JPS62282584A - プラスミド↓ｐＳＲ９６１８ - Google Patents
プラスミド↓ｐＳＲ９６１８Info
- Publication number
- JPS62282584A JPS62282584A JP61124698A JP12469886A JPS62282584A JP S62282584 A JPS62282584 A JP S62282584A JP 61124698 A JP61124698 A JP 61124698A JP 12469886 A JP12469886 A JP 12469886A JP S62282584 A JPS62282584 A JP S62282584A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- streptomyces
- plasmid
- psr9618
- medium
- properties
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規なプラスミドに関し、更に詳しくは、放線
菌に属する微生物で複製維持されるベクタープラスミド
に関する。
菌に属する微生物で複製維持されるベクタープラスミド
に関する。
従来の技術
放線菌は抗生物質、酵素阻害剤、酵素などの生産菌とし
て産業上重要な微生物である。組換えＤＮＡ技術は大腸
菌、枯草菌、酵母などにおいて広く応用され、従来微生
物では生産されなかった植種の有用物質が、これらの微
生物において生産されるようになった。また、この技術
は生産物そのものの改良や収率向上に役立っている。
て産業上重要な微生物である。組換えＤＮＡ技術は大腸
菌、枯草菌、酵母などにおいて広く応用され、従来微生
物では生産されなかった植種の有用物質が、これらの微
生物において生産されるようになった。また、この技術
は生産物そのものの改良や収率向上に役立っている。
放線菌、とくにストレプトマイセス属は医薬。
農業、畜産用の抗生物質の生産菌の大部分を占める重要
な菌群であυ、抗生物質の改良や増収に期待がかけられ
ているが、そのための組換えＤＮＡ技術の応用は殆んど
成果が上っていないと言っても過言ではない。このスト
レプトマイセスにおける組換えＤＮＡ技術の発展の遅れ
は、適当なりローニングベクターおよび発現ベクターが
無かったのが原因である。
な菌群であυ、抗生物質の改良や増収に期待がかけられ
ているが、そのための組換えＤＮＡ技術の応用は殆んど
成果が上っていないと言っても過言ではない。このスト
レプトマイセスにおける組換えＤＮＡ技術の発展の遅れ
は、適当なりローニングベクターおよび発現ベクターが
無かったのが原因である。
よく知られているように大腸菌の一ロユ〔ジーン（Ｇｅ
ｎｅ） 、 ９．２７頁、（１９８２）］、シシ〔セル
（Ｃｅｌｌ）、２０，５４３（１９８０））、土、（・
ゾヤーナＡ／、バクチオロシー（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｌ
ｏｌｏｇｙ ） ＋ １４６ ＋８６１（１９８１））
、λＰＬ（ノー７ （Ｇｏｎｏ） ＋ １７ 。
ｎｅ） 、 ９．２７頁、（１９８２）］、シシ〔セル
（Ｃｅｌｌ）、２０，５４３（１９８０））、土、（・
ゾヤーナＡ／、バクチオロシー（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｌ
ｏｌｏｇｙ ） ＋ １４６ ＋８６１（１９８１））
、λＰＬ（ノー７ （Ｇｏｎｏ） ＋ １７ 。
４５（１９８２）］などの転写プロモーター、翻訳シス
テムはストレプトマイセスでは機能しない。そのため、
ストレプトミセスの宿主系では外来遺伝子の発現は非常
に困難であった。
テムはストレプトマイセスでは機能しない。そのため、
ストレプトミセスの宿主系では外来遺伝子の発現は非常
に困難であった。
これらの問題点を解決すべく提案された放線菌における
ベクタープラスミドとしては５ＬＰＩ、２ 。
ベクタープラスミドとしては５ＬＰＩ、２ 。
ＰＩＪＩＯＩ 、 ５ＣＰ２などを親プラスミドとし種
々の誘導体としたシラスミドが知られている（下記文献
参照）。
々の誘導体としたシラスミドが知られている（下記文献
参照）。
発明が解決しようとする問題点
上記の公知グラスミドは、宿主としてストレプトミセス
・リビダンス（５ｔｒｅ ｔｏｍｙｅｅｓ （以下「Ｓ
、」と略記する） １ｉｖｉｄａｎｓ ） ＋ストレプ
トミセス・コエリコラー（且、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）
＊ストレプトミセス・／４−ビュラス（Ｓ、 ｐａｒ
ｖｕｌｕｓ ） ＋ストレプトミセスｅグリゼウス（Ｓ
、ｇｒｉｓｓｕｓ ） ＋ストレプトミセス・７ Ａ／
フス（Ｓ、 ａｌｂｕｍ ） ｒストレプトミセス・
ビナセウス（Ｓ、 ｖｉｎａｃｅｕｓ ） ＋ストレプ
トミセス・アクリミシニ−（下、 ａｅｒｉｍｙｃｉｎ
ｉ ） 、ストレプトミセス・クラプリダラス（冬ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕａ ）などにその使用範囲が限られ
ている〔例えば、デ・ビオロジー・オブ・デ・アクチノ
ミ七イチェス（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ ｔｈｅ
Ａｅｔｔｎｏｍｙｅｅｔｓｓ ） ＋ ２２９〜２８６
頁（１９８３）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ ） ：ジャーナル・ノエネラル・マイ
クロビオロソ−（Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｌ
ｏｌｏｇｙ ） １２９＋２７０３〜２７１４頁（１９
８３）；ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ ）±、５２６−
５３１頁（１９８０）：同、對Ｓ６，５２５−５２７頁
（１９８０）；ジャーナル・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５１ ＋６６８−６７７頁
（１９８２）等〕。
・リビダンス（５ｔｒｅ ｔｏｍｙｅｅｓ （以下「Ｓ
、」と略記する） １ｉｖｉｄａｎｓ ） ＋ストレプ
トミセス・コエリコラー（且、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）
＊ストレプトミセス・／４−ビュラス（Ｓ、 ｐａｒ
ｖｕｌｕｓ ） ＋ストレプトミセスｅグリゼウス（Ｓ
、ｇｒｉｓｓｕｓ ） ＋ストレプトミセス・７ Ａ／
フス（Ｓ、 ａｌｂｕｍ ） ｒストレプトミセス・
ビナセウス（Ｓ、 ｖｉｎａｃｅｕｓ ） ＋ストレプ
トミセス・アクリミシニ−（下、 ａｅｒｉｍｙｃｉｎ
ｉ ） 、ストレプトミセス・クラプリダラス（冬ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕａ ）などにその使用範囲が限られ
ている〔例えば、デ・ビオロジー・オブ・デ・アクチノ
ミ七イチェス（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ ｔｈｅ
Ａｅｔｔｎｏｍｙｅｅｔｓｓ ） ＋ ２２９〜２８６
頁（１９８３）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ ） ：ジャーナル・ノエネラル・マイ
クロビオロソ−（Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｌ
ｏｌｏｇｙ ） １２９＋２７０３〜２７１４頁（１９
８３）；ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ ）±、５２６−
５３１頁（１９８０）：同、對Ｓ６，５２５−５２７頁
（１９８０）；ジャーナル・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５１ ＋６６８−６７７頁
（１９８２）等〕。
殊に、広くその用途が検討されている５ＣＰ２”および
５ＬＰ１．２由来のシラスミドの宿主はＳ、 ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒまたはＳ、 １ｉｖｉｄａｎａに限定され
、他の産業、医薬上重要な抗生物質生産菌では複製維持
されずベクターとしての応用範囲がせまい。ＰＩＪ １
０１由来のプラスミドの宿主範囲は比較的広いがすべて
の抗生物質生産菌を宿主とすることはできない。またコ
ピー数が４０〜３００コピ一／染色体と多く、挿入され
た外来ＤＮＡから翻訳されるたん白により、宿主自体の
代謝系が乱される可能性が高い〔モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ゾエネテックス：（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） １
８５ ＋２２３−２３８頁、（１９８２）：］。そのた
め、さらに放線菌を宿主として用いることのできるベク
ターグラスミドの開発が待たれている。
５ＬＰ１．２由来のシラスミドの宿主はＳ、 ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒまたはＳ、 １ｉｖｉｄａｎａに限定され
、他の産業、医薬上重要な抗生物質生産菌では複製維持
されずベクターとしての応用範囲がせまい。ＰＩＪ １
０１由来のプラスミドの宿主範囲は比較的広いがすべて
の抗生物質生産菌を宿主とすることはできない。またコ
ピー数が４０〜３００コピ一／染色体と多く、挿入され
た外来ＤＮＡから翻訳されるたん白により、宿主自体の
代謝系が乱される可能性が高い〔モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ゾエネテックス：（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） １
８５ ＋２２３−２３８頁、（１９８２）：］。そのた
め、さらに放線菌を宿主として用いることのできるベク
ターグラスミドの開発が待たれている。
そこで、本発明者らは抗生物質産生の土壌分離放線菌に
ついてシラスミドの検出をスクリーニングしたところ、
パロモマイシン生産能のある一菌株ストレグトミセス・
Ｐ９６１８ （以下ｒ Ｐ９６１８Ｓｐ＠ 株」と略記する）が保持しているプラスミドが染色体当
たシのコピー数が２０〜４０個であり、か”）Ｐ９６１
８株ノキュアリング株（以下ｒ Ｐ９６１８Ｃ株」と略
記する）およびストレプトミセス・リビダンスに対して
ポック形成能を付与する能力を有することを見い出し、
本発明を完成した。
ついてシラスミドの検出をスクリーニングしたところ、
パロモマイシン生産能のある一菌株ストレグトミセス・
Ｐ９６１８ （以下ｒ Ｐ９６１８Ｓｐ＠ 株」と略記する）が保持しているプラスミドが染色体当
たシのコピー数が２０〜４０個であり、か”）Ｐ９６１
８株ノキュアリング株（以下ｒ Ｐ９６１８Ｃ株」と略
記する）およびストレプトミセス・リビダンスに対して
ポック形成能を付与する能力を有することを見い出し、
本発明を完成した。
たお、キー〒１１ングｙｋ−シは二手、・クラにプロタ
ー処理によりプラスミドを脱落させた株をいい、また、
ポック形成とは、ある種のプラスミドを保持している菌
株を当該プラスミドを保持していない同じ種に属する菌
株と接触する状態で生育させた場合、該プラスミド非保
持菌の気菌糸または胞子の形成が阻害される現象をいう
。
ー処理によりプラスミドを脱落させた株をいい、また、
ポック形成とは、ある種のプラスミドを保持している菌
株を当該プラスミドを保持していない同じ種に属する菌
株と接触する状態で生育させた場合、該プラスミド非保
持菌の気菌糸または胞子の形成が阻害される現象をいう
。
問題点を解決するための手段
しかして、本発明はストレプトミセス・エスピー（且ユ
担、ゆａｓ ｇｐ、）Ｐ９６１８及びストレプトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅａ １ｌｖｉｄ
ａｎｓ ）に対してＩ、り形成能を付与する性質を有し
、分子量が１４．８ｋｂであり、かつ下記の制限酵素に
対して下記の性質を示す。すなわち （ａ） ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｅｔ ｌおよ
びＸｈｏＩによる認識部位が２ケ所であり、 （ｂ）ＫｐｎＩによる認識部位が３ケ所であり、（ｃ）
Ｈｌｎｄ ｍ、Ｓａｃ Ｉ、 Ｘｂａ ｌおよびＥ
ｃ ｏＲＩにより切断され☆い、 ことを特徴とするプラスミドｐｓＲ９６１８を提供する
ものである。
担、ゆａｓ ｇｐ、）Ｐ９６１８及びストレプトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅａ １ｌｖｉｄ
ａｎｓ ）に対してＩ、り形成能を付与する性質を有し
、分子量が１４．８ｋｂであり、かつ下記の制限酵素に
対して下記の性質を示す。すなわち （ａ） ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｅｔ ｌおよ
びＸｈｏＩによる認識部位が２ケ所であり、 （ｂ）ＫｐｎＩによる認識部位が３ケ所であり、（ｃ）
Ｈｌｎｄ ｍ、Ｓａｃ Ｉ、 Ｘｂａ ｌおよびＥ
ｃ ｏＲＩにより切断され☆い、 ことを特徴とするプラスミドｐｓＲ９６１８を提供する
ものである。
本プラスミドは選択指標としてポック形成能を用いるこ
とができ、またベクターｆ２スミドとして適当なコピー
数を有し、更に外来の遺伝子のクローニング可能部位を
数箇所有することから、放線菌を宿主とするベクターと
して有用である。
とができ、またベクターｆ２スミドとして適当なコピー
数を有し、更に外来の遺伝子のクローニング可能部位を
数箇所有することから、放線菌を宿主とするベクターと
して有用である。
本明細書においていう分子量はアがロース・ダル電気泳
動法によυ測定した分子量を意味するものである。
動法によυ測定した分子量を意味するものである。
さらに、本発明のプラスミドｐｓＲ９６１８の各種制限
酵素に対する感受性は上記（、）〜（ｄ）に示すとおり
であυ、より詳細に各制限酵素による分解断片の分子量
（ｋｂ）は次のとおりである。
酵素に対する感受性は上記（、）〜（ｄ）に示すとおり
であυ、より詳細に各制限酵素による分解断片の分子量
（ｋｂ）は次のとおりである。
（、） 且ａｍ ＨＩ： ８．０２ ； ６．７８（
ｂ） ｇｇｌ Ｕ ： ７．９ ： ６．９（ｃ）
Ｘｈｏ １ ： ８．０ ： ６．８（ｄ）
Ｂｃｌ Ｉ ：１１．４９ ： ３．３１（ｅ） Ｋ
ｐｎ Ｉ ：１１．２９ ； ２．１１ ： １．４ま
た制限酵素二重分解によって決定した本発明のグラスミ
ドの制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりである。
ｂ） ｇｇｌ Ｕ ： ７．９ ： ６．９（ｃ）
Ｘｈｏ １ ： ８．０ ： ６．８（ｄ）
Ｂｃｌ Ｉ ：１１．４９ ： ３．３１（ｅ） Ｋ
ｐｎ Ｉ ：１１．２９ ； ２．１１ ： １．４ま
た制限酵素二重分解によって決定した本発明のグラスミ
ドの制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりである。
図中の数字は分子量（単位：ｋｂ＝キロペースペア）で
ある。Ｂｇｌ ＩＩ及びＢａｍＨＩ分屏によって自己複
製領域は壊わされないので該認識部位は有効なりローニ
ングサイトとして使用できる。
ある。Ｂｇｌ ＩＩ及びＢａｍＨＩ分屏によって自己複
製領域は壊わされないので該認識部位は有効なりローニ
ングサイトとして使用できる。
以上に述べたような特性を持つ本発明のプラスミドｐｓ
Ｒ９６１８は福井県永平寺町の土壌から分離されたスト
レプトミセス属に属し、本発明者らによってストレプト
ミセス・エスピー・Ｐ９６１８と命名された菌株から分
離、精製される。
Ｒ９６１８は福井県永平寺町の土壌から分離されたスト
レプトミセス属に属し、本発明者らによってストレプト
ミセス・エスピー・Ｐ９６１８と命名された菌株から分
離、精製される。
本菌株の菌学的性状は下記の通りである。
（１）形態
分枝した気菌糸は鉤状乃至不完全らせん状を呈し、輪生
枝は認められない。成熟した胞子鎖は普通３〜１０個の
胞子の連鎖を認め胞子の表面は平滑である。
枝は認められない。成熟した胞子鎖は普通３〜１０個の
胞子の連鎖を認め胞子の表面は平滑である。
（１１）各糧培地における生育状態を次に示す。
（ｉｉｉ） 生理学的性質
（１）生育源＆：１５℃〜３７℃で生育する。
４２℃以上で生育できない。
（２）ゼラチンの液化：陽性（グルコース・Ｒプトン・
ゼラチン培地を使用し２０℃で培養）（３） スター
チの加水分解：陽性（スターチ・無機塩寒天培地） （４）ミルクの凝固：陰性、ペプトン化：陽性（５）
メラニン様色素の生成ニドリプトン・イーストブロス
、ペプトン・イースト・鉄寒天培地およびチロシン寒天
培地のいずれの培地でも陰性。
ゼラチン培地を使用し２０℃で培養）（３） スター
チの加水分解：陽性（スターチ・無機塩寒天培地） （４）ミルクの凝固：陰性、ペプトン化：陽性（５）
メラニン様色素の生成ニドリプトン・イーストブロス
、ペプトン・イースト・鉄寒天培地およびチロシン寒天
培地のいずれの培地でも陰性。
４Ｊ 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天
培地） Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−７ラクトース、
イノシトール、ラフィノース、Ｄ−マンニット：陽性 Ｌ−７；ｙビノース、シュークロースｒ Ｌ −７ムノ
ース；陰性 上記の菌株は茨城県筑波群谷田部町東１丁目１番３号の
工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６１年５月２７
日付で受託番号：微工研菌寄第８’？ｇ７号で寄託され
ている。
培地） Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−７ラクトース、
イノシトール、ラフィノース、Ｄ−マンニット：陽性 Ｌ−７；ｙビノース、シュークロースｒ Ｌ −７ムノ
ース；陰性 上記の菌株は茨城県筑波群谷田部町東１丁目１番３号の
工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６１年５月２７
日付で受託番号：微工研菌寄第８’？ｇ７号で寄託され
ている。
本菌株からの前記グラスミドの分離・精製はそれ自体公
知の方法、例えばアルカリ抽出法〔ヌクレイツクアシド
リサーチ（Ｎｕｃｌａｉｃ ａｃｉｄ Ｒｓｓ、 ）
ｅヱ、１５１３−１５２３（１９７９）参照〕によ）行
うことができる。よシ具体的には上記菌株を例えばグリ
シンを含む栄養培地で培養した後、リゾチーム処理を行
い界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ８
）を添加して溶菌させ、その溶菌液をアルカリでｐＨ１
２に調製することによって染色体ＤＮＡ ｌ特異的に変
性させる。次いで、遠心分離により該変性染色体を除去
した後、上清液をエタノール沈澱し、ＤＮＡを塩化セシ
ウム（ｃｓｃｔ ）−エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ
）平衡密度勾配遠心分離に付すことによりプラスミド
ｐｓＲ９６１８が実質的に純粋な形で分離することがで
きる。
知の方法、例えばアルカリ抽出法〔ヌクレイツクアシド
リサーチ（Ｎｕｃｌａｉｃ ａｃｉｄ Ｒｓｓ、 ）
ｅヱ、１５１３−１５２３（１９７９）参照〕によ）行
うことができる。よシ具体的には上記菌株を例えばグリ
シンを含む栄養培地で培養した後、リゾチーム処理を行
い界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ８
）を添加して溶菌させ、その溶菌液をアルカリでｐＨ１
２に調製することによって染色体ＤＮＡ ｌ特異的に変
性させる。次いで、遠心分離により該変性染色体を除去
した後、上清液をエタノール沈澱し、ＤＮＡを塩化セシ
ウム（ｃｓｃｔ ）−エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ
）平衡密度勾配遠心分離に付すことによりプラスミド
ｐｓＲ９６１８が実質的に純粋な形で分離することがで
きる。
作用・効果
本発明により提供されるプラスミドｐｓＲ９６１８は医
薬上有用なパロモマイシン生産菌を宿主とする外ストレ
ゾトマイセス・リビダンスも宿主とすることができ、さ
らに制限酵素Ｂｇ１ ［および１３プｍＨＩ切断によっ
て自己複製領域が壊されず、この部位に外来遺伝子を挿
入し発現させることのできる有効なりローニングベクタ
ーである。
薬上有用なパロモマイシン生産菌を宿主とする外ストレ
ゾトマイセス・リビダンスも宿主とすることができ、さ
らに制限酵素Ｂｇ１ ［および１３プｍＨＩ切断によっ
て自己複製領域が壊されず、この部位に外来遺伝子を挿
入し発現させることのできる有効なりローニングベクタ
ーである。
実施例Ｉ
Ｐ９６１８株のスラント培地（ＩＳＰ −２）培養の胞
子−白金耳相当量をＮＺ培地（グリセリン２慢。
子−白金耳相当量をＮＺ培地（グリセリン２慢。
ＮＺ・アミン・Ａｌ１．酵母エキス０．１％。
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、 Ｋ２ＨＰＯ４０，
０５チ、ｐＨ７，０゜２５ψ２５０ｄ−三角フラスコ）
に接種し、２８℃で４０時間振とう培養する。この培養
液０．５１ｎｌを新しいＮＺ培地（２５ｍｊ７２５０−
三角フラスコ）３本に接種し２０時間培養する。菌体を
遠心分離し、溶液ｔ（グルコース５０ ｍＭ 、エチレ
ンジアミン四酢酸１０ｍＭ、）リス−ＨＣＬパフ ７７
−２５ｍＭ＋ｐＨ８、Ｏ）で１回洗浄後、同溶液ｌにリ
ゾチームを２４佃となるように加えた液２・４ｒｎｌに
けん濁し、３７℃、１時間反応を行った。次に溶液ＩＦ
（０，２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ）を４８１ｎ！加
え氷水中に５分間つけた後、溶液ｍ（３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４，８）を３６ｍ添加し、氷水中に１時間放置
した。次に遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ 、 １０分
間）を行い、上清液６０ＷＬｌをとり溶液■を６−とエ
タノール１２０ｒｔｒｌを加え一２０℃で２０時間放置
した。これを遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ 、 １０
分間）し沈でんをＴＥＳバッファー（トリス−ＨＣ４３
０ｍＭ 、 ＥＤＴＡ ５ｍＭ 、 ＮａＣｌ２０ ｒ
ｎＭ 、 ｐＨ８，０） ３ ｍｌに溶解し、す？ヌク
レ７−セＡ （１ｍ９／ｍｌ 、８０１： 、 １５分
間処理したもの）０．３−を加え３７℃、１時間反応す
る。
０５チ、ｐＨ７，０゜２５ψ２５０ｄ−三角フラスコ）
に接種し、２８℃で４０時間振とう培養する。この培養
液０．５１ｎｌを新しいＮＺ培地（２５ｍｊ７２５０−
三角フラスコ）３本に接種し２０時間培養する。菌体を
遠心分離し、溶液ｔ（グルコース５０ ｍＭ 、エチレ
ンジアミン四酢酸１０ｍＭ、）リス−ＨＣＬパフ ７７
−２５ｍＭ＋ｐＨ８、Ｏ）で１回洗浄後、同溶液ｌにリ
ゾチームを２４佃となるように加えた液２・４ｒｎｌに
けん濁し、３７℃、１時間反応を行った。次に溶液ＩＦ
（０，２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ）を４８１ｎ！加
え氷水中に５分間つけた後、溶液ｍ（３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４，８）を３６ｍ添加し、氷水中に１時間放置
した。次に遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ 、 １０分
間）を行い、上清液６０ＷＬｌをとり溶液■を６−とエ
タノール１２０ｒｔｒｌを加え一２０℃で２０時間放置
した。これを遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ 、 １０
分間）し沈でんをＴＥＳバッファー（トリス−ＨＣ４３
０ｍＭ 、 ＥＤＴＡ ５ｍＭ 、 ＮａＣｌ２０ ｒ
ｎＭ 、 ｐＨ８，０） ３ ｍｌに溶解し、す？ヌク
レ７−セＡ （１ｍ９／ｍｌ 、８０１： 、 １５分
間処理したもの）０．３−を加え３７℃、１時間反応す
る。
これをクロロホルム−フェノール（１：１）で抽出後水
層３−をとりエーテルで３回抽出する。水層２．５ゴを
とり、溶液１１０．２５ｍｊとエタノール５Ｍを加え一
２０℃で２０時間放置後、遠心分離によυ沈でんを集め
ＴＥバッフ丁−（トリス・ＨｃＬｌ ０ｍＭ 、 ＥＤ
ＴＡ １ ｍＭ 、 ｐＨ８，０） １．２ ｒｒｔｌ
に溶解する。
層３−をとりエーテルで３回抽出する。水層２．５ゴを
とり、溶液１１０．２５ｍｊとエタノール５Ｍを加え一
２０℃で２０時間放置後、遠心分離によυ沈でんを集め
ＴＥバッフ丁−（トリス・ＨｃＬｌ ０ｍＭ 、 ＥＤ
ＴＡ １ ｍＭ 、 ｐＨ８，０） １．２ ｒｒｔｌ
に溶解する。
この溶液０．６６ ｍｌにＴＥバッファー８．７２プ、
エチジウムプロミド（４，８号ゲ）０．４７６ｄ、およ
び塩化セシウム１０．１２１１を加え攪拌溶解後、遠心
チー−ブ（クイックシールチューブ１６Ｘ７６ｍ）に入
れ、２０℃で３６，０００ ｒｐｍ （ペックマン社製
７０．１０−ター）４０時間遠心分離を行った。分離し
たプラスミドバンドを注射器でとり、１−ブタノール抽
出、透析を行うことによシ、プラスミドｐｓＲ９６１８
が実質的に純粋な形で得られた。
エチジウムプロミド（４，８号ゲ）０．４７６ｄ、およ
び塩化セシウム１０．１２１１を加え攪拌溶解後、遠心
チー−ブ（クイックシールチューブ１６Ｘ７６ｍ）に入
れ、２０℃で３６，０００ ｒｐｍ （ペックマン社製
７０．１０−ター）４０時間遠心分離を行った。分離し
たプラスミドバンドを注射器でとり、１−ブタノール抽
出、透析を行うことによシ、プラスミドｐｓＲ９６１８
が実質的に純粋な形で得られた。
実施例２
（キユアリング株ストレプトミセス・ｓｐ。
Ｐ９６１８Ｃの作成）
Ｐ９６１８株のスラントより胞子１白金耳をとり前述の
ＮＺ培地にエチジウムプロミド２μ／ｉ／７１Ｌｌ ｔ
添加した培地に接種し４０時間振とぅ培養する。この
培養液０．５ ｄをエチジウムプロミド２０μミ柁添加
したＮＺ培地に接ｆｉし、６８時間撮とぅ培養する。
ＮＺ培地にエチジウムプロミド２μ／ｉ／７１Ｌｌ ｔ
添加した培地に接種し４０時間振とぅ培養する。この
培養液０．５ ｄをエチジウムプロミド２０μミ柁添加
したＮＺ培地に接ｆｉし、６８時間撮とぅ培養する。
次にこの培養液Ｑ、 ５ ｍｌをエチノウムブロミド３
０μ９７属添加したＮＺ培地に接種し４０時間培養した
。
０μ９７属添加したＮＺ培地に接種し４０時間培養した
。
生育した菌体を遠心分離によって集め、蒸留水で１回洗
浄した後、ホモデナイザ−（日本精器製作所）にて冷却
下２分間、菌糸を切断した後、２紙（東洋科学産業（株
）製ｍｌ）にてｒ過し、ｒ液を段階的に希釈して０．１
−をｌ５Ｐ−２寒天培地（ペトリ皿中）上に拡げた。こ
れを２８℃で５日間培養すると培地上に生育した胞子を
担う気菌糸から成る菌叢の表面に直径０．５〜１．５瓢
のポックが観察される。このポックの外周辺部の菌叢よ
り胞子をとりスラント培地に移す。スラントに充分生育
後ＮＺ培地に接種し、４０時間振とり培養後菌体より前
述のアルカリ抽出法にてグラスミド抽出操作を行いアガ
ロース電気泳動でプラスミド検出を試みたが、プラスミ
ドは検出されなかったので、この菌株をプラスミド脱落
株（キユアリング株）としてＰ９６１８Ｃと命名した。
浄した後、ホモデナイザ−（日本精器製作所）にて冷却
下２分間、菌糸を切断した後、２紙（東洋科学産業（株
）製ｍｌ）にてｒ過し、ｒ液を段階的に希釈して０．１
−をｌ５Ｐ−２寒天培地（ペトリ皿中）上に拡げた。こ
れを２８℃で５日間培養すると培地上に生育した胞子を
担う気菌糸から成る菌叢の表面に直径０．５〜１．５瓢
のポックが観察される。このポックの外周辺部の菌叢よ
り胞子をとりスラント培地に移す。スラントに充分生育
後ＮＺ培地に接種し、４０時間振とり培養後菌体より前
述のアルカリ抽出法にてグラスミド抽出操作を行いアガ
ロース電気泳動でプラスミド検出を試みたが、プラスミ
ドは検出されなかったので、この菌株をプラスミド脱落
株（キユアリング株）としてＰ９６１８Ｃと命名した。
（ｐｓＲ９６１８のＰ９６１８Ｃへの導入）Ｐ９６１８
Ｃ株のスラント培養よシ胞子−白金耳をとシ前述のＮＺ
培地に接種し２８℃で２日間振とり培養する。菌体を遠
心分離によって集め、０．３Ｍシュークロース水溶液で
洗浄し遠心分離する。この菌体をｌ ｒｒｕｐ７ｆｎｌ
のリゾチームを含むＰ培地（シュークロース１０．３％
、 Ｋ２ＳＯ４０，０２５チ、 ＭｇＣｊ２・６Ｈ２０
０，２０３％ 、 ＣａＣｔ２’２Ｈ２００，３７％、
）Ｇ（２ＰＯ４０，００５％、 ０．０２５ ＭＴＥ
Ｓバッファー、微量元素溶液０．２％ｖｏＶｖｏＬ ＊
（Ｏｋａｎｉｍｈｉ ｅｔ ａｌ ： Ｊ。
Ｃ株のスラント培養よシ胞子−白金耳をとシ前述のＮＺ
培地に接種し２８℃で２日間振とり培養する。菌体を遠
心分離によって集め、０．３Ｍシュークロース水溶液で
洗浄し遠心分離する。この菌体をｌ ｒｒｕｐ７ｆｎｌ
のリゾチームを含むＰ培地（シュークロース１０．３％
、 Ｋ２ＳＯ４０，０２５チ、 ＭｇＣｊ２・６Ｈ２０
０，２０３％ 、 ＣａＣｔ２’２Ｈ２００，３７％、
）Ｇ（２ＰＯ４０，００５％、 ０．０２５ ＭＴＥ
Ｓバッファー、微量元素溶液０．２％ｖｏＶｖｏＬ ＊
（Ｏｋａｎｉｍｈｉ ｅｔ ａｌ ： Ｊ。
Ｇ＠ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、、 ８０ 、３８９−４
００．１９７４） ）に懸濁し、３０℃で１時間ゆるや
かに振とうし、プロトプラストを形成させた。１０００
ｘ、ｙで遠心分離後５ｄのＰ培地で２回洗浄した。この
プロトプラストを血球計算盤で計数すると約１０２況の
プロトゲラスト懸濁液が得られた。このプロトプラスト
懸濁液を遠心分離し、上清をすてた後２００μｌのＰ培
地に再懸濁し、これより１００ ｐｌをとり、予め、実
施例１で得られたプラスミドＤＮＡ ２０μｌ（１μｇ
）と３０チシユークロース２０μノを入れた小遠心管に
加えた。これに４０ ＄ Ｊ ＩＪエチレングリコール
１，０００を１５０μ！加え、静かに攪拌し１分間室温
に放置後直ちにＰ培地５プを加え１．０ＯＯＸ、９で１
５分間遠心分離し、プロトプラストを集めた。プロトプ
ラストを０．４ ｍｌのＰ培地に懸濁し、各０．１ ｍ
ｌを再生培地Ｒ２ＹＥ培地（シュークロース１２％、
Ｋ２Ｓ０．０．０２５％、 ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０１、
Ｏチ、酵母エキス０．４チ、Ｌ−ゾロリン０．３％。
００．１９７４） ）に懸濁し、３０℃で１時間ゆるや
かに振とうし、プロトプラストを形成させた。１０００
ｘ、ｙで遠心分離後５ｄのＰ培地で２回洗浄した。この
プロトプラストを血球計算盤で計数すると約１０２況の
プロトゲラスト懸濁液が得られた。このプロトプラスト
懸濁液を遠心分離し、上清をすてた後２００μｌのＰ培
地に再懸濁し、これより１００ ｐｌをとり、予め、実
施例１で得られたプラスミドＤＮＡ ２０μｌ（１μｇ
）と３０チシユークロース２０μノを入れた小遠心管に
加えた。これに４０ ＄ Ｊ ＩＪエチレングリコール
１，０００を１５０μ！加え、静かに攪拌し１分間室温
に放置後直ちにＰ培地５プを加え１．０ＯＯＸ、９で１
５分間遠心分離し、プロトプラストを集めた。プロトプ
ラストを０．４ ｍｌのＰ培地に懸濁し、各０．１ ｍ
ｌを再生培地Ｒ２ＹＥ培地（シュークロース１２％、
Ｋ２Ｓ０．０．０２５％、 ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０１、
Ｏチ、酵母エキス０．４チ、Ｌ−ゾロリン０．３％。
カザミノ酸０．０１％、グルコース１．０チ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，００２５％、 ＣａＣＡ２’２Ｈ２００，３７
％、０．０２５ＭＴＥＳバッファー１．５％寒天および
微量元素溶液（０ｋａｎｉｓｈｉ ａｔ ａｌ、 ：
Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８０ ｒ３８９（
１９７４）０．２チｖｏｌ／ｖｏｌ ）上に拡げ２８℃
で培養した。７日後再生培地上に生じたコロニーの胞子
を白金耳で静かにかきとり５ｄの無菌水に懸濁し、段階
的に希釈した。これを別に用意したＰ９６１８Ｃａｌ：
ノＲ子ｇｍＷＫ混合Ｌ、ｒｓｐ−２培ｉ上に拡げる。２
８℃で４〜５日間培養すると寒天表面上に生育した菌叢
中にポックが観察されるようになる。このポックの中心
より胞子をとシＮｚ培地で培養後前述の方法によりプラ
スミド抽出を行い、アガロース電気泳動を行うとｐｓＲ
９６１８と同じ移動度のプラスミドが認められた。この
プラスミと同定された。形質転換頻度は５ Ｘ １０
／μ／ｉ ＤＮＡでちった。
Ｏ４０，００２５％、 ＣａＣＡ２’２Ｈ２００，３７
％、０．０２５ＭＴＥＳバッファー１．５％寒天および
微量元素溶液（０ｋａｎｉｓｈｉ ａｔ ａｌ、 ：
Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８０ ｒ３８９（
１９７４）０．２チｖｏｌ／ｖｏｌ ）上に拡げ２８℃
で培養した。７日後再生培地上に生じたコロニーの胞子
を白金耳で静かにかきとり５ｄの無菌水に懸濁し、段階
的に希釈した。これを別に用意したＰ９６１８Ｃａｌ：
ノＲ子ｇｍＷＫ混合Ｌ、ｒｓｐ−２培ｉ上に拡げる。２
８℃で４〜５日間培養すると寒天表面上に生育した菌叢
中にポックが観察されるようになる。このポックの中心
より胞子をとシＮｚ培地で培養後前述の方法によりプラ
スミド抽出を行い、アガロース電気泳動を行うとｐｓＲ
９６１８と同じ移動度のプラスミドが認められた。この
プラスミと同定された。形質転換頻度は５ Ｘ １０
／μ／ｉ ＤＮＡでちった。
参考例Ｉ
Ｓ、 １ｌｖｉｄａｎｓ １３２６株のスラント培養胞
子をＹＥＭＥ培地（Ｍ、 Ｊ、 Ｂｌｂｂ ｅｔ ａｌ
、 ：Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｓｎ、 Ｇｅｎｅｔ。
子をＹＥＭＥ培地（Ｍ、 Ｊ、 Ｂｌｂｂ ｅｔ ａｌ
、 ：Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｓｎ、 Ｇｅｎｅｔ。
１５４．１５５（１９７７））２５ｍ中で２８℃にて４
０時間培養した。菌体を０．３Ｍシー−クロースで２回
洗浄後１０祠の１ψｌ リゾチームを含むＰ培地に懸濁
し３２℃で１時間、時々ゆるやかに攪拌してゾロドプラ
ストを形成させた。これを滅菌脱指綿をつめたガラスロ
ートでデ過し、１５００ｘｇで遠心分離後、１０プのＰ
培地で２回洗浄し１ψｌのＰ培地に懸濁した。血球計算
盤で計数すると約１０’／ｆｎｌのプロトプラストが得
られた。このプロトプラスト１００μｌをとり、２０μ
ｌのｐＳＲ９６１８ＤＮＡ液（１μｇ）と２０μ２の３
０％シュークロース液を加え、つぎに１５０μｌの４０
％ポリエチレンで１分間放置後Ｐ培地５１Ｒ１を添加し
た。遠心分離後０．５−のＰ培地に懸濁し、各０．１−
を再生培地ＲＺＹＥ上に拡げた。２８℃で７日間培養す
ると再生培地上の菌叢の中にポ、りが観察され、すべて
のポ、り中心部からのコロニーはｐｓＲ９６１８を保持
していた。形質転換頻度は２ Ｘ １０５／μ７７ Ｄ
ＮＡであった。
０時間培養した。菌体を０．３Ｍシー−クロースで２回
洗浄後１０祠の１ψｌ リゾチームを含むＰ培地に懸濁
し３２℃で１時間、時々ゆるやかに攪拌してゾロドプラ
ストを形成させた。これを滅菌脱指綿をつめたガラスロ
ートでデ過し、１５００ｘｇで遠心分離後、１０プのＰ
培地で２回洗浄し１ψｌのＰ培地に懸濁した。血球計算
盤で計数すると約１０’／ｆｎｌのプロトプラストが得
られた。このプロトプラスト１００μｌをとり、２０μ
ｌのｐＳＲ９６１８ＤＮＡ液（１μｇ）と２０μ２の３
０％シュークロース液を加え、つぎに１５０μｌの４０
％ポリエチレンで１分間放置後Ｐ培地５１Ｒ１を添加し
た。遠心分離後０．５−のＰ培地に懸濁し、各０．１−
を再生培地ＲＺＹＥ上に拡げた。２８℃で７日間培養す
ると再生培地上の菌叢の中にポ、りが観察され、すべて
のポ、り中心部からのコロニーはｐｓＲ９６１８を保持
していた。形質転換頻度は２ Ｘ １０５／μ７７ Ｄ
ＮＡであった。
参考例２
ｐｓＲ９６１８のＳ、 １ｌｖｉｄａｎｓ １３２６株
におけるコピー！ キーザーらの方法（Ｋｉｅｓｅｒ 、 Ｔ、 ａｔ ａ
ｌ、 ＊ Ｍｏｌ。
におけるコピー！ キーザーらの方法（Ｋｉｅｓｅｒ 、 Ｔ、 ａｔ ａ
ｌ、 ＊ Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ−ｅ−１８５＋ ２２３−２３８
．１９８２ ）を一部改変してコピー数を決定した。す
なわち、ｐＳＲ９６１８を保持するＳ、 １ｉｖｉｄａ
ｎｓ １３２６株を参考例１と同様にプロトゲラスト化
し、１倍容のデルコシル及び２５ ｍＭ ＥＤＴＡ液を
加え完全に溶菌させた後、７０℃に１０分間保温し膜結
合型ＤＮＡを細胞残渣から遊離させた。冷却後、１倍容
のフェノール：クロロホル゛ム（１：１）液を加え激し
く攪拌し、遠心分離によって水層と有機層とに分けた。
．１９８２ ）を一部改変してコピー数を決定した。す
なわち、ｐＳＲ９６１８を保持するＳ、 １ｉｖｉｄａ
ｎｓ １３２６株を参考例１と同様にプロトゲラスト化
し、１倍容のデルコシル及び２５ ｍＭ ＥＤＴＡ液を
加え完全に溶菌させた後、７０℃に１０分間保温し膜結
合型ＤＮＡを細胞残渣から遊離させた。冷却後、１倍容
のフェノール：クロロホル゛ム（１：１）液を加え激し
く攪拌し、遠心分離によって水層と有機層とに分けた。
この操作によシ蛋白質が除かれる。水層をエタノール沈
澱後、適当に希釈し、種々の希釈サンプルについてアガ
ロース電気泳動を行った。泳動後、ダルをエチジウムブ
ロマイド（ＥｔＢｒ ）溶液（１μミ値）で染色し３１
０ ｎｍの紫外線によりｃ ｃ ｅ−ＤＮＡに切れ目を
入れ、さらにＥｔＢｒ溶液で１時間染色を行った。
澱後、適当に希釈し、種々の希釈サンプルについてアガ
ロース電気泳動を行った。泳動後、ダルをエチジウムブ
ロマイド（ＥｔＢｒ ）溶液（１μミ値）で染色し３１
０ ｎｍの紫外線によりｃ ｃ ｅ−ＤＮＡに切れ目を
入れ、さらにＥｔＢｒ溶液で１時間染色を行った。
このダルをポラロイドフィルムｔｙｐｅ ６６５を用い
て撮影し、そのネガフィルムを島津クロマトスキャナー
Ｃ８・９３０を用いてバンドの濃度を定量的に測定した
。Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓの染色体の大きさを１０’ｋ
ｂとして染色体とシラスミドのフィルム上の濃さよ）、
ｐｓＲ９６１Ｂのコピー数は約２０コピー／染色体と算
出された。
て撮影し、そのネガフィルムを島津クロマトスキャナー
Ｃ８・９３０を用いてバンドの濃度を定量的に測定した
。Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓの染色体の大きさを１０’ｋ
ｂとして染色体とシラスミドのフィルム上の濃さよ）、
ｐｓＲ９６１Ｂのコピー数は約２０コピー／染色体と算
出された。
参考例３
ｐｓＲ９６１８のＳ、 １ｉｖｉｄａｎｓ １３２６で
の安定性ｐｓＲ９６１８で旦、 １ｉｖｉｄａｎａ １
３２６を形質転換した後再生培地上で出現したポックを
別のｌ５Ｐ−２培地に移し胞子を形成させた。ここから
胞子懸濁液を調製し、適当に希釈後ｌ５Ｐ−２培地上に
拡げコロニーを形成させた。ｐｓＲ９６１８を保持しな
いＳ、 １ｉｖｉｄａｎ♂１３２６の胞、子をプレート
−面に生育するようにまいた寒天培地（ｌ５Ｐ−２）上
に先のコロニーをレプリカし、ポック形成能をしらべた
。この結果１ライフサイクル当りポック形成能を示さな
くなった胞子は０．４％以下であった。これはｐｓＲ９
６１８の脱落頻度と考えられその頻度は低く、ｐｓＲ９
６１８はＳ、 １１ｖｉｄａｎｓ １３２６株中で安定
であった。
の安定性ｐｓＲ９６１８で旦、 １ｉｖｉｄａｎａ １
３２６を形質転換した後再生培地上で出現したポックを
別のｌ５Ｐ−２培地に移し胞子を形成させた。ここから
胞子懸濁液を調製し、適当に希釈後ｌ５Ｐ−２培地上に
拡げコロニーを形成させた。ｐｓＲ９６１８を保持しな
いＳ、 １ｉｖｉｄａｎ♂１３２６の胞、子をプレート
−面に生育するようにまいた寒天培地（ｌ５Ｐ−２）上
に先のコロニーをレプリカし、ポック形成能をしらべた
。この結果１ライフサイクル当りポック形成能を示さな
くなった胞子は０．４％以下であった。これはｐｓＲ９
６１８の脱落頻度と考えられその頻度は低く、ｐｓＲ９
６１８はＳ、 １１ｖｉｄａｎｓ １３２６株中で安定
であった。
参考例４
ｐｓＲ９６１８の宿主域
先に述べたポック形成能によシ宿主域をしらべたところ
、下記の如く、広範囲のス）Ｌ／グトミセス属に形質転
換されることが分かった。すなわち３、 ｄｅｌｆａｅ
＋ Ｓ、 虹かＪｌｕＩＳ、 ｃｉｒｒａｔｕｓ ＋
Ｓ。
、下記の如く、広範囲のス）Ｌ／グトミセス属に形質転
換されることが分かった。すなわち３、 ｄｅｌｆａｅ
＋ Ｓ、 虹かＪｌｕＩＳ、 ｃｉｒｒａｔｕｓ ＋
Ｓ。
μｓｐ、 Ａ２７１ ＡＴＣＣ３１３５８、旦、すＰ−
８６４８ＡＴＣＣ３１２８９＋ Ｓ、 ｈａｌｓｔｅｄ
ｉｉ ＋ Ｓ、 ｃｏａｌｌａｏｌｏｒを宿主として複
製・増殖できた。
８６４８ＡＴＣＣ３１２８９＋ Ｓ、 ｈａｌｓｔｅｄ
ｉｉ ＋ Ｓ、 ｃｏａｌｌａｏｌｏｒを宿主として複
製・増殖できた。
添付の第１図は本発明のシラスミドｐｓＲ９６１８の制
限酵素地図である。
限酵素地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ストレプトミセス・エスピー（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ￥ｓｐ．）Ｐ９６１８及びストレプトミセス・リビ
ダンス（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ ￥ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ￥）に対してポック形成能を付与する性質を有し
、分子量が１４．８ｋｂであり、かつ下記の制限酵素に
対して下記の性質を示す、すなわち （ａ）ＢａｍＨ I 、ＢｇｌII、ＢｃｌIIおよびＸｈｏ
I による認識部位が２ケ所であり、 （ｂ）Ｋｐｎ I による認識部位が３ケ所であり、（ｃ
）ＨｉｎｄIII、Ｓａｃ I 、Ｘｂａ I およびＥｃｏＲ
I により切断されない、 ことを特徴とするプラスミドｐＳＲ９６１８。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61124698A JPS62282584A (ja) | 1986-05-31 | 1986-05-31 | プラスミド↓ｐＳＲ９６１８ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61124698A JPS62282584A (ja) | 1986-05-31 | 1986-05-31 | プラスミド↓ｐＳＲ９６１８ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62282584A true JPS62282584A (ja) | 1987-12-08 |
Family
ID=14891880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61124698A Pending JPS62282584A (ja) | 1986-05-31 | 1986-05-31 | プラスミド↓ｐＳＲ９６１８ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62282584A (ja) |
-
1986
- 1986-05-31 JP JP61124698A patent/JPS62282584A/ja active Pending
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