JPH04365477A - Ｄｎａクローニングベクターｔｇ１ - Google Patents
Ｄｎａクローニングベクターｔｇ１Info
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- JPH04365477A JPH04365477A JP3272989A JP27298991A JPH04365477A JP H04365477 A JPH04365477 A JP H04365477A JP 3272989 A JP3272989 A JP 3272989A JP 27298991 A JP27298991 A JP 27298991A JP H04365477 A JPH04365477 A JP H04365477A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C12N2730/00011—Details
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- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は細胞系内へのＤＮＡの組み込みを
行なうために、アクチノファージＴＧ１関連ベクター（
ｖｅｃｔｏｒｓ）に付加ＤＮＡを組み込む方法に関する
。より詳細には、本発明はファージＴＧ１宿主菌種スト
レプトマイセス カトレヤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｃａｔｔｌｅｙａ）ＮＲＲＬ８０５７、ストレプト
マイセス アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｖｅｒｍｉｔｉｌｌｉｓ）ＭＡ４９９０、ストレプ
トマイセス ビリドクロモゲネス（Ｓ． ｖｉｒｉｄｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＮＲＲＬ３４１４、ストレプ
トマイセス ガリファルス（Ｓ． ｇａｒｙｐｈａｌｕ
ｓ）ＮＲＲＬ２４４８などを含め細菌などの生物体内へ
のクローニングベクターとして有用な新規なバクテリオ
ファージＴＧ１ゲノムおよびその誘導体（欠失および挿
入変異型）ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込み方法に関す
る。本発明によって得られた細胞は新規であり、その細
胞の複製及び／又はＤＮＡまたはファージとしてのその
ベクター誘発および複製を通じて、あるいはその外来核
酸の存在によってその細胞に価値ある特性を付与するこ
とを通じてこの外来核酸及び／又はその産物の製造手段
として有用性を持つものである。
行なうために、アクチノファージＴＧ１関連ベクター（
ｖｅｃｔｏｒｓ）に付加ＤＮＡを組み込む方法に関する
。より詳細には、本発明はファージＴＧ１宿主菌種スト
レプトマイセス カトレヤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｃａｔｔｌｅｙａ）ＮＲＲＬ８０５７、ストレプト
マイセス アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｖｅｒｍｉｔｉｌｌｉｓ）ＭＡ４９９０、ストレプ
トマイセス ビリドクロモゲネス（Ｓ． ｖｉｒｉｄｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＮＲＲＬ３４１４、ストレプ
トマイセス ガリファルス（Ｓ． ｇａｒｙｐｈａｌｕ
ｓ）ＮＲＲＬ２４４８などを含め細菌などの生物体内へ
のクローニングベクターとして有用な新規なバクテリオ
ファージＴＧ１ゲノムおよびその誘導体（欠失および挿
入変異型）ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込み方法に関す
る。本発明によって得られた細胞は新規であり、その細
胞の複製及び／又はＤＮＡまたはファージとしてのその
ベクター誘発および複製を通じて、あるいはその外来核
酸の存在によってその細胞に価値ある特性を付与するこ
とを通じてこの外来核酸及び／又はその産物の製造手段
として有用性を持つものである。
【０００２】ＤＮＡのクローニングのためのバクテリオ
ファージの利用は、すでに確立された技法に属する。し
かしながら この技術のアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ）のファージへの応用は最近のことである
。この点に関しては、下記の論文および特許文献が参照
される。 １）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＤＮＡ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ”
， Ｊ．Ｅ．Ｓｕａｒｅｚ と Ｋ．Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ
；６ Ｃｉｅｎｃ． Ｂｉｏｌ． 第９９〜１１０頁（
１９８１年）。 ２）“Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ＰｈａｇｅφＣ３１ ａ
ｎｄ Ｉｔｓ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”， Ｋ．Ｆ．
Ｃｈａｔｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｂｒｕｔｏｎ および
Ｊ． Ｅ．Ｓｕａｒｅｚ；１４ Ｇｅｎｅ， 第１
８３〜１９４頁（１９８１年）。 ３）“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ： Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｆ
ｒｏｍ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ −Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｃ．Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．
Ｍ．Ｗａｒｄ およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ；２８６
Ｎａｔｕｒｅ， 第５２５〜５２７頁（１９８０年）
。 ４）“Ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｎｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ
ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ φＣ３１”
， Ｋ． Ｆ． Ｃｈａｔｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｂｒｕ
ｔｏｎ， Ｗ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ および Ｊ． Ｅ．
Ｓｕａｖｅｚ；１５ Ｇｅｎｅ， 第２４９〜２５６
頁 （１９８１年）。 ５）“Ａ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆ
ｏｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ｉｎ ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＰｒｏｄｕｃｉ
ｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｍ． Ｂｉｂｂ
， Ｊ． Ｌ． Ｓｃｈｏｔｔｅｌ および Ｓ．Ｎ．
Ｃｏｈｅｎ；２８４ Ｎａｔｕｒｅ，第５２６〜５３１
頁（１９８０年）。 ６）“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ；Ａ Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｌ
ｉｃｏｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ＰＢＲ ３２２ Ｉ
ｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ Ｐｈａｇｅ”， Ｊ． Ｅ． Ｓｕａｒｅｚ と
Ｋ． Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ；２８６ Ｎａｔｕｒｅ，
第５２７〜５２９頁（１９８０年）。 ７）“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．”， Ｊ． Ｌ． Ｓｃｈｏ
ｔｔｅｌ， Ｍ．Ｂｉｂｂ および Ｓ． Ｎ． Ｃｏ
ｈｅｎ；１４６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ， 第３６０〜３６８頁（１９８１年）。 ８）“ＡｃｔｉｎｏＰｈａｇｅ ＤＮＡ”，Ｋ．Ｆ．Ｃ
ｈａｔｅｒ；２１ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
第６章、第６５〜７４頁（１９８０年）。 ９）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０２３６１２Ａ号；Ｎｏ．
７９１９１５８；１９８０年１月３日発行。 １０）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０３１４３４Ａ号；Ｎｏ
．７９２８１５６；１９８０年４月２３日発行。 １１）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０１８７７８Ａ号；Ｎｏ
．７９１３０３３；１９７９年１０月２４日発行。 １２）欧州特許願第００３６２５９Ａ２号；Ｎｏ．８１
３００８５８．８；１９８１年９月２３日発行。 １３）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０４６２７２Ａ号；Ｎｏ
．８０１１０００；１９８０年１１月１２日発行。 １４）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０６９５０３Ａ号；Ｎｏ
．８１０４４７３；１９８１年８月２６日発行。 １５）欧州特許願第００２０１４７Ａ１号；Ｎｏ．８０
３９１７８．４；１９８０年１２月１６日発行。 １６）欧州特許願第００２０２５１Ａ２号；Ｎｏ．８０
４００７２２．７；１９８０年１２月１０日発行。
ファージの利用は、すでに確立された技法に属する。し
かしながら この技術のアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ）のファージへの応用は最近のことである
。この点に関しては、下記の論文および特許文献が参照
される。 １）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＤＮＡ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ”
， Ｊ．Ｅ．Ｓｕａｒｅｚ と Ｋ．Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ
；６ Ｃｉｅｎｃ． Ｂｉｏｌ． 第９９〜１１０頁（
１９８１年）。 ２）“Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ＰｈａｇｅφＣ３１ ａ
ｎｄ Ｉｔｓ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”， Ｋ．Ｆ．
Ｃｈａｔｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｂｒｕｔｏｎ および
Ｊ． Ｅ．Ｓｕａｒｅｚ；１４ Ｇｅｎｅ， 第１
８３〜１９４頁（１９８１年）。 ３）“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ： Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｆ
ｒｏｍ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ −Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｃ．Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．
Ｍ．Ｗａｒｄ およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ；２８６
Ｎａｔｕｒｅ， 第５２５〜５２７頁（１９８０年）
。 ４）“Ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｎｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ
ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ φＣ３１”
， Ｋ． Ｆ． Ｃｈａｔｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｂｒｕ
ｔｏｎ， Ｗ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ および Ｊ． Ｅ．
Ｓｕａｖｅｚ；１５ Ｇｅｎｅ， 第２４９〜２５６
頁 （１９８１年）。 ５）“Ａ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆ
ｏｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ｉｎ ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＰｒｏｄｕｃｉ
ｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｍ． Ｂｉｂｂ
， Ｊ． Ｌ． Ｓｃｈｏｔｔｅｌ および Ｓ．Ｎ．
Ｃｏｈｅｎ；２８４ Ｎａｔｕｒｅ，第５２６〜５３１
頁（１９８０年）。 ６）“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ；Ａ Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｌ
ｉｃｏｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ＰＢＲ ３２２ Ｉ
ｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ Ｐｈａｇｅ”， Ｊ． Ｅ． Ｓｕａｒｅｚ と
Ｋ． Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ；２８６ Ｎａｔｕｒｅ，
第５２７〜５２９頁（１９８０年）。 ７）“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．”， Ｊ． Ｌ． Ｓｃｈｏ
ｔｔｅｌ， Ｍ．Ｂｉｂｂ および Ｓ． Ｎ． Ｃｏ
ｈｅｎ；１４６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ， 第３６０〜３６８頁（１９８１年）。 ８）“ＡｃｔｉｎｏＰｈａｇｅ ＤＮＡ”，Ｋ．Ｆ．Ｃ
ｈａｔｅｒ；２１ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
第６章、第６５〜７４頁（１９８０年）。 ９）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０２３６１２Ａ号；Ｎｏ．
７９１９１５８；１９８０年１月３日発行。 １０）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０３１４３４Ａ号；Ｎｏ
．７９２８１５６；１９８０年４月２３日発行。 １１）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０１８７７８Ａ号；Ｎｏ
．７９１３０３３；１９７９年１０月２４日発行。 １２）欧州特許願第００３６２５９Ａ２号；Ｎｏ．８１
３００８５８．８；１９８１年９月２３日発行。 １３）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０４６２７２Ａ号；Ｎｏ
．８０１１０００；１９８０年１１月１２日発行。 １４）英国特許願Ｇ．Ｂ．第２０６９５０３Ａ号；Ｎｏ
．８１０４４７３；１９８１年８月２６日発行。 １５）欧州特許願第００２０１４７Ａ１号；Ｎｏ．８０
３９１７８．４；１９８０年１２月１６日発行。 １６）欧州特許願第００２０２５１Ａ２号；Ｎｏ．８０
４００７２２．７；１９８０年１２月１０日発行。
【０００３】土壌から単離された本発明のバクテリオフ
ァージＴＧ１は広範な特性研究に基づき、従来未だ記載
されていないアクチノファージであることが同定された
。このファージはテンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）
である、すなわちＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔ
ｌｅｙａ ＭＡ４２９７（ＮＲＲＬ８０５７）の溶原化
（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ） ファージである。このファー
ジは、ブラッドレー［Ｄａｖｉｄ Ｅ． Ｂｒａｄｌｅ
ｙ （１９６７）“Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｔ
ｒｉｏｃｉｎｓ”， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｒｅｖ
． ３１、第２３０〜３１４頁］によるＢ型形態を有す
る。このファージの頭部は正二十面体形であり平均頭部
直径は約５７ｎｍである；そうして第１図の電子顕微鏡
に見られるように基板を含めたファージ尾部は長さ約１
２８ｎｍである。このファージの核酸は二本鎖ＤＮＡ分
子であって、付着末端を有し、長さは４１．４７キロ塩
基対である。第２図は、このファージＤＮＡの制限エン
ドヌクレアーゼ分裂部位の位置を示す地図である。これ
らの位置は、シングルＰｓｔＩ部位に最も近いこのファ
ージＤＮＡの末端からのキロ塩基対の部位距離として与
えられている。地図は、酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩのすべて
の部位を示しており、これらはアガロースゲル電気泳動
と、０．２キロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチ
ジウム染色とによって決定することができた。下記酵素
は、このＤＮＡを分裂し得なかった：ＢａｍＩ、Ｎａｅ
Ｉ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳｓｔＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓｔ
ｕＩおよびＸｈｏＩ。或る種の欠失変異体および雑種フ
ァージ誘導体については、以下に同様に記載する。ファ
ージＴＧ１は以下にさらに詳細に記載する。なお、以下
の記載においては、該ファージの単離、保存、繁殖に関
する明瞭な特定化情報ならびに特にサイズとその制限マ
ッピングとによって定義されたその核酸のデータが記載
される。なお、後記のごとく、ＴＧ１プロファージを含
む微生物、代表的ＴＧ１プロファージ誘導体およびＴＧ
１プラスミド誘導体は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約の下に公認されたカル
チャーコレクションに寄託されている（表Ｉ参照）。
ァージＴＧ１は広範な特性研究に基づき、従来未だ記載
されていないアクチノファージであることが同定された
。このファージはテンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）
である、すなわちＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔ
ｌｅｙａ ＭＡ４２９７（ＮＲＲＬ８０５７）の溶原化
（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ） ファージである。このファー
ジは、ブラッドレー［Ｄａｖｉｄ Ｅ． Ｂｒａｄｌｅ
ｙ （１９６７）“Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｔ
ｒｉｏｃｉｎｓ”， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｒｅｖ
． ３１、第２３０〜３１４頁］によるＢ型形態を有す
る。このファージの頭部は正二十面体形であり平均頭部
直径は約５７ｎｍである；そうして第１図の電子顕微鏡
に見られるように基板を含めたファージ尾部は長さ約１
２８ｎｍである。このファージの核酸は二本鎖ＤＮＡ分
子であって、付着末端を有し、長さは４１．４７キロ塩
基対である。第２図は、このファージＤＮＡの制限エン
ドヌクレアーゼ分裂部位の位置を示す地図である。これ
らの位置は、シングルＰｓｔＩ部位に最も近いこのファ
ージＤＮＡの末端からのキロ塩基対の部位距離として与
えられている。地図は、酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩのすべて
の部位を示しており、これらはアガロースゲル電気泳動
と、０．２キロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチ
ジウム染色とによって決定することができた。下記酵素
は、このＤＮＡを分裂し得なかった：ＢａｍＩ、Ｎａｅ
Ｉ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳｓｔＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓｔ
ｕＩおよびＸｈｏＩ。或る種の欠失変異体および雑種フ
ァージ誘導体については、以下に同様に記載する。ファ
ージＴＧ１は以下にさらに詳細に記載する。なお、以下
の記載においては、該ファージの単離、保存、繁殖に関
する明瞭な特定化情報ならびに特にサイズとその制限マ
ッピングとによって定義されたその核酸のデータが記載
される。なお、後記のごとく、ＴＧ１プロファージを含
む微生物、代表的ＴＧ１プロファージ誘導体およびＴＧ
１プラスミド誘導体は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約の下に公認されたカル
チャーコレクションに寄託されている（表Ｉ参照）。
【０００４】本明細書に記載のごとく、ファージＴＧ１
、そのゲノム、誘導体およびＴＧ１ゲノムまたはそのい
くつかの部分を含むキメラＤＮＡ分子は、特に組換えＤ
ＮＡ技術におけるクローニングビヒクル（ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）として有用性を持つ。ファージ
ＴＧ１は、ＤＮＡクローニングベクターとしてそれを格
別に有用なものとするある特別な性質を有している。そ
のＤＮＡおよびその誘導体は、単離が容易であり且つプ
ロトプラストに細胞感染（トランスフェクション）させ
次に得られたファージを溶菌増殖させることによって容
易に増加させることができる（実施例１、Ｊ項参照）。 これらの機能ならびに宿主菌を溶原化する能力を保持し
且つ相当量（数キロ塩基対）の外来ＤＮＡを挿入するの
に十分なスペースを与える欠失突然変異体が容易に得ら
れる。さらに、本ファージＤＮＡは、制限エンドヌクレ
アーゼＰｓｔＩのためのただ１つの開裂部位を有してい
る。その部位は、そのファージゲノムの必要不可欠では
ない領域内に位置している。この部位における外来ＤＮ
Ａの挿入は、該ファージの溶菌的および溶原的機能を損
なうことがない（実施例１、Ｉ項およびＭ項参照）。こ
のようなＤＮＡ挿入に格別に好適な部位を持つことは、
クローニングベクターの１つの重要な特性である。なぜ
ならば、所望立体配置の混成分子が得られる可能性が、
ただ２個の新しいＤＮＡ結合の形成が必要となるだけで
大幅に増大されるからである。
、そのゲノム、誘導体およびＴＧ１ゲノムまたはそのい
くつかの部分を含むキメラＤＮＡ分子は、特に組換えＤ
ＮＡ技術におけるクローニングビヒクル（ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）として有用性を持つ。ファージ
ＴＧ１は、ＤＮＡクローニングベクターとしてそれを格
別に有用なものとするある特別な性質を有している。そ
のＤＮＡおよびその誘導体は、単離が容易であり且つプ
ロトプラストに細胞感染（トランスフェクション）させ
次に得られたファージを溶菌増殖させることによって容
易に増加させることができる（実施例１、Ｊ項参照）。 これらの機能ならびに宿主菌を溶原化する能力を保持し
且つ相当量（数キロ塩基対）の外来ＤＮＡを挿入するの
に十分なスペースを与える欠失突然変異体が容易に得ら
れる。さらに、本ファージＤＮＡは、制限エンドヌクレ
アーゼＰｓｔＩのためのただ１つの開裂部位を有してい
る。その部位は、そのファージゲノムの必要不可欠では
ない領域内に位置している。この部位における外来ＤＮ
Ａの挿入は、該ファージの溶菌的および溶原的機能を損
なうことがない（実施例１、Ｉ項およびＭ項参照）。こ
のようなＤＮＡ挿入に格別に好適な部位を持つことは、
クローニングベクターの１つの重要な特性である。なぜ
ならば、所望立体配置の混成分子が得られる可能性が、
ただ２個の新しいＤＮＡ結合の形成が必要となるだけで
大幅に増大されるからである。
【０００５】ある１つのベクターへのクローニングのた
めに使用しうる制限酵素について広い選択の余地がある
ことは、組換えＤＮＡの実験においてきわめて有利であ
る。多数の制限エンドヌクレアーゼは、このファージＤ
ＮＡを開裂させ得ない（実施例１、Ｈ項参照）。その特
別なＰｓｔＩ部位は、アダプター分子の使用によってこ
れら酵素のいずれか１つのための独特な部位に変換させ
られうる［Ｒ． Ｇ． Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、 Ｌ．
Ｆ． Ｌａｕ、 Ｃ． Ｐ． Ｂａｈｌ、Ｓ． Ａ．
Ｎａｒａａｎｇ および Ｒ． Ｗｕ の Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８巻（１９７９年
）、Ｓ． Ｐ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ および Ｎ． Ｏ
． Ｋａｐｌａｎ 編、第９８〜１０９頁所載の論文参
照］。 このＰｓｔＩクローニング部位を別の独自な部位に変換
するための別の技術は、所望部位を含む短い断片を挿入
することである。実施例２のＡ項には、両側にＰｓｔＩ
部位を有する単一ＢａｍＨ Ｉ部位を持つ短断片をＰ
ｓｔＩ部位に挿入するための方法が示されている。
めに使用しうる制限酵素について広い選択の余地がある
ことは、組換えＤＮＡの実験においてきわめて有利であ
る。多数の制限エンドヌクレアーゼは、このファージＤ
ＮＡを開裂させ得ない（実施例１、Ｈ項参照）。その特
別なＰｓｔＩ部位は、アダプター分子の使用によってこ
れら酵素のいずれか１つのための独特な部位に変換させ
られうる［Ｒ． Ｇ． Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、 Ｌ．
Ｆ． Ｌａｕ、 Ｃ． Ｐ． Ｂａｈｌ、Ｓ． Ａ．
Ｎａｒａａｎｇ および Ｒ． Ｗｕ の Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８巻（１９７９年
）、Ｓ． Ｐ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ および Ｎ． Ｏ
． Ｋａｐｌａｎ 編、第９８〜１０９頁所載の論文参
照］。 このＰｓｔＩクローニング部位を別の独自な部位に変換
するための別の技術は、所望部位を含む短い断片を挿入
することである。実施例２のＡ項には、両側にＰｓｔＩ
部位を有する単一ＢａｍＨ Ｉ部位を持つ短断片をＰ
ｓｔＩ部位に挿入するための方法が示されている。
【０００６】ＴＧ１ベクターとその誘導体が宿主ＤＮＡ
内へ挿入されうることは、いま１つの重要な特性である
。この特性が、遺伝子および遺伝子の新規な組合せを伝
達する雑種ベクターを宿主内へ安定的に組込むことを可
能にし、これによってその宿主に対して新規な化合物の
生産（たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原、実施例２参照）、
あるいは例えば増加された遺伝子量による通常細胞産物
の生産増加が可能となる。組込みはまた、宿主突然変異
体の遺伝的相補性によるクローン遺伝子の検定のために
も役立つ。その遺伝子を含む溶原菌が一旦同定されてし
まえば、その溶原菌から得られたファージを増殖し、次
いでそのファージＤＮＡを単離することによって簡単に
大量にその遺伝子を回収することがベクターにより可能
となる。すなわち、このベクターはプラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１７７のＤＮＡの大量生産に役立つ（実施例１、Ｍ項
参照）。
内へ挿入されうることは、いま１つの重要な特性である
。この特性が、遺伝子および遺伝子の新規な組合せを伝
達する雑種ベクターを宿主内へ安定的に組込むことを可
能にし、これによってその宿主に対して新規な化合物の
生産（たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原、実施例２参照）、
あるいは例えば増加された遺伝子量による通常細胞産物
の生産増加が可能となる。組込みはまた、宿主突然変異
体の遺伝的相補性によるクローン遺伝子の検定のために
も役立つ。その遺伝子を含む溶原菌が一旦同定されてし
まえば、その溶原菌から得られたファージを増殖し、次
いでそのファージＤＮＡを単離することによって簡単に
大量にその遺伝子を回収することがベクターにより可能
となる。すなわち、このベクターはプラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１７７のＤＮＡの大量生産に役立つ（実施例１、Ｍ項
参照）。
【０００７】このファージの宿主域は、特別に興味ある
ものである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅ
ｙａＭＡ４２９７（ＮＲＲＬ８０５７）は化合物チエナ
マイシンを産生する（米国特許第３９５０３５７号参照
）。チエナマイシンは、グラム陽性菌およびグラム陰性
菌の両者に対して強力な抗菌作用を持っている。これは
さらに、ベーターラクタマーゼの存在の故に、ペニシリ
ンやセファロスポリンのごときベーターラクタム抗生物
質に対して耐性のある細菌に対しても有効である。別の
ファージ宿主である Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖ
ｅｒｍｉｔｉｌｉｓ は、アベルメクチンと呼ばれてい
る化学的に類縁の剤の錯体を産生し、これはきわめて強
力な駆虫作用を示す（Ｒ．Ｗ．Ｂｕｒｇ等の論文：Ａｎ
ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１５、第３６１〜３６７頁（１
９７９年）。本ファージは、これら重要な化合物の合成
および合成制御に関連して、当該遺伝子中の突然変異体
の遺伝的相補性により遺伝子および遺伝子産物の同定、
単離および研究のために使用することができる（たとえ
ばチエナマイシンのために、実施例３参照）。
ものである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅ
ｙａＭＡ４２９７（ＮＲＲＬ８０５７）は化合物チエナ
マイシンを産生する（米国特許第３９５０３５７号参照
）。チエナマイシンは、グラム陽性菌およびグラム陰性
菌の両者に対して強力な抗菌作用を持っている。これは
さらに、ベーターラクタマーゼの存在の故に、ペニシリ
ンやセファロスポリンのごときベーターラクタム抗生物
質に対して耐性のある細菌に対しても有効である。別の
ファージ宿主である Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖ
ｅｒｍｉｔｉｌｉｓ は、アベルメクチンと呼ばれてい
る化学的に類縁の剤の錯体を産生し、これはきわめて強
力な駆虫作用を示す（Ｒ．Ｗ．Ｂｕｒｇ等の論文：Ａｎ
ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１５、第３６１〜３６７頁（１
９７９年）。本ファージは、これら重要な化合物の合成
および合成制御に関連して、当該遺伝子中の突然変異体
の遺伝的相補性により遺伝子および遺伝子産物の同定、
単離および研究のために使用することができる（たとえ
ばチエナマイシンのために、実施例３参照）。
【０００８】ファージＴＧ１のある種の混成誘導体は、
別の面において役立つ。実施例１のＭ項にその構造およ
び特性が記載されているこれら雑種は、ＴＧ１ベクター
の誘導体が Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 内で
プラスミドとして複製されることを可能にする。これら
雑種ファージ−プラスミドベクターは、トランスフェク
ションによってあるいはトランスフォーメーションによ
って、異なる種の間を転移させることができる。この特
性は非常に価値あるものである。なぜならばこれによっ
て Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ のためにこれ
まで開発されてきた遺伝子技術の使用が可能となるから
である。たとえば、Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ からの遺伝
子をＥ．ｃｏｌｉ へ組み入れて相補的な突然変異を生
じさせることが可能となろう。Ｅ．ｃｏｌｉ 中のその
Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ遺伝子内への突然変異の導入が、
たとえば、トランスポゾン突然変異誘発によってできよ
う。あるいはまた、ナンセンスサプレッサー（翻訳停止
コードン）によって抑圧される突然変異体を単離するこ
とが可能となろう。後者の突然変異された遺伝子は、Ｓ
．ｃａｔｔｌｅｙａ 内へ戻すことができ、そして Ｓ
．ｃａｔｔｌｅｙａ 内の翻訳停止コードンを抑圧する
ことが可能な突然変異体を単離するために使用すること
ができる。このようなサプレッサー突然変異は、かかる
生物の遺伝研究に役立つ。 Ｅ．ｃｏｌｉ 内でそのベクターが複製できるというこ
とは、別の面でも有益である。この特性は、挿入プラス
ミドＤＮＡの領域外でのベクターＤＮＡの欠失部の選択
のために使用された（実施例１、Ｎ参照）。かかる欠失
は、ベクター内のかなりの量のＤＮＡのクローニングの
ために重要である。ＴＧ１とその誘導体は、特定ファー
ジベクターのＤＮＡ中への挿入のために適当な各種の制
限酵素を用いて切除されたＤＮＡ配列をクローン化する
ために別の仕方で利用することができる。組換えＤＮＡ
技術の有益な解説書の１つはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ．６８（１９７９年）、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ 社（ニューヨーク）発
行である。
別の面において役立つ。実施例１のＭ項にその構造およ
び特性が記載されているこれら雑種は、ＴＧ１ベクター
の誘導体が Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 内で
プラスミドとして複製されることを可能にする。これら
雑種ファージ−プラスミドベクターは、トランスフェク
ションによってあるいはトランスフォーメーションによ
って、異なる種の間を転移させることができる。この特
性は非常に価値あるものである。なぜならばこれによっ
て Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ のためにこれ
まで開発されてきた遺伝子技術の使用が可能となるから
である。たとえば、Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ からの遺伝
子をＥ．ｃｏｌｉ へ組み入れて相補的な突然変異を生
じさせることが可能となろう。Ｅ．ｃｏｌｉ 中のその
Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ遺伝子内への突然変異の導入が、
たとえば、トランスポゾン突然変異誘発によってできよ
う。あるいはまた、ナンセンスサプレッサー（翻訳停止
コードン）によって抑圧される突然変異体を単離するこ
とが可能となろう。後者の突然変異された遺伝子は、Ｓ
．ｃａｔｔｌｅｙａ 内へ戻すことができ、そして Ｓ
．ｃａｔｔｌｅｙａ 内の翻訳停止コードンを抑圧する
ことが可能な突然変異体を単離するために使用すること
ができる。このようなサプレッサー突然変異は、かかる
生物の遺伝研究に役立つ。 Ｅ．ｃｏｌｉ 内でそのベクターが複製できるというこ
とは、別の面でも有益である。この特性は、挿入プラス
ミドＤＮＡの領域外でのベクターＤＮＡの欠失部の選択
のために使用された（実施例１、Ｎ参照）。かかる欠失
は、ベクター内のかなりの量のＤＮＡのクローニングの
ために重要である。ＴＧ１とその誘導体は、特定ファー
ジベクターのＤＮＡ中への挿入のために適当な各種の制
限酵素を用いて切除されたＤＮＡ配列をクローン化する
ために別の仕方で利用することができる。組換えＤＮＡ
技術の有益な解説書の１つはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ．６８（１９７９年）、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ 社（ニューヨーク）発
行である。
【０００９】クローニング実施法の改良、変更は、別の
ファージ変種の使用および別の制限酵素の使用以外にさ
らに以下のものを含む。制限されたベクターＤＮＡをホ
スファターゼで処理して末端リン酸基を除去し、しかし
てそのベクターＤＮＡの自己連結（ｓｅｌｆ ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ）を防止すること；１つの制限酵素による開裂
によって生じた一本鎖端部をＳＩヌクレアーゼを用いて
除去、或いはかかる一本鎖端部の相補部のＤＮＡポリメ
ラーゼによる合成の後に平滑末端連結を行う；および／
またはベクターと挿入されるべきＤＮＡとの間に付着端
を与えるＤＮＡ尾端反応（ｔａｉｌｉｎｇ ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）を行なうことである。 （Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔｌａｇ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６８（
１９７９年）第４１〜５０頁参照）。
ファージ変種の使用および別の制限酵素の使用以外にさ
らに以下のものを含む。制限されたベクターＤＮＡをホ
スファターゼで処理して末端リン酸基を除去し、しかし
てそのベクターＤＮＡの自己連結（ｓｅｌｆ ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ）を防止すること；１つの制限酵素による開裂
によって生じた一本鎖端部をＳＩヌクレアーゼを用いて
除去、或いはかかる一本鎖端部の相補部のＤＮＡポリメ
ラーゼによる合成の後に平滑末端連結を行う；および／
またはベクターと挿入されるべきＤＮＡとの間に付着端
を与えるＤＮＡ尾端反応（ｔａｉｌｉｎｇ ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）を行なうことである。 （Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔｌａｇ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６８（
１９７９年）第４１〜５０頁参照）。
【００１０】トランスフェクション頻度は、記載されて
いる条件または成分を変えることによって、あるいは連
結されたＤＮＡをリポゾームカプセル封入し、続いてか
かるリポゾームを受容菌のプロトプラストへ融合するこ
とによって向上させることができる。このような技法は
、最近Ｊ．Ｆ．Ｍａｋｉｎｓ と Ｇ．Ｈｏｌｔ によ
って染色体ＤＮＡのリポゾームトランスフォーメーショ
ンの場合について記載されている［Ｎａｔｕｒｅ ２９
３（１９８１年）、第６７１〜６７３頁］。そこに記載
された方法またはその変法が使用できる。
いる条件または成分を変えることによって、あるいは連
結されたＤＮＡをリポゾームカプセル封入し、続いてか
かるリポゾームを受容菌のプロトプラストへ融合するこ
とによって向上させることができる。このような技法は
、最近Ｊ．Ｆ．Ｍａｋｉｎｓ と Ｇ．Ｈｏｌｔ によ
って染色体ＤＮＡのリポゾームトランスフォーメーショ
ンの場合について記載されている［Ｎａｔｕｒｅ ２９
３（１９８１年）、第６７１〜６７３頁］。そこに記載
された方法またはその変法が使用できる。
【００１１】所望の挿入ＤＮＡを含む雑種ファージのた
めのファージクローンまたは溶原菌のスクリーニングは
、挿入体の形質的または遺伝的性状に応じていくつかの
方法で実施することができる。たとえば、特にアミノ酸
、ビタミン、プリンまたはピリミジンのごとき一次代謝
物質の合成の途中がブロックされた突然変異体を相補で
きる遺伝子を、次の方法で検出することができる。
めのファージクローンまたは溶原菌のスクリーニングは
、挿入体の形質的または遺伝的性状に応じていくつかの
方法で実施することができる。たとえば、特にアミノ酸
、ビタミン、プリンまたはピリミジンのごとき一次代謝
物質の合成の途中がブロックされた突然変異体を相補で
きる遺伝子を、次の方法で検出することができる。
【００１２】特定突然変異種をプロトプラスト化し、そ
して連結されたＤＮＡでトランスフェクトし、そしてな
んら選択をせずに放置して再生させる。この結果生じる
コロニーは、非トランスフェクト細胞、非雑種ファージ
によるトランスフェクトから生じた溶原菌ならびに雑種
ファージによる感染から生じた溶原菌を含んでいる。所
望の挿入体を含んでいる溶原菌は、１つの特定栄養素が
欠乏している最少培地上でその再生培養を培養すること
によって単離される。コロニーは適当なＤＮＡ挿入体を
含む再生溶原菌からのみ生じる。所望の挿入体を同じく
簡単に検出できる第２の方法は、野生型プロトプラスト
を連結ＤＮＡでトランスフェクトし、これを野生型菌（
ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ）と混合し、そしてこの混合物を適
当なプレート上で平板培養して溶菌斑（プラーク）を形
成させる方法である。増殖後の培地は親のファージの再
連結（ｒｅｌｉｇａｔｉｏｎ）に起因するプラークと、
挿入体を持つファージに起因するプラークとを含む（実
質的にはプラスミドｐＡＣＹＣ１７７をＴＧ１誘導体に
挿入したものを単離するために使用される方法と同じで
ある；実施例１、Ｍ項参照）このファージを採集して実
施例Ｂ項に記載したような無菌ファージストックが得ら
れる。これらの溶菌液は適当な突然変異株に形質導入す
るために使用される。 所望の挿入体を含むファージのみが特定突然変異の形質
導入の能力を持ち、そしてコロニーを形成させる。通常
容易に検出可能な増殖表現型を持たない抗生物質のごと
き二次代謝生成物の生産中にブロックされる突然変異体
の場合には、所望の挿入体を含むファージは、上記に記
載した方法のいずれかによって得られた溶原菌を適当な
培地で培養することによって検出される。ある時間だけ
コロニーを生育させたのち、その抗生物質に敏感な生物
の培養物を培地に流し込み、そして更に培養する。機能
性抗生物質合成遺伝子を持つ挿入体を含む溶原菌は、そ
の抗生物質を産生し、そしてコロニーのまわりに増殖阻
止域を形成させる（実施例２参照）。
して連結されたＤＮＡでトランスフェクトし、そしてな
んら選択をせずに放置して再生させる。この結果生じる
コロニーは、非トランスフェクト細胞、非雑種ファージ
によるトランスフェクトから生じた溶原菌ならびに雑種
ファージによる感染から生じた溶原菌を含んでいる。所
望の挿入体を含んでいる溶原菌は、１つの特定栄養素が
欠乏している最少培地上でその再生培養を培養すること
によって単離される。コロニーは適当なＤＮＡ挿入体を
含む再生溶原菌からのみ生じる。所望の挿入体を同じく
簡単に検出できる第２の方法は、野生型プロトプラスト
を連結ＤＮＡでトランスフェクトし、これを野生型菌（
ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ）と混合し、そしてこの混合物を適
当なプレート上で平板培養して溶菌斑（プラーク）を形
成させる方法である。増殖後の培地は親のファージの再
連結（ｒｅｌｉｇａｔｉｏｎ）に起因するプラークと、
挿入体を持つファージに起因するプラークとを含む（実
質的にはプラスミドｐＡＣＹＣ１７７をＴＧ１誘導体に
挿入したものを単離するために使用される方法と同じで
ある；実施例１、Ｍ項参照）このファージを採集して実
施例Ｂ項に記載したような無菌ファージストックが得ら
れる。これらの溶菌液は適当な突然変異株に形質導入す
るために使用される。 所望の挿入体を含むファージのみが特定突然変異の形質
導入の能力を持ち、そしてコロニーを形成させる。通常
容易に検出可能な増殖表現型を持たない抗生物質のごと
き二次代謝生成物の生産中にブロックされる突然変異体
の場合には、所望の挿入体を含むファージは、上記に記
載した方法のいずれかによって得られた溶原菌を適当な
培地で培養することによって検出される。ある時間だけ
コロニーを生育させたのち、その抗生物質に敏感な生物
の培養物を培地に流し込み、そして更に培養する。機能
性抗生物質合成遺伝子を持つ挿入体を含む溶原菌は、そ
の抗生物質を産生し、そしてコロニーのまわりに増殖阻
止域を形成させる（実施例２参照）。
【００１３】リポゾームＲＮＡや転移ＲＮＡのような、
なんら検出可能な表現型を授けないＤＮＡの挿入体を含
むファージは、プローブとして相補ＤＮＡを用いてプラ
ークまたはコロニー交雑によって検出することができる
。
なんら検出可能な表現型を授けないＤＮＡの挿入体を含
むファージは、プローブとして相補ＤＮＡを用いてプラ
ークまたはコロニー交雑によって検出することができる
。
【００１４】所望コロニー単離の効率は、溶原菌の直接
選択の方法が開発されたならば、相当程度まで増大させ
ることができる。このような選択は、抗生物質に対する
耐性または生合成ステップをコードする挿入ＤＮＡを含
むＤＮＡをベクターファージとして用いて行うことがで
きる（実施例２及び３を参照）。いずれの選択でも、未
感染プロトプラストから生じるコロニーの分析が不必要
になろう。
選択の方法が開発されたならば、相当程度まで増大させ
ることができる。このような選択は、抗生物質に対する
耐性または生合成ステップをコードする挿入ＤＮＡを含
むＤＮＡをベクターファージとして用いて行うことがで
きる（実施例２及び３を参照）。いずれの選択でも、未
感染プロトプラストから生じるコロニーの分析が不必要
になろう。
【００１５】抗生物質合成のための遺伝子を含むファー
ジクローンは、いくつかの他の実験にも使用することが
できる。このファージは、野生型あるいは他の抗生物質
産生培養物に形質導入し生産レベルでの、特定クローン
遺伝子の増加量の効果を調べるために使用できる。部位
特異的突然変異誘発の技術は、特定クローン遺伝子内の
突然変異体の単離のために使用することができ、これに
よって、離れているが多分有害な損傷（ｌｅｓｉｏｎｓ
）がある株に導入されることが排除される。このような
局所突然変異誘発は、抗生物質の生産を増加または減少
させる突然変異体の単離を可能にし、そして生産菌の改
良および抗生物質の合成および制御の遺伝的解析の助け
になるであろう。組換えＤＮＡの技術はまた、特定の抗
生物質合成遺伝子の発現を大幅に増強するために、適当
な部位に高レベルプロモータ配列を導入することを可能
ならしめるであろう。遺伝子産物量の増加は、その菌株
の生産性を顕著に高めるであろう。クローン遺伝子産物
は、宿主細胞を紫外線照射し次いで特定雑種ファージを
感染させることによって同定されうる。放射線標識をつ
けたアミノ酸の存在下で増殖させると、そのファージに
よってコードされたタンパク質が放射線標識されて合成
されるであろう。宿主細胞によってコードされたタンパ
ク質は、紫外線処理によって生じた損傷のために合成さ
れないであろう。これらタンパク質は、標準技術によっ
て分離されそして分析されうる。
ジクローンは、いくつかの他の実験にも使用することが
できる。このファージは、野生型あるいは他の抗生物質
産生培養物に形質導入し生産レベルでの、特定クローン
遺伝子の増加量の効果を調べるために使用できる。部位
特異的突然変異誘発の技術は、特定クローン遺伝子内の
突然変異体の単離のために使用することができ、これに
よって、離れているが多分有害な損傷（ｌｅｓｉｏｎｓ
）がある株に導入されることが排除される。このような
局所突然変異誘発は、抗生物質の生産を増加または減少
させる突然変異体の単離を可能にし、そして生産菌の改
良および抗生物質の合成および制御の遺伝的解析の助け
になるであろう。組換えＤＮＡの技術はまた、特定の抗
生物質合成遺伝子の発現を大幅に増強するために、適当
な部位に高レベルプロモータ配列を導入することを可能
ならしめるであろう。遺伝子産物量の増加は、その菌株
の生産性を顕著に高めるであろう。クローン遺伝子産物
は、宿主細胞を紫外線照射し次いで特定雑種ファージを
感染させることによって同定されうる。放射線標識をつ
けたアミノ酸の存在下で増殖させると、そのファージに
よってコードされたタンパク質が放射線標識されて合成
されるであろう。宿主細胞によってコードされたタンパ
ク質は、紫外線処理によって生じた損傷のために合成さ
れないであろう。これらタンパク質は、標準技術によっ
て分離されそして分析されうる。
【００１６】外来ＤＮＡ、すなわち宿主菌以外の源から
のＤＮＡも本ファージベクター内へ挿入できる。ｐＡＣ
ＹＣ１７７の該ファージへの挿入は、その１例である。 このような場合、宿主制限系の存在は、トランスフェク
ションの頻度を大幅に低下させ、したがって所望クロー
ンの検出を困難にする。この問題を排除するために、宿
主制限に欠陥のある菌突然変異体を単離することができ
る。このような菌株およびその誘導体は、次にクローニ
ング実験のための宿主として役立てることができる。有
用であることが証明されうる外来ＤＮＡの例は、抗生物
質産生遺伝子、情報サップレッサー（転移ＲＮＡ）の暗
号を持つ遺伝子、あるいはトランスポゾンまたは突然変
異遺伝子のごとき突然変異誘発性要素である。
のＤＮＡも本ファージベクター内へ挿入できる。ｐＡＣ
ＹＣ１７７の該ファージへの挿入は、その１例である。 このような場合、宿主制限系の存在は、トランスフェク
ションの頻度を大幅に低下させ、したがって所望クロー
ンの検出を困難にする。この問題を排除するために、宿
主制限に欠陥のある菌突然変異体を単離することができ
る。このような菌株およびその誘導体は、次にクローニ
ング実験のための宿主として役立てることができる。有
用であることが証明されうる外来ＤＮＡの例は、抗生物
質産生遺伝子、情報サップレッサー（転移ＲＮＡ）の暗
号を持つ遺伝子、あるいはトランスポゾンまたは突然変
異遺伝子のごとき突然変異誘発性要素である。
【００１７】クローン化抗生物質遺伝子は、標準的組換
えＤＮＡの技術を用いて物理的に単離可能であり、そし
て他のクローニングベクターへ転移されることができる
。これらは、宿主生体内で複製を行なうプラスミドまた
は他の菌株内で複製を行なうプラスミドを含む。クロー
ン化抗生物質遺伝子は、ＴＧ１またはその誘導体を介し
て、通常はその抗生物質を産生しない他のＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ 菌株へ転移されうる。この転移により、
新規な抗生物質の合成、あるいはそのクローン遺伝子の
発現の変化がもたらされるであろう。
えＤＮＡの技術を用いて物理的に単離可能であり、そし
て他のクローニングベクターへ転移されることができる
。これらは、宿主生体内で複製を行なうプラスミドまた
は他の菌株内で複製を行なうプラスミドを含む。クロー
ン化抗生物質遺伝子は、ＴＧ１またはその誘導体を介し
て、通常はその抗生物質を産生しない他のＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ 菌株へ転移されうる。この転移により、
新規な抗生物質の合成、あるいはそのクローン遺伝子の
発現の変化がもたらされるであろう。
【００１８】本ベクターは、ＤＮＡクローニングを達成
するためいくつかの別の仕方で使用することができる。 通常は無関係の菌株のプラスミドたとえばＥ．ｃｏｌｉ
のプラスミドは、それがあるファージ宿主菌株に導入さ
れた場合、それが外来起源であるが故に複製しないかあ
るいは保存されない。しかしながら、もしそのプラスミ
ドが該宿主染色体に存在するものと相同なＤＮＡ配列の
挿入によって予め変えられていたならば、その相同座位
において該染色体に該プラスミドが組み込まれた組換え
が可能となる。もしその宿主菌株がファージ溶原菌であ
る場合には、プラスミド上のその相同シーケンスは、１
つのファージ断片によって提供されうる。この場合、染
色体に組み込まれるプロファージに、そのプラスミドが
挿入される。このような挿入されたプラスミドは、その
プロファージが組み込まれた状態のままでいる限り宿主
染色体の一部として保存されるであろう。あるいは、フ
ァージの通常の組み込みのために必要な機能を持ってい
るある特定ファージ断片、すなわち、付着部位とファー
ジ組み込みに必要な遺伝子産物を指示するコードを持つ
ファージ遺伝子とを持つ断片をプラスミドに挿入しても
よい。このようなベクターは、野生型ファージの組み込
みと同様な態様且つ同じ座位において宿主遺伝子へ挿入
可能でなければならない。挿入されたベクターを持つ組
換え菌は、もしある選択可能な遺伝子型も同時にそのベ
クターによって運ばれていたならば、容易に同定するこ
とができる。このタイプのベクターは、下記のごときい
くつかの利点を持つ： （１） そのような分子内にクローン化されうるＤＮ
Ａの量が、ファージパッケージングの束縛によって制限
されることがない。 （２） プラスミドがそのオリジナル宿主内で複製可
能である。たとえばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 宿主内
よりもはるかに容易に種々の遺伝的または物理的操作を
行なうことのできるＥ．ｃｏｌｉオリジナル宿主内で複
製可能である；（３） たとえば、ラムダｃｏｓ部位
のようなエレメントも導入可能である。これによってコ
スミドＤＮＡクローニングの技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８参照）を用いて
プラスミド宿主たとえばＥ．ｃｏｌｉ内で大きなＤＮＡ
断片をクローニングし、次いで生じた雑種ＤＮＡを単離
しそしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 菌株のプロトプラ
ストをトランスフォーメーションまたはトランスフェク
ションすることが可能となる。
するためいくつかの別の仕方で使用することができる。 通常は無関係の菌株のプラスミドたとえばＥ．ｃｏｌｉ
のプラスミドは、それがあるファージ宿主菌株に導入さ
れた場合、それが外来起源であるが故に複製しないかあ
るいは保存されない。しかしながら、もしそのプラスミ
ドが該宿主染色体に存在するものと相同なＤＮＡ配列の
挿入によって予め変えられていたならば、その相同座位
において該染色体に該プラスミドが組み込まれた組換え
が可能となる。もしその宿主菌株がファージ溶原菌であ
る場合には、プラスミド上のその相同シーケンスは、１
つのファージ断片によって提供されうる。この場合、染
色体に組み込まれるプロファージに、そのプラスミドが
挿入される。このような挿入されたプラスミドは、その
プロファージが組み込まれた状態のままでいる限り宿主
染色体の一部として保存されるであろう。あるいは、フ
ァージの通常の組み込みのために必要な機能を持ってい
るある特定ファージ断片、すなわち、付着部位とファー
ジ組み込みに必要な遺伝子産物を指示するコードを持つ
ファージ遺伝子とを持つ断片をプラスミドに挿入しても
よい。このようなベクターは、野生型ファージの組み込
みと同様な態様且つ同じ座位において宿主遺伝子へ挿入
可能でなければならない。挿入されたベクターを持つ組
換え菌は、もしある選択可能な遺伝子型も同時にそのベ
クターによって運ばれていたならば、容易に同定するこ
とができる。このタイプのベクターは、下記のごときい
くつかの利点を持つ： （１） そのような分子内にクローン化されうるＤＮ
Ａの量が、ファージパッケージングの束縛によって制限
されることがない。 （２） プラスミドがそのオリジナル宿主内で複製可
能である。たとえばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 宿主内
よりもはるかに容易に種々の遺伝的または物理的操作を
行なうことのできるＥ．ｃｏｌｉオリジナル宿主内で複
製可能である；（３） たとえば、ラムダｃｏｓ部位
のようなエレメントも導入可能である。これによってコ
スミドＤＮＡクローニングの技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８参照）を用いて
プラスミド宿主たとえばＥ．ｃｏｌｉ内で大きなＤＮＡ
断片をクローニングし、次いで生じた雑種ＤＮＡを単離
しそしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 菌株のプロトプラ
ストをトランスフォーメーションまたはトランスフェク
ションすることが可能となる。
【００１９】その他のファージシーケンスもまたクロー
ニングの目的のために使用することができる。一例を挙
げれば、ファージＴＧ１のｃｏｓ部位である。この部位
は、ＤＮＡをファージキャプシドの中にパッケージング
する間ある１つのファージ産物によって認識される。効
果的なパッケージングのために、順次連続するｃｏｓ座
位間のＤＮＡの長さが一定以上である必要がある。この
ｃｏｓ部位が１つのプラスミド内に挿入され且つ他のＤ
ＮＡも挿入されれば、そのＤＮＡを処理しそしてファー
ジ粒子を形成するために試験管内パッケージングシステ
ムが使用できる。ｃｏｓ座位間のＤＮＡの正しい長さを
作り出すような挿入物のみをパッケージすることができ
、これによって大きい挿入物が選択される。
ニングの目的のために使用することができる。一例を挙
げれば、ファージＴＧ１のｃｏｓ部位である。この部位
は、ＤＮＡをファージキャプシドの中にパッケージング
する間ある１つのファージ産物によって認識される。効
果的なパッケージングのために、順次連続するｃｏｓ座
位間のＤＮＡの長さが一定以上である必要がある。この
ｃｏｓ部位が１つのプラスミド内に挿入され且つ他のＤ
ＮＡも挿入されれば、そのＤＮＡを処理しそしてファー
ジ粒子を形成するために試験管内パッケージングシステ
ムが使用できる。ｃｏｓ座位間のＤＮＡの正しい長さを
作り出すような挿入物のみをパッケージすることができ
、これによって大きい挿入物が選択される。
【００２０】染色体遺伝子を異なる制御下におくために
ファージプロモータシーケンスも利用することができる
。ファージプロモータのいくつかは、ファージレギュレ
ータ機構によって制御される。すなわち、正しく挿入さ
れたクローン遺伝子の発現もまたかかる制御機構によっ
て制御されることとなる。たとえば、温度感受性リプレ
ッサーは、低温においては、オペレータ座位に結合する
ことによってある特定のプロモータの発現を大幅に低減
させるであろう。他方、高温においては、そのリプレッ
サーは不活性となりそして高レベルの転写が起こるであ
ろう。もしある所望のクローン遺伝子が適当な位置に挿
入されたならば、その発現とその遺伝子の生産レベルは
、温度調節によって発酵の間制御可能である。
ファージプロモータシーケンスも利用することができる
。ファージプロモータのいくつかは、ファージレギュレ
ータ機構によって制御される。すなわち、正しく挿入さ
れたクローン遺伝子の発現もまたかかる制御機構によっ
て制御されることとなる。たとえば、温度感受性リプレ
ッサーは、低温においては、オペレータ座位に結合する
ことによってある特定のプロモータの発現を大幅に低減
させるであろう。他方、高温においては、そのリプレッ
サーは不活性となりそして高レベルの転写が起こるであ
ろう。もしある所望のクローン遺伝子が適当な位置に挿
入されたならば、その発現とその遺伝子の生産レベルは
、温度調節によって発酵の間制御可能である。
【００２１】
表 Ｉ
微生物寄託
菌 株
受 託 番 号
固有ベクター
番 号 （注ａ）
（注ｂ） ＭＡ５
７６６ ＴＧ２
ＡＴＣＣ ３９０７７ ＭＡ５７
６７ ＴＧ１
ＡＴＣＣ ３９０７８ ＭＡ５７６
９ ＴＧ４
ＮＲＲＬ １５０３４ ＭＡ５７７０
ＴＧ５
ＮＲＲＬ １５０３５ ＭＢ４５４０
ｐＴＧ６
ＡＴＣＣ ３９０７９ ＭＢ４５４１
ｐＴＧ１２
ＡＴＣＣ ３９０８０ ＭＢ４５４２
ｐＴＧ１６ ＡＴＣ
Ｃ ３９０８１ ＭＢ４５４３
ｐＴＧ７ ＡＴＣＣ
３９０８２ ＭＢ４５４４
ｐＴＧ１５ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２７ ＭＢ４５４５
ｐＴＧ８ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２８ ＭＢ４５４６
ｐＴＧ９ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２９ ＭＢ４５４７
ｐＴＧ１０ ＮＲＲＬ Ｂ−１５
０３０ ＭＢ４５４８
ｐＴＧ１１ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０
３１ ＭＢ４５４９
ｐＴＧ１３ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０３
２ ＭＢ４５５０
ｐＴＧ１４ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０３３
表 Ｉ
微生物寄託
菌 株
受 託 番 号
固有ベクター
番 号 （注ａ）
（注ｂ） ＭＡ５
７６６ ＴＧ２
ＡＴＣＣ ３９０７７ ＭＡ５７
６７ ＴＧ１
ＡＴＣＣ ３９０７８ ＭＡ５７６
９ ＴＧ４
ＮＲＲＬ １５０３４ ＭＡ５７７０
ＴＧ５
ＮＲＲＬ １５０３５ ＭＢ４５４０
ｐＴＧ６
ＡＴＣＣ ３９０７９ ＭＢ４５４１
ｐＴＧ１２
ＡＴＣＣ ３９０８０ ＭＢ４５４２
ｐＴＧ１６ ＡＴＣ
Ｃ ３９０８１ ＭＢ４５４３
ｐＴＧ７ ＡＴＣＣ
３９０８２ ＭＢ４５４４
ｐＴＧ１５ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２７ ＭＢ４５４５
ｐＴＧ８ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２８ ＭＢ４５４６
ｐＴＧ９ ＮＲＲＬ Ｂ−１
５０２９ ＭＢ４５４７
ｐＴＧ１０ ＮＲＲＬ Ｂ−１５
０３０ ＭＢ４５４８
ｐＴＧ１１ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０
３１ ＭＢ４５４９
ｐＴＧ１３ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０３
２ ＭＢ４５５０
ｐＴＧ１４ ＮＲＲＬ Ｂ−１５０３３
【００２２】注ａ
菌株の呼称はメルク社（Ｍｅｒｋ ａｎｄ Ｃｏ．Ｉｎ
ｃ．，Ｒａｈｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の培養
コレクションの呼称である。ＭＡ５７６６〜ＭＡ５７７
０は指示したファージベクターに対して溶原性であるＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４
２９７（ＮＲＲＬ８０５７）の誘導体である。ＭＢ４５
４０〜ＭＢ４５５０は指示した雑種ファージ−プラスミ
ドベクターを含む Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２ＲＲ１の誘導体である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ＲＲ１はＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄ
ｒｉｑｕｅｚ、Ｍ．Ｃ．ＢｅｔｌａｃｈおよびＨ．Ｗ．
Ｂｏｙｅｒによって、 Ｇｅｎｅ ２、第７５〜９３頁
（１９７７年）に記載されている。 注ｂ 各菌株の培養物はＡＴＣＣ（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
、米国メリーランド州、ロックビル、パークローンドラ
イブ１２３０１所在、に永久寄託され、そして１９８２
年４月２日現在すべて完全である。また１９８２年現在
ｔｈｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＮＲＲＬ
）、Ｆｅｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｄ
ｕｃａｔｉｏｎ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｕ．
Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅ、米国イリノイ州、ペオリア、ノースユニバーシ
ティストリート１８１５所在、に寄託されており、そし
て表に示した受託番号が与えられた。
ｃ．，Ｒａｈｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の培養
コレクションの呼称である。ＭＡ５７６６〜ＭＡ５７７
０は指示したファージベクターに対して溶原性であるＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４
２９７（ＮＲＲＬ８０５７）の誘導体である。ＭＢ４５
４０〜ＭＢ４５５０は指示した雑種ファージ−プラスミ
ドベクターを含む Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２ＲＲ１の誘導体である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ＲＲ１はＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄ
ｒｉｑｕｅｚ、Ｍ．Ｃ．ＢｅｔｌａｃｈおよびＨ．Ｗ．
Ｂｏｙｅｒによって、 Ｇｅｎｅ ２、第７５〜９３頁
（１９７７年）に記載されている。 注ｂ 各菌株の培養物はＡＴＣＣ（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
、米国メリーランド州、ロックビル、パークローンドラ
イブ１２３０１所在、に永久寄託され、そして１９８２
年４月２日現在すべて完全である。また１９８２年現在
ｔｈｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＮＲＲＬ
）、Ｆｅｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｄ
ｕｃａｔｉｏｎ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｕ．
Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅ、米国イリノイ州、ペオリア、ノースユニバーシ
ティストリート１８１５所在、に寄託されており、そし
て表に示した受託番号が与えられた。
【００２３】図面についての説明
第１図
これはファージＴＧ１の電子顕微鏡写真である。サンプ
ルは、２％のリンタングステン酸水溶液（１．０モルＫ
ＯＨでｐＨ６．３に調整）で染色された。試料は、フィ
リップス３００透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ３
００ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて２１０５７０倍の倍率
で観察された。
ルは、２％のリンタングステン酸水溶液（１．０モルＫ
ＯＨでｐＨ６．３に調整）で染色された。試料は、フィ
リップス３００透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ３
００ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて２１０５７０倍の倍率
で観察された。
【００２４】第２図
これはファージＴＧ１の制限地図である。位置は任意的
に左端として示してある単一のＰｓｔＩ座位に最も近い
ファージＤＮＡの端からのキロ塩基対単位での座位距離
として与えられている。この地図は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
、Ｋｐｎ Ｉ、ＰｓｔＩ、Ｓｍａ Ｉ、ＳｐｈＩ、Ｘｂ
ａ Ｉの酵素のためのすべての部位を示す。これらの位
置はアガロースゲル電気泳動と、０．２キロ塩基対およ
びそれより大きな断片の臭化エチジウム染色とによって
決定することができた。
に左端として示してある単一のＰｓｔＩ座位に最も近い
ファージＤＮＡの端からのキロ塩基対単位での座位距離
として与えられている。この地図は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
、Ｋｐｎ Ｉ、ＰｓｔＩ、Ｓｍａ Ｉ、ＳｐｈＩ、Ｘｂ
ａ Ｉの酵素のためのすべての部位を示す。これらの位
置はアガロースゲル電気泳動と、０．２キロ塩基対およ
びそれより大きな断片の臭化エチジウム染色とによって
決定することができた。
【００２５】第３図
これはファージＴＧ１の欠失突然変異体を示す。欠失は
当該ＤＮＡを酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｐｓ
ｔ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｘｂａ Ｉで消化させることによ
って解析された。ＴＧ１のための制限部位の位置は、第
２図と同様に、ファージＤＮＡの左端からのキロ塩基対
で示されている。各誘導体についての欠失ＤＮＡの位置
が未確認であることはＴＧ１の地図の下に横向きカッコ
で指示されている。なお、ファージ地図の左端のみが示
されていることに注意されたい。この領域外には欠失は
起こらなかった。欠失の最も左の可能位置は、上向きカ
ギカッコで示唆されており、最も右の可能位置は、下向
きカギカッコで示唆されている。キロ塩基対（Ｋｂｐ）
単位での各欠失長さは、関連するカッコの右側の丸カッ
コ内に記載してある。ファージ突然変異体は左側に同定
されている。ただし、一方のカギカッコの端位置の部位
がその突然変異体に存在しない場合には、それは他方の
カギカッコの中に閉じられていることに注意されたい。 その他の場合はその所位は存在する。
当該ＤＮＡを酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｐｓ
ｔ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｘｂａ Ｉで消化させることによ
って解析された。ＴＧ１のための制限部位の位置は、第
２図と同様に、ファージＤＮＡの左端からのキロ塩基対
で示されている。各誘導体についての欠失ＤＮＡの位置
が未確認であることはＴＧ１の地図の下に横向きカッコ
で指示されている。なお、ファージ地図の左端のみが示
されていることに注意されたい。この領域外には欠失は
起こらなかった。欠失の最も左の可能位置は、上向きカ
ギカッコで示唆されており、最も右の可能位置は、下向
きカギカッコで示唆されている。キロ塩基対（Ｋｂｐ）
単位での各欠失長さは、関連するカッコの右側の丸カッ
コ内に記載してある。ファージ突然変異体は左側に同定
されている。ただし、一方のカギカッコの端位置の部位
がその突然変異体に存在しない場合には、それは他方の
カギカッコの中に閉じられていることに注意されたい。 その他の場合はその所位は存在する。
【００２６】第４図
これは雑種ファージＴＧ６とＴＧ７および欠失突然変異
体を示す。ＴＧ６とＴＧ７の制限地図の左端のみが示さ
れていることに注意されたい。１０．２８Ｋｂｐの位置
にあるＰｓｔＩの右側のすべての制限座位は第２図に示
したＴＧ１のそれと同じである。ただし、これらの制限
座位の位置は、ＰｓｔＩ座位のすぐ左の２．０Ｋｂｐの
ＤＮＡの欠失（第３図のＴＧ２参照）とこの部位への３
．９ＫｂｐのｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡの挿入を考慮すれ
ば、１．９Ｋｂｐｐ分だけ増えているはずである。ｐＡ
ＣＹＣ１７７からのＤＮＡを含む領域は６．３８Ｋｂｐ
と１０．２８Ｋｂｐとにそれぞれ位置するＰｓｔＩの２
つの座位の間に濃い線で示してある。各種誘導体の欠失
部は、第３図の場合と同様に各関連する親の下に指示さ
れている。
体を示す。ＴＧ６とＴＧ７の制限地図の左端のみが示さ
れていることに注意されたい。１０．２８Ｋｂｐの位置
にあるＰｓｔＩの右側のすべての制限座位は第２図に示
したＴＧ１のそれと同じである。ただし、これらの制限
座位の位置は、ＰｓｔＩ座位のすぐ左の２．０Ｋｂｐの
ＤＮＡの欠失（第３図のＴＧ２参照）とこの部位への３
．９ＫｂｐのｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡの挿入を考慮すれ
ば、１．９Ｋｂｐｐ分だけ増えているはずである。ｐＡ
ＣＹＣ１７７からのＤＮＡを含む領域は６．３８Ｋｂｐ
と１０．２８Ｋｂｐとにそれぞれ位置するＰｓｔＩの２
つの座位の間に濃い線で示してある。各種誘導体の欠失
部は、第３図の場合と同様に各関連する親の下に指示さ
れている。
【００２７】しかして、本発明の目的の１つは、新規な
バクテリオファージＴＧ１それ自体およびその誘導体（
複数）を提供すること；かかるファージおよびその誘導
体のゲノム（核酸）成分（欠失突然変異体を含む）、フ
ァージＴＧ１ゲノムまたはその部分を含む混成（キメラ
）核酸分子および生体へのＤＮＡクローニングベクター
として有用なその他のＤＮＡシーケンスを提供すること
である。上記生体は、たとえばＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ
ＮＲＲＬ ８０５７のごとき菌である。上記ファージゲ
ノムの部分は、さらに組換えＤＮＡクローニング技法に
おける補助体として役立つ。たとえば下記の機能を持つ
：１） 組込まれた状態でも、自律的エレメントとし
ても、宿主内でのクローン化ＤＮＡの保存を可能ならし
める。 ２） 内因性のまたは外来の遺伝子の発現を強化する
プロモータとして働く。この場合、それが連結されてい
る遺伝子に対するプロモータとして働く。また他の場合
でもプロモータとして役立つ。 ３） 内因性および外来の遺伝子の発現を制御するた
めの制御エレメントとして働く。
バクテリオファージＴＧ１それ自体およびその誘導体（
複数）を提供すること；かかるファージおよびその誘導
体のゲノム（核酸）成分（欠失突然変異体を含む）、フ
ァージＴＧ１ゲノムまたはその部分を含む混成（キメラ
）核酸分子および生体へのＤＮＡクローニングベクター
として有用なその他のＤＮＡシーケンスを提供すること
である。上記生体は、たとえばＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ
ＮＲＲＬ ８０５７のごとき菌である。上記ファージゲ
ノムの部分は、さらに組換えＤＮＡクローニング技法に
おける補助体として役立つ。たとえば下記の機能を持つ
：１） 組込まれた状態でも、自律的エレメントとし
ても、宿主内でのクローン化ＤＮＡの保存を可能ならし
める。 ２） 内因性のまたは外来の遺伝子の発現を強化する
プロモータとして働く。この場合、それが連結されてい
る遺伝子に対するプロモータとして働く。また他の場合
でもプロモータとして役立つ。 ３） 内因性および外来の遺伝子の発現を制御するた
めの制御エレメントとして働く。
【００２８】クローニングベクターとして、ＴＧ１およ
びその欠失突然変異体は、有用な機能をコードするＤＮ
Ａシーケンス（遺伝子）たとえば抗生物質チエナマイシ
ン生産のために必要な遺伝子あるいはＢ型肝炎抗原の生
産に必要な遺伝子の担体として役立つ。またそれ自体が
有用なＤＮＡシーケンスたとえば本来有用性のある別個
のプラスミドベクターの担体として働く。かかる変異さ
れたクローニングベクター（ＴＧ１ゲノムまたはその部
分および外来ＤＮＡシーケンスを含む混成ＤＮＡ分子）
は感染、トランスフェクションまたはトランスフォーメ
ーションによって受容生体内へ導入され、そこで該混成
ＤＮＡは組込モード、溶菌（増殖相）モードおよび／ま
たはプラスミドモードで機能する。
びその欠失突然変異体は、有用な機能をコードするＤＮ
Ａシーケンス（遺伝子）たとえば抗生物質チエナマイシ
ン生産のために必要な遺伝子あるいはＢ型肝炎抗原の生
産に必要な遺伝子の担体として役立つ。またそれ自体が
有用なＤＮＡシーケンスたとえば本来有用性のある別個
のプラスミドベクターの担体として働く。かかる変異さ
れたクローニングベクター（ＴＧ１ゲノムまたはその部
分および外来ＤＮＡシーケンスを含む混成ＤＮＡ分子）
は感染、トランスフェクションまたはトランスフォーメ
ーションによって受容生体内へ導入され、そこで該混成
ＤＮＡは組込モード、溶菌（増殖相）モードおよび／ま
たはプラスミドモードで機能する。
【００２９】本発明のいま１つの目的はしたがって、Ｔ
Ｇ１プロファージおよびその欠失および雑種（キメラ）
誘導体を含む微生物、および雑種（キメラ）ファージプ
ラスミドおよびその誘導体を含む微生物を提供すること
である。［なお、本明細書で使用されている“ＴＧ１ベ
クター”という言葉は、一般的意味において、ＴＧ１で
あるバクテリオファージおよびすべてのその誘導体、Ｔ
Ｇ１およびその誘導体のゲノム（全部および部分を含む
）、およびＴＧ１およびその誘導体のゲノム（全部およ
び部分を含む）を含有するクローニングベクターを包括
するものである］。以下、本発明をいくつかの代表的実
施例について更に詳細に説明する。なお、“実施例”と
いう言葉は明細書の記載形式の点から便宜上使用するも
のであり、これらの実施例は上記した本発明に対してな
んら限定を加えるものではない。
Ｇ１プロファージおよびその欠失および雑種（キメラ）
誘導体を含む微生物、および雑種（キメラ）ファージプ
ラスミドおよびその誘導体を含む微生物を提供すること
である。［なお、本明細書で使用されている“ＴＧ１ベ
クター”という言葉は、一般的意味において、ＴＧ１で
あるバクテリオファージおよびすべてのその誘導体、Ｔ
Ｇ１およびその誘導体のゲノム（全部および部分を含む
）、およびＴＧ１およびその誘導体のゲノム（全部およ
び部分を含む）を含有するクローニングベクターを包括
するものである］。以下、本発明をいくつかの代表的実
施例について更に詳細に説明する。なお、“実施例”と
いう言葉は明細書の記載形式の点から便宜上使用するも
のであり、これらの実施例は上記した本発明に対してな
んら限定を加えるものではない。
【００３０】実施例１
ＴＧ１ベクターの単離、構成、保存および増殖このファ
ージとＤＮＡは、クローニングベクターとして従来使用
されていた他のバクテリオファージおよびプラスミドに
関する作業によって確立された技法とは多少異なる方法
で単離され、処理された。技法の良い手引書の１つは、
Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ および
Ｊ．Ｒ．Ｒｏｔｈ によって書かれた“Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ”、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー所
在、ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ 刊行（１９８０年）である。本願に係わる
作業に使用した特定の方法が、上記マニュアルに記載し
た方法と同一でない点については以下に記載がなされる
。ＴＧ１ベクターとその誘導体とを特定化するために役
立つデータおよびそれらを他のクローニングベクターか
ら役立つデータは適当な箇所で記載がなされる。
ージとＤＮＡは、クローニングベクターとして従来使用
されていた他のバクテリオファージおよびプラスミドに
関する作業によって確立された技法とは多少異なる方法
で単離され、処理された。技法の良い手引書の１つは、
Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ および
Ｊ．Ｒ．Ｒｏｔｈ によって書かれた“Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ”、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー所
在、ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ 刊行（１９８０年）である。本願に係わる
作業に使用した特定の方法が、上記マニュアルに記載し
た方法と同一でない点については以下に記載がなされる
。ＴＧ１ベクターとその誘導体とを特定化するために役
立つデータおよびそれらを他のクローニングベクターか
ら役立つデータは適当な箇所で記載がなされる。
【００３１】Ａ．ファージＴＧ１の単離約３００種のさ
まざまな土壌試料を収集して Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ
上で生育しうるファージが存在しないかを調べた。 土壌試料１ｇを、１０５個／ｍｌの濃度で菌を含むＹＣ
肉汁５ｍｌと混合し、そして３０℃で振盪しながら１６
時間培養することによってファージの存否を検査した。 この検査に使用した菌は、ＹＣ肉汁中、１０７コロニー
形成単位（ｃｆｕ−ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕ
ｎｉｔ）／ｍｌの濃度のＳｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２９７の芽胞を振盪しなが
ら３７℃で３時間培養することによって準備された。Ｙ
Ｃ肉汁は１リットルにつきディフコ（Ｄｉｆｃｏ）イー
スト抽出物４．０ｇ、ディフコ麦芽抽出物１０ｇおよび
Ｄ−グルコース４．０ｇを含有する。オートクレーブし
たのち１．０モルＭｇＣｌ２および２．５モルＣａＣｌ
２各１０ｍｍを添加する。土と共にインキュベートした
このブロスを濾過し、１０６個の菌を含有している軟寒
天を上掛けしたプレートの上に濾過したブロスの１滴を
たらした。この培養プレートを３０℃で１６時間培養し
た。 使用した上掛けは菌０．１ｍｌをＹＣ軟寒天４．０ｍｌ
と混合し、そしてこの混合物を約４０ｍｌのＹＣ寒天を
含有する１枚のペトリ皿に注入することによって作成し
た。ＹＣ軟寒天は４６℃の溶融ディフコ寒天０．６％（
ｗ／ｖ）を含むＹＣ肉汁である。ＹＣ寒天は２．０％（
ｗ／ｖ）ディフコ寒天で固めたＹＣ肉汁である。
まざまな土壌試料を収集して Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ
上で生育しうるファージが存在しないかを調べた。 土壌試料１ｇを、１０５個／ｍｌの濃度で菌を含むＹＣ
肉汁５ｍｌと混合し、そして３０℃で振盪しながら１６
時間培養することによってファージの存否を検査した。 この検査に使用した菌は、ＹＣ肉汁中、１０７コロニー
形成単位（ｃｆｕ−ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕ
ｎｉｔ）／ｍｌの濃度のＳｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２９７の芽胞を振盪しなが
ら３７℃で３時間培養することによって準備された。Ｙ
Ｃ肉汁は１リットルにつきディフコ（Ｄｉｆｃｏ）イー
スト抽出物４．０ｇ、ディフコ麦芽抽出物１０ｇおよび
Ｄ−グルコース４．０ｇを含有する。オートクレーブし
たのち１．０モルＭｇＣｌ２および２．５モルＣａＣｌ
２各１０ｍｍを添加する。土と共にインキュベートした
このブロスを濾過し、１０６個の菌を含有している軟寒
天を上掛けしたプレートの上に濾過したブロスの１滴を
たらした。この培養プレートを３０℃で１６時間培養し
た。 使用した上掛けは菌０．１ｍｌをＹＣ軟寒天４．０ｍｌ
と混合し、そしてこの混合物を約４０ｍｌのＹＣ寒天を
含有する１枚のペトリ皿に注入することによって作成し
た。ＹＣ軟寒天は４６℃の溶融ディフコ寒天０．６％（
ｗ／ｖ）を含むＹＣ肉汁である。ＹＣ寒天は２．０％（
ｗ／ｖ）ディフコ寒天で固めたＹＣ肉汁である。
【００３２】菌細胞溶解域からその軟寒天を取り出し、
そして推定上のファージを抽出してＹＣで希釈した。各
希釈物の０．１ｍｌを試料として取って菌０．１ｍｌと
混ぜた。室温に１０乃至２０分間放置したのち、４．０
ｍｌのＹＣ軟寒天を添加した。その軟寒天培地が固化し
たのち、各培養皿を３０℃で１６時間培養した。わずか
数個のファージが加えられていた培養皿に単一ファージ
の成長と繁殖から形成された、プラーク（溶菌斑）と呼
ばれている菌細胞溶解の小さな領域が観察された。各培
養皿に観察されるプラークの数はその懸濁物中のファー
ジの濃度に正比例する。約３０の異なるファージ単離物
が、このようにして獲られた。ファージＴＧ１は他と異
なりさらに２日の培養後に合一して広がった溶菌域が濁
ってきた。この観察がそのファージが溶原性であること
を示唆した。その可能性について更に詳細な吟味を行っ
た（後記のＣ項およびＥ項参照）。
そして推定上のファージを抽出してＹＣで希釈した。各
希釈物の０．１ｍｌを試料として取って菌０．１ｍｌと
混ぜた。室温に１０乃至２０分間放置したのち、４．０
ｍｌのＹＣ軟寒天を添加した。その軟寒天培地が固化し
たのち、各培養皿を３０℃で１６時間培養した。わずか
数個のファージが加えられていた培養皿に単一ファージ
の成長と繁殖から形成された、プラーク（溶菌斑）と呼
ばれている菌細胞溶解の小さな領域が観察された。各培
養皿に観察されるプラークの数はその懸濁物中のファー
ジの濃度に正比例する。約３０の異なるファージ単離物
が、このようにして獲られた。ファージＴＧ１は他と異
なりさらに２日の培養後に合一して広がった溶菌域が濁
ってきた。この観察がそのファージが溶原性であること
を示唆した。その可能性について更に詳細な吟味を行っ
た（後記のＣ項およびＥ項参照）。
【００３３】Ｂ．ファージＴＧ１の成長ファージＴＧ１
は２８℃から３２℃までの間の温度において最も良く成
長する。プラークの形成のためにはＣａ＋＋が要求され
る。プラークは通常その直径が１乃至３ｍｍである。安
定性を得るためには二価陽イオン（Ｍ＋＋で十分）が要
求される。このことはピロリン酸塩、エチレンジアミン
テトラ酢酸塩のごときキレート剤の存在でファージが不
活性化されることによって明かである（後記のＩ項およ
びＮ項参照）。単一ファージの子孫を繁殖させるために
は、１つのプラークの中心から軟寒天培地を取り出して
１ｍｌ当り２×１０７ｃｆｕの菌を含有するＹＣ肉汁１
０ｍｌと混合し、そして４０乃至５０ｒ．ｐ．ｍ．の速
度で回転している組織培養ローラドラム（Ｎｅｗ Ｂｒ
ｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ
ＴＣ−７）中、２５×１５０ｍｍ培養管内で３０℃の温
度において１６時間培養する。生じる溶菌物を０．４５
ミクロンの細孔サイズのフィルターに通す。この濾液が
管１本のファージストックとなり、通常は１０１０ｐｆ
ｕ／ｍｌの内容物を含む。全面溶菌を起こすのに十分な
量のファージ（約１０１４ｐｆｕ＝プラーク形成単位）
で感染された平板培養からその寒天上掛けを取り上げて
５．０ｍｌのＹＣ肉汁に再懸濁する。この混合物を約１
０秒間激しく混合攪拌する。寒天を遠心分離によって除
き、そして上澄みを濾過する。この濾液が一皿のファー
ジストックとなり、通常１０９ｐｆｕ／ｍｌの内容物を
含む。これらのファージストックを４℃で貯蔵する。
は２８℃から３２℃までの間の温度において最も良く成
長する。プラークの形成のためにはＣａ＋＋が要求され
る。プラークは通常その直径が１乃至３ｍｍである。安
定性を得るためには二価陽イオン（Ｍ＋＋で十分）が要
求される。このことはピロリン酸塩、エチレンジアミン
テトラ酢酸塩のごときキレート剤の存在でファージが不
活性化されることによって明かである（後記のＩ項およ
びＮ項参照）。単一ファージの子孫を繁殖させるために
は、１つのプラークの中心から軟寒天培地を取り出して
１ｍｌ当り２×１０７ｃｆｕの菌を含有するＹＣ肉汁１
０ｍｌと混合し、そして４０乃至５０ｒ．ｐ．ｍ．の速
度で回転している組織培養ローラドラム（Ｎｅｗ Ｂｒ
ｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ
ＴＣ−７）中、２５×１５０ｍｍ培養管内で３０℃の温
度において１６時間培養する。生じる溶菌物を０．４５
ミクロンの細孔サイズのフィルターに通す。この濾液が
管１本のファージストックとなり、通常は１０１０ｐｆ
ｕ／ｍｌの内容物を含む。全面溶菌を起こすのに十分な
量のファージ（約１０１４ｐｆｕ＝プラーク形成単位）
で感染された平板培養からその寒天上掛けを取り上げて
５．０ｍｌのＹＣ肉汁に再懸濁する。この混合物を約１
０秒間激しく混合攪拌する。寒天を遠心分離によって除
き、そして上澄みを濾過する。この濾液が一皿のファー
ジストックとなり、通常１０９ｐｆｕ／ｍｌの内容物を
含む。これらのファージストックを４℃で貯蔵する。
【００３４】Ｃ．溶原菌の単離と確認
プラークを有する培養皿をさらに１日または２日培養す
ると、溶菌域内においてわずかながら菌増殖が観察され
る。それらの菌を取り出して芽胞化する。それらの芽胞
を汚染ファージを除くため洗滌し、希釈しそして単離コ
ロニーとして成長させる。このような純粋培養から得ら
れる芽胞または成長能力のある細胞は溶原性であり、こ
れがさらに成長すると、それら細胞のいくつかはファー
ジを放出する。この培養液は新しい遊離のファージを蓄
積し、蓄積されたファージは、濾過によってその菌から
分離することができる。細胞自体は遊離ファージが感染
して溶菌することはない。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｏａｔｔｌｅｙａファージ溶原菌の凍結乾燥された芽胞
の１本の管ストックから次のようにしてファージが調製
できる。凍結乾燥された芽胞の管を無菌的に開封し、そ
の内容物を２５×１５０ｍｍの培養管に入れられている
１０ｍｌの殺菌ＹＣ肉汁中に懸濁する。そして４０乃至
５０ｒ．ｐ．ｍ．の回転速度で回転している組織培養ロ
ーラドラム内で３０℃の温度において６時間培養する。 その培養液を細孔サイズ０．４５ミクロンのフィルター
に通す。得られた懸濁物中のファージは保存可能であり
、上記と同様にして増殖させることができる。
ると、溶菌域内においてわずかながら菌増殖が観察され
る。それらの菌を取り出して芽胞化する。それらの芽胞
を汚染ファージを除くため洗滌し、希釈しそして単離コ
ロニーとして成長させる。このような純粋培養から得ら
れる芽胞または成長能力のある細胞は溶原性であり、こ
れがさらに成長すると、それら細胞のいくつかはファー
ジを放出する。この培養液は新しい遊離のファージを蓄
積し、蓄積されたファージは、濾過によってその菌から
分離することができる。細胞自体は遊離ファージが感染
して溶菌することはない。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｏａｔｔｌｅｙａファージ溶原菌の凍結乾燥された芽胞
の１本の管ストックから次のようにしてファージが調製
できる。凍結乾燥された芽胞の管を無菌的に開封し、そ
の内容物を２５×１５０ｍｍの培養管に入れられている
１０ｍｌの殺菌ＹＣ肉汁中に懸濁する。そして４０乃至
５０ｒ．ｐ．ｍ．の回転速度で回転している組織培養ロ
ーラドラム内で３０℃の温度において６時間培養する。 その培養液を細孔サイズ０．４５ミクロンのフィルター
に通す。得られた懸濁物中のファージは保存可能であり
、上記と同様にして増殖させることができる。
【００３５】Ｄ． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏａ
ｔｔｌｅｙａ からの染色体ＤＮＡの単離 約１０７ 芽胞を用いて接種を行なう。接種は二価陽イ
オンが添加されていない。ただしグリシン０．１％（ｗ
／ｖ）を加えた２５ｍｌのＹＣ肉汁を含有している２５
０ｍｌのバッフルつきエルレンマイヤーフラスコに対し
て行なう。このフラスコを２２０ｒ．ｐ．ｍ．シェーカ
ー［行程約５ｃｍ（２インチ）］にのせて３７℃で１６
時間振盪する。この時間で培養には十分である。遠心分
離によって細胞を集め、０．０９％（ｗ／ｖ）のＮａＣ
ｌの２５ｍｌで１回洗い、そして２５％（ｗ／ｖ）スク
ロースと５０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンを含有している溶液５ｍｌに再懸濁する。そ
の溶液は予め塩酸でｐＨ８．０に調整されていて、そし
てニワトリ卵白リソチームの最終濃度が２ｍｇ／ｍｌと
なるよう使用直前に添加されている。この混合物を３７
℃で１時間培養し、次いでＮａＯＨでｐＨ８に調整され
たエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム０．２５モ
ルを含有する溶液２．５ｍｌに加える。この混合物を氷
上に１５分間放置し、そして２．０％（ｗ／ｖ）のＮ−
ラウロイル−Ｎ−メチルグリシンを含有する溶液７．５
ｍｌを加える。さらに３０分間氷上に放置したのち、牛
のパンクレアチンリボヌクレアーゼＡを添加する（０．
１モル酢酸ナトリウム中５ｍｇ／ｍｌの溶液として０．
１５ｍｌ。この溶液は予め１００℃で１０分間加熱され
ていた）。次に新規に調製されたプロナーゼ（Ｐｒｏｎ
ａｓｅ（登録商標））溶液０．６ｍｌを添加する。この
溶液は、緩衝液Ｐに２５ｍｇ／ｍｌの量で溶解されたプ
ロナーゼを含有し、使用直前に３７℃で４５分間温めら
れた。なお緩衝液Ｐは５０ミリモルのＮａＣｌ、５０ミ
リモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウムおよ
び３０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンを含有しており、溶液は塩酸でｐＨ７．５に調整さ
れていた。上記の添加による混合物を３７℃で２時間培
養する。この溶菌液を３０分間で３回等容量のフェノー
ルで抽出する。フェノールは３回とも使用直前に０．２
モルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの溶液
（これは塩酸でｐＨ７．５に調整されていた）の等量で
平衡化して中和されていた。次にその溶菌液を等容量の
クロロホルムで１０回抽出し、そして１０分の１容量の
酢酸塩溶液と混合する（この溶液は酢酸ナトリウム３．
０モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム１．
０ミリモルを含有しており、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調
整されていた）。そのあと０．５４容量部のイソプロパ
ノールを添加する。ＤＮＡをガラスロッドに巻きつけて
回収し、そして０．１％（ｖ／ｖ）のジエチルピロカー
ボネートを含有する水５．０ｍｌに再溶解する。連続し
て２回以上同様方法で沈殿させる。但し、各回の沈殿後
に１０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンと１．０ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二
ナトリウムを含有する溶液５０ｍｌ（塩酸でｐＨ８．２
に調整したもの）に再溶解させる。
ｔｔｌｅｙａ からの染色体ＤＮＡの単離 約１０７ 芽胞を用いて接種を行なう。接種は二価陽イ
オンが添加されていない。ただしグリシン０．１％（ｗ
／ｖ）を加えた２５ｍｌのＹＣ肉汁を含有している２５
０ｍｌのバッフルつきエルレンマイヤーフラスコに対し
て行なう。このフラスコを２２０ｒ．ｐ．ｍ．シェーカ
ー［行程約５ｃｍ（２インチ）］にのせて３７℃で１６
時間振盪する。この時間で培養には十分である。遠心分
離によって細胞を集め、０．０９％（ｗ／ｖ）のＮａＣ
ｌの２５ｍｌで１回洗い、そして２５％（ｗ／ｖ）スク
ロースと５０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンを含有している溶液５ｍｌに再懸濁する。そ
の溶液は予め塩酸でｐＨ８．０に調整されていて、そし
てニワトリ卵白リソチームの最終濃度が２ｍｇ／ｍｌと
なるよう使用直前に添加されている。この混合物を３７
℃で１時間培養し、次いでＮａＯＨでｐＨ８に調整され
たエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム０．２５モ
ルを含有する溶液２．５ｍｌに加える。この混合物を氷
上に１５分間放置し、そして２．０％（ｗ／ｖ）のＮ−
ラウロイル−Ｎ−メチルグリシンを含有する溶液７．５
ｍｌを加える。さらに３０分間氷上に放置したのち、牛
のパンクレアチンリボヌクレアーゼＡを添加する（０．
１モル酢酸ナトリウム中５ｍｇ／ｍｌの溶液として０．
１５ｍｌ。この溶液は予め１００℃で１０分間加熱され
ていた）。次に新規に調製されたプロナーゼ（Ｐｒｏｎ
ａｓｅ（登録商標））溶液０．６ｍｌを添加する。この
溶液は、緩衝液Ｐに２５ｍｇ／ｍｌの量で溶解されたプ
ロナーゼを含有し、使用直前に３７℃で４５分間温めら
れた。なお緩衝液Ｐは５０ミリモルのＮａＣｌ、５０ミ
リモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウムおよ
び３０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンを含有しており、溶液は塩酸でｐＨ７．５に調整さ
れていた。上記の添加による混合物を３７℃で２時間培
養する。この溶菌液を３０分間で３回等容量のフェノー
ルで抽出する。フェノールは３回とも使用直前に０．２
モルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの溶液
（これは塩酸でｐＨ７．５に調整されていた）の等量で
平衡化して中和されていた。次にその溶菌液を等容量の
クロロホルムで１０回抽出し、そして１０分の１容量の
酢酸塩溶液と混合する（この溶液は酢酸ナトリウム３．
０モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム１．
０ミリモルを含有しており、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調
整されていた）。そのあと０．５４容量部のイソプロパ
ノールを添加する。ＤＮＡをガラスロッドに巻きつけて
回収し、そして０．１％（ｖ／ｖ）のジエチルピロカー
ボネートを含有する水５．０ｍｌに再溶解する。連続し
て２回以上同様方法で沈殿させる。但し、各回の沈殿後
に１０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンと１．０ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二
ナトリウムを含有する溶液５０ｍｌ（塩酸でｐＨ８．２
に調整したもの）に再溶解させる。
【００３６】Ｅ． ファージＴＧ１溶原菌のゲルトラ
ンスファーハイブリダイゼーション分析 適当な制限酵素によって消化されたＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動によって分離する。それらの断片を精製し
、変性し、そしてニトロセルロースペーパーに移す（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｏｈｕｅｌｌ，ＢＡ８
５）。精製したファージからのＤＮＡで放射線標識をつ
けた試料をつくり、この試料を熱で変性し、そして上記
のニトロセルロース上のＤＮＡとハイブリダイズさせる
。これはホルムアルデヒド、フイコル、牛血清アルブミ
ンおよびポリビニルピロリドンの存在且つ硫酸デキスト
ランの不存在下で４２℃で４８時間、実質的にＤａｖｉ
ｓ 等（前掲）により記載されているような仕方で実施
される。
ンスファーハイブリダイゼーション分析 適当な制限酵素によって消化されたＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動によって分離する。それらの断片を精製し
、変性し、そしてニトロセルロースペーパーに移す（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｏｈｕｅｌｌ，ＢＡ８
５）。精製したファージからのＤＮＡで放射線標識をつ
けた試料をつくり、この試料を熱で変性し、そして上記
のニトロセルロース上のＤＮＡとハイブリダイズさせる
。これはホルムアルデヒド、フイコル、牛血清アルブミ
ンおよびポリビニルピロリドンの存在且つ硫酸デキスト
ランの不存在下で４２℃で４８時間、実質的にＤａｖｉ
ｓ 等（前掲）により記載されているような仕方で実施
される。
【００３７】ファージＴＧ１の溶原性モードを決定する
ためには、ファージ制限地図が役立った。一般に、溶原
性ファージはプラスミドとして、あるいは宿主染色体内
への組込みによって溶原化する［Ａ．Ｍ．Ｃａｍｂｅｌ
ｌ； Ｔｈｅ ｅｐｉｓｏｍｅｓ． Ａｄｖ． Ｇｅｎ
ｅｔ．１１（１９６２年）第１０１〜１４５頁参照］。 溶原化のモードの知識はそのファージがＤＮＡベクター
として使用される予定である場合にはかなり重要なこと
である。適当な制限エンドヌクレアーゼで消化された溶
原性染色体ＤＮＡのゲルトランスファー分析によって、
いずれのモードの可能性があるかが判別される。そのフ
ァージがプラスミドとして溶原化する場合には、プロフ
ァージＤＮＡと増殖能力あるファージＤＮＡとの間の差
異は、その付着末端がプロファージでは共に結合される
ということのみである。そのファージが組込まれる場合
には、しかしながら、組込み部位が存在する特定制限断
片が欠けている。それは元の断片の両半分が染色体ＤＮ
Ａと融合することによって生じる２つの新しい断片によ
って置換されるからである。われわれの実験結果は、フ
ァージＴＧ１が Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａの染色体内へ組
込まれることを示している。酵素 Ｐｓｔ Ｉと Ｃｌ
ａ Ｉとが選択され、そのファージＤＮＡは実質的に２
つの領域に分割された。すなわち、２５ Ｋｂｐサイズ
の大きな１つの内部断片と、サイズ１６．３Ｋｂｐ の
、ｃｏｓ 断片と呼ばれているファージ付着末端を持つ
２つの断片が結合したことから結果する１つの断片とで
ある。結合する前の２つの断片のサイズはそれぞれ８．
４Ｋｂｐと７．９Ｋｂｐである。増殖能力のあるファー
ジからのＤＮＡ（０．０１μｇ）と溶原菌からの染色体
ＤＮＡ（１．０μｇ）とをそれら酵素で消化し、そして
アガロースゲル上で分離した。その制限パターンを上記
した放射線標識ファージＤＮＡとハイブリダイズして分
析した。非溶原菌からのＤＮＡはファージＤＮＡと相同
なシーケンスを含んでいなかった。ｃｏｓ 断片はその
溶原菌内に欠けており、そしてファージＤＮＡとハイブ
リダイズするサイズ１５ｋｂｐ と１１ｋｂｐ との２
つの新規な断片によって置換されていた。この結果は、
そのファージＤＮＡが宿主ＤＮＡ内へ組込まれたことを
示す。
ためには、ファージ制限地図が役立った。一般に、溶原
性ファージはプラスミドとして、あるいは宿主染色体内
への組込みによって溶原化する［Ａ．Ｍ．Ｃａｍｂｅｌ
ｌ； Ｔｈｅ ｅｐｉｓｏｍｅｓ． Ａｄｖ． Ｇｅｎ
ｅｔ．１１（１９６２年）第１０１〜１４５頁参照］。 溶原化のモードの知識はそのファージがＤＮＡベクター
として使用される予定である場合にはかなり重要なこと
である。適当な制限エンドヌクレアーゼで消化された溶
原性染色体ＤＮＡのゲルトランスファー分析によって、
いずれのモードの可能性があるかが判別される。そのフ
ァージがプラスミドとして溶原化する場合には、プロフ
ァージＤＮＡと増殖能力あるファージＤＮＡとの間の差
異は、その付着末端がプロファージでは共に結合される
ということのみである。そのファージが組込まれる場合
には、しかしながら、組込み部位が存在する特定制限断
片が欠けている。それは元の断片の両半分が染色体ＤＮ
Ａと融合することによって生じる２つの新しい断片によ
って置換されるからである。われわれの実験結果は、フ
ァージＴＧ１が Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａの染色体内へ組
込まれることを示している。酵素 Ｐｓｔ Ｉと Ｃｌ
ａ Ｉとが選択され、そのファージＤＮＡは実質的に２
つの領域に分割された。すなわち、２５ Ｋｂｐサイズ
の大きな１つの内部断片と、サイズ１６．３Ｋｂｐ の
、ｃｏｓ 断片と呼ばれているファージ付着末端を持つ
２つの断片が結合したことから結果する１つの断片とで
ある。結合する前の２つの断片のサイズはそれぞれ８．
４Ｋｂｐと７．９Ｋｂｐである。増殖能力のあるファー
ジからのＤＮＡ（０．０１μｇ）と溶原菌からの染色体
ＤＮＡ（１．０μｇ）とをそれら酵素で消化し、そして
アガロースゲル上で分離した。その制限パターンを上記
した放射線標識ファージＤＮＡとハイブリダイズして分
析した。非溶原菌からのＤＮＡはファージＤＮＡと相同
なシーケンスを含んでいなかった。ｃｏｓ 断片はその
溶原菌内に欠けており、そしてファージＤＮＡとハイブ
リダイズするサイズ１５ｋｂｐ と１１ｋｂｐ との２
つの新規な断片によって置換されていた。この結果は、
そのファージＤＮＡが宿主ＤＮＡ内へ組込まれたことを
示す。
【００３８】Ｆ． ファージ粒子の精製１皿または１
管のファージストックの試料１．０ｍｌを菌濃度１０７
ｏｆｕ／ｍｌ、温度３０℃のＹＣ肉汁１．０リットルに
加える。これを回転シェーカー上の２．０リットルフラ
スコ内で３０℃で１６時間培養する。シェーカーの行程
は約５センチ（２インチ）、そして回転速度は２２０ｒ
．ｐ．ｍ．であった。溶解物をガラスウールを通して濾
過して清澄化する。この溶解物は約１０９ｐｆｕ／ｍｌ
の内容を持つ。ＮａＣｌ ２０ｇとポリエチレングリ
コール（平均分子量６０００）を加えてファージを沈殿
させる。攪拌して添加物を溶解させたのち、この混合物
を攪拌しないで一晩４℃で放置する。ファージを低速遠
心分離によって沈殿させる。ペレット状になった物質を
再び１０ｍｌのＳＭ緩衝液に溶解する。ＳＭ緩衝液はＮ
ａＣｌ ０．５％（ｗ／ｖ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン２０ミリモル、ゼラチン０．０１％
、ＭｇＣｌ２ １０ミリモル、ＣａＣｌ２ ５ミリモル
を含有し、その全体は塩酸でｐＨ７．５に調整されてい
た。
管のファージストックの試料１．０ｍｌを菌濃度１０７
ｏｆｕ／ｍｌ、温度３０℃のＹＣ肉汁１．０リットルに
加える。これを回転シェーカー上の２．０リットルフラ
スコ内で３０℃で１６時間培養する。シェーカーの行程
は約５センチ（２インチ）、そして回転速度は２２０ｒ
．ｐ．ｍ．であった。溶解物をガラスウールを通して濾
過して清澄化する。この溶解物は約１０９ｐｆｕ／ｍｌ
の内容を持つ。ＮａＣｌ ２０ｇとポリエチレングリ
コール（平均分子量６０００）を加えてファージを沈殿
させる。攪拌して添加物を溶解させたのち、この混合物
を攪拌しないで一晩４℃で放置する。ファージを低速遠
心分離によって沈殿させる。ペレット状になった物質を
再び１０ｍｌのＳＭ緩衝液に溶解する。ＳＭ緩衝液はＮ
ａＣｌ ０．５％（ｗ／ｖ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン２０ミリモル、ゼラチン０．０１％
、ＭｇＣｌ２ １０ミリモル、ＣａＣｌ２ ５ミリモル
を含有し、その全体は塩酸でｐＨ７．５に調整されてい
た。
【００３９】５分間２５００×ｇの遠心分離にかけて上
記懸濁物を清澄化する。その上澄み液を新しい遠心管に
入れ、そしてＳＭ緩衝液中下記量のＣｓＣｌの溶液各２
．０ｍｌを下に重層する。即ち密度１．３ｇ／ｍｌ、１
．５ｇ／ｍｌ、および１．７ｇ／ｍｌである。この管を
１０℃で１．５時間ベックマン６０Ｔｉロータを用い５
００００ｒ．ｐ．ｍ．の回転速度（平均回転遠心力１８
００００×ｇ）で遠心分離する。ファージ粒子は、底の
２つの層の間の界面に濁った帯域として可視となる。 この帯域の物質をピペットで取り、最終体積１０ｍｌを
与えるのに十分な量の密度１．５ｇ／ｍｌのＳＭ緩衝液
中ＣｓＣｌの溶液と混合し、そしてベックマン８０Ｔｉ
ロータにより４００００ ｒ．ｐ．ｍ．（平均回転遠心
力１１００００×ｇ）、温度１０℃で１６時間遠心分離
する。ファージは再び管の真中近くに１つの濁ったバン
ドとして可視となる。これをピペットで採集し、そのフ
ァージ懸濁物を各バッチ２．０リットルのバッファー液
に対して順次透析する。使用バッファー液はトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン２０ミリモル、ＭｇＣｌ
２１０ミリモル、ＣａＣｌ２ ５ミリモルを含有し、
塩酸でｐＨ７．５に調整された溶液にＮａＣｌをそれぞ
れ１．０モル、０．３モル、０．１モル、０．０１モル
溶解させたものである。
記懸濁物を清澄化する。その上澄み液を新しい遠心管に
入れ、そしてＳＭ緩衝液中下記量のＣｓＣｌの溶液各２
．０ｍｌを下に重層する。即ち密度１．３ｇ／ｍｌ、１
．５ｇ／ｍｌ、および１．７ｇ／ｍｌである。この管を
１０℃で１．５時間ベックマン６０Ｔｉロータを用い５
００００ｒ．ｐ．ｍ．の回転速度（平均回転遠心力１８
００００×ｇ）で遠心分離する。ファージ粒子は、底の
２つの層の間の界面に濁った帯域として可視となる。 この帯域の物質をピペットで取り、最終体積１０ｍｌを
与えるのに十分な量の密度１．５ｇ／ｍｌのＳＭ緩衝液
中ＣｓＣｌの溶液と混合し、そしてベックマン８０Ｔｉ
ロータにより４００００ ｒ．ｐ．ｍ．（平均回転遠心
力１１００００×ｇ）、温度１０℃で１６時間遠心分離
する。ファージは再び管の真中近くに１つの濁ったバン
ドとして可視となる。これをピペットで採集し、そのフ
ァージ懸濁物を各バッチ２．０リットルのバッファー液
に対して順次透析する。使用バッファー液はトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン２０ミリモル、ＭｇＣｌ
２１０ミリモル、ＣａＣｌ２ ５ミリモルを含有し、
塩酸でｐＨ７．５に調整された溶液にＮａＣｌをそれぞ
れ１．０モル、０．３モル、０．１モル、０．０１モル
溶解させたものである。
【００４０】Ｇ． ファージＤＮＡの製造本ＤＮＡは
、精製されたファージ粒子から標準的ないくつかの方法
によって製造することができる。そのうちの２つの方法
をここに述べる。 方法１． 再蒸留されたフェノールを続けて３回、塩
酸でｐＨ８に調整した０．２モルのトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンの１．０容量で平衡化する。平衡
化されたフェノールの等容量をファージ懸濁物に加え、
そして３０分間管の上下をくり返し反転させて２相を混
合する。フェノール（下層）をピペットで除去する。こ
のフェノール抽出を２回くり返す。水性相を等容量のエ
ーテルで３回抽出する。ピペットで除去できないエーテ
ルを放置して蒸発させる。酢酸でｐＨ６．５に調整され
た３．０モルの酢酸ナトリウム溶液を１０分の１の容量
だけ添加し、次いで２倍容量の２００プルーフエタノー
ルを添加する。エタノールを水性相と混ぜ合わせると沈
殿したＤＮＡが可視となる。このＤＮＡを１３０００×
ｇで１０分間遠心分離にかけて回収する。上澄みを傾瀉
し、そのペレットを７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗
い、そして残存液体を窒素ガス流で蒸発させる。このＤ
ＮＡを少量のＴＥに再溶解する。ＴＥはトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン１０ミリモルとエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム１．０ミリモルとを含有す
るものであり、塩酸でｐＨ７．８に調整される。精製し
たＤＮＡを４℃または−７０℃で貯蔵する。
、精製されたファージ粒子から標準的ないくつかの方法
によって製造することができる。そのうちの２つの方法
をここに述べる。 方法１． 再蒸留されたフェノールを続けて３回、塩
酸でｐＨ８に調整した０．２モルのトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンの１．０容量で平衡化する。平衡
化されたフェノールの等容量をファージ懸濁物に加え、
そして３０分間管の上下をくり返し反転させて２相を混
合する。フェノール（下層）をピペットで除去する。こ
のフェノール抽出を２回くり返す。水性相を等容量のエ
ーテルで３回抽出する。ピペットで除去できないエーテ
ルを放置して蒸発させる。酢酸でｐＨ６．５に調整され
た３．０モルの酢酸ナトリウム溶液を１０分の１の容量
だけ添加し、次いで２倍容量の２００プルーフエタノー
ルを添加する。エタノールを水性相と混ぜ合わせると沈
殿したＤＮＡが可視となる。このＤＮＡを１３０００×
ｇで１０分間遠心分離にかけて回収する。上澄みを傾瀉
し、そのペレットを７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗
い、そして残存液体を窒素ガス流で蒸発させる。このＤ
ＮＡを少量のＴＥに再溶解する。ＴＥはトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン１０ミリモルとエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム１．０ミリモルとを含有す
るものであり、塩酸でｐＨ７．８に調整される。精製し
たＤＮＡを４℃または−７０℃で貯蔵する。
【００４１】方法２． ファージ懸濁液を５分の１容
量のトリス（ヒデロキシメチル）アミノメタン０．５モ
ルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム０．２５
モルとを含有し、塩酸でｐＨ８．０に調整された溶液に
混合する。１／５０００容量のジエチルピロカーボネー
トを添加する。この混合物を３７℃で１時間培養する。 等容量のホルムアミドを加える。この時に完全なファー
ジ粒子による濁りが消え、溶液はＤＮＡの放出のために
粘性となる。透析によってファージ懸濁物からＣｓＣｌ
が除去されていない場合には最初の水溶液と等容量の水
をホルムアミド含有混合物に加える。ＤＮＡを沈殿させ
るために、この溶液を２倍容量の２００プルーフエタノ
ールと混合する。沈殿したＤＮＡを回収して上記方法１
の場合と同様に貯蔵する。純度はやや乏しいが、しかし
制限分析（Ｈ項）、トランスフェクション（Ｊ項）また
はトランスフォーメーション（Ｋ項）のために使用でき
るファージＤＮＡもこの方法によって、ベックマン８０
Ｔｉロータの４５０００ｒ．ｐ．ｍ．（平均回転遠心力
１５００００×ｇ）で３時間遠心分離することにより管
内溶菌物から採集されたファージから製造できる。この
ファージペレットを０．２ミリモルのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノエタンと２５ミリモルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸塩とを含み、予め塩酸でｐＨ８．５に調
整された溶液０．５ｍｌに懸濁させる。この懸濁物に直
接的にジエチルピロカーボネートを加える。上記と同様
に単離されたＤＮＡを、牛のパンクレアチンリボヌクレ
アーゼＡを最終濃度１０μｇ／ｍｌの量で添加して７２
℃で１０分間加熱する。そして上記のように貯蔵する。
量のトリス（ヒデロキシメチル）アミノメタン０．５モ
ルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム０．２５
モルとを含有し、塩酸でｐＨ８．０に調整された溶液に
混合する。１／５０００容量のジエチルピロカーボネー
トを添加する。この混合物を３７℃で１時間培養する。 等容量のホルムアミドを加える。この時に完全なファー
ジ粒子による濁りが消え、溶液はＤＮＡの放出のために
粘性となる。透析によってファージ懸濁物からＣｓＣｌ
が除去されていない場合には最初の水溶液と等容量の水
をホルムアミド含有混合物に加える。ＤＮＡを沈殿させ
るために、この溶液を２倍容量の２００プルーフエタノ
ールと混合する。沈殿したＤＮＡを回収して上記方法１
の場合と同様に貯蔵する。純度はやや乏しいが、しかし
制限分析（Ｈ項）、トランスフェクション（Ｊ項）また
はトランスフォーメーション（Ｋ項）のために使用でき
るファージＤＮＡもこの方法によって、ベックマン８０
Ｔｉロータの４５０００ｒ．ｐ．ｍ．（平均回転遠心力
１５００００×ｇ）で３時間遠心分離することにより管
内溶菌物から採集されたファージから製造できる。この
ファージペレットを０．２ミリモルのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノエタンと２５ミリモルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸塩とを含み、予め塩酸でｐＨ８．５に調
整された溶液０．５ｍｌに懸濁させる。この懸濁物に直
接的にジエチルピロカーボネートを加える。上記と同様
に単離されたＤＮＡを、牛のパンクレアチンリボヌクレ
アーゼＡを最終濃度１０μｇ／ｍｌの量で添加して７２
℃で１０分間加熱する。そして上記のように貯蔵する。
【００４２】Ｈ． ファージＤＮＡの制限分析ＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼの種々の組合わせで制限切断
し、そしてそれらの制限生成物を実質的に Ｄａｖｉｓ
等（上掲）により記載された方法によりアガロースゲ
ル電気泳動によって分析した。結果は、ファージＴＧ１
核酸が付着末端を持つ長さ４１．４７キロ塩基対（ｋｐ
ｂ）の線形二本鎖ＤＮＡ分子よりなることを示した。下
記の酵素はこのＤＮＡを開裂させることができない：Ｂ
ａｍＨ Ｉ，Ｎａｅ Ｉ，Ｎａｒ Ｉ，Ｐｖｕ Ｉ，Ｓ
ｓｔ Ｉ，Ｓｓｔ ＩＩ，Ｓｔｕ Ｉ，ＸｈｏＩ。下記
の酵素は複数部位において、このＤＮＡを開裂させる：
Ｂｇｌ Ｉ，ＢｓｔＥ ＩＩ，ＨｇｉＡ Ｉ，Ｈｐｈ
Ｉ，Ｍｂｏ ＩＩ，Ｓａｌ Ｉ，Ｘｍａ ＩＩＩ，Ｘｏ
ｒＩＩ，Ｎｒｕ Ｉ，Ｐｖｕ Ｉ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｂｃ
ｌ Ｉ，Ｂｇｌ ＩＩ，Ｂａｌ Ｉ，Ｋｐｎ Ｉ，Ｈｐ
ａ Ｉ，Ｓｐｈ，Ａｖａ Ｉ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ。下記
酵素はただ１つの部位において、そのＤＮＡを開裂する
：Ｐｓｔ Ｉ，Ｘｂａ Ｉ，Ｃｌａ Ｉ，Ｓｍａ Ｉ。 これら酵素のいくつかの場合にもたらされた制限パター
ンが第２図に示されている。
を制限エンドヌクレアーゼの種々の組合わせで制限切断
し、そしてそれらの制限生成物を実質的に Ｄａｖｉｓ
等（上掲）により記載された方法によりアガロースゲ
ル電気泳動によって分析した。結果は、ファージＴＧ１
核酸が付着末端を持つ長さ４１．４７キロ塩基対（ｋｐ
ｂ）の線形二本鎖ＤＮＡ分子よりなることを示した。下
記の酵素はこのＤＮＡを開裂させることができない：Ｂ
ａｍＨ Ｉ，Ｎａｅ Ｉ，Ｎａｒ Ｉ，Ｐｖｕ Ｉ，Ｓ
ｓｔ Ｉ，Ｓｓｔ ＩＩ，Ｓｔｕ Ｉ，ＸｈｏＩ。下記
の酵素は複数部位において、このＤＮＡを開裂させる：
Ｂｇｌ Ｉ，ＢｓｔＥ ＩＩ，ＨｇｉＡ Ｉ，Ｈｐｈ
Ｉ，Ｍｂｏ ＩＩ，Ｓａｌ Ｉ，Ｘｍａ ＩＩＩ，Ｘｏ
ｒＩＩ，Ｎｒｕ Ｉ，Ｐｖｕ Ｉ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｂｃ
ｌ Ｉ，Ｂｇｌ ＩＩ，Ｂａｌ Ｉ，Ｋｐｎ Ｉ，Ｈｐ
ａ Ｉ，Ｓｐｈ，Ａｖａ Ｉ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ。下記
酵素はただ１つの部位において、そのＤＮＡを開裂する
：Ｐｓｔ Ｉ，Ｘｂａ Ｉ，Ｃｌａ Ｉ，Ｓｍａ Ｉ。 これら酵素のいくつかの場合にもたらされた制限パター
ンが第２図に示されている。
【００４３】
Ｉ． ファージＴＧ１の欠失突然変異体の単離欠失突
然変異体はＤＮＡのクローニングのために特に役立つ。 １個のファージ粒子内にパッケージしうるＤＮＡの量は
限度がある。ファージＤＮＡの一部の欠失は、その欠失
サイズに等しい付加的量のＤＮＡをそのファージに挿入
できるスペースを与える。また、欠失によって、そのフ
ァージゲノムのどの部分が必要不可欠でないか、すなわ
ちどの部分がＤＮＡ挿入のために適当かが判明する。他
の領域への挿入はおそらくファージの機能に必要な遺伝
子をこわすであろう。突然変異体はキレート剤に耐性の
あるファージ変種を単離するために一般に使用されてい
る技術（前記参考文献８参照）によって得られた。ファ
ージ粒子の安定性のためにはマグネシウムイオンが必要
である。もしＭｇ＋＋がキレート剤（この場合ではエチ
レンジアミンテトラ酢酸塩）の添加によって有効的に除
去されると、生きたファージの個数は急速に減少する。 ファージゲノムの幾分かの欠失に由来する突然変異のた
めに、より短いＤＮＡ分子を含むファージ粒子はＭｇ＋
＋の不存在でもより安定であり、生き残る。
然変異体はＤＮＡのクローニングのために特に役立つ。 １個のファージ粒子内にパッケージしうるＤＮＡの量は
限度がある。ファージＤＮＡの一部の欠失は、その欠失
サイズに等しい付加的量のＤＮＡをそのファージに挿入
できるスペースを与える。また、欠失によって、そのフ
ァージゲノムのどの部分が必要不可欠でないか、すなわ
ちどの部分がＤＮＡ挿入のために適当かが判明する。他
の領域への挿入はおそらくファージの機能に必要な遺伝
子をこわすであろう。突然変異体はキレート剤に耐性の
あるファージ変種を単離するために一般に使用されてい
る技術（前記参考文献８参照）によって得られた。ファ
ージ粒子の安定性のためにはマグネシウムイオンが必要
である。もしＭｇ＋＋がキレート剤（この場合ではエチ
レンジアミンテトラ酢酸塩）の添加によって有効的に除
去されると、生きたファージの個数は急速に減少する。 ファージゲノムの幾分かの欠失に由来する突然変異のた
めに、より短いＤＮＡ分子を含むファージ粒子はＭｇ＋
＋の不存在でもより安定であり、生き残る。
【００４４】ファージＴＧ１の欠失突然変異体を得るた
め、ＫＯＨでｐＨ６．５に調整した１．０モルの２−（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸０．１０ｍｌと、Ｎ
ａＯＨでｐＨ７に調整した０．５０モルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム０．１０ｍｌとをファージ
の平板または管ストックの１．０ｍｌと混合する。この
混合物を３７℃で３０分間培養する。ついで、これを２
５ｍｌのＹＣ肉汁と０．１０ｍｌの菌とを含有している
２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに添加する。 時としてはファージの増殖を促進するため５ミリモルの
ＨＣｌ中ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｍｌの溶液
を０．５０ｍｌ添加することが必要である。これの必要
性はＹＣ肉汁の特定バッチの種類による。このフラスコ
を１４０ｒ．ｐ．ｍ．のシェーカー［行程約５センチ（
２インチ）］上で３０℃において１６時間振盪する。一
晩培養したのち得られた溶菌液を０．４５ミクロンの細
孔サイズを持つフィルターに通して濾過し、そして生き
ているファージの濃度を判定する。もしこれが１０７ｐ
ｔｕ／ｍｌ以上であった場合には、エチレンジアミンテ
トラ酢酸塩による処理ならびにそれに続くファージの培
養をくり返す。エチレンジアミンテトラ酢酸塩の第１回
目の処理でｐｆｕ／ｍｌ濃度は約１０４乃至１０５倍低
下する。その後の処理によるｐｆｕ／ｍｌの減少度は段
々と低くなる。通常この処理を３回くり返す。最後の処
理終了後に単一プラークから増殖させたファージのＤＮ
Ａを精製し、そして制限エンドヌクレアーゼによる消化
によって分析する。クローンファージの多くはそれらの
ＤＮＡの一部が欠失されてしまっている。かかる欠失フ
ァージの制限分析により少なくとも４つの型のファージ
欠失種が生じたことが判明する。例えばファージＴＧ２
，ＴＧ３，ＴＧ４，ＴＧ５（第３図参照）である。これ
らのファージＤＮＡ分子について酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
， ＫｐｎＩ，Ｐｓｔ Ｉ，Ｓｐｈ Ｉ の制限部位の
存否を調べた。 ファージＴＧ２はＤＮＡの２．０ｋｂｐの欠失を持ち、
これにより６．７２ｋｂｐ位置の Ｓｐｈ Ｉ部位、７
．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ Ｉ部位および７．９９ｋｂ
ｐ位置のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位が取り去られている。フ
ァージＴＧ３は２．５ｋｂｐのＤＮＡの欠失を持ち、７
．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ Ｉ部位、７．９９ｋｂｐ位
置のＨｉｎｄ ＩＩＩ 部位および８．３８ｋｂｐ位置
のＰｓｔ Ｉ 部位が取り去られている。ファージＴＧ
４は２．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、６．７２ｋｂｐ
位置のＳｐｈ Ｉ部位、７．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ
Ｉ部位および８．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔ Ｉ部位が取
り去られている。 これらのファージを放出する能力を持つ Ｓ．ｃａｔｔ
ｌｅｙａ ＮＲＲＬ８０５７の溶原菌は前記表Ｉに記載
したようにファージＴＧ２を放出するものは菌株ＡＴＣ
Ｃ３９０７７（ＭＡ５７６６）として、ファージＴＧ４
を放出するものは菌株ＮＲＲＬ １５０３４（ＭＡ５
７６９）として、ファージＴＧ５を放出するものは菌株
ＮＲＲＬ １５０３５（ＭＡ５７７０）として寄託さ
れている。多分、他の型の欠失突然変異体も同様にして
得られ、そしてそれらは有用性を持っているであろう。 第３図はこれらファージのそれぞれにおいて欠失された
ＴＧ１ゲノム部分を示す図である。第３図に示した欠失
突然変異体のすべては溶原菌形成能力がある。偶発的に
得られたすべての欠失突然変異体について同じことが言
えるとは限らない。第３図に示したファージ内のＤＮＡ
欠失域はそのファージの細胞溶解性機能にも溶原性機能
にも必要ない領域である。これら欠失のうち２つはファ
ージゲノムの単一Ｐｓｔ Ｉ部位を取り去ってしまって
いる。ファージの機能に影響を与えることなしにこの部
位に外来ＤＮＡが挿入可能であり、したがって、この部
位はクローンされるべきＤＮＡの挿入のために有用な部
位であることが判明している（Ｍ項参照）。欠失型のう
ちの２つはＰｓｔ Ｉ部位を手つけずに残している。こ
れらのＤＮＡ分子はクローンされるべきＤＮＡの挿入の
ために格別に有用である。Ｐｓｔ Ｉのための部位以外
の他の部位もまたＤＮＡのクローニングのために役立つ
ことが判明する可能性は大きい。
め、ＫＯＨでｐＨ６．５に調整した１．０モルの２−（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸０．１０ｍｌと、Ｎ
ａＯＨでｐＨ７に調整した０．５０モルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム０．１０ｍｌとをファージ
の平板または管ストックの１．０ｍｌと混合する。この
混合物を３７℃で３０分間培養する。ついで、これを２
５ｍｌのＹＣ肉汁と０．１０ｍｌの菌とを含有している
２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに添加する。 時としてはファージの増殖を促進するため５ミリモルの
ＨＣｌ中ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｍｌの溶液
を０．５０ｍｌ添加することが必要である。これの必要
性はＹＣ肉汁の特定バッチの種類による。このフラスコ
を１４０ｒ．ｐ．ｍ．のシェーカー［行程約５センチ（
２インチ）］上で３０℃において１６時間振盪する。一
晩培養したのち得られた溶菌液を０．４５ミクロンの細
孔サイズを持つフィルターに通して濾過し、そして生き
ているファージの濃度を判定する。もしこれが１０７ｐ
ｔｕ／ｍｌ以上であった場合には、エチレンジアミンテ
トラ酢酸塩による処理ならびにそれに続くファージの培
養をくり返す。エチレンジアミンテトラ酢酸塩の第１回
目の処理でｐｆｕ／ｍｌ濃度は約１０４乃至１０５倍低
下する。その後の処理によるｐｆｕ／ｍｌの減少度は段
々と低くなる。通常この処理を３回くり返す。最後の処
理終了後に単一プラークから増殖させたファージのＤＮ
Ａを精製し、そして制限エンドヌクレアーゼによる消化
によって分析する。クローンファージの多くはそれらの
ＤＮＡの一部が欠失されてしまっている。かかる欠失フ
ァージの制限分析により少なくとも４つの型のファージ
欠失種が生じたことが判明する。例えばファージＴＧ２
，ＴＧ３，ＴＧ４，ＴＧ５（第３図参照）である。これ
らのファージＤＮＡ分子について酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
， ＫｐｎＩ，Ｐｓｔ Ｉ，Ｓｐｈ Ｉ の制限部位の
存否を調べた。 ファージＴＧ２はＤＮＡの２．０ｋｂｐの欠失を持ち、
これにより６．７２ｋｂｐ位置の Ｓｐｈ Ｉ部位、７
．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ Ｉ部位および７．９９ｋｂ
ｐ位置のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位が取り去られている。フ
ァージＴＧ３は２．５ｋｂｐのＤＮＡの欠失を持ち、７
．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ Ｉ部位、７．９９ｋｂｐ位
置のＨｉｎｄ ＩＩＩ 部位および８．３８ｋｂｐ位置
のＰｓｔ Ｉ 部位が取り去られている。ファージＴＧ
４は２．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、６．７２ｋｂｐ
位置のＳｐｈ Ｉ部位、７．９３ｋｂｐ位置のＫｐｎ
Ｉ部位および８．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔ Ｉ部位が取
り去られている。 これらのファージを放出する能力を持つ Ｓ．ｃａｔｔ
ｌｅｙａ ＮＲＲＬ８０５７の溶原菌は前記表Ｉに記載
したようにファージＴＧ２を放出するものは菌株ＡＴＣ
Ｃ３９０７７（ＭＡ５７６６）として、ファージＴＧ４
を放出するものは菌株ＮＲＲＬ １５０３４（ＭＡ５
７６９）として、ファージＴＧ５を放出するものは菌株
ＮＲＲＬ １５０３５（ＭＡ５７７０）として寄託さ
れている。多分、他の型の欠失突然変異体も同様にして
得られ、そしてそれらは有用性を持っているであろう。 第３図はこれらファージのそれぞれにおいて欠失された
ＴＧ１ゲノム部分を示す図である。第３図に示した欠失
突然変異体のすべては溶原菌形成能力がある。偶発的に
得られたすべての欠失突然変異体について同じことが言
えるとは限らない。第３図に示したファージ内のＤＮＡ
欠失域はそのファージの細胞溶解性機能にも溶原性機能
にも必要ない領域である。これら欠失のうち２つはファ
ージゲノムの単一Ｐｓｔ Ｉ部位を取り去ってしまって
いる。ファージの機能に影響を与えることなしにこの部
位に外来ＤＮＡが挿入可能であり、したがって、この部
位はクローンされるべきＤＮＡの挿入のために有用な部
位であることが判明している（Ｍ項参照）。欠失型のう
ちの２つはＰｓｔ Ｉ部位を手つけずに残している。こ
れらのＤＮＡ分子はクローンされるべきＤＮＡの挿入の
ために格別に有用である。Ｐｓｔ Ｉのための部位以外
の他の部位もまたＤＮＡのクローニングのために役立つ
ことが判明する可能性は大きい。
【００４５】Ｊ． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａ
ｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２９７トランスフェクション トランスフェクションは下記方法で実施される。遠心分
離によって菌を採集し、そして約１０１０ｃｆｕ／ｍｌ
で２．０ｍｌのＰＭＣ２０に懸濁する。ＰＭＣ２０はス
クロース２００ｇ、Ｋ２ＳＯ４ ０．２５ｇ、ＭｇＣｌ
２・６Ｈ２Ｏ ２．０ｇおよび微量元素液２．０ｍｌ
を最終体積が１．０リットルとなるよう水に溶解し、オ
ートクレーブ後に２．５モルＣａＣｌ２ １０ｍｌおよ
びＫＯＨでｐＨ６．０に調整した１．０モル２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸と０．５％（ｗ／ｖ）Ｋ
Ｈ２ＰＯ４の溶液１０ｍｌを１リットルにつき添加する
ことによって調整される。微量元素液は１リットルにつ
きＺｎＣｌ２を４０ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを２０
０ｍｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１０ｍｇ、ＭｎＣｌ２
・２Ｈ２Ｏを１０ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏを
１０ｍｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを１０
ｍｇ含有する。上記の菌懸濁物にニワトリ卵白リゾチー
ム２．０ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌＰＭＣ２０）を加える。こ
の混合物を３７℃で９０分間培養し、その後で２５００
×ｇの遠心分離に５分間かけてプロトプラストを集める
。このペレットをＰＭＣ２０の４．０ｍｌに再懸濁して
氷上に保持する。ＤＮＡのサンプル、たとえばベクター
ＤＮＡを１マイクロリットル当り０．２５μｇ含有して
いるＤＮＡサンプル２０μｌを等容量のヘパリン溶液（
シグマ、ナトリウム塩、２倍濃縮したＰＭＣ２０の１ｍ
ｌにつき５ｍｇ）と混合し、そしてＰＭＣ２０の２４０
μｌを添加し、次いでＰＭＣ２０に溶解した２８％（Ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ、平均分子量１
０００）１．５０ｍｌを添加する。この混合物を室温で
１０分間培養する。０．７ｍｌの試料を取ってＲＭ軟寒
天１０ｍｌおよびＰＭＣ２０の１ｍｌ当り１０７ｃｆｕ
の濃度のＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ の芽胞０．２ｍｌと混
合し、そして直ちに四角（１００×１５ｍｍ）のペトリ
皿に注入する。この皿にはＲＭ寒天約６０ｍｌが入って
いる。なお、ＲＭはスクロース２００ｇ、Ｋ２ＳＯ４
０．２５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １０ｇ、Ｄ−グ
ルコース１０ｇ、ディフコカサミノ酸類０．１ｇ、デイ
フコオートミール寒天３．５ｇ、微量元素液２．０ｍｌ
、Ｌ−プロリン３ｇ、ディフコイースト抽出物２ｇおよ
び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸１．９５ｇ
を含有しており、これらは水の中で十分に混合され、Ｋ
ＯＨでｐＨ６．０に調整され、１．０リットルまで希釈
されてオートクレーブで煮られた。オートクレーブで煮
たのち、１リットルにつき８．０ｍｌの２．５モルＣａ
Ｃｌ２と１０ｍｌの０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４
が添加された。ＲＭ寒天は２．０％（ｗ／ｖ）のディフ
コ寒天で固めたＲＭのことである。ＲＭ軟寒天とは温度
４６℃で０．６％（ｗ／ｖ）溶融ディフコ寒天を含んで
いるＲＭである。軟寒天の上掛けが固まったのち、皿を
２８℃で２日間培養する。ファージは菌溶解域から単離
され、そして増殖される。
ｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２９７トランスフェクション トランスフェクションは下記方法で実施される。遠心分
離によって菌を採集し、そして約１０１０ｃｆｕ／ｍｌ
で２．０ｍｌのＰＭＣ２０に懸濁する。ＰＭＣ２０はス
クロース２００ｇ、Ｋ２ＳＯ４ ０．２５ｇ、ＭｇＣｌ
２・６Ｈ２Ｏ ２．０ｇおよび微量元素液２．０ｍｌ
を最終体積が１．０リットルとなるよう水に溶解し、オ
ートクレーブ後に２．５モルＣａＣｌ２ １０ｍｌおよ
びＫＯＨでｐＨ６．０に調整した１．０モル２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸と０．５％（ｗ／ｖ）Ｋ
Ｈ２ＰＯ４の溶液１０ｍｌを１リットルにつき添加する
ことによって調整される。微量元素液は１リットルにつ
きＺｎＣｌ２を４０ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを２０
０ｍｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１０ｍｇ、ＭｎＣｌ２
・２Ｈ２Ｏを１０ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏを
１０ｍｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを１０
ｍｇ含有する。上記の菌懸濁物にニワトリ卵白リゾチー
ム２．０ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌＰＭＣ２０）を加える。こ
の混合物を３７℃で９０分間培養し、その後で２５００
×ｇの遠心分離に５分間かけてプロトプラストを集める
。このペレットをＰＭＣ２０の４．０ｍｌに再懸濁して
氷上に保持する。ＤＮＡのサンプル、たとえばベクター
ＤＮＡを１マイクロリットル当り０．２５μｇ含有して
いるＤＮＡサンプル２０μｌを等容量のヘパリン溶液（
シグマ、ナトリウム塩、２倍濃縮したＰＭＣ２０の１ｍ
ｌにつき５ｍｇ）と混合し、そしてＰＭＣ２０の２４０
μｌを添加し、次いでＰＭＣ２０に溶解した２８％（Ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ、平均分子量１
０００）１．５０ｍｌを添加する。この混合物を室温で
１０分間培養する。０．７ｍｌの試料を取ってＲＭ軟寒
天１０ｍｌおよびＰＭＣ２０の１ｍｌ当り１０７ｃｆｕ
の濃度のＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ の芽胞０．２ｍｌと混
合し、そして直ちに四角（１００×１５ｍｍ）のペトリ
皿に注入する。この皿にはＲＭ寒天約６０ｍｌが入って
いる。なお、ＲＭはスクロース２００ｇ、Ｋ２ＳＯ４
０．２５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １０ｇ、Ｄ−グ
ルコース１０ｇ、ディフコカサミノ酸類０．１ｇ、デイ
フコオートミール寒天３．５ｇ、微量元素液２．０ｍｌ
、Ｌ−プロリン３ｇ、ディフコイースト抽出物２ｇおよ
び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸１．９５ｇ
を含有しており、これらは水の中で十分に混合され、Ｋ
ＯＨでｐＨ６．０に調整され、１．０リットルまで希釈
されてオートクレーブで煮られた。オートクレーブで煮
たのち、１リットルにつき８．０ｍｌの２．５モルＣａ
Ｃｌ２と１０ｍｌの０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４
が添加された。ＲＭ寒天は２．０％（ｗ／ｖ）のディフ
コ寒天で固めたＲＭのことである。ＲＭ軟寒天とは温度
４６℃で０．６％（ｗ／ｖ）溶融ディフコ寒天を含んで
いるＲＭである。軟寒天の上掛けが固まったのち、皿を
２８℃で２日間培養する。ファージは菌溶解域から単離
され、そして増殖される。
【００４６】Ｋ． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２ＲＲ−１のトランスフォーメーション ＤＮＡの取込みにコンピテントとなったＥ・ｃｏｌｉ細
胞が下記方法によって得られる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＲＲ−１［Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ
、 Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｑｕｅｒｚ、Ｍ． Ｃ．Ｂｅｔ
ｌａｃｈ、 Ｈ． Ｗ． Ｂｏｙｅｒ の論文、２ Ｇ
ｅｎｅ、第７５〜９３頁（１９７７年）参照］は、培地
ＬＢ２５０ｍｌ中、３７℃の温度で指数関数的に増殖す
る。ＬＢは蒸留水１リットル中にバクト−トリプトン１
０ｇ、バクト−イースト抽出物５ｇおよびＮａＣｌ ５
ｇを含有するものである。細胞濃度が２×１０８ｃｆｕ
／ｍｌに達したらその培養物を氷の温度まで１５分間冷
却し、しかるのち４℃で遠心分離（６０００ｘｇ、５分
間）により細胞を集める。上澄み液を傾瀉し、そして細
胞を氷冷した０．１モルＣａＣｌ２溶液１２５ｍｌで懸
濁する。この細胞懸濁物を１５分間氷の上に保持する。 再び遠心分離によって細胞を集め、氷冷０．１モルＣａ
Ｃｌ２ ２５ｍｌに懸濁し、そしてさらに１５分間氷上
に保持する。この細胞懸濁物に０．１モルＣａＣｌ中４
０％（ｗ／ｖ）グリセリンを含む氷冷溶液（１５ｍｌ）
を混合する。これは−７０℃で貯蔵しておくこともでき
るし、また直接使用することもできる。ＤＮＡ（ＴＥ３
０μｌ中約０．１乃至１．０μｇ）を、５０ミリモルＮ
ａＣｌ、５ミリモル クエン酸ナトリウム、６７ミリモ
ルＣａＣｌ２を含有する溶液１００μｌと混合する。次
に細胞懸濁物（０．２０ｍｌ）を加え、そしてこの混合
物を４５分乃至１時間氷上においておく。培養液ＬＢ（
４．０ｍｌ）を加え、振盪しながら３７℃で３時間細胞
を培養する。この培養期間中にプラスミドの確立と変換
ＤＮＡによって授与された選択可能な特性の表現が可能
である。遠心分離によって細胞を集め、そして種々の量
でこれを寒天培養皿の上に拡げる。これらの培養皿には
付加されたＤＮＡによって授与された特性を獲得した菌
のみの成長を許容する培養培地を入れておく。たとえば
、１．５％（ｗ／ｖ）のディフコ寒天で固められ、そし
て抗生物質たとえば５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシ
ンを添加したＬＢを培養培地とする。
ｉ Ｋ−１２ＲＲ−１のトランスフォーメーション ＤＮＡの取込みにコンピテントとなったＥ・ｃｏｌｉ細
胞が下記方法によって得られる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＲＲ−１［Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ
、 Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｑｕｅｒｚ、Ｍ． Ｃ．Ｂｅｔ
ｌａｃｈ、 Ｈ． Ｗ． Ｂｏｙｅｒ の論文、２ Ｇ
ｅｎｅ、第７５〜９３頁（１９７７年）参照］は、培地
ＬＢ２５０ｍｌ中、３７℃の温度で指数関数的に増殖す
る。ＬＢは蒸留水１リットル中にバクト−トリプトン１
０ｇ、バクト−イースト抽出物５ｇおよびＮａＣｌ ５
ｇを含有するものである。細胞濃度が２×１０８ｃｆｕ
／ｍｌに達したらその培養物を氷の温度まで１５分間冷
却し、しかるのち４℃で遠心分離（６０００ｘｇ、５分
間）により細胞を集める。上澄み液を傾瀉し、そして細
胞を氷冷した０．１モルＣａＣｌ２溶液１２５ｍｌで懸
濁する。この細胞懸濁物を１５分間氷の上に保持する。 再び遠心分離によって細胞を集め、氷冷０．１モルＣａ
Ｃｌ２ ２５ｍｌに懸濁し、そしてさらに１５分間氷上
に保持する。この細胞懸濁物に０．１モルＣａＣｌ中４
０％（ｗ／ｖ）グリセリンを含む氷冷溶液（１５ｍｌ）
を混合する。これは−７０℃で貯蔵しておくこともでき
るし、また直接使用することもできる。ＤＮＡ（ＴＥ３
０μｌ中約０．１乃至１．０μｇ）を、５０ミリモルＮ
ａＣｌ、５ミリモル クエン酸ナトリウム、６７ミリモ
ルＣａＣｌ２を含有する溶液１００μｌと混合する。次
に細胞懸濁物（０．２０ｍｌ）を加え、そしてこの混合
物を４５分乃至１時間氷上においておく。培養液ＬＢ（
４．０ｍｌ）を加え、振盪しながら３７℃で３時間細胞
を培養する。この培養期間中にプラスミドの確立と変換
ＤＮＡによって授与された選択可能な特性の表現が可能
である。遠心分離によって細胞を集め、そして種々の量
でこれを寒天培養皿の上に拡げる。これらの培養皿には
付加されたＤＮＡによって授与された特性を獲得した菌
のみの成長を許容する培養培地を入れておく。たとえば
、１．５％（ｗ／ｖ）のディフコ寒天で固められ、そし
て抗生物質たとえば５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシ
ンを添加したＬＢを培養培地とする。
【００４７】Ｌ． Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２からのプ
ラスミドＤＮＡの製造 プラスミドＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のプラス
ミド含有誘導体から標準的技法、たとえば Ｄａｖｉｓ
等（前掲）の第１１６〜１１９頁に記載された方法に
よって単離することができる。純度はやや低いが、しか
しトランスフォーメーション、トランスフェクションま
たは制限分析のために使用するのに適当なＤＮＡが下記
方法によってより早く単離することができる。選択性培
地、通常は抗生物質を加えたＬＢの５ｍｌ中で細胞を静
止相になるまで一晩増殖させる。これらの細胞を遠心分
離（３０００ｘｇ、５分間）によって採集し、そして下
記成分を含み全体がＫＯＨでｐＨ８に調整された溶液０
．４５ｍｌに懸濁する。８％（ｗ／ｖ）スクロース、５
％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ミリモ
ルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウムおよび５
０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、リゾチーム（ＴＥの１ｍｌ中１０ｍｇの新しく調製し
た溶液２５μｌ）を加える。この混合物を沸騰水中で６
０秒間インキュベートし、そしてその後直ちに室温で遠
心分離する（１２０００ｘｇ、１０分間）。上澄み液の
１００μｌを取り、そして１００μｌのイソプロパノー
ルと混合する。 −２０℃で３０分間培養後、ＤＮＡ沈殿を遠心分離（１
２０００ｘｇ、１０分間）により回収し、１００μｌの
ＴＥに溶解して４℃で貯蔵する。制限分析、トランスフ
ェクションまたはトランスフォーメーションのためには
５乃至２０μｌで十分である。
ラスミドＤＮＡの製造 プラスミドＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のプラス
ミド含有誘導体から標準的技法、たとえば Ｄａｖｉｓ
等（前掲）の第１１６〜１１９頁に記載された方法に
よって単離することができる。純度はやや低いが、しか
しトランスフォーメーション、トランスフェクションま
たは制限分析のために使用するのに適当なＤＮＡが下記
方法によってより早く単離することができる。選択性培
地、通常は抗生物質を加えたＬＢの５ｍｌ中で細胞を静
止相になるまで一晩増殖させる。これらの細胞を遠心分
離（３０００ｘｇ、５分間）によって採集し、そして下
記成分を含み全体がＫＯＨでｐＨ８に調整された溶液０
．４５ｍｌに懸濁する。８％（ｗ／ｖ）スクロース、５
％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ミリモ
ルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウムおよび５
０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、リゾチーム（ＴＥの１ｍｌ中１０ｍｇの新しく調製し
た溶液２５μｌ）を加える。この混合物を沸騰水中で６
０秒間インキュベートし、そしてその後直ちに室温で遠
心分離する（１２０００ｘｇ、１０分間）。上澄み液の
１００μｌを取り、そして１００μｌのイソプロパノー
ルと混合する。 −２０℃で３０分間培養後、ＤＮＡ沈殿を遠心分離（１
２０００ｘｇ、１０分間）により回収し、１００μｌの
ＴＥに溶解して４℃で貯蔵する。制限分析、トランスフ
ェクションまたはトランスフォーメーションのためには
５乃至２０μｌで十分である。
【００４８】Ｍ． ファージＴＧ２ＤＮＡ内へのプラ
スミドｐＡＣＹＣ １７７の挿入 この実験は、このベクター内への外来ＤＮＡのクローニ
ングが実行可能であることを実証するものである。プラ
スミドｐＡＣＹＣ １７７は Ａ． Ｃ．Ｙ． Ｃｈａ
ｎｇ と Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ によってＪ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ． １３４（１９７８年） 第１１４１
〜１１５６頁に記載されている。これは Ｅ． Ｃｏｌ
ｉ から得られたものであり、サイズは約３．６キロ塩
基対である。これはアムピシリンおよびカナマイシンに
対する耐性を与え、そしてアムピシリンに対する耐性を
コードしているＤＮＡシーケンス内に単一ＰｓｔＩ部位
を持っている。共有結合的に閉環しているｐＡＣＹＣ
１７７ プラスミドＤＮＡとファージＴＧ２ＤＮＡとは
、下記組成の反応混合物０．２５ｍｌ中で３７℃で８時
間インキュベートすることによって別々に開裂された。 反応混合物はＴＥ０．２０ｍｌ中のＤＮＡ５０μｇに５
×ＫＣ［０．１モルのトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、５０ミリモルのＭｇＣｌ２、０．１モルのＫ
Ｃｌを含み、ＨＣｌでｐＨ７．７に調整した溶液］０．
０５ｍｌとＰｓｔエンドヌクレアーゼ１５μｌ（１５０
単位、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｏｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ 製品）とを混合してなるものであっ
た。４時間インキュベートしたのち、さらに１００単位
のエンドヌクレアーゼをファージＤＮＡ含有反応混合物
に添加した。各混合物を７０℃に１０分間加熱し、しか
るのちジエチルピロカーボネート１．０μｌを添加し、
そしてさらに３７℃で１時間インキュベートしてエンド
ヌクレアーゼを不活性化した。前記のごとく、このＤＮ
Ａをエタノールを添加して沈殿させ、そしてＴＥの０．
２０ｍｌに再溶解する。各開裂されたＤＮＡ試料（７５
μｌ）を、次のものをプラスして互いに混合した。ＴＥ
７５μｌ、ＬＭ［０．６６モルのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、６６ミリモルのＭｇＣｌ２を含み
、ＨＣｌでｐＨ７．５に調整したもの］２８μｌ、４．
０ミリモルのアデノシン−５’−三リン酸塩（二ナトリ
ウム塩）２５μｌ、０．１０モルのジチオスレイトール
２５μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ３μｌ（６単位、Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）。この混合物を３．５℃で２４時間インキュ
ベートした。エタノールでＤＮＡを沈殿させ、そしてＴ
Ｅ７５μｌに再溶解した。このＤＮＡ調製物の数部量が
Ｊ項に記載したように Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロ
トプラストのトランスフェクトのために使用された。フ
ァージが単離されて、それらのＤＮＡが制限分析によっ
て調べられた。挿入によって親のファージとは異なった
ＤＮＡを持つファージが得られた。この挿入は、プラス
ミドｐＡＣＹＣ１７７のサイズと制限特性を有するＤＮ
Ａが単一ＰｓｔＩ部位に挿入されたものであり、Ｐｓｔ
Ｉの消化によって線形に切り出すことができた。第４図
に示すように、互いに反対の配位（ｏｒｉｅｎｔａｔｉ
ｏｎ）で挿入されたｐＡＣＹＣ１７７を持つ２種のファ
ージ、ＴＧ６とＴＧ７とが得られた。これらファージの
ＤＮＡがＫ項に記載したように Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−
１２ＲＲ １のトランスフォームのために使用された。 形質転換体（トランスフォーマント）は１．５％（ｗ／
ｖ）ディフコ寒天で固められ、そして５０μｇ／ｍｌの
カナマイシンを補足されたＬＢを含有するペトリ皿上で
選択された。
スミドｐＡＣＹＣ １７７の挿入 この実験は、このベクター内への外来ＤＮＡのクローニ
ングが実行可能であることを実証するものである。プラ
スミドｐＡＣＹＣ １７７は Ａ． Ｃ．Ｙ． Ｃｈａ
ｎｇ と Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ によってＪ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ． １３４（１９７８年） 第１１４１
〜１１５６頁に記載されている。これは Ｅ． Ｃｏｌ
ｉ から得られたものであり、サイズは約３．６キロ塩
基対である。これはアムピシリンおよびカナマイシンに
対する耐性を与え、そしてアムピシリンに対する耐性を
コードしているＤＮＡシーケンス内に単一ＰｓｔＩ部位
を持っている。共有結合的に閉環しているｐＡＣＹＣ
１７７ プラスミドＤＮＡとファージＴＧ２ＤＮＡとは
、下記組成の反応混合物０．２５ｍｌ中で３７℃で８時
間インキュベートすることによって別々に開裂された。 反応混合物はＴＥ０．２０ｍｌ中のＤＮＡ５０μｇに５
×ＫＣ［０．１モルのトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、５０ミリモルのＭｇＣｌ２、０．１モルのＫ
Ｃｌを含み、ＨＣｌでｐＨ７．７に調整した溶液］０．
０５ｍｌとＰｓｔエンドヌクレアーゼ１５μｌ（１５０
単位、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｏｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ 製品）とを混合してなるものであっ
た。４時間インキュベートしたのち、さらに１００単位
のエンドヌクレアーゼをファージＤＮＡ含有反応混合物
に添加した。各混合物を７０℃に１０分間加熱し、しか
るのちジエチルピロカーボネート１．０μｌを添加し、
そしてさらに３７℃で１時間インキュベートしてエンド
ヌクレアーゼを不活性化した。前記のごとく、このＤＮ
Ａをエタノールを添加して沈殿させ、そしてＴＥの０．
２０ｍｌに再溶解する。各開裂されたＤＮＡ試料（７５
μｌ）を、次のものをプラスして互いに混合した。ＴＥ
７５μｌ、ＬＭ［０．６６モルのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、６６ミリモルのＭｇＣｌ２を含み
、ＨＣｌでｐＨ７．５に調整したもの］２８μｌ、４．
０ミリモルのアデノシン−５’−三リン酸塩（二ナトリ
ウム塩）２５μｌ、０．１０モルのジチオスレイトール
２５μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ３μｌ（６単位、Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）。この混合物を３．５℃で２４時間インキュ
ベートした。エタノールでＤＮＡを沈殿させ、そしてＴ
Ｅ７５μｌに再溶解した。このＤＮＡ調製物の数部量が
Ｊ項に記載したように Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロ
トプラストのトランスフェクトのために使用された。フ
ァージが単離されて、それらのＤＮＡが制限分析によっ
て調べられた。挿入によって親のファージとは異なった
ＤＮＡを持つファージが得られた。この挿入は、プラス
ミドｐＡＣＹＣ１７７のサイズと制限特性を有するＤＮ
Ａが単一ＰｓｔＩ部位に挿入されたものであり、Ｐｓｔ
Ｉの消化によって線形に切り出すことができた。第４図
に示すように、互いに反対の配位（ｏｒｉｅｎｔａｔｉ
ｏｎ）で挿入されたｐＡＣＹＣ１７７を持つ２種のファ
ージ、ＴＧ６とＴＧ７とが得られた。これらファージの
ＤＮＡがＫ項に記載したように Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−
１２ＲＲ １のトランスフォームのために使用された。 形質転換体（トランスフォーマント）は１．５％（ｗ／
ｖ）ディフコ寒天で固められ、そして５０μｇ／ｍｌの
カナマイシンを補足されたＬＢを含有するペトリ皿上で
選択された。
【００４９】上記のペトリ皿を３７℃で一晩培養した。
カナマイシン耐性菌の多数のコロニーがファージＴＧ６
とＴＧ７のＤＮＡにさらされた細胞から得られた。この
ような菌を再精製した。そしてファージＴＧ６から得ら
れたプラスミドｐＴＧ６を含有する菌は菌株ＡＴＣＣ３
９０７９（ＭＢ４５４０）として、そしてファージＴＧ
７からのプラスミドｐＴＧ７を含有するものは菌株ＡＴ
ＣＣ３９０８２（ＭＢ４５４３）として寄託されている
。Ｌ項に記載したように、これら菌株からプラスミドＤ
ＮＡが単離され、そしてＨｉｎｄ ＩＩＩの制限分析に
よって検査された。そのプラスミドは付着末端が結合さ
れている点を除き対応する増殖能力のあるファージ、Ｔ
Ｇ６とＴＧ７のＤＮＡと同じであった。さらに、未消化
のＤＮＡ調製物をＪ項に記載した仕方と同様な仕方でＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２
９７のプロトプラストをトランスフェクトするために使
用した。その結果、同様判定によってはファージＴＧ６
およびＴＧ７から区別不能なファージが生じた。
とＴＧ７のＤＮＡにさらされた細胞から得られた。この
ような菌を再精製した。そしてファージＴＧ６から得ら
れたプラスミドｐＴＧ６を含有する菌は菌株ＡＴＣＣ３
９０７９（ＭＢ４５４０）として、そしてファージＴＧ
７からのプラスミドｐＴＧ７を含有するものは菌株ＡＴ
ＣＣ３９０８２（ＭＢ４５４３）として寄託されている
。Ｌ項に記載したように、これら菌株からプラスミドＤ
ＮＡが単離され、そしてＨｉｎｄ ＩＩＩの制限分析に
よって検査された。そのプラスミドは付着末端が結合さ
れている点を除き対応する増殖能力のあるファージ、Ｔ
Ｇ６とＴＧ７のＤＮＡと同じであった。さらに、未消化
のＤＮＡ調製物をＪ項に記載した仕方と同様な仕方でＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ＭＡ４２
９７のプロトプラストをトランスフェクトするために使
用した。その結果、同様判定によってはファージＴＧ６
およびＴＧ７から区別不能なファージが生じた。
【００５０】Ｎ． 交配ファージの欠失突然変異体の
単離 プラスミドｐＡＣＹＣ１７７を欠失ファージＴＧ２に挿
入すると、そのゲノム（核酸）が元のファージＴＧ１の
それよりも４．７％長いファージが生じる。このファー
ジにパッケージされたＤＮＡのその余分な長さは、元の
ＴＧ１よりもキレート剤に対してそのＤＮＡをより敏感
にする。この特性は、次のようにして欠失突然変異体の
単離のために利用することができる。注目すべきは、元
の単離物のゲノムよりも大きいゲノムサイズをもたらす
ことになるファージＴＧ１のいずれの誘導体内へのいず
れのＤＮＡの挿入も類似の特性を示すであろうことであ
る。ファージＴＧ６およびＴＧ７の欠失突然変異体を単
離するため、単一プラークから調製された管ストックの
１０μｌを、二価陽イオンを添加されていないそして２
５ミリモルのピロリン酸ナトリウムが補足され且つＮａ
ＯＨでｐＨ６．０に調整されたＹＣ肉汁０．１０ｍｌと
混合する。３５℃で３０分間培養したのち（この時点で
生き残っているファージ個体数は最初の濃度の約１０−
３である）、ＹＣ肉汁に菌を懸濁した懸濁物０．２０ｍ
ｌを加える。室温で１０乃至２０分間経過させたのち、
ＹＣ軟寒天４．０ｍｌを加え、その混合物をＹＣ寒天皿
の上に注ぎ、そして３０℃で一晩培養する。これにより
１皿のファージストックが得られる。ピロリン酸塩によ
るファージ処理を続けて２回以上くり返す。
単離 プラスミドｐＡＣＹＣ１７７を欠失ファージＴＧ２に挿
入すると、そのゲノム（核酸）が元のファージＴＧ１の
それよりも４．７％長いファージが生じる。このファー
ジにパッケージされたＤＮＡのその余分な長さは、元の
ＴＧ１よりもキレート剤に対してそのＤＮＡをより敏感
にする。この特性は、次のようにして欠失突然変異体の
単離のために利用することができる。注目すべきは、元
の単離物のゲノムよりも大きいゲノムサイズをもたらす
ことになるファージＴＧ１のいずれの誘導体内へのいず
れのＤＮＡの挿入も類似の特性を示すであろうことであ
る。ファージＴＧ６およびＴＧ７の欠失突然変異体を単
離するため、単一プラークから調製された管ストックの
１０μｌを、二価陽イオンを添加されていないそして２
５ミリモルのピロリン酸ナトリウムが補足され且つＮａ
ＯＨでｐＨ６．０に調整されたＹＣ肉汁０．１０ｍｌと
混合する。３５℃で３０分間培養したのち（この時点で
生き残っているファージ個体数は最初の濃度の約１０−
３である）、ＹＣ肉汁に菌を懸濁した懸濁物０．２０ｍ
ｌを加える。室温で１０乃至２０分間経過させたのち、
ＹＣ軟寒天４．０ｍｌを加え、その混合物をＹＣ寒天皿
の上に注ぎ、そして３０℃で一晩培養する。これにより
１皿のファージストックが得られる。ピロリン酸塩によ
るファージ処理を続けて２回以上くり返す。
【００５１】第２回目、第３回目の処理後に生き残るフ
ァージの割合は、実質的に段々と大きくなる。このよう
なピロリン酸塩耐性ファージから単離された単一プラー
クのＤＮＡは、通常その挿入されたプラスミドの領域が
欠失されている。この欠失の平均サイズは４乃至６ｋｂ
ｐである。挿入されたプラスミドの領域とは別の領域に
欠失を持つ突然変異体を選択するため、上記のピロリン
酸塩耐性ファージ皿ストックの試料０．１０ｍｌから直
接的に調製されたファージ管ストックからＤＮＡを単離
する。このようなストックは混合集団であり、そのうち
のいくつかのメンバーが所望の欠失を持つファージであ
る。そのＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＲＲ１をカナ
マイシン耐性にするために使用する。かかる形質転換（
トランスフォーマント）のプラスミドＤＮＡは再生機能
と挿入されたｐＡＣＹＣ１７７プラスミドのカナマイシ
ン耐性遺伝子とを保持しているはずである。二者択一的
に選択可能な特質を授与する挿入ＤＮＡを持つ誘導体は
同じような方法で利用することができる。もし、その特
質が Ｅ． ｃｏｌｉ ではなくて Ｓ． ｃａｔｔｌ
ｅｙａ の中で発現されるならば、そのピロリン酸塩耐
性ファージ混合集団を Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａ菌に直
接感染させることによって、これら欠失突然変異体を得
ることができる。そのファージを吸着させたのち、菌を
２乃至４時間増殖させれば、選択的培地に移す前にその
ベクター分子の確立とその選択可能な特質の発現とがな
される。
ァージの割合は、実質的に段々と大きくなる。このよう
なピロリン酸塩耐性ファージから単離された単一プラー
クのＤＮＡは、通常その挿入されたプラスミドの領域が
欠失されている。この欠失の平均サイズは４乃至６ｋｂ
ｐである。挿入されたプラスミドの領域とは別の領域に
欠失を持つ突然変異体を選択するため、上記のピロリン
酸塩耐性ファージ皿ストックの試料０．１０ｍｌから直
接的に調製されたファージ管ストックからＤＮＡを単離
する。このようなストックは混合集団であり、そのうち
のいくつかのメンバーが所望の欠失を持つファージであ
る。そのＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＲＲ１をカナ
マイシン耐性にするために使用する。かかる形質転換（
トランスフォーマント）のプラスミドＤＮＡは再生機能
と挿入されたｐＡＣＹＣ１７７プラスミドのカナマイシ
ン耐性遺伝子とを保持しているはずである。二者択一的
に選択可能な特質を授与する挿入ＤＮＡを持つ誘導体は
同じような方法で利用することができる。もし、その特
質が Ｅ． ｃｏｌｉ ではなくて Ｓ． ｃａｔｔｌ
ｅｙａ の中で発現されるならば、そのピロリン酸塩耐
性ファージ混合集団を Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａ菌に直
接感染させることによって、これら欠失突然変異体を得
ることができる。そのファージを吸着させたのち、菌を
２乃至４時間増殖させれば、選択的培地に移す前にその
ベクター分子の確立とその選択可能な特質の発現とがな
される。
【００５２】ベクターＤＮＡを形質転換細胞から（或は
場合によっては溶原菌から放出されたファージから）単
離し、そして欠失の有無を調べる。ファージＴＧ６とＴ
Ｇ７のピロリン酸塩耐性集団からのＤＮＡで得られたカ
ナマイシン耐性形質転換体は増殖性ファージＤＮＡ制限
地図の左端（第４図）と挿入プラスミドのカナマイシン
耐性遺伝子との間の位置に欠失を持つプラスミドを含有
していた。ファージＴＧ６とＴＧ７の制限地図に関する
位置およびそれら欠失のサイズは第４図に示されている
。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，Ｓ
ｍａＩおよびＢａｍＨＩについてそれらプラスミドを分
析した。
場合によっては溶原菌から放出されたファージから）単
離し、そして欠失の有無を調べる。ファージＴＧ６とＴ
Ｇ７のピロリン酸塩耐性集団からのＤＮＡで得られたカ
ナマイシン耐性形質転換体は増殖性ファージＤＮＡ制限
地図の左端（第４図）と挿入プラスミドのカナマイシン
耐性遺伝子との間の位置に欠失を持つプラスミドを含有
していた。ファージＴＧ６とＴＧ７の制限地図に関する
位置およびそれら欠失のサイズは第４図に示されている
。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，Ｓ
ｍａＩおよびＢａｍＨＩについてそれらプラスミドを分
析した。
【００５３】ＴＧ６から下記のプラスミドが誘導された
： ｐＴＧ ８：これは３．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、
これによって６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位および
７．２７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位が取り去られてい
る； ｐＴＧ ９：これは４．７ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、
その結果４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位、６．３８
ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位および７．２７ｋｂｐ位置の
ＢａｍＨＩ部位が取り除かれている； ｐＴＧ １０：これは３．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、その結果１．６６位置のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位が除去
されている； ｐＴＧ １１：これは２．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、これにより６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位と７．
２７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位が除去されている； ｐＴＧ １２：これは６．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位、６．３８ｋｂｐ
位置のＰｓｔＩ部位および７．２ｋｂｐ位置のＢａｍＨ
Ｉ部位が除去されている； ｐＴＧ １３：これは２．８ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、その結果６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位と７．２
７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位とが取り去られている； ｐＴＧ １４：これは４．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、そのため４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が取り去
られている。
： ｐＴＧ ８：これは３．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、
これによって６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位および
７．２７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位が取り去られてい
る； ｐＴＧ ９：これは４．７ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち、
その結果４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位、６．３８
ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位および７．２７ｋｂｐ位置の
ＢａｍＨＩ部位が取り除かれている； ｐＴＧ １０：これは３．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、その結果１．６６位置のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位が除去
されている； ｐＴＧ １１：これは２．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、これにより６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位と７．
２７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位が除去されている； ｐＴＧ １２：これは６．０ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位、６．３８ｋｂｐ
位置のＰｓｔＩ部位および７．２ｋｂｐ位置のＢａｍＨ
Ｉ部位が除去されている； ｐＴＧ １３：これは２．８ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、その結果６．３８ｋｂｐ位置のＰｓｔＩ部位と７．２
７ｋｂｐ位置のＢａｍＨＩ部位とが取り去られている； ｐＴＧ １４：これは４．１ｋｂｐのＤＮＡ欠失を持ち
、そのため４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が取り去
られている。
【００５４】
ＴＧ７からは下記のプラスミドが誘導された：ｐＴＧ
１５：これは３．１ｋｂｐの欠失を持ち、これにより４
．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が除去されている； ｐＴＧ １６：これは４．６ｋｂｐの欠失を持ち、その
結果４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が除去されてい
る。 これらのプラスミド誘導体のいくつかを含む代表的誘導
体は以下の菌株番条をもって寄託されている。 プラスミドｐＴＧ １２を含む菌株ＡＴＣＣ３９０８０
（ＭＢ４５４１）；プラスミドｐＴＧ １６を含む菌株
ＡＴＣＣ３９０８１（ＭＢ４５４２）；プラスミドｐＴ
Ｇ ８を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０２７（ＭＢ４５４
４）；プラスミドｐＴＧ ９を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１
５０２８（ＭＢ４５４５）；プラスミドｐＴＧ １０
を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０２９（ＭＢ４５４６）；
プラスミドｐＴＧ １１ を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５
０３０（ＭＢ４５４７）；プラスミドｐＴＧ １３ を
含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０３１（ＭＢ４５４８）；プ
ラスミドｐＴＧ １４ を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０
３２（ＭＢ４５４９）；プラスミドｐＴＧ １５ を含
む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０３３（ＭＢ４５５０）。
１５：これは３．１ｋｂｐの欠失を持ち、これにより４
．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が除去されている； ｐＴＧ １６：これは４．６ｋｂｐの欠失を持ち、その
結果４．７５ｋｂｐ位置のＳｐｈＩ部位が除去されてい
る。 これらのプラスミド誘導体のいくつかを含む代表的誘導
体は以下の菌株番条をもって寄託されている。 プラスミドｐＴＧ １２を含む菌株ＡＴＣＣ３９０８０
（ＭＢ４５４１）；プラスミドｐＴＧ １６を含む菌株
ＡＴＣＣ３９０８１（ＭＢ４５４２）；プラスミドｐＴ
Ｇ ８を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０２７（ＭＢ４５４
４）；プラスミドｐＴＧ ９を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１
５０２８（ＭＢ４５４５）；プラスミドｐＴＧ １０
を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０２９（ＭＢ４５４６）；
プラスミドｐＴＧ １１ を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５
０３０（ＭＢ４５４７）；プラスミドｐＴＧ １３ を
含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０３１（ＭＢ４５４８）；プ
ラスミドｐＴＧ １４ を含む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０
３２（ＭＢ４５４９）；プラスミドｐＴＧ １５ を含
む菌株ＮＲＲＬＢ−１５０３３（ＭＢ４５５０）。
【００５５】これらのプラスミドは、Ｓ． ｃａｔｔｌ
ｅｙａ のプロトプラストをトランスフェクトするため
に使用され、そしてそのＤＮＡが、付着末端が分離され
うる点を除き、対応するプラスミドＤＮＡと同じであっ
たファージを生じた。プラスミドｐＴＧ８はファージＴ
Ｇ８を、ｐＴＧ９はファージＴＧ９を与えた。他につい
ても同様であった。
ｅｙａ のプロトプラストをトランスフェクトするため
に使用され、そしてそのＤＮＡが、付着末端が分離され
うる点を除き、対応するプラスミドＤＮＡと同じであっ
たファージを生じた。プラスミドｐＴＧ８はファージＴ
Ｇ８を、ｐＴＧ９はファージＴＧ９を与えた。他につい
ても同様であった。
【００５６】実施例２
チエナマイシン遺伝子のクローニング
この実施例はＴＧ１ベクターの誘導体がどのようにして
チエナマイシン遺伝子の同定およびクローニングのため
に使用しうるかを示すものである。実験は種々の方法で
実施可能であり、ここに記載するのはその一例を示すに
すぎない。したがって、本実施例は目的を達成するため
にＴＧ１およびその誘導体を用いる方法を例示するだけ
であり、なんら限定的なものではない。
チエナマイシン遺伝子の同定およびクローニングのため
に使用しうるかを示すものである。実験は種々の方法で
実施可能であり、ここに記載するのはその一例を示すに
すぎない。したがって、本実施例は目的を達成するため
にＴＧ１およびその誘導体を用いる方法を例示するだけ
であり、なんら限定的なものではない。
【００５７】Ａ． チオストレプトン耐性遺伝子を担
持するＴＧ１誘導体の構成 薬剤に対する耐性の遺伝子を担持するＴＧ１誘導体を構
成することは、溶原菌の直接的選択を可能にする。これ
はチエナマイシン遺伝子のためのハイブリッドベクター
クローンをスクリーニングするために役立つ（本実施例
のＢ項参照）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでは抗生物質
チオストレプトンに対する耐性を与える遺伝子がすでに
クローンされている［Ｃ．Ｊ．Ｗａｒｄ、Ｊ．Ｍ．およ
び Ｈｏｐｗｏｏｄ．Ｄ．Ａ．： ＤＮＡＣｌｏｎｉｎ
ｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ： ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８６（１９８０）第５２５〜５２７頁参照
］。この遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを単離し、そし
てＢａｍＨＩで開裂する。そのチオストレプトン耐性遺
伝子を持つ断片（２．０ｋｂｐ）を、アガロースゲル電
気泳動により精製する。精製された断片をＢｃｌＩで部
分的に消化する。この断片は、その薬剤耐性遺伝子の両
側にＢｃｌＩ部位を持っている。部分的に開裂されたＤ
ＮＡとＢａｍＨＩですでに開裂されているベクターＴＧ
１５のＤＮＡとを混合し、そして結合する。結合された
ＤＮＡを実施例１、Ｊ項に記載したようにＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストをトラ
ンスフェクトするために使用する。 ただし今回は、ポリエチレングリコールによる処理後に
そのプロトプラストを１０ｍｌのＲＭおよび芽胞と混合
し、そして２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ内３
０℃の温度でゆっくりと振り回しながら一晩培養する。 細胞を種々の度合いに希釈し、そして最初濃度５および
１０μｇ／ｍｌでチオストレプトンを追加したＹＣ寒天
を含有するペトリ皿の上に撒く。チオストレプトン耐性
溶原菌の成長によりコロニーが生じる。これらの溶原菌
からのファージのＤＮＡを分析してＢａｍＨＩ部位の有
無を調べる。
持するＴＧ１誘導体の構成 薬剤に対する耐性の遺伝子を担持するＴＧ１誘導体を構
成することは、溶原菌の直接的選択を可能にする。これ
はチエナマイシン遺伝子のためのハイブリッドベクター
クローンをスクリーニングするために役立つ（本実施例
のＢ項参照）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでは抗生物質
チオストレプトンに対する耐性を与える遺伝子がすでに
クローンされている［Ｃ．Ｊ．Ｗａｒｄ、Ｊ．Ｍ．およ
び Ｈｏｐｗｏｏｄ．Ｄ．Ａ．： ＤＮＡＣｌｏｎｉｎ
ｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ： ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８６（１９８０）第５２５〜５２７頁参照
］。この遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを単離し、そし
てＢａｍＨＩで開裂する。そのチオストレプトン耐性遺
伝子を持つ断片（２．０ｋｂｐ）を、アガロースゲル電
気泳動により精製する。精製された断片をＢｃｌＩで部
分的に消化する。この断片は、その薬剤耐性遺伝子の両
側にＢｃｌＩ部位を持っている。部分的に開裂されたＤ
ＮＡとＢａｍＨＩですでに開裂されているベクターＴＧ
１５のＤＮＡとを混合し、そして結合する。結合された
ＤＮＡを実施例１、Ｊ項に記載したようにＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストをトラ
ンスフェクトするために使用する。 ただし今回は、ポリエチレングリコールによる処理後に
そのプロトプラストを１０ｍｌのＲＭおよび芽胞と混合
し、そして２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ内３
０℃の温度でゆっくりと振り回しながら一晩培養する。 細胞を種々の度合いに希釈し、そして最初濃度５および
１０μｇ／ｍｌでチオストレプトンを追加したＹＣ寒天
を含有するペトリ皿の上に撒く。チオストレプトン耐性
溶原菌の成長によりコロニーが生じる。これらの溶原菌
からのファージのＤＮＡを分析してＢａｍＨＩ部位の有
無を調べる。
【００５８】単一のＢａｍＨＩ部位を持つハイブリッド
ベクターとＢａｍＨＩ部位を全く持たないハイブリッド
ベクターとを選択する。ＢｃｌＩで消化されて生じた端
はＢａｍＨＩの消化によって生じた端で連結されうるが
、しかしその新規連結はいずれの酵素のための部位も再
生しないからして、１端においてＢａｍＨＩでそして他
端においてＢｃｌＩで開裂されて生じた断片の挿入は単
一のＢａｍＨＩ部位を持つベクターを与え、両端におい
てＢｃｌＩで開裂されて生じた断片の挿入は全くＢａｍ
ＨＩ部位を持たないベクターを与える。１端にＢａｍＨ
Ｉ部位を持つチオストレプトン耐性遺伝子を担持する挿
入体の長さは約１．５ｋｂｐである。ＢａｍＨＩ部位を
全く持たないチオストレプトン耐性遺伝子を担持する挿
入体の長さは１．１ｋｂｐである。
ベクターとＢａｍＨＩ部位を全く持たないハイブリッド
ベクターとを選択する。ＢｃｌＩで消化されて生じた端
はＢａｍＨＩの消化によって生じた端で連結されうるが
、しかしその新規連結はいずれの酵素のための部位も再
生しないからして、１端においてＢａｍＨＩでそして他
端においてＢｃｌＩで開裂されて生じた断片の挿入は単
一のＢａｍＨＩ部位を持つベクターを与え、両端におい
てＢｃｌＩで開裂されて生じた断片の挿入は全くＢａｍ
ＨＩ部位を持たないベクターを与える。１端にＢａｍＨ
Ｉ部位を持つチオストレプトン耐性遺伝子を担持する挿
入体の長さは約１．５ｋｂｐである。ＢａｍＨＩ部位を
全く持たないチオストレプトン耐性遺伝子を担持する挿
入体の長さは１．１ｋｂｐである。
【００５９】チオストレプトン遺伝子の左側に位置する
ファージおよびｐＡＣＹＣ１７７の欠失は、実質的に上
記した方法（実施例１、Ｉ項およびＮ項参照）により得
られる。所望の欠失により４乃至４．５ｋｂｐのＤＮＡ
とｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡの左端に位置するＰｓｔＩ部
位が除去される。これは、そのファージをキレート剤で
処理し、そして所望の欠失を持つＤＮＡを有するファー
ジを放出するチオストレプトン耐性溶原菌をスクリーニ
ングすることによって選択される。ＢａｍＨＩ部位のな
いベクター内へＢａｍＨＩ部位を次のごとくして導入す
ることができる。プラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡをＲ
ｓａＩおよびＳｐｈＩで消化させる。この消化によって
生じた０．４ｋｂｐの断片にＮｅｌｓｏｎ および Ｂ
ｒｕｔｌａｇによって記載された方法に従って１０乃至
１５のデオキシチジンヌクレオチド残分を端付加する［
Ｔ． Ｎｅｌｓｏｎ および Ｄ． Ｂｒｕｔｌａｇの
論文“ Ａｄｄｉｔｃｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ ｔｏ ３’−ｅｎｄｓ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ
ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．６８（１９７９年）、Ｓ． Ｐ． Ｃｏ
ｌｄｗｉｃｋ および Ｎ． Ｏ． Ｋａｐｌａｎ 編
、第４１〜５０頁参照］。
ファージおよびｐＡＣＹＣ１７７の欠失は、実質的に上
記した方法（実施例１、Ｉ項およびＮ項参照）により得
られる。所望の欠失により４乃至４．５ｋｂｐのＤＮＡ
とｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡの左端に位置するＰｓｔＩ部
位が除去される。これは、そのファージをキレート剤で
処理し、そして所望の欠失を持つＤＮＡを有するファー
ジを放出するチオストレプトン耐性溶原菌をスクリーニ
ングすることによって選択される。ＢａｍＨＩ部位のな
いベクター内へＢａｍＨＩ部位を次のごとくして導入す
ることができる。プラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡをＲ
ｓａＩおよびＳｐｈＩで消化させる。この消化によって
生じた０．４ｋｂｐの断片にＮｅｌｓｏｎ および Ｂ
ｒｕｔｌａｇによって記載された方法に従って１０乃至
１５のデオキシチジンヌクレオチド残分を端付加する［
Ｔ． Ｎｅｌｓｏｎ および Ｄ． Ｂｒｕｔｌａｇの
論文“ Ａｄｄｉｔｃｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ ｔｏ ３’−ｅｎｄｓ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ
ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．６８（１９７９年）、Ｓ． Ｐ． Ｃｏ
ｌｄｗｉｃｋ および Ｎ． Ｏ． Ｋａｐｌａｎ 編
、第４１〜５０頁参照］。
【００６０】ＢａｍＨＩ部位を持たず挿入チオストレプ
トン耐性遺伝子の左側のファージとプラスミドＤＮＡの
１部分が欠失されたベクターのＤＮＡを、ＰｓｔＩで開
裂する。このベクター内には、挿入された遺伝子の右側
にただ１つのＰｓｔＩ部位が残る。開裂されたベクター
ＤＮＡに１０乃至１５のデオキシグアノシンヌクレオチ
ド基の尾端を付ける（Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔ
ｌａｇ の論文（前掲参照）。尾端をつけた断片と尾端
をつけたベクターとを混合し、そして Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストをトラ
ンスフェクトするために使用する。生じたファージのＤ
ＮＡをｐＢＲ３２２からの断片の挿入のために調べる。 このベクターはクローン断片に隣接するＰｓｔＩ部位と
ＳｐｈＩ部位を持つ、Ｓａｕ３ＡＩによる部分消化によ
って生じた任意断片のクローニング（Ｂ項参照）に有利
である。ＰｓｔＩで開裂されたＤＮＡにデオキシグアノ
シンで尾端をつけると最終混合成分子内にＰｓｔＩ部位
が再生され、他方ＳｐｈＩで開裂されたＤＮＡにデオキ
シシチジンの尾端をつけるとＳｐｈＩ部位が再生される
。これらの余分な部位は、その後のクローン断片の切取
りのために有利である。
トン耐性遺伝子の左側のファージとプラスミドＤＮＡの
１部分が欠失されたベクターのＤＮＡを、ＰｓｔＩで開
裂する。このベクター内には、挿入された遺伝子の右側
にただ１つのＰｓｔＩ部位が残る。開裂されたベクター
ＤＮＡに１０乃至１５のデオキシグアノシンヌクレオチ
ド基の尾端を付ける（Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔ
ｌａｇ の論文（前掲参照）。尾端をつけた断片と尾端
をつけたベクターとを混合し、そして Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストをトラ
ンスフェクトするために使用する。生じたファージのＤ
ＮＡをｐＢＲ３２２からの断片の挿入のために調べる。 このベクターはクローン断片に隣接するＰｓｔＩ部位と
ＳｐｈＩ部位を持つ、Ｓａｕ３ＡＩによる部分消化によ
って生じた任意断片のクローニング（Ｂ項参照）に有利
である。ＰｓｔＩで開裂されたＤＮＡにデオキシグアノ
シンで尾端をつけると最終混合成分子内にＰｓｔＩ部位
が再生され、他方ＳｐｈＩで開裂されたＤＮＡにデオキ
シシチジンの尾端をつけるとＳｐｈＩ部位が再生される
。これらの余分な部位は、その後のクローン断片の切取
りのために有利である。
【００６１】Ｂ． チエナマイシン遺伝子の単離と同
定Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ の染
色体ＤＮＡをＳａｎ３ＡＩで部分的に消化させる。この
消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分割する
。長さ３乃至１０ｋｂｐ範囲の断片をそのゲルから抽出
する（ Ｄａｖｉｄ 等、（前掲）参照）。これらの断
片をＢａｍＨＩですでに開裂されているベクターＴＧ１
５の誘導体と混合する。この誘導体の構成は上記した。 このＤＮＡを用いて Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロト
プラストのランスフェクションを行ない、そしてチオス
トレプトンに耐性のある溶原菌を本実施例のＡ項に記載
のように単離する。これらの溶原菌中のベクターの多く
は Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａ染色体ＤＮＡの挿入体を担
持する。これをスクリーニングにかけて、次のようにし
てチエナマイシン合成の途中がブロックされている Ｓ
． ｃａｔｔｌｅｙａの突然変異体を補足できる挿入体
の存在を調べる。
定Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ の染
色体ＤＮＡをＳａｎ３ＡＩで部分的に消化させる。この
消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分割する
。長さ３乃至１０ｋｂｐ範囲の断片をそのゲルから抽出
する（ Ｄａｖｉｄ 等、（前掲）参照）。これらの断
片をＢａｍＨＩですでに開裂されているベクターＴＧ１
５の誘導体と混合する。この誘導体の構成は上記した。 このＤＮＡを用いて Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロト
プラストのランスフェクションを行ない、そしてチオス
トレプトンに耐性のある溶原菌を本実施例のＡ項に記載
のように単離する。これらの溶原菌中のベクターの多く
は Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａ染色体ＤＮＡの挿入体を担
持する。これをスクリーニングにかけて、次のようにし
てチエナマイシン合成の途中がブロックされている Ｓ
． ｃａｔｔｌｅｙａの突然変異体を補足できる挿入体
の存在を調べる。
【００６２】上記溶原菌の混合物からファージストック
を調製し、そして液体培養基中で各種チエナマイシン突
然変異体を感染させるために使用する。ファージと共に
数時間培養したのち、細胞をチオストレプトンを付加し
たＹＣ寒天皿の上に撒く。宿主内に存在する突然変異を
補完する能力のある遺伝子を担持する雑種ベクターの寄
宿している細胞のコロニーを検出する。この検出はチエ
ナマイシンに感受性のある菌を接種した軟寒天上掛けを
その培養皿にかけることによって行なわれる［Ｊ． Ｓ
． Ｋａｈｎ、Ｆ． Ｍ． Ｋａｈｎ、Ｒ． Ｇｏｅｇ
ｅｌｍａｎ、Ｓ． Ａ． Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ． Ｊａｃ
ｋｓｏｎ、 Ｅ． Ｏ．Ｓｔａｐｌｅｙ、Ｔ． Ｗ．
Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ． Ｋ． Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ． Ｈｅ
ｎｄｌｉｎ、Ｓ． Ｍｏｃｈａｌｅｓ、Ｓ． Ｈｅｒｎ
ａｎｄｅｚ、Ｈ． Ｂ． Ｗｏｏｄｒｕｆｆ および
Ｊ． Ｂｉｒｎｂａｎｍ の論文、“ Ｔｈｉｅｎａｍ
ｙｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃ． Ｉ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ｔ
ａｘｏｎｏｍｙ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈ
ｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”Ｊ． Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔ．３２（１９７９年）第１〜１２参照］。その
ような雑種ベクターを持つ菌のコロニーは、チエナマイ
シン感受性菌の大きい円形溶解域の中央にある。雑種ベ
クターの存在は、その溶原菌によって産出されたファー
ジからのＤＮＡを分析することによって確認される。チ
エナマイシン遺伝子の存在はその突然変異体に雑種ファ
ージを再感染させることによって確認される。この新規
雑種ファージを用いて得られたすべての溶原菌はチエナ
マイシン合成能力を獲得するはずである。
を調製し、そして液体培養基中で各種チエナマイシン突
然変異体を感染させるために使用する。ファージと共に
数時間培養したのち、細胞をチオストレプトンを付加し
たＹＣ寒天皿の上に撒く。宿主内に存在する突然変異を
補完する能力のある遺伝子を担持する雑種ベクターの寄
宿している細胞のコロニーを検出する。この検出はチエ
ナマイシンに感受性のある菌を接種した軟寒天上掛けを
その培養皿にかけることによって行なわれる［Ｊ． Ｓ
． Ｋａｈｎ、Ｆ． Ｍ． Ｋａｈｎ、Ｒ． Ｇｏｅｇ
ｅｌｍａｎ、Ｓ． Ａ． Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ． Ｊａｃ
ｋｓｏｎ、 Ｅ． Ｏ．Ｓｔａｐｌｅｙ、Ｔ． Ｗ．
Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ． Ｋ． Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ． Ｈｅ
ｎｄｌｉｎ、Ｓ． Ｍｏｃｈａｌｅｓ、Ｓ． Ｈｅｒｎ
ａｎｄｅｚ、Ｈ． Ｂ． Ｗｏｏｄｒｕｆｆ および
Ｊ． Ｂｉｒｎｂａｎｍ の論文、“ Ｔｈｉｅｎａｍ
ｙｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃ． Ｉ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ｔ
ａｘｏｎｏｍｙ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈ
ｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”Ｊ． Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔ．３２（１９７９年）第１〜１２参照］。その
ような雑種ベクターを持つ菌のコロニーは、チエナマイ
シン感受性菌の大きい円形溶解域の中央にある。雑種ベ
クターの存在は、その溶原菌によって産出されたファー
ジからのＤＮＡを分析することによって確認される。チ
エナマイシン遺伝子の存在はその突然変異体に雑種ファ
ージを再感染させることによって確認される。この新規
雑種ファージを用いて得られたすべての溶原菌はチエナ
マイシン合成能力を獲得するはずである。
【００６３】実施例３
Ｂ型肝炎表面抗原の Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ へのクロ
ーニングＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ 内で発現される遺伝子
に、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子のＣ−末端部の大部分を挿
入することによってＳ． ｃａｔｔｌｅｙａ 内へＢ型
肝炎表面抗原をクローニングすることができる。もしそ
の表面抗原挿入が正しい配位と正しい暗号翻訳の読み枠
でなされたならば、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原特性を持つ
配合タンパク質が産生されるであろう［ Ｊ． Ｃ．
Ｅｄｍａｎ 等の論文、Ｎａｔｕｒｅ ２９１（１９８
１年）第５０３〜５０６頁参照］。本実施例ではＢ型肝
炎表面抗原が、ネオマイシンに耐性を授与する遺伝子に
挿入される。Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ の中においてＢ型
肝炎表面抗原を発現させるという目的は種々の方法で達
成することができる。ここに記載する方法はＴＧ１ベク
ターおよびその誘導体がこの目的達成のためにどのよう
に使用できるかを例示するだけのものであり、なんら限
定的なものではない。
ーニングＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ 内で発現される遺伝子
に、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子のＣ−末端部の大部分を挿
入することによってＳ． ｃａｔｔｌｅｙａ 内へＢ型
肝炎表面抗原をクローニングすることができる。もしそ
の表面抗原挿入が正しい配位と正しい暗号翻訳の読み枠
でなされたならば、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原特性を持つ
配合タンパク質が産生されるであろう［ Ｊ． Ｃ．
Ｅｄｍａｎ 等の論文、Ｎａｔｕｒｅ ２９１（１９８
１年）第５０３〜５０６頁参照］。本実施例ではＢ型肝
炎表面抗原が、ネオマイシンに耐性を授与する遺伝子に
挿入される。Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ の中においてＢ型
肝炎表面抗原を発現させるという目的は種々の方法で達
成することができる。ここに記載する方法はＴＧ１ベク
ターおよびその誘導体がこの目的達成のためにどのよう
に使用できるかを例示するだけのものであり、なんら限
定的なものではない。
【００６４】Ａ． ネオマイシン耐性遺伝子を担持す
るＴＧ１ベクターの誘導体の構成 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ において抗生物質ネオマイ
シンに耐性を授与する遺伝子はすでにクローンされてい
る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ 等、ｓｕｐｒａ 参照）。この
遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼのコー
ドを有する。この遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを単離
し、そしてＳｓｔＩＩ で開裂させる。ネオマイシン耐
性遺伝子を持っている断片（長さ１．０ｋｂｐ）をアガ
ロースゲル電気泳動で精製する。 この断片をＳｓｔＩＩですでに開裂されているベクター
ＴＧ８のＤＮＡと混合する。ベクターＴＧ８は、そのＤ
ＮＡのｐＡＣＹＣ１７７部内のＳｍａＩ部位とＰａｔＩ
部位との間に位置する単一のＳｓｔＩＩ部位を持ってい
る。 このＤＮＡを連結してＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ のプロト
プラストのトランスフェクションのために使用する。ネ
オマイシンに耐性のある溶原菌を１０および２０μｇ／
ｍｌのネオマイシンを補給されたＹＣ寒天皿の上で単離
する（実施例２、Ａ項に記載した方法と同様にして行な
う）。
るＴＧ１ベクターの誘導体の構成 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ において抗生物質ネオマイ
シンに耐性を授与する遺伝子はすでにクローンされてい
る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ 等、ｓｕｐｒａ 参照）。この
遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼのコー
ドを有する。この遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを単離
し、そしてＳｓｔＩＩ で開裂させる。ネオマイシン耐
性遺伝子を持っている断片（長さ１．０ｋｂｐ）をアガ
ロースゲル電気泳動で精製する。 この断片をＳｓｔＩＩですでに開裂されているベクター
ＴＧ８のＤＮＡと混合する。ベクターＴＧ８は、そのＤ
ＮＡのｐＡＣＹＣ１７７部内のＳｍａＩ部位とＰａｔＩ
部位との間に位置する単一のＳｓｔＩＩ部位を持ってい
る。 このＤＮＡを連結してＳ．ｃａｔｔｌｅｙａ のプロト
プラストのトランスフェクションのために使用する。ネ
オマイシンに耐性のある溶原菌を１０および２０μｇ／
ｍｌのネオマイシンを補給されたＹＣ寒天皿の上で単離
する（実施例２、Ａ項に記載した方法と同様にして行な
う）。
【００６５】Ｂ． ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ−Ｂ型肝炎表面抗原融解タンパク質を発現する誘
導体の構成 ＳｓｔＩＩ部位にネオマイシン断片が挿入されたファー
ジのＤＮＡをＢａｍＨＩで開裂する。このベクターはネ
オマイシン耐性の暗号を持つ遺伝子の中央付近に位置し
た単一のＢａｍＨＩ部位を持っている。このベクターに
約１０乃至１５のデオキシグアノシンヌクレオチド残分
の尾端をつける（Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔｌａ
ｇ、ｓｐｕｒａ 参照）。 クローンされたＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡをＨｉｎｃＩ
Ｉで消化し、そしてＢ型肝炎表面抗原の部分を含む７４
４−塩基対断片（その２２アミノ末端アミノ酸は欠けて
いる）をポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離す
る［Ｊ． Ｃ． Ｅｄｍａｎ、 Ｒ． Ｈ． Ｈａｌｌ
ｅｗｅｌｌ、Ｐ． Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、Ｈ． Ｍ．
Ｇｏｏｄｍａｎ および Ｗ． Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ
の “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏ
ｌ ２９１（１９８１年）、５０３〜５０６頁参照］。 この断片に約１０乃至１５のデオキシチジンヌクレオチ
ド残分の尾端をつける（Ｎｅｌｓｏｎおよび Ｂｒｕｔ
ｌａｇ、ｓｕｐｒａ 参照）。ついでこの断片を尾端を
つけたベクターと交配し、そしてその混合物を用いて
Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストにトランスフ
ェクションを行なう。生じたプラークからファージを単
離し、そしてそれらのＤＮＡを制限分析によってＢ型肝
炎表面抗原断片の挿入について調べる。溶原菌を単離し
、そして３５Ｓ−システイン標識タンパク抽出物の免疫
沈殿によって（Ｅｄｍａｎ 等、ｓｕｐｒａ参照）、予
期したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−Ｂ型肝
炎表面抗原融合タンパク質（ネオマイシン遺伝子のアミ
ノ末端のデオキシグアノシン尾端から由来する短いグリ
シン残分によって結合されている）の産生の有無を調べ
る。挿入されたＢ型肝炎表面抗原断片は正しい配位と正
しい読み枠になければならないから、雑種クローンの６
つのうちのわずか１つぐらいがその融合タンパク質を産
生するにすぎないだろう。
ラーゼ−Ｂ型肝炎表面抗原融解タンパク質を発現する誘
導体の構成 ＳｓｔＩＩ部位にネオマイシン断片が挿入されたファー
ジのＤＮＡをＢａｍＨＩで開裂する。このベクターはネ
オマイシン耐性の暗号を持つ遺伝子の中央付近に位置し
た単一のＢａｍＨＩ部位を持っている。このベクターに
約１０乃至１５のデオキシグアノシンヌクレオチド残分
の尾端をつける（Ｎｅｌｓｏｎ および Ｂｒｕｔｌａ
ｇ、ｓｐｕｒａ 参照）。 クローンされたＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡをＨｉｎｃＩ
Ｉで消化し、そしてＢ型肝炎表面抗原の部分を含む７４
４−塩基対断片（その２２アミノ末端アミノ酸は欠けて
いる）をポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離す
る［Ｊ． Ｃ． Ｅｄｍａｎ、 Ｒ． Ｈ． Ｈａｌｌ
ｅｗｅｌｌ、Ｐ． Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、Ｈ． Ｍ．
Ｇｏｏｄｍａｎ および Ｗ． Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ
の “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏ
ｌ ２９１（１９８１年）、５０３〜５０６頁参照］。 この断片に約１０乃至１５のデオキシチジンヌクレオチ
ド残分の尾端をつける（Ｎｅｌｓｏｎおよび Ｂｒｕｔ
ｌａｇ、ｓｕｐｒａ 参照）。ついでこの断片を尾端を
つけたベクターと交配し、そしてその混合物を用いて
Ｓ． ｃａｔｔｌｅｙａのプロトプラストにトランスフ
ェクションを行なう。生じたプラークからファージを単
離し、そしてそれらのＤＮＡを制限分析によってＢ型肝
炎表面抗原断片の挿入について調べる。溶原菌を単離し
、そして３５Ｓ−システイン標識タンパク抽出物の免疫
沈殿によって（Ｅｄｍａｎ 等、ｓｕｐｒａ参照）、予
期したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−Ｂ型肝
炎表面抗原融合タンパク質（ネオマイシン遺伝子のアミ
ノ末端のデオキシグアノシン尾端から由来する短いグリ
シン残分によって結合されている）の産生の有無を調べ
る。挿入されたＢ型肝炎表面抗原断片は正しい配位と正
しい読み枠になければならないから、雑種クローンの６
つのうちのわずか１つぐらいがその融合タンパク質を産
生するにすぎないだろう。
【図１】ファージＴＧ１の電子顕微鏡写真を示す図であ
る。
る。
【図２】ファージＴＧ１の制限地図を示す図である。
【図３】ファージＴＧ１の欠失突然変異体の制限地図を
示す図である。
示す図である。
【図４】雑種ファージＴＧ６とＴＧ７および欠失突然変
異体を示す図である。
異体を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【１】 アクチノファージＴＧ１（ＡＴＣＣ３９０７
８）またはその欠失もしくは挿入変異体ファージのゲノ
ムおよびそのゲノム変異体中に付加的ＤＮＡを組み込む
ための方法であって、該方法が、該ゲノムまたは変異体
ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断し、切断された
ＤＮＡに付加的ＤＮＡを組み合せ、このＤＮＡ混合物を
処理して連結を起こさせ、該付加的ＤＮＡと該バクテリ
オファージの双方のＤＮＡを全部または一部を共に組み
込んでいるバクテリオファージ、あるいはその雑種ファ
ージを形成させることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36855182A | 1982-04-15 | 1982-04-15 | |
| US36854482A | 1982-04-15 | 1982-04-15 | |
| US368544 | 1982-04-15 | ||
| US368551 | 1982-04-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58066859A Division JPS58198290A (ja) | 1982-04-15 | 1983-04-15 | Ｄａｎクロ−ニングベクタ−ｔｇ１，その誘導体，産物およびクロ−ニングの方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04365477A true JPH04365477A (ja) | 1992-12-17 |
| JPH0565156B2 JPH0565156B2 (ja) | 1993-09-17 |
Family
ID=27004220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3272989A Granted JPH04365477A (ja) | 1982-04-15 | 1991-10-22 | Ｄｎａクローニングベクターｔｇ１ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0094506B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04365477A (ja) |
| DE (1) | DE3378218D1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8333659D0 (en) * | 1983-12-16 | 1984-01-25 | Pfizer Ltd | Cosmid cloning vectors |
| JPS6158589A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 |
| DE3584866D1 (de) * | 1984-09-12 | 1992-01-23 | Chiron Corp | Hybridpartikel-immunogene. |
| AU603145B2 (en) * | 1986-10-14 | 1990-11-08 | Shionogi & Co., Ltd. | Aminoglycoside phosphotransferase-proteinfusions |
| US6245504B1 (en) * | 1999-03-26 | 2001-06-12 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Transducing phages of Actinomycetales |
-
1983
- 1983-04-12 DE DE8383103520T patent/DE3378218D1/de not_active Expired
- 1983-04-12 EP EP83103520A patent/EP0094506B1/en not_active Expired
-
1991
- 1991-10-22 JP JP3272989A patent/JPH04365477A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0094506A2 (en) | 1983-11-23 |
| DE3378218D1 (en) | 1988-11-17 |
| EP0094506A3 (en) | 1985-08-07 |
| JPH0565156B2 (ja) | 1993-09-17 |
| EP0094506B1 (en) | 1988-10-12 |
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