬＩＡ　蛍光人サテライトＤ　Ｎ 　Ａ　１　、　ＨＵＭＳＡＴ３１　ローダミン人サテライトＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ　Ｈ １１ＭＳＡＴ３２　ローダミン人サテライトＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ　ＨＵＭＳＡＴ３３ 　ローダミンコラーゲン　と　°　ヒ オリゴヌクレオチットが合成され、最終段階で、アミノへキシル燐酸塩リンカ− が５′と３′末端に付けられる。

上記の染色体の各々に対する、５’、３’−アミノヘキシルオリゴデオキシヌク レオチッド　プローブは、上記の表４に示したような種々の蛍光染料と結合する 。蛍光染料はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓから得ることが出来、ＨＰＬＣ （水）で洗浄する。

ハイブリダイゼーション、°　′、 これらのステップは実施例１と同様に行われる。

標識に使う４つの蛍光色素の写真を取るため、４つの相異なる標識プローブ、適 当な励起と放射フィルターを有する４つの相異なるフィルターキューブ、が顕微 鏡で使われる。写真はフィルターキューブを変えながら連続的に取られる。

あるいはＣｈｒｏｍａ　Ｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、 ＶｅｒｍｏｎＬＨそしてＯｍｅｇａ、Ｉｎｃ、ｏｆ　Ｂｒａ−ｔｔｌｅｂｏｒｏ 、Ｖｅｒｍｏｎｔから入手できる、二重（ｄｕａｌ）と三重（ｔｒｉｐｌｅ）の フィルターセットが、２つあるいは３つの相異なるカラーの、同時撮影を可能に する（上の例４に示したように）。カラーテレビカメラもオプシヨンとして利用 できる。

実施例１の工程のように、１つの細胞から１つのプローブが検出される。実施例 ２の工程によると、２つのプローブが検出され、観察され、そして撮影される。

もし検出可能な異なる波長の蛍光を出すレポーター分子を使えば、３つあるいは それ以上が検出できる。利用可能な光フイルタ−システムにより、数多くの異な る蛍光体染料が識別できるにつれて、多くの異なるプローブが、区別出来るだろ う。

前の例で、胎児細胞が正常な男性の核型を持ち、Ｘプローブを使うとき、胎児細 胞の細胞核中に１点のオレンジ色の蛍光（１ドツト）が存在する；Ｙプローブを 使うときは１点のグリーンドツト；染色体１８に対するプローブを使うときは、 ２個のブルードツト；染色体１６に対するプローブを使うときは、２個の赤ドツ ト；染色体２１に対するプローブを使うときは、２個のオレンジドツト；染色体 １３に対するプローブを使うときは、２個のグリーンドツト；染色体１に対する プローブを使うときは、２個のオレンジドツト；である、これらが、正常な染色 体数を持つ男性胎児についての結果である。

１隻貫土 ＤＮＡプローブによる胎児細胞の検出 Ａ、母体血液中を循環する胎児性栄養芽層の選別フローサイトメリーと胎児性細 胞検出プローブを使った富化豊盗二準Ｉ 妊婦から分離した白血球を次の例のように使った。細胞をヌクレアーゼ（核酸分 解酵素）を含まないＰＢＳで洗い、細胞がはっきりと分離した状態になる濃度で 、細胞懸濁液とした。細胞を遠心分離しペレットとし、上澄み液を除いた。細胞 を再び０．５％パラフォルムアルデヒドに懸濁し、４°Ｃで１２−１６時間放置 した。固定の後、細胞を遠心にかけパラフォルムアルデヒドを除き、ついでＰＢ Ｓで一度洗い、Ｚ　Ｘ５ＳＣ中に再び懸濁した。細胞は直ぐ使用する。

プ三ニｊ食皿製 Ａ、陰性制御プローブには、窒素還元酵素（ＮＲ）の遺伝子配列からの２５−塩 基数配列が使われる（表５）、陽性制御プローブには、２８Ｓ遺伝子の２５−塩 基数配列が使われる（表５）。

遺伝子配列試験用プローブは、人染色体Ｘ、Ｙ、　１３．１６．１８と２１の領 域に相補生のある、オリゴヌクレオチットである。

プローブの選別、調製、標識化の詳細については、下の表６に示す。

Ｂ、胎児細胞同定用プローブ。

胎児細胞同定用プローブ（表６Ｂ）は、Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄ ａｔａ　Ｂａｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋ、バージョン６９．０　から入手でき、次の 遺伝子配列から調製した： （１）胎児性ヘモグロビン遺伝子、 （２）サイトケラチン遺伝子、 （３）絨毛ゴナドトロピンのβ−サブユニット、（４）　！！！毛ソマト乳腺刺 激ホルモン（人胎盤ラクトジエン（泌乳ホルモン）） （５）　α−フェト蛋白質遺伝子、と （６）妊娠−特異性グリコ蛋白質遺伝子。

前記の配列を２５塩基のオリゴヌクレオチットに切断し、ＤＮＡ合成剤で前記の ように合成し、最終段階でアミノへキシル燐酸塩リンカ−を各々のオリゴヌクレ オチットの５′末端に付加した。５′−アミノへキシルオリゴヌクレオチットを 蛍光染料ＦＩＴＣに結合し、そしてカラムクロマトグラフィーと）ＩＰＬＣで精 製する。

紅 制御用プローブ プローブ　配列 名称 ２ＢＳ　ＡＴＣＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＣＧＧＣＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ；１：ＮＲＴＡＣＧＣＴＣＧＡＴＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＴ　５ＥＱＩ ＤＮＯ：２：遺伝子試験用プローブ プローブ　染色体　ＧｅｎＢａｎｋ　蛍光名称　検出された　位置名　標識 α−セントロメリックリピート　Ｘ　ＨＵＭＳＡＴＡＸ　ローダミンα−セント ロメリックリピート　Ｙ　）ＩＵＮＳＡＴＢ　ローダミンα−セントロメリック リピート　１８　ＨＵＭＲＥＰＥＡ８４　ローダミンコラーゲンタイプＩＶ　２ ３　ＨＵＭＣＯＬＩＡ　ローダミンアミロイド　２１　ＨＵＭＡＭＹＢ　ローダ ミンアミロイド（Ｆｒａｇｉｌｅ）Ｘ　Ｘ　ａ＋ｕＬ、　蛍光ＦｒａｇｉｌｅＸ 状態、すなわち増幅は、プローブＳＥＱ　１０　：３：で検出される。そしてそ れは下の実施例１４で更に例示する。

ｌｌ旦 胎児細胞検出プローブ プローブ　ＧｅｎＢａｎｋ　蛍光 名称　位置名　標識 胎児性ヘモグロビン　ＨＵＭＧＬＢＮ　蛍光人すイチケラチン　間ＭＣＹＴＯＫ 　蛍光ＨＣＧ　間１４ｃＧ３Ｂ　蛍光 １（ＣＧ　ＨＵＭＣＧ６ＢＡ　蛍光 １１ｃＧ　ＨＵＭＣＧ７Ｂ２　蛍光 １（ＣＧ　’　ＨＵＭＣＧＢ　蛍光 大ソマト乳腺刺激ホルモン　ＨＵＭＣ５Ｉ、３　蛍光α−フェト蛋白質　１（Ｕ ＭＡＦＰ　蛍光妊娠−特異性α−グリコ蛋白質　蛍光 トランスフェリン　リセプター　〇〇ＭＴＦＲＲローダミン胎児性ヘモグロビン ε鎖　ＣＹ５ 胎児性ヘモグロブリンぐＩ　ＣＹ３ ハイプリ　゛イゼーション 胎児性細胞検出プローブを使い、ハイブリダイゼーションを行うには、３０％フ ォルムアミド、５　ｘＳＳＣ，０，１６Ｍ燐酸ソーダ緩衝液、ｐＨ７，４，ｌμ ｇ／μｌ剪断ＤＮＡ、３％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５％ＰＥＧ　 ４０００．２５　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．４　Ｍグアニジンイソチオシアネート、 １５　Ｘ　Ｆｉｃｏｌ　１／ＰＶＰ、と濃度２．５μｓ／ａ＋１で加えたプロー ブ（胎児性細胞同定プローブの混合物）から成る、ハイブリダイゼーション混合 液を細胞ペレットに加える。ハイブリダイゼーションは湿潤条件下、４２°Ｃで ３０分間行う。

抜止 ハイブリダイゼーションの後、細胞を１０ｎ＋１の洗浄液＃１を入れた１５１１ コニカルチユーブに入れる。溶液を細胞が単細胞懸濁液に成るまで攪拌し、次い で２５０　Ｘｇで５分間遠心分離する。上澄み液を除き、１０ｍ１の洗浄液＃２ をペレットに加える。第二の洗浄液を単細胞懸濁液に成るまで攪拌する。細胞を 再び２５０　Ｘｇで５分間遠心分離する。上澄み液を除き、細胞ペレットを０． ００２５％Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅを含むＰＢＳの対比染色溶液２　ｍｌ中に再懸 濁する。

フローサイトメーターの　と 細胞をＥｐｉｃｓ　Ｅｌｉｔｅ分類フローサイトメーター（ＣｏｕｌｔｅｒＩｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析する。装置は、４８８止アルゴンレーザー、ＦＬＩ のために５２５止バンドパスフイルター、対比染色用に６３５ｎｍロングパスフ ィルターを使っている。分析する各サンプルについて、陰性プローブを含有する サンプルを最初に分析する。そして上部の四分儀に０．０５％未満の細胞が落ち るように、四分割像をセットする。次に陽性プローブでハイブリダイズしたサン プルを、陰性プローブで分類したサンプルと同じパラメーターで分析する。上部 の四分儀に落ちた細胞を集め、胎児細胞の遺伝特性を決定するために、ハイブリ ダイズする。

■ この実験において、ＮＲは陰性コントロールプローブとして使われ、それに対し て、胎児性細胞同定用プローブは陽性プローブである。そして母体血液中を循環 する胎児細胞を同定する。胎児細胞を次々に上に述べたように分類し、次いでス ライドガラス上にのせる。胎児細胞を例１と２で述べたように、遺伝子試験プロ ーブを使い分析する。

Ｂ、ＩＩＩＩ　ヘモグロビンに・　るｍＲＮＡの本発明で使用するために調製し た集団プローブについて、更に説明及び例示するため、以下の詳しい説明書を表 ６Ｂのために提供する。ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：４：は）ＩＵＭＧＬＢＮ遺伝子に 対しＧｅｎＢａｎｋからの得られる、４４３−ヌクレオチット配列の３つの破片 である。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：の１から９１の塩基は、ＨＵＭＧＬＢＮの２ １７９から２２６９である。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：の９２から３１４の塩基 は、ＨＵＭＧＬＢＮの２３９３から２６１５である。３１５から４４３の塩基は ＨＵＭＧＬＢＮの３５０２から３６３０である。ＳＥ口ＩＤ　ＮＯ：４：から細 胞中に転写された標的ｍＲＮＡに相補性の、集団ＤＮＡプローブはここでの教示 に従って調製される。

さらに明確には、集団プローブ配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：を通しＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：５：　として提供されている。それらの各々は、標的ｍＲＮＡに 相補性のＤＮＡの、最高２５塩基のオリゴヌクレオチットであり、前記の遺伝子 位置から転写され、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：としてさらに明確に例示されであ る。このような各プローブをここで述べたように合成し、ＦＩＴＣで５′を標識 する。

図５は、図３の工程により調製し、前記の集団プローブにハイブリダイズした母 体末梢血液サンプル中で増殖富化した、胎児性有核赤血球を示す顕微鏡写真であ る。灰色の核と明瞭な形態を持つ細胞は、胎児性有核赤血球細胞である。核のな い細胞は、胎児性赤血球、あるいはまだ胎児性ヘモグロビンｍＲＮＡを含有する 、胎児性網状赤血球である。

０．１日　しの６　の　をＪす、のＲＮＡ５の皇煎皮■ 前に述べたように、胎児細胞が同一細胞中の２乃至それ以上の特定ＲＮＡ５を発 現するのに、一方では同じ標本ソースからの母体細胞は、同一細胞中に両方のＲ ＮＡ種を含まない。ユニークな組み合わせのＲＮＡ５が存在したときにのみ、同 一細胞に同時に多数のｍＲＮＡやｈｎＲＮＡ種が検出される。すなわち、胎児細 胞を同定する特異的シグナルが検出される。

使用に先立って、懸濁液中の細胞を冷却したＰＢＳで洗い、確実に単細胞懸濁液 にするため充分に混合する。

現在の例では、標的ＲＮＡ５の組み合わせは、人絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ） とトランスフェリンレセプター（受容体）である、これらの遺伝子のどちらかは 、あるタイプの母体細胞に発現するが、これらの遺伝子を通常に発現する細胞は 血流中に循環しない、そして母体細胞の単独タイプは遺伝子のどちらも発現しな い、しかしながら、胎児性栄養芽層は同一細胞中に、同時にこれらの遺伝子を発 現する。

表６Ｂで同定されたＨＣＧの配列に対する、−ないしそれ以上の最高２５塩基数 のオリゴヌクレオチットＤＮＡプローブを調製し、フルオレスセインで標識する ０表６Ｂで同定されたＴＲの配列に対する、−ないしそれ以上の最高２５塩基数 のオリゴヌクレオチットＤＮＡプローブを調製し、ローダミンで標識する。

母体末梢血液のサンプルを冷却したＰＢＳで洗い、顕微鏡スライド上に置かれた なすり付は標本として、確実に単細胞懸濁液にするため充分に混合する。ＨＧＣ とＴＲに対するプローブで、ハイブリダイゼーションを前述のように行う。

胎児性栄養芽層に出るシグナルは、フルオレスセインのグリーンとローダミンの 赤の付加的組み合わせであり、黄色−オレンジに見える１個の２×シグナルを出 す。

犬１斑ｌ ハイブリダイゼーションの標的としてのＤＮＡの両鎖に対するプローブとしての 合成オリゴヌクレオチットの使用ＤＮＡ標的の両鎖に対し調製したオリゴマーは 、そのＤＮＡの１本の鎖だけに対し調製したプローブが出すシグナルに比較して 、約２倍のシグナルを出す。その上、両ＤＮＡ鎖に対するハイプリント形成能力 は、個々の細胞中のＤＮＡとＲＮＡの量を同時に定量する事を可能にする。

豊凶■皿袈 Ｈ９セルライン（ＡＴＣＣＮｏ、８５４３）を以下の実験で使う。培養した細胞 を酵素を含まないＰＢＳで洗浄し、明らかに分離した細胞状になる濃度で単細胞 状懸濁液とした。細胞をベレット状になるまで遠心分離し、上澄み液をすてる。

細胞を４０％エタノール、５０％ＰＢＳ、　１０％氷酢酸に再懸濁する。

細胞は直ちに使用する。

プローブ　ＧｅｎＢａｎｋ　蛍光　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ名称　位置名　標＠　Ｐ ｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、ＣａＬ。

Ｈ［Ｖ−ｓｅｎｓｅ鎖　ＨＵＭＨＢ　１０２　ＦＩＴＣ１−３旧Ｖ−ａｎｔｉｓ ｅｎｓｅ鎖　）ＩＵＭＨＢ　１０２　ローダミン誘導体　Ｔ４８８プローブ人　 、＆、　ヒ 前に述べた旧Ｖ配列を、３０個の塩基のオリゴヌクレオチットに切断し、ＤＮＡ 合成剤（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＤＮＡ合成剤、モデル３８０Ｂ ）と推奨するＡ、Ｂ、１．試薬を使い、燐酸チオエートオリゴヌクレオチットと して合成する。多硫化オリゴヌクレオチットは次いで蛍光染料と結合し、カラム クロマトグラフィーとＨＰＬＣで精製する。窒素還元酵素遺伝子からの３０個塩 基のオリゴヌクレオチットは陰性コントロールプローブとして役立てる。

ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション工程で、３０％フォルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ，０，１ ６Ｍ燐酸ソーダ緩衝液、ｐＨ７，４，Ｉμｇ／μｌ剪断ＤＮＡ、　３　％（ｖ／ ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５％　ＰＥＧ　４００Ｑ、２５ｍＭ　ＤＴＴ 、　０．４　Ｍグアニジンイソチオシアネート、１５ＸＦｉｃ。

１１／ＰＶＰ、　と濃度２．５μｓ／ｍ　Ｉで加えたプローブから成る、ハイブ リダイゼーシジン用混合液（５０μｍ）を細胞ペレットに加える。ハイブリダイ ゼーションを４２°Ｃの加湿した雰囲気中で３０分間行う。

洗車 ハイブリッド形成後、細胞を１０■ｌの洗浄液を入れた１５−ｍ１コニカルチユ ーブに入れる。洗浄液は４２℃で、０．Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，４Ｍ　グアニジンイ ソチオシアネートと０，１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−ｉｏｏからなる（洗浄液＃ｌ）。

細胞が単細胞状濁液に成るまで攪拌し、次いで２５０　Ｘｇで５分間遠心分離す る。

上澄み液を除き、４２℃で１０■ｌの洗浄液＃２をペレットに加える。第二の洗 浄液を単細胞状懸濁液に成るまで攪拌する。

細胞を再び２５０Ｘｇで５分間遠心分離する。上澄み液を除き、細胞ペレットを ０．００２５％Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅを含むＰＢＳの対比染色溶液０．２　＋ｉ ｌ中に再懸濁する。

フローサイトメーターの　と” 細胞をＦＡＣ５ＴＡＲ装置（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｊｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。

この装置は色素ヘッドに結合した５ワツトアルゴンレーザー、ＦＬＩに対する５ ２５ｎｍバンドパスフィルター、ローダミンに対する５８４止バンドパスフイル ターを用いる。各分析サンプルにつき、陰性プローブを持つサンプルを最初に分 析する。そして細胞の０，０１％未満が、上部の右の四分儀か下の右の四分儀に 落ちるように、四分割像をセットする。次に）１１Ｖプローブで処理したサンプ ルを、陰性プローブで分析したサンプルと同じパラメーターで分析する。四分割 像を正確にセットし、２つのサンプルを全（同じに取り扱っているから、上部の 右の四分儀で記録した総ての細胞数（上で０．０１％）は、鎖とあるいはｒａＲ ＮＡ両方に対して、陽性として計数する。下の右の四分儀で記録した総ての細胞 数（上で０．０１％）は、ＤＮＡだけに対して陽性と計数する。

１施Ｍ旦 母体血液から胎児細胞の分離と、胎児性細胞特異性抗体とＤＮＡプローブの胎児 細胞の陽性同定への使用母　゛血゛から　１日　の Ｐｅｒｃｏｌｌ　５ｔｏｃｋと勾配溶液を、メーカーの推奨を支持して、９部の Ｐｅｒｃｏｌ　Ｉを１部の１．５Ｍ　ＮａＣ１に混ぜて調製した。

密度勾配Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を表８に従って調製した。

密度　Ｐｅｒｃｏｌｌ　５ｔｏｃｋ溶液　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１全容量１．０ ６５　５．１５ｍ１　４．８５ｍ１　１０ｍ１１．０７５　６．００ｍ１　４． ００ｍ１　ｌ０ｍ１１．０Ｂ５　６．８３ｍ１　３．１７■ｌ　１０ｍ１１．１ ００　８．０９ｍ１　１．９１ｍ１　１０ｍ１循環する胎児細胞を濃縮するため 、妊娠の最初の３ケ月の婦人の母体末梢血液の１Ｏｎ＋１を、５０１コニカルチ ユーブ中の、底から上部へ各々１０ｍ１の１．１００．１．０Ｂ、　１．０７５ と１．０６５ｇ／ｌの密度勾配溶液からなる、Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配上 に重ねた。勾配溶液を３６０　Ｘｇで３０分間室温で遠心分離した。この工程で 血液は数層に分割した。勾配液の上から第一番目と二番目の層は、循環する胎児 性栄養芽層の殆どを含んでいた。これらの層を集め、ＰＢＳで５０ｍ　ｌに薄め 、５００×ｇで５分間室温で遠心分離した。胎児細胞で濃縮したペレットをＰＢ Ｓで二回洗い、前記のように遠心分離し、冷却した７５％エタノールで固定し、 以下に述べるように胎児細胞の同定と遺伝子的無秩序の試験に使った。

図４に示すように、母体血液細胞は４層のＰｅｒｃｏｌ　１不連続密度勾配（チ ューブＡ、Ｂ）を使い、望むように幾つかのバンドに分割した。チューブＢの上 部からバンドｌと２を取り出し、次いでＰＢＳを加へ（チューブＣ）　、５００ 　ｘｇで５分間遠心分離した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、上のように２回遠心分 離した。ペレットを１０６細胞／ｍｌ濃度で、冷却した７５％エタノール中に再 懸濁し、その日に使用するか、あるいは２０℃で保存した。

ム旧　の　性６ Ａ、直接免疫蛍光法による同定 エタノールで固定した、胎児細胞を増殖富化した約１０’の母体血液細胞を、１ ５００ｒｐｍで５分間室温でマイクロ遠心分離した。ペレットを５％子ウつ胎児 血清（！ｌ衝液Ａ／ＦＣ５）を含む１■１の緩衝液ＡＣ８，０１ｇ　ＮａＣＬ、 　０．２０ｇ　ＫＣＩ、　１．４４ｇ　ＮａｇＨＰＯ，、１０１００Ｏ蒸留、脱 イオン水）に再懸濁し、上に述べたようにマイクロ遠心分離した。

この洗浄ステップを繰り返した。最終ペレットを１μｌの抗・入サイトケラチン １Ｂ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＣｏｍｐａｎｙカタログＮｏ 、Ｆ−４７７２；マウスホスト、ＪｇＧクラスラスクーロンＣＹ−９０）を含有 する１００μ■の緩衝液Ａ／ＦＣ５に再懸濁し、暗中で１−２時間、往復攪拌機 で静かに攪拌しながらインキュベートした。ついで反応混合液を上に述べたよう に、１ｍｌの緩衝液Ａ／ＦＣ５で３回洗浄し、ペレットをスライドガラス上で７ ００ｒｐｍで７分間細胞遠心分離した。胎児細胞を蛍光顕Ｖ＆鏡で計数した。

図６Ａと６Ｂは、上に述べたように、母体末梢血液中の抗・人サイトケラチン１ ８−ＦＩＴＣで染色した、胎児性細胞画像を示している。

Ｂ１間接免疫蛍光法による標識化 上に述べたように、直接免疫蛍光法に代わり、間接免疫蛍光法を使うことが出来 る。

細胞を最初、緩衝液ＡＦ／ＦＣ５中の抗・大サイトケラチン（ＢｅｃＬｏｎ　Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎからのＣＡＭ５．２）の１７２００の溶液中で、４０分間イン キュベートすることを除けば、工程は直接免疫蛍先注と同じであり、そして洗浄 して最初の抗体をとり除いた。細胞を次いで、ＦＩＴＣ（ヤギの抗−マウスＩｇ Ｇ＋ＩｇＧ）　；　（Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊ｃａｌｓ　Ｃａｔａｌ ｏｇ　Ｎｏ、６０１−２５）で３０分間ラベルした第二の抗体で標識した。そし て上に述べたように、洗浄して残りの抗体を取り除いた。

Ｃ０母体血液中の胎児細胞を検出し遺伝子テストするために、抗・サイトケラチ ン抗体で前もって染色した胎児細胞に対する、Ｙ染色体ＤＮＡプローブの連続的 使用廠斑災皿製 上に述べたように抗・サイトケラチンで染色した追加のスライドを、下に述べる ようにハイブリダイゼーション工程で採取した。

１旦ニブ■囲製 Ｙ染色体プローブは、人のＹ染色体領域に相補性な合成オリゴデオキシヌクレオ チットである。これらプローブの調製と標識化についての詳細は、実施例１と表 ２に示されハイブリダイゼーション工程には、２０μＩのハイブリダイゼーショ ン混合液をスライドに加えた。混合液はＰＥＧ　、　２５％フォルムアミド、５ 　Ｘ５ＳＣ，１１ｇ７１鮭の精子ＤＮＡ、１５ｘＦｉｃ−ｏｆｔ／ＰＶＰ　、０ ．４　Ｍグアニジンイソチオシアネート、５０　ｍＭ　ＤＴＴ、　５％Ｔｒｉｔ ｏｎ　Ｘ−１００，５０ｔｎＨＥＤＴＡ、　５０　ｍＭ　ＮａｚＰＯ４＋と２０ μｇ／ｓ　Ｉ濃度のＹ染色体プローブを含有する。カバーガラスを置き、スライ ドを保温具申に８５°Ｃで１５分間インキュベートした。

後止 ハイブリダイゼーション後、スライドを１００１の洗浄液＃ｌを入れたＣａｐ− １ｉｎジヤーに入れた。ジャーをカバーガラスが落ちるまで攪拌し、スライドを ２分間この溶液中に保持した。この洗浄液を除き、洗浄液＃２を加えた。この第 二の洗浄液を１分間攪拌し、注ぎ出した。そしてこの最後の洗浄を６回繰り返し た。洗浄に続いて８μｍのマウンチング液を加えた。スライドはカバーグラスを かけ、蛍光顕微鏡で観察した。

１友■検■ スライドを蛍光装置付きのオリンパスＢＨＩＯ顕微鏡を使い、４０×対物レンズ でチェックした。

図７は、母体末梢血液中のサイトケラチンで染色した胎児細胞（明るく染色した サイトプラズマ）を示す、細胞はその核のなかに一つのＹ染色体を持ち、Ｙ染色 体はローダミンで標識したＹ染色体プローブでのハイブリダイゼーション後、陽 性染色しである。

２隻班ユ 胎盤からの栄養芽層の分離と、それらの植生の染色体Ｘ。

Ｙと１８の検出 栄養芽層は胎盤組織から、Ｗａｎｇ　ｅｔ、ａｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒ ｎａＩ　ｏｆ　Ｒｅｐｒ−ｏｄｕｃＬｉｖｅ　Ｉａｖ＋ｕｎｏｌｏｇ＋’　１６ ：８−１４（１９８Ｂ）の修正法による工程で分離した。

ついで栄養芽層を７５％の冷やしたエタノールで固定し、上に述べたように抗サ イトケラチン抗体で染色した（例６）、そして同しく例６で上に述べたように、 それにつずいてＸ、Ｙと染色体１８−特異性プローブにハイブリダイズした。

染色体Ｘ、Ｙと１８のプローブの起源は実施例１に示した。

ＤＮＡプローブは実施例１に述べたように、総てローダミン誘導体で標識した。

ハイブリダイゼーション、洗浄と検出は、実施例１に述べたように行った。

図８ＡはＸ−染色体プローブでの結果を示しである；８ＢはＹ−染色体ブローブ ；そして８Ｃは染色体−１８−特異性プローブでの結果を示している。サイトプ ラズマを、ＦＩＴＣで標識した抗サイトケラチン抗体で強く染色した。８Ａと８ Ｂ中の核は強い一個の光を有し、−個のＸとＹ染色体が存在することを示してい る。８Ｃ中の核は強い二個の光を持ち、二個の染色体１８を持つことを示してい る。

尖施炎主 羊水と或いは胎盤から得た細胞中の胎児細胞−特異性ｍＲＮＡを検出するための 胎児細胞−特異性ＤＮＡプローブの使用 箱ＩびＢ」裂 羊水からの細胞を上に述べたように（実施例１）調製した。そして胎盤からの細 胞も上に述べたように（実施例７）調製した。

正常な末梢単核血液を含むスライドも、実施例２に述べたように調製した。

１ユニ１■皿翌 胎児性細胞同定プローブはＧｅｎｅｔｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａ ｎｋ。

ＧｅｎＢａｎｋ、ｖｅｒｓｉｏｎ　６９．０から入手出来、表９の以下の遺伝子 配列から調製する。

紅 プローブ　ＧｅｎＢａｎｋ　蛍光 名称　位置名　標識 人　サイトケラチン　ＨＵＭＣＹＴＯＫ　蛍光あるいはローダミンＨＣＧβ−サ ブユニット　ＨＵＭＣＧ３Ｂ　蛍光あるいはローダミンα−フェト蛋白質　）１ ．０ＭＡＦＰ　蛍光あるいはローダミン先に述べた配列を幾つかの３９−塩基− オリゴヌクレオチットに切断し、ＤＮＡ合成剤（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｉｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成剤、Ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ）と推奨されるＡ、Ｂ、１ ．試薬を使い、燐酸チオエートとして合成した。多硫化オリゴヌクレオチットを ついで、ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、　Ｃａｔａ ｌｏｇｕｅ　Ｎ。

、１−２）あるいはローダミン（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　Ｔ４ＢＢ）に結 合し、そしてカラムクロマトグラフィーとＨＰＬＣで精製した。陰性コントロル ープロープとして、実施例１０に記したＨＩＶプローブを使用した。

ハイブリ　゛イゼーション ハイブリダイゼーション工程のために、２０μｌのハイブリダイゼーション用混 合液を各々のスライドに添加した。

混合液は３１％ＰＥＧ、　２５％フォルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ，ＩＢ／＊１鮭 の精子Ｄ　ＮＡ、　１５ＸＦｉｃｏｌｌ／ＰＶＰ、　０．４　Ｍグアニジンイソ チオシアネート、５０　ｍＭ　ＤＴＴ、　５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０　ｉｉＭ　ＮａｚＰＯ４，と２０　ｔｔ　ｇ／ｍ１ｉＪ 度のプローブを含有する。

カバーガラスを各々のスライド上に置き、４２°Ｃで３０分間インキュベートし た。

洗浄 ハイブリダイゼーション後、スライドを１００　ｄの洗浄液＃ｌを入れたＣｏｐ −１ｉｎジヤーに入れた。ジャーをカバーガラスが落ちるまで撹拌し、スライド をこの溶液中に２分間保持した。この洗浄液を除去し、そして洗浄液＃２を加え た。この第二の洗浄液を１分間攪拌し、流出した。そしてこの洗浄を６回繰り返 した。洗浄に続いて、８μｌのマウンチンダ液を添加した。スライドにカバーグ ラスを掛け、蛍光顕微鏡で観察した。

１人至検斑 顕微鏡写真を蛍光装置付きのオリンパスＢＨＩＯ顕微鏡で、Ｋｏｄａｋ　Ｅｋｔ ａｃｈｒｏｍｅ　ＥＥＳ−１３５（ＰＳ　８００／１６００）フィルムを使い露 光し、１６００　ＡＳＡでブツシュ現像して逼影した。総てのとられた顕微鏡写 真間で直接比較できるように、常に２０秒の露出時間を使った。

以下の写真の各々の細胞中で、核とサイトケラチンの双方から出る明るい光（カ ラー写真ではオレンジ）は、陽性のシグナルを示している。写真中（カラー写真 では対比染色のため赤色である）の染色してない細胞は、胎児細胞同定プローブ の存在に対し陰性の母体細胞を示している。

陰性コントロールとして、旧Ｖプローブをこれらの羊膜細胞と栄養芽層にハイブ リダイズ形成した。そして明るいハイブリダイゼーションのシグナルはなかった 。

旧■プローブのみならず総ての胎児性細胞同定プローブは、正常な白血球細胞を 使う、別々のハイブリダイゼーション実験に使われる。そしてこれらの細胞は明 るいハイブリダイゼーションのシグナルは無く、それら総てが適当に陰性である ことを示している。

図９Ａは羊膜細胞（上のパネル）と栄養芽層（下のパネル）を分析するため、サ イトケラチンプローブを使ったときの結果を示す。

図９Ｂは　羊膜細胞（上のパネル）と栄養芽層（下のパネル）を分析するため、 ＨＣＧプローブを使ったときの結果を示す。

図９０は羊膜細胞（上のパネル）と栄養芽層（下のパネル）を分析するため、α −フェト蛋白質プローブを使ったときの結果を示す。

裏施■工 胎盤組織から得られた胎児性栄養７層を検出するため抗−サイトケラチン抗体と フローサイトメトリーの使用豊凶■１１ 胎盤性栄養７層を出産予定日の胎盤から分離し、実施例２で述べたように７５％ の冷却エタノールで固定した。固定した細胞は、実施例６で述べたように両方と もＦＩＴＣで標識した抗−サイトケラチンとアイソトープコントロール抗体で染 色し、フローサイトメトリーで分析した。

フローサイトメトリーの　と” 細胞はＰｒｏｆｉｌｅ　ＩＩシステム（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ）で分析した。装置は４８８止アルゴンレーザー、ＦＬＩに対する５２５ｎ層 バンドパスフィルターを使用した。試験する各々のサンプルに対し、アイソトー プコントロール抗体を含有するサンプルを最初に分析し、そして細胞の０．２％ 未満が、上部の右の四分儀に落ちるように、四分画像をセントする。

次に抗−サイトケラチン抗体で処理したサンプルを、アイソトープコントロール 抗体で処理したサンプルと同じパラメーターで分析した。四分画像を正確にセッ トし、２つのサンプルを全く同じに取り扱っているから、上部の右の四分儀で記 録した０、２％以上の細胞数は陽性として計数した。

裏１医刊 胎盤胎児性栄養７層あるいは羊膜細胞中のＨＩＶｍＲＮＡ検出用ＨＩＶＤＮＡプ ローブの使用 実施例７に述べたような修正法で、出産予定日の胎盤組織から栄養芽層を分離す る。羊膜細胞は羊水穿刺で得る。

Ｈ９ＨＩＶセルラインと末梢血液の多形核細胞は、各々陽性と陰性として作用す る。これらの細胞を、ヌクレアーゼを含まないＰＢＳで洗浄し、明らかにばらば らの細胞で存在出来る濃度で、単細胞状懸濁液にする。細胞を遠心分離してベレ ットとし、上澄みをデカントする。細胞を０．５％パラフォルムアルデヒド中に 再懸濁し、４°Ｃで１２−１６時間放置する。固定後、細胞を固定剤を除くため 遠心分離し、ついでＰＢＳで１回洗浄し、ｚｘｓｓｃ中に再懸濁する。細胞は直 ちに使用する。

１旦二１至貞製 陰性コントロールプローブ、人パピローマウィルス（ＨＰＶ）タイプ１６とタイ プ１８（表１０）の配列は、公表された配列から得た。そしてＧｅｎｅｔｉｃ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋ、ｖｅｒｓｉｏｎ　６ ９．０を通し入手できた。

１刊 プローブ　ＧｅｎＢａｎｋ　蛍光 名称　位置名　標識 ＨＰＶ　１６　ＰＰＨ１６蛍光 ＨＰＶ　１８　ＰＰＨ１Ｂ　蛍光 ＨＩＶ　ＨＵＭＢＩ＋　１０２　蛍光 ２０の分離したＨＰＶプローブ（ｔＩＰＶタイプ１６に対し１０個とＨＰＶタイ プ１Ｂニ対し１０個）と１８０個（７）　ＨＩＶプローブを、ＨＩＶ配列を数個 の３９塩基数のオリゴヌクレオチットに切断し、ＤＮＡ合成剤（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄ　ＮＡ合成剤、Ｍｏｄｅ１３８０Ｂ　）と推奨され るＡ、Ｂ、１．試薬を使い、フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチッドとし て合成する。フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチノドはついでＦＩＴＣに 結合し、カラムクロマトグラフィーとＨＰＬＣで精製する。

ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション工程のために、５０μｍのハイブリダイゼーション混合 液をペレット状細胞に添加した。混合液は３０％フォルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ ，０，１６Ｍ　燐酸ソーダ緩衝液、ｐＨ７，０，１μｇ／μｌの剪断ＤＮＡ、３ ％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｒｏｎ　Ｘ−１００，５％ＰＥＧ４０００，２５　ｍＭＤ ＴＴ、　０．４　Ｍ　グアニジンイソチｔシ７ネ−ｈ　１５ＸＦｉｃｏｌｌ／Ｐ ＶＰ、２．５μｇ＃＋Ｉｉ１度で添加したプローブを含有する。ハイブリダイゼ ーションを加湿雰囲気中で４２°Ｃで３０分間行う。

洗浄 ハイブリダイゼーション後、細胞を１０鳳ｌの洗浄液＃１（４２°Ｃに加熱）を 入れた１５１１コニカルチユーブに入れた。

細胞が単細胞状懸濁液に成るまで攪拌し、次いで２５０　Ｘｇで５分間遠心分離 した。上澄み液を除き、１０ｍ１の洗浄液＃２（４２°Ｃ）をペレットに加えた 。第二の洗浄液を単細胞状懸濁液に成るまで攪拌した。細胞を再び２５０Ｘｇで ５分間遠心分離した。上澄み液を除き、細胞ペレットを０．００２５％Ｅｖａｎ ｓ　Ｂｌｕｅを含むＰＢＳ対比染色溶液２園ｌ中に再懸濁した。

フローサイトメーターの　と” 前に述べたように、細胞はＰｒｏｆｉｌｅＩ［システムで分析した。装置は４８ ８０■アルゴンレーザー、ＦＬＩに対する５２５止バンドパスフイルターと対比 染色のために６３５ｎｍのバンドパスフィルターを使う、試験する各々のサンプ ルに対し、陰性プローブを含有するサンプルを最初に分析した。そして細胞の０ ．０１％未満が、上部の右の四分儀に落ちるように、四分画像をセントした。次 に陽性プローブで分析したサンプルを、陰性プローブで分析したサンプルと全く 同じパラメーターで分析した。四分画像を正確にセットし、２つのサンプルを全 く同じように取り扱っているから、上部の右の四分儀で記録した細胞数（０，０ １％以上）は陽性として計数した。

１旅±旦 多数のレポーターグループで標識したオリゴヌクレオチントの合成 最大の感度を得るために、本発明の好ましい具体例は、例えば蛍光部分のような 多数のレポータ一部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ　）で標識した、オリゴヌクレオチッ トプローブを使うことである。この実施例はこのようなプローブの調製法を述べ る。

２００μｇの乾燥オリゴヌクレオチットを、１００μｍの２５０１１ＩＭトリス 緩衝液ｐＨ７，４に溶かし最初の溶液を作る。１ｍｇのヨードアセトアミドーフ ルオレスセインを１００μｍの乾燥ＤＭＦに混ぜ、２００μｌの反応混合液を作 る。２つの溶液を一緒に混合し、−晩生攪拌する。これで反応混合液中のアセト アミドーフルオレスセイン対オリゴヌクレオチッドの比は１：５となる。ｌｌｌ １ｇのヨードアセトアミドーフルオレスセインを再び１００μｍのＤＭＦに混ぜ る。そしてこの１００μＩを２００μｍの反応混合液に混ぜる。もう一つの１０ ０ｕｌ　の２５０１１ＩＭトリス緩衝液を、４００μｍの反応混合液に加え、反 応をさらに６時間続ける。標識化オリゴヌクレオチットをエタノールと３Ｍ酢酸 ソーダで沈殿させる。この未精製物をついでＰＤ−１０カラムに入れ、未反応の 染料を除く、希望する分画を集める。液状部分は真空で除去する。

ついで未精製物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する。

裏施桝玖 ＤＮＡ標的の２本の鎖に対するプローブ上の例の工程を次のように修正出来る： （１）各々長さ３０の塩基数としてデザインした、４１６個の別々のプローブ（ ２０８個はタイプ１６に対して、２０８個はタイプ１８に対して）を合成した。

しかしながら、２つのＨＰＶ標的の各々の１つの鎖に対するプローブを共に含む 、それら４１６個の別々のオリゴヌクレオチットに対応するプローブを作ること に加えて、２つのＨＰＶ標的双方の第二の鎖に対する、４１６個の追加的オリゴ ヌクレオチットプローブを作る。第一の鎖に対するプローブは、ＩＩＰＶゲノム マツプ上に、いかにそれらを書くかについて、第二のプローブ鎖に関連して′° 位相を異にする”であろう。結果として、各々の第一のプローブ鎖の１／２　（ １５ヌクレオチソド）は、ある第二のプローブ鎖の１７２と相補性（ヌクレオチ ッド配列中で）である。そして、第一のプローブ鎖の他の半分（１５ヌクレオチ ツト）はもう一方の第二のプローブ鎖の部分と相補性であろう。プローブのスタ ギャリング（ｓｔａｇｇｅｒｉｎｇ）は、重なりの短さのため（１０ヌクレオチ ント）、第−鎖のプローブは第二鎖のプローブとあまりハイブリクイズしないだ るう、と言うことを意味している。それに反して、一つの鎖に対応するプローブ のみが使われる場合と比較して、約２倍のハイブリダイゼーションが検出される 。

（２）　プローブをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）　Ｄ　Ｎ 　Ａ合成剤Ｍｏｄｅ１３８０Ｂと推奨されるＡ、Ｂ、１．試薬を使い、４つの硫 黄原子を持つ最大で３０塩基の、フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチッド として合成する。硫黄原子は以下のように位置するニ一つはプローブの再末端５ ′、第二は７番と８番のヌクレオチット（５′末端から数えて）の間：第三は２ ２番と２３番のヌクレオチットの間：そして第四は２９番と３０番のヌクレオチ ットの間である。多硫化オリゴヌクレオチットの硫黄原子はついで蛍光染料ヨー ドアセトアミドーフルオレスセインと次のように（容量を調整すれば、より少な い量で合成出来る）結合する。：２００μｇの乾燥オリゴヌクレオチットを１０ ０　μｌの２５０　ｄ　ｌ−リス緩衝液ｐＨ７，４に溶かし、最初の溶液を作る 。ついでＩ　Ｂのヨードアセトアミドーフルオレスセインを１００μｍの乾燥Ｄ ＭＦ　（例えば、１００％ＤＭＦ）に混ぜ、第二の溶液となる。この２つの溶液 を一緒に混合し、−晩生攪拌する。−晩のインキュベートののち、標識化オリゴ ヌクレオチットをエタノールと３Ｍ酢酸ソーダで沈殿させる。この未精製物をつ いでＰＤ−１０カラムに入れ、未反応の染料を除く。希望する分画を集める。液 状部分は真空で除去する。ついで未精製物をＨＰＬＣ（高速重液体クロマトグラ フィー）で精製する。

（３）陰性コントロールプローブをステップ（１）と（２）と同じように作る。

（４）ハイブリダイゼーション用混合液を次のように修正した： １．５％のＰＥＧを３１％ＰＥＧの代わりに使用し、２１％フォルムアミドの代 わりに３０％フォルムアミドを使用し、１０％ＤＭＳＯ（１０％ｖ／ｖ）を含ま せ、そして５％（ｖ／ｖ）のビタミンＥを含ませる。スライドに５０μＩのハイ ブリダイゼーション混合液を加える代わりに、４０μｌの混合液を５μｍスクア レンに５μｌのピロリジノンをプラスものに加え、混合した５０μｌをスライド に加える。１００ｕｌのハイブリダイゼーション用混合液につき、５μｌのＩＭ 　（１モル’Ｊ　ＤＴＴと５μｌのプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液を加 えることは有用である。そしてハイブリダイゼーション反応を、例えば４２°Ｃ で５分間、次いで９５°Ｃで５分間、次いで４２°Ｃで２分間行う、ハイブリダ イゼーション混合溶液中に、約０．０５％あるいは０．１０％のオーリントリカ ルボン酸（ＡＴＡ）を加えることもまた有用である。

（５）スライドに８μＩの退色防止／Ｈｏｅｃｈｓｔを加える代わりに、８μｌ の以下の溶液を加える＝　９容量の溶液Ａに１容量の溶液Ｂを加えるが溶液Ａは ０．０１％１．４ジフエニルアミン（退色防止）プラス　抜染色Ｈｏｅｃｈｓｔ （＃３３２５８；　１　ｕｇ／ｌ）プラス（５０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール中） 　０．００２５％Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅ（５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中）プ ラス５０％（ｖ／ｖ）１　ｘＰＢＳ　（０，１３６Ｍ　ＮａＣｌ、０．００３　 Ｍ　ＫＣＩ、　０．００８　Ｍ　ＮａｚＨＰＯｎ。

０．００１　Ｍ　ＫＨ，ＰＯ，）であり、溶液Ｂはドデシルアルコールである混 合溶液。

実施■超 フィラデルフィヤ染色体の存在を決定するためＤＮＡプローブとｉｎ　５ｉｔｕ 　・ハイブリダイゼーションの使用豊凶■星ｌ 慢性骨髄遺伝子性白血病の患者から得た末梢血液あるいは骨髄の白血球細胞を、 細胞スピン法でスライドガラス上に宜く。

プ」七二ズ１」引１ 幾つかの２５塩基の合成オリゴヌクレオチットプローブを、下の表に載せたＤＮ Ａ配列から調製した。

人■ プローブ　染色体　ＧｅｎＢａｎｋ 名称　検出された　位置塩 ＢＣＲ２２ＨＵＭＢＣＲ プヱ：ゴイｌ【ζｌ激 オリゴデオキシヌクレオチットを実施例１に述べたように合成し、標識した。

バイブ１ダイゼーシヲン ハイブリダイゼーション工程のため、細胞をスライド上に？ｉｆ＜、３１％ＰＥ Ｇ、　３０％フォルムアミド、５　ｘＳＳＣ，０，１Ｍ燐酸ソーダ緩衝液、ｐ） Ｉ　７．４．１００μｓ／ｍ　１の低分子量の変性した鮭あるいはニシン精子Ｄ ＮＡ、１０％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１０％ＤＭＳ０．１５Ｘ Ｆｉｃｌｌ／ＰＶＰ、　０．４　Ｍグアニジンイソチオシアネート、　１０　ｍ Ｍ　ＤＴＴ、と０．０２５　Ｍ　ＥＤＴＡと２０μｇ／ｍｌ濃度で添加したプロ ーブを加えた、２０から２５μｍのハイブリダイゼーション用混合液を用いた。

カバーガラスを載せ、そしてスライドを９５°Ｃで５分間加熱し、４２°Ｃ迄冷 し、その温度で２５分間インキュベートする。

洗浄点検■ 洗浄と検出を実施例１のように行った。

慢性骨髄遺伝子性白血病は染色体９と２２の間の特徴的な染色体転座を伴い、い わゆるフィラデルフィア染色体、２２９＋となる。［参照：　Ｒｏｗｌｙ、ＪＤ ：　キナクリン蛍光法とギムサ染色法で同定した骨髄遺伝子性白血病に於ける、 新しい一貫した染色体異常性、　Ｎａｔｕｒｅ　２４３：２９０（１９７３）； 　ＨｅｉｓｔｅｒｋａｍＰＮ、ら、：　ｂｃｒ遺伝子の構造的組織化とｐｈ転座 におけるその役割。Ｎａｔｕｒｅ　３１５ニア５Ｂ　（１９８５）　］ｂｃｒ遺 伝子に対するプローブは、遺伝子の５′と３′末端の両方を含むクラスターの破 壊領域に相当するスパンをもつように調製するから、転座が起きるとき細胞内に ３つの光の点（ドツト）が存在する。１つの明るい点は影響を受けない染色体を 表し、そして２つのより弱い点は転座しない５’ｂｃｒ遺伝子を表し、一方第二 のより弱い点は染色体９に転座したｂｃｒ遺伝子の３′末端を表す。

もう一つの構成において、染色体２２に転座するｃ−ａｂｌ遺伝子からの配列は 上で述べたように入手し調製した。これらの配列を第二の蛍光部分で標識し、ハ イブリダイゼーション溶液に添加した。さて転座が起きるとき、１つの陽性シグ ナル（まだ染色体２２上に残るｂｃｒ遺伝子の５′末端を表す）は１つの色で現 れる（例えば緑）。そしてもう１つの陽性シグナル（染色体２２に転座したｃ− ａｂｌ遺伝子を表す）に隣接して第二の色（例えば赤）を現れる。

裏旌炎且 羊膜と末梢血液単核細胞中の壊れやすい（脆弱）Ｘ染色体の検出 豊凶■與製 羊水２ｍｌをＰＢＳでＩｈｌに薄め、そして１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離 する。得た細胞ペレットは８００μｍのエタノール−メタノール混合物（Ｖ／Ｖ 、３：１）に懸濁する。２００μｌのサンプルを細胞スピン法で各スライド上に 置く。それに加えて、正常な男性から得た約５　、０００の末梢血液単核細胞を 、細胞スピン法でスライドガラス上に置く。

１ユニ１■皿製 実施例１に述べたように、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３：からなる２５−塩基数の合 成オリゴヌクレオチットを合成し、そして標識する。

ハイブリダイゼーションと′°　と 実施例１と１３に述べたように、ハイブリダイゼーション、洗浄及び検出を行う 。

脆弱Ｘ症候群は、Ｘ染色体（Ｘｑ　２７．３）の特異性ＤＮＡフラグメント（長 たらしいＣＧＰの繰り返しを含む）のサイズが増加する突然変異により起こる。

参照、例えばＦｒａｎｃｏｉｓＲｏｕｓｓｅａｕ、Ｍ、Ｄ、ら、　Ｎ　Ｅｎｇｌ 　Ｊ　Ｍｅｄ、　３２５：１６７３−１６８１（１９９１）。

前に述べた工程に従うと、ＣＧＧＤＮＡフラグメントの増幅があると、シグナル 強度の上昇がある。数多くの画像解析法のどれかを使い、シグナルを定量する。

そして脆弱性Ｘ染色体、例えばＣＣＧの増幅が存在するかどうかを決めるため、 正常なコントロールと比較する。このような画像解析法は例えばＭｅｒｉｄｉａ ｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｋｅｍｏｓ、Ｍｌ；からのＡＣＡＳ　５７０． 　Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｌｅａｇｕｅ　Ｃ１ ｔｙ、　ＴＸのＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　；及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍａｇｉｎ ｇ、　５ａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ、　ＣＡ。

などを含む。

実１拠卦 直接陰性選別法を用いた母体血液中の胎児性有核赤血球細胞の濃縮 ２０１の母体末梢血液からなるサンプルを緩衝液Ａで３５１に薄め、そして５０ １１コニカルチユーブ中の１５１の）Ｉｉｓｔ。

ｐａｑｕｅ−１０８３上に重ねる。チューブは７００　Ｘｇで３０分間遠心分離 し、そして中間層を新しい５０１１コニカルチユーブに集め、ついで容量を緩衝 液Ａで４０１とする。コニカルチューブをついで１０分間１０００ｒｐ履（２０ ０ｘｇ）で遠心分離する。

細胞ペレットを１ｍｌの緩衝液Ｂに再懸濁し、前もって洗浄した、抗ＣＤ−４５ で被覆した免疫性磁気ビーズと混合する。

ビーズ／細胞混合物は１０分間反応させ、その間に不必要な白血球はビーズと反 応し、一方有核赤血球細胞（ＮＲＢＣｓ）は溶液中に残る。磁気粒子濃縮装置を 反応チューブの側面に働かせる。磁気ビーズとそこに複合する物質を、マグネッ トに隣接した反応チューブの側面に集める。　ＮＲＢＣｓを含む上澄み液をつい で除去し、細胞スピンし、８０％エタノールで５分間固定し、そしてｉｎ　５ｉ ｔｕ　・ハイブリダイゼーションに使う。

！１ＬＬｆｉ もう一つの直接陰性選別法を用いた母体血液中の胎児性有核赤血球細胞の濃縮 実施例１５の工程で行うが、以下の修正がある：抗ＣＤ−４５で被覆した免疫性 磁気ビーズを使用する代わりに、母体血液の色々の成分に対するモノクローナル 抗体で被覆した免疫性磁気ビーズを含む混合液を、被検体からの血小板ならびに 非胎児性細胞を、胎児性標的細胞を残し効率的に除去するために使う。

五体■五■ 特定の抗体あるいは抗体の混合物が、本発明に従って使用するのに通しているか 否かを決めるために、以下の工程を行ってみる： 実施例４のように、へその緒の血液のサンプルを密度分離にかける。１ｍｌの緩 衝液Ｂに軟層を再懸濁する。この細胞懸濁液５０μｍを細胞スピンにかけ、３： １エタノール／メタノールに漬けて固定してコントロール用スライドを準備する 。前述の軟層再懸濁液からｌＸｌ０’の細胞を除き、磁気ビーズに結合している 試験する抗体の２０μｇを加えて、試験用スライドを準備する。実施例６に記し たように細胞を調製する。実施例６のようにスライドの顕微鏡試験を行い各スラ イド上の全細胞に対する胎児性有核赤血球細胞の比を決める。もしも試験スライ ドの比率が、コントロールスライドに対応する比率の７５％から１２５％の間な ら、抗体は使用可能と考えられる。例えば受理可能な結果は、コントロールスラ イドは１０，０００細胞につき５ＮＲＢＣｓを持ち、そして対応する試験スライ ドは１０，０００細胞につき４ＮＲＢＣｓ持っことである。

スＩＬ巨 間接陰性選別法を用いた母体血液中の胎児性有核赤血球細胞の濃縮 ２０１の母体末梢血液のサンプルを緩衝液Ａで３６１に薄め、そして５０１１コ ニカルチユーブ中の１５ｍ１の旧５ｔｏｐａｑｕｃ−１０８３上に重ねる。チュ ーブは７００×ｇで３０分間遠心分離し、中間層（軟層）を新しいコニカルチュ ーブに集める。ついで容量を緩衝液Ａで４０１にする。チューブを１０分間２０ ０×ｇで遠心分離する。細胞ベレットをモノクローナル抗体を含有する液に再懸 濁する。モノクローナル抗体は、１−＋ａｌの容量の反応液の抗ＣＤ−４５、又 は抗ＣＤ−４５、抗ＣＤ−３４、抗ＣＤ−１２、抗ＣＤ−３１，及び抗ＣＤ−４ ４からなる群から選ばれるモノクローナル抗体の混合物である。細胞を抗体と４ °Ｃで３０分間反応させる。次いで混合物を５００「ρ―で５分間マイクロ遠心 分離し、そして上澄み液を吸い出す。細胞ペレットを１４００ｍ１の反応緩衝ｅ 、Ｃｕｉ衝液Ａ）で洗い、ペレットを１ｍｌの緩衝液Ｂに再懸濁する。次いで細 胞懸濁液をやぎの抗−マウスＩｇＧで被覆した前もって洗浄したヘント（ｂｅｎ ｄｓ）を混ぜ、そして混合液を１０分間反応させ、その間に不必要な細胞（白血 球と赤血球）の大部分はビーズと反応し、細胞／ビーズ複合体となる。複合体を ついで反応液から磁気粒子濃縮装置で取り除き、その装置は複合体を反応チュー ブの片側に集める。　ＮＲＢＣｓを含む上澄み液をスライドを作るため、直接細 胞スピンに載せる。

スライドを８０％エタノールで固定し、蛍光ｉｎ　５ｉＬｕ　・ハイブリダイゼ ーションに使う。

１隻拠則 母体血液から富化した胎児性有核赤血球細胞の検出と染色体異常の同時検出 実施例１５．１６と１７によって調製したスライドを実施例３のような胎児性ヘ モグロビン細胞ｍＲＮＡに対するプローブと、実施例４のような大染色体に対す るプローブを使い、１ステツプでスライド上でハイブリダイズする。

図１０は実施例４、Ｂ部分に述べたような胎児性ヘモグロビン細胞ｍＲＮＡに特 異性のＤＮＡプローブと、実施例４、Ａ部分で述べたような大染色体ＸとＹに対 するプローブに、同時にハイブリダイズした胎児性有核赤血球細胞を示す。緑っ ぽいサイトプラズムは、Ｉ（ｂＦｍＲＮＡに対するフルオレスセイン標識プロー ブからのシグナルに由来するが、細胞が胎児性有核赤血球細胞であることを示す 。植生の緑の点は、Ｘ染色体に対するフルオレスセイン標識プローブからのＸ染 色体に対するシグナルである。植生の赤の点は、Ｙ染色体に対するローダミン標 識プローブからのＹ染色体に対するシグナルである。

実施五■ 間接免疫蛍光技術を使った母体血液から富化した胎児性有核赤血球細胞の検出 胎児細胞検出のもう一つの工程は、以下のように修正した実施例１８の工程を行 うことである：胎児性ヘモグロビンｍＲＮＡに対するＤＮＡプローブを使う代わ りに、胎児性ヘモグロビン蛋白質（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ｃａ ｔ、ｎｏ、ＩＲＸ　Ｇ−１１１４９）に対するモノクローナル抗体を使う、富化 した細胞を２％パラフォルムアルデヒドに２時間入れ固定し、固定剤を洗って除 いてからｌ　：　１００に稀釈した抗−ＨｂＦ抗体と３０分間反応させる。加え る抗体の量は、サンプル中の胎児性赤血球細胞１００万当たり２２０Ｍｇである 。過剰の抗体は細胞をＰＢＳで２回洗浄して取り除く０次に選択的に抗−ＨｂＦ 抗体（Ｂｕｒｏ−Ｐａｔｈ、Ｌｔｄ、）に結合し、アルカリフォス７７ターゼで 標識するモノクローナル抗体のｉ：ｌｏＯに薄めた溶液で、細胞を３０分間染色 する。過剰の抗体はＰＢＳで洗浄して取り除き、そして基体としてＶｅｃｔｏｒ 　Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏ、）を細胞に加える。その後 のステ・ノブで、過剰の基体を洗浄で除く。細胞をスライドガラス上で細胞スピ ンし、実施例１８のようにｉｎ　５ｉｔｕ　・ハイブリダイゼーションに使う。

災施■毅 母体赤血球の溶解による母体血液中の胎児細胞の富化母体血液被検体を０．０７ ５Ｍ　ＫＣＩで１５分間３７°Ｃで処理する。

この処理は選択的に母体赤血球を溶かし、サンプル中に存在する総ての核細胞を 無傷で残す。ついでリゼート（ｌｙｓａｔｅ）は抗ＣＤ−４５で、あるいは更に 一般的には、母体血液細胞の表面抗原に対する、１乃至それ以上の抗体で被覆し たビーズに接触させる。混合物を反応させる０次いで連結した（Ｉｉｇａｔｅｄ ）細胞と共にビーズを磁気粒子収集器で混合物から除く。残った液体は、基本的 には胎児性有核赤血球を含み、これは前に述べたように細胞スピンスライドの製 作に使う。この工程は全く自動化装置で行われる。

本発明の好ましい具体例についての以上の記述は、図示と記述の目的でなされた ものである。これらは本発明の全てでもないし、本発明を開示の範囲に制限する という何らの開示もない。そして前記の教示を参考にして、多くの修正法と変法 が可能であることも当然である。具体例を、発明の原理と応用を最も良く説明し 、そしてそれによって技術に練達した人達（当業者）が、色々の具体例で色々に 修正して発明を最も良く利用するために、選び且つ記述した。

発明の範囲はここに添付する請求の範囲によって規定されるものと考える。

インサイチュ（ｉｎ　５ｉｔｕ）・ハイブリダイゼーションのための母体血液中 の胎児細胞の強化（富化）と同定配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人　：アスガリ９モルテッツアプラシャド、ナギンドラ キューベンジ。マイケル　リー （１、発明の名称　：インサイチュ（ＩＮ　５ＴＴＵ）・ハイブリダイゼーショ ンのための母体血 液中の胎児性細胞の富化と同定 （ｉｉｉ　）配列数　：２１ （ｉｖ）連絡先 （＾）宛先人　：ジェームス　エフ、ウエイラー弁護士 （Ｂ）　街　：ワン　リバーウェイ、シュート（Ｄ）　州　：テキサス （Ｅ）　国　：米国 ＣＦ）郵便番号　ニア７０５６ （Ｖ）コンピュータ読み出し形態 （Ａ）媒体形式　：フロノビ−ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ、ＰＣ両立 型（Ｃ）Ｏ３：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウエア：ワードパー フェクト５．１（ｖｉ）本願のデータ （Ａ）出願番号　： （Ｂ）出願日　：１９９３．７．１９ （Ｃ）特許分類　： （ｖｉ）弁護士／代理人情報 （＾）氏　名　二つェイラー、ジェームス　エフ（Ｂ）登録番号　：ｉ６，０４ ０ （Ｃ）参照／内容摘要録番号：Ｄ−５５０７ＣＩＰＣＴ （ｉｘ）　を話電信情報 （Ａ）電話　ニア１３−６２６−８６４６（Ｂ）ファックス　ニア１３−９６３ −５８５３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１の情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長　さ　：２４塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ＤＮＡＣゲノミック）（ｉｉｉ　）仮定　二Ｎ○ （１■）アンチセンス　二Ｎ０ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ＩＡＴＣＧＡＧＴＡＧＴ　ＧＧＴ ＡＴＴＴＣＡＣＣＧＧＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２の情報 （１）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｉｉ　）仮定　二Ｎ０ （１ｖ）アンチセンス　＝ＮＯ （ｖｉ）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２ＴＡＣＧＣＴＣＧＡＴ　ＣＣＡＧ ＣＴＡＴＣＡ　ＧＣＣＧＴ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３の情報 （１）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）仮定　−ＮＯ （１■）アンチセンス　：Ｎ。

（ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＧＧＣＧ　ＧＣＧＧＣ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、４の情報（１）配列 特性 （Ａ）長　さ　＝４４３塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）仮定　：Ｎ （ｘｉ）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、４ＡＴＧＧＧＴＣＡＴＴ　ＴＣＡＣＡ ＧＡＧＧＡ　ＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴ　ＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡ　・・・ＧＴＧＧＡ ＡＧＡＴＧ　ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡ　ＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡ　ＡＧＣＴＣＣＴＧ ＧＴ　・・・ＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡ　ＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣ Ｔ　ＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣ・・・ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＡ　ＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧ 　ＧＴＧＣＴＧＡＣＴＴ　ＣＣＴＴＧＧＧＡＧＡ　・・・ＡＴＣＴＣＡＡＧＧＧ 　ＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＴＧ　ＡＡＣＴＧＣＡＣＴＧ　・　・ 　・ＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴ　ＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧ　ＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ ＧＴＧＡＣＣＧＴ　・　・　・ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧ　Ｃ ＡＧＧＣＴＴＣＣＴ　ＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴ　・　・　・ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣ ＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＡ　・　・　・・　・　・　ＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧ　 ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴ　６０・　・　・　ＴＧＴＣＴＡＣＣＣＡ　ＴＧＧＡＣＣ ＣＡＧＡ　１２０・　・　・　ＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧ　１ ８０・　・　・　ＴＧＣＣＡＴＡＡＡＧ　ＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧ　２４０・　・ 　・　ＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧ　ＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣ３００・　・　・　ＴＴＴ ＧＧＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＧＧＣＡ　３６０・　・　・　ＧＧＴＧＡＣＴＧＧ Ａ　ＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧ　４２０（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、５の情報（ ｉ）配列特性 （Ａ）長　さ　＝２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （ｉｉ　）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ　）仮定　二Ｎ （ｘｉ）配列記述　：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、５ＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴ　ＣＴＧＧ ＡＧＧＡＣＡ　ＧＧＧＣＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６の情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（■）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６ＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴ ＣＡＣＣＡＴ　ＣＴＴＣＴ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、７の情報（１）配列 特性 （Ａ）長　さ　＝２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｊ）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７ＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣ ＡＣＣＴＣＡ　ＧＧＧＧＴ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８の情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ　）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧ　ＣＣＧ ＡＡＡＴＧＧＡ　ＴＴＧＣＣ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、９の情報（１）配 列特性 （Ａ）長　さ　＝２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランド不ス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９ＡＡＡＡＣＧＧＴＣＡ　ＣＣＡ ＧＣＡＣＡＴＴ　ＴＣＣＣＡ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、１０の情報（１） 配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （ｉｉ　）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ　）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１０ＧＧＡＧＣＴＴＧＡＡ　ＧＴ ＴＣＴＣＡＧＧＡ　ＴＣＣＡＣ（２）ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ、１１の情報（１）配 列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　；直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮定　二Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１１ＡＴＧＣＡＧＣＴＴＧ　ＴＣ ＡＣＡＧＴＧＣＡ　ＧＴＴＣＡ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、Ｉ２の情報（ｉ ）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｊｉ）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１２ＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧ　ＣＡ ＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＴＧＡ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、１３の情報（１） 配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （ＩＩ）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ　）仮定　二Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１３ＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧ　ＧＴ ＧＣＴＴＴＡＴＧ　ＧＣＡ丁Ｃ（２）　ＳＥＱ　Ｔ　Ｄ　Ｎｏ、１４の情報（１ ）配列特性 （Ａ）長　さ　＝２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （１１）分子形式　：ｃＤＮＡ　むｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ　）仮定　二Ｎ （ｘｉ）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１４丁ＣＣＣＡＡＧＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＧＣＡＣＣＴ　ＴＣＴＴＧ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、１５の情報（１） 配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （ｉ）配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （ｉｉ）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｊ）仮定　二Ｎ （ｘｉ）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１９ＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧ　ＧＴＴ ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡ（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、２０の情報（ｉ）配 列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位　相　：直線 （ｉｉ　）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（１ｊ）仮定　：Ｎ （ｘｉ　）配列記述　：ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ、２０ＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴ　ＴＣ ＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣ＾（２）　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、２１の情報（ｉ） 配列特性 （Ａ）長　さ　：２５塩基対 （Ｂ）　型　：核酸 （Ｃ）ストランドネス：単一 （Ｄ）位相　：直線 （ｉｉ　）分子形式　：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉ）仮定　二Ｎ （ｘｉ）配列記述　：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２１ＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴ　ＡＧＴ ＡＧＣＣＴＴＧ　ＴＣＣＴＣＦＩＧ、　ＩＡ−１ ＦＩＧ、　ＩＢ−１ ＦＩＧ、　６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、　８８ ＦＩＧ、　８Ｃ ＦＩＧ、９Ａ−Ｉ ＦＩＧ、　９Ａ−２ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　７年　１月１７ 日

Claims (68)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のステップからなる被検体中の胎児細胞を同定する方法； 胎児細胞を含む被検体を採取； 該被検体中の前記胎児細胞数を濃縮（富化）；そして前記被検体中に通常存在す る成人細胞（非胎児性細胞）には存在しないが、前記の胎児細胞中に存在するマ ーカーの検出、該方法は実質的に無傷（インタクト）の細胞膜を持つ細胞で行わ れ、かつインサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションによる標的核酸 の検出を行う。
2. ２．該被検体が、母体末梢血液、へその緒の血液、胎盤組織、絨毛及び羊水から なる群から選ばれるものである請求項１記載の方法。
3. ３．該被検体が、母体の末梢血液である請求項１記載の方法。
4. ４．同定される胎児細胞が、トロホブラスト（栄養芽層）と胎児性有核エリスロ サイト（赤血球）からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
5. ５．該マーカーが胎児細胞抗原であり、該胎児細胞を前記胎児細胞抗原に対する 抗体を使い、配位子（リーガンド）結合で検出し、該胎児細胞抗原を胎児性ヘモ グロビン、サイトケラチン、絨毛ゴナドトロピンのβ−サブユニット、絨毛性ソ マトマンモトロパピン（泌乳ホルモン）、妊娠特異性グリコ蛋白質及びα−フェ ト蛋白質からなるペプチッドグループから選び、該標的核酸をウイルスー由来Ｒ ＮＡ，ウイルスー由来ＤＮＡ、ｍＲＮＡ．ｈｎＲＮＡ及び染色体ＤＮＡからなる 群から選ぶ請求項１記載の方法。
6. ６．該胎児細胞を、サイトケラチンに対する蛍光で標識した抗体を使い検出する 請求項５記載の方法。
7. ７．該マーカーと該標的核酸が、被検体中に通常存在する成人細胞にはないが、 胎児細胞中には存在するｍＲＮＡである請求項１記載の方法。
8. ８．該ｍＲＮＡが、胎児性ヘモグロビンｍＲＮＡ、胚芽性ヘモグロビンｍＲＮＡ ，サイトケラチンｍＲＮＡ、絨毛ゴナドトロピンのβ−サブユニットｍＲＮＡ、 絨毛性ソマト泌乳ホルモンｍＲＮＡ、妊娠特異性グリコ蛋白質ｍＲＮＡ、α−フ ェト蛋白質ｍＲＮＡ及びトランスフェリンレセプタ−ｍＲＮＡからなる群から選 ばれたものである請求項７記載の方法。
9. ９．第二の標的核酸を、該ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより同時に検 出する請求項８記載の方法。
10. １０．第二の標的核酸が、ウイルスー由来ＲＮＡ，ウイルスー由来ＤＮＡ，ｍＲ ＮＡ，ｈｎＲＮＡ及び染色体ＤＮＡからなる群から選ばれたものである請求項９ 記載の方法。
11. １１．更に以下のステップを含む請求項９記載の方法；該細胞をフローサイトメ ーターに通し、そして検出される蛍光標識の量を記録。
12. １２．該被検体が母体末梢血液、へその緒の血液、胎盤組織、絨毛及び羊水から なる群から選ばれたものである請求項１１記載の方法。
13. １３．同定される胎児細胞が、栄養芽層と胎児性有核赤血球からなる群から選ば れたものである請求項１１記載の方法。
14. １４．該胎児性細胞ｍＲＮＡが、胎児性ヘモグロビンｍＲＮＡ、サイトケラチン ｍＲＮＡ、繊毛ゴナドトロピンのβ−サブユニットｍＲＮＡ、絨毛性ソマト泌乳 ホルモンｍＲＮＡ、妊娠特異性グリコ蛋白質ｍＲＮＡ及びα−フェト蛋白質ｍＲ ＮＡからなる群から選ばれたものである請求項１１記載の方法。
15. １５．ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーシヨンが水性懸濁液中で行われ、そこでの 蛍光性標識オリゴヌクレオチッドプローブは、該ハイブリダイゼーションに導入 され、そして更に該細胞をフローサイトメーターに通し、検出した蛍光標識の量 を記録するステップを含む請求項１記載の方法。
16. １６．更に他の細胞から胎児細胞を選別するステップを含む請求項１５記載の方 法。
17. １７．同定される該胎児細胞が、栄養芽層と胎児性有核赤血球からなる群から選 ばれる請求項１５記載の方法。
18. １８．該胎児細胞を、胎児細胞抗原に対する抗体を使い検出し、そこでの該抗原 が胎児性ヘモグロビン、サイトケラチン、絨毛ゴナドトロピンのβ−サブユニッ ト、胎児グロビン、絨毛性ソマト泌乳ホルモン、妊娠特異性β−グリコ蛋白質及 びα−フェト蛋白質からなる蛋白質グループから選ばれる請求項１５記載の方法 。
19. １９．前記１ｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、以下のステップを含む請求 項１記載の方法。 （ｉ）沈殿剤と架橋剤からなるグループから選ばれた少なくとも一つの試剤を含 む媒体で、胎児細胞を固定する； （ｉｉ）前記固定した被検体を変性剤、ハイブリッド安定剤、緩衝液、選択的膜 孔隙形成剤と、さらに検出される標的ヌクレオチッド配列に、少なくとも実質的 に相補性のヌクレオチッド配列を持つ、少なくとも一つの合成オリゴヌクレオチ ッドプローブを含むハイブリダイゼーション溶液に接触する。前記接触は、少な くとも一つの検出可能な標識が存在するハイブリダイゼーシヨン条件で行われる ； （ｉｉｉ）そして前記標識を使いハイブリッド形成を検出する。
20. ２０．該ハイブリダイゼーション条件は温度約１５℃から約９９℃で、約５分間 から約２４０分間である請求項１９記載の方法。
21. ２１．該媒体が更に蛍光染料の類似体（アナログ）からなる群から選ばれたもの を含む請求項１９記載の方法。
22. ２２．蛍光染料の類似体がオーリントリカルボン酸である請求項２１記載の方法 。
23. ２３．同定される該胎児細胞が、栄養芽層と胎児性赤血球からなる群から選ばれ たものである請求項１９記載の方法。
24. ２４．該核酸がウイルス、染色体、ＤＮＡあるいはｍＲＮＡからなる群から選ば れたものである請求項１９記載の方法。
25. ２５．該ウイルスが、人免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスとヘルペスウイルスか らなる群から選ばれた請求項１９記載の方法。
26. ２６．該染色体が、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体１、染色体１３、染色体１６、 染色体１８及び染色体２１からなる人の染色体群から選ばれたものである請求項 １９記載の方法。
27. ２７．該標識が、放射性標識、蛍光体、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃ ｅｒｓ）、及び酵素標識からなる群から選ばれたものである請求項１９記載の方 法。
28. ２８．該標識が、フルオレスセイン、クマリン、ローダミン、ローダミン誘導体 及びフィコエリトリンからなる群がら選ばれたものである請求項２７記載の方法 。
29. ２９．そこでの少なくとも二つの核酸が、同一サンプル中で同時に検定される請 求項１９記載の方法。
30. ３０．そこでの前記方法が約５分から約３０分以内で完了する請求項２０記載の 方法。
31. ３１．そこでの核酸が遺伝的異常性が特徴的である請求項１９記載の方法。
32. ３２．該遺伝的異常性が欠失である請求項３１記載の方法。
33. ３３．そこでの欠失が、標的配列に対するハイブリダイゼーション可能なプロー ブの結合の不存在を検出することで同定される請求項３２記載の方法。
34. ３４．そこでの遺伝的異常性が、付加あるいは増幅である請求項３１記載の方法 。
35. ３５．そこでの付加が、染色体のポリヌクレオチッドの繰り返しセグメントに対 する標識プローブの結合の検出で同定される請求項３４記載の方法。
36. ３６．そこでの遺伝的異常性が、転座あるいは再配列である請求項３１記載の方 法。
37. ３７．該転座は、以下のステップで同定される請求項３６記載の方法； 転座する染色体のポリヌクレオチッド部分のマーカー領域に対する標識プローブ の結合；そして前記標識プローブの結合の検出。
38. ３８．該転座が、以下のステップで同定される請求項３６記載の方法； 転座しない染色体のマーカー領域に対する第一の標識プローブの結合； 転座する第二の染色体の領域に対する第二の標識プローブの結合；そして前記第 一のプローブと前記第二のプローブの結合の検出。
39. ３９．以下のステップからなり、実質的に無傷の細胞膜を持つ胎児細胞中の核酸 の存在を、細胞核酸の検定で検出する方法； （ｉ）前記胎児細胞中を、変性剤、ハイブリツド安定剤、緩衝液、選択的膜孔隙 形成剤、及び検出される特異性標的ヌクレオチッド配列に、少なくとも実質的に 相補性のヌクレオチッド配列を持つ、少なくとも一つの合成オリゴヌクレオチッ ドプローブを含む媒体と接触する。この接触は少なくとも一つの検出可能な蛍光 染料標識の存在するハイブリダイゼーション条件下で行われる；（ｉｉ）そして 前記標識を使いハイブリッド形成を検出する。
40. ４０．そこでの前記ハイブリダイゼーションは、温度約１５℃から約９０℃で、 約５分間から約２４０分間である請求項３９記載の方法。
41. ４１．該媒体が更に固定剤を含む請求項３９記載の方法。
42. ４２．該媒体が、更に蛍光染料の類似体を含む請求項３９記載の方法。
43. ４３．該蛍光染料の類似体が、オーリントリカルボン酸である請求項４２記載の 方法。
44. ４４．該方法は、目視顕微鏡観察により７５塩基程の標的ヌクレオチッド配列を 検出出来る請求項３９記載の方法。
45. ４５．該核酸が、ウイルス、染色体、ＤＮＡとＲＮＡからなる群から撰ばれる請 求項３９記載の方法。
46. ４６．該ウイルスが、人免疫不全性ウイルス、肝炎ウイルスとヘルペスウイルス からなる群から選ばれたものである請求項４５記載の方法。
47. ４７．該染色体が、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体１、染色体１３、染色体１６、 染色体１８と染色体２１からなる群がら選ばれたものである請求項４５記載の方 法。
48. ４８．該標識が、放射性標識、蛍光体、化学発光体と酵素標識からなる群から選 ばれたものである請求項３９記載の方法。
49. ４９．該標識が、フルオレスセイン、クマリン、ローダミン、ローダミン誘導体 、及びフィコエリトリンからなる群がら選ばれた発光体である請求項４８記載の 方法。
50. ５０．少なくとも二つの核酸が、同一サンプル中で同時に検定される請求項３９ 記載の方法。
51. ５１．そこでの温度が、４０℃から５０℃である請求項４０記載の方法。
52. ５２．そこでの温度が、８５℃である請求項４０記載の方法。
53. ５３．そこでの方法が、約５分から約３０分以内で完了する請求項４０記載の方 法。
54. ５４．そこでの核酸は遺伝的異常性が特徴的である請求項３９記載の方法。
55. ５５．そこでの遺伝的異常性が、欠失である請求項５４記載の方法。
56. ５６．該欠失は、標的配列に対するハイブリダイゼーション可能なプローブの結 合の不存在を検出することで同定される請求項５５記載の方法。
57. ５７．該遺伝的異常性が、付加あるいは増幅である請求項５４記載の方法。
58. ５８．該付加が、染色体のポリヌクレオチッドの繰り返しセグメントに対する標 識プローブの結合の検出で同定される請求項５７記載の方法。
59. ５９．該遺伝的異常性が、転座あるいは再配列である請求項５４記載の方法。
60. ６０．転座が、以下のステップで同定される請求項５９記載の方法； 転座しない染色体のマーカー領域に対する第一の標識プローブの結合； 転座する第二の染色体領域に対する第二の標識プローブの結合； そして前記第一のプローブと前記第二のプローブの結合の検出。
61. ６１．転座が、以下のステップで同定される請求項５９記載の方法； 転位する染色体のポリヌクレオチッド部分のマーカー領域に対する標識プローブ の結合；そして該標識プローブの結合の検出。
62. ６２．次の手段を有する、被検体中の胎児細胞の同定用キット； 胎児細胞数を濃縮（富化）する手段；そして該胎児細胞の存在を検出する手段。
63. ６３．そこでの前記胎児細胞を濃縮する手段が、密度勾配遠心分離法であり、該 密度勾配遠心分離法が、コロイド状ポリビニルピロリドンで被覆したシリカ、非 イオン性多糖類とナイコデンツからなる群から選ばれる密度勾配混合液を使う請 求項６２記載のキット。
64. ６４．そこでの前記胎児細胞を検出する手段が、胎児細胞表面の抗原に対する標 識抗体の結合の検出、胎児細胞ペプチッドの染色、及び胎児性細胞ｍＲＮＡに対 して特異性の合成オリゴヌクレオチッドプローブの結合の検出からなる群から選 ばれる請求項６２記載のキット。
65. ６５．そこでの胎児細胞を検出する手段が、胎児性細胞ベプチッドの染色であり 、そして該胎児細胞ベプチッドは胎児性ヘモグロビンである請求項６３記載のキ ット。
66. ６６．該抗体か、サイトケラチン又は胎児性ヘモグロビンに対する蛍光標識抗体 である請求項６４記載のキット。
67. ６７．次の構成からなる被検体中の胎児細胞核酸の検出用キット； 変性剤、ハイブリッド安定剤、緩衝液と膜孔隙形成剤を含むハイブリダイゼーシ ョン溶液； 合成オリゴヌクレオチッドプローブの供給、該プローブは標的核酸とハイプリダ イズ可能。
68. ６８．ハイブリッドの形成を検出することができる検出可能な標識をさらに含む 、請求項６７記載のキット。