JPS62285061A - 自律神経系代謝物の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （イ）産業上の利用分野 この発明は、自律神経系代謝物の分析法に関する。さら
に詳しくは、種々の自律神経系代謝物の分離分析法に関
する。

〈口）従来の技術 バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、ホ干バニリンＭ　（Ｈ
ＭＡ）　及Ｕｔ＜＝＋）ル乳酸（ＶＬＡ）は、各々自律
神経伝達物質であるノルエピネフリン、エピネフリン、
ドーパミン及びドーパの最終代謝物であり、尿中のこれ
らの濃度を測定することにより褐色細胞腫、神経芽細胞
腫などの診断が行なわれている。また、５−ヒドロキシ
インドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）は、知覚・腫眠・内分
秘及び精神行動等に関与しているセロトロンの代謝物で
あり、尿中濃度測定は、種々の精神軽疾患の診断上重要
である。そしてこれら種々の自律神経代謝物は通常尿中
に複数種存在しているため、これらの濃度測定は高速液
体クロマトグラフィーによる分離分析が必要とされてい
る。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら、これらの複数の自律神経代謝物コトニ前
記ＶＭＡ、ＨＶＡ、ＶＬＡ及び５−１−Ｉ　ＩＡＡつい
て、汎用性の高い逆相り［１マドグラフイー用カラムを
用いて単一の移動相で一斉に分離分析して各濃度を測定
することは困難であった。例えば、検出器として蛍光光
度計を用いる場合、これら各成分の蛍光強度が最大とな
るように移動相のｐＨを中性付近に調整することが高感
度測定上必要であるが、この場合、ＶＭＡと他成分の保
持時間が著しく相違し、言い換えれば、ＶＭＡを分析す
るのに適当な時間に溶出させようとすると他のＨＶＡ、
ＶＬＡ等の溶出に相当な時間を要し、側底実用に供し得
ない。このため移動相組成を時間と共に変える繁雑なグ
ラジェント溶離法を採用せざるを得なかった。

また、グラジェント溶離法によれば、ベースラインが安
定しないため、蛍光検出の代りに、いわゆるＥＣＤ等を
用いた電気化学的検出を行なえないという不都合があっ
た。

この発明は、かかる状況に鑑みなされたものであり、こ
とに自律神経代謝物を単一の移動相で一斉にかつ高感痘
に分離分析できる分析法を提供しにつとするものである
。

（ニ）問題点を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、自律神経系代謝物を含む試
料を高速液体クロマトグラフィーに付すことからなり、
該クロマトグラフィーの分離カラムとして逆相クロマト
グラフィー用カラムを用い、移動相として、正電荷を有
するカウンターイオンとホウ酸を含有しｐＨが中性域に
調整された水性溶液を用いて自律神経系代謝物を分離分
析することを特徴とする自律神経系代謝の分析法が提供
される。

この発明の最も特徴とする点は、中性域の移動相を用い
るに際し、該移動相中に自律神経系代謝物のカウンター
イオンを添加すると共にホウ酸を共存せしめた点にある
。

この発明の分析対象の自律神経代謝物としては、ＶＭＡ
、ＨＶＡｌＶＬＡ、５−ＨＩＡＡやインドール酢酸（Ｉ
ＡＡ）等が挙げられ、これらを含む試料としては生体試
料、ことに尿が挙げられる。

これら生体試料は通常、タンパク成分等の夾雑物を除い
た後、分析に供される。この発明の分析法は、ことにこ
れらの代謝物のうち少なくとも二種以」ニ共存しうる場
合に有用であり、とくにＶＭＡ。

ＨＶＡ、ＶＬＡ及び５−Ｈ’ＩＡＡの共存時の一斉分析
に有用である。

この発明に用いる分離カラムとしては、当該分野で公知
の種々の逆相クロマ１〜グラフイー用カラムが使用でき
、例えばいわゆる０ＤＳ−シリカカラムが適している。

また移動相のベースとなる媒体としては中性域の緩衝液
が用いられ、これらの緩衝液は通常の緩衝水溶液のみな
らず保持時間調整用の親水性有機溶媒が混合されたもの
であってもよい。これらの具体例としては、ｐＨ６〜８
の緩衝水溶液（例えば、リン酸緩衝液）やこの緩衝水溶
液とメタノール又はアセトニ］〜リルとの混合量衝液が
挙げられる。全体の溶出速度を上稈させる点で、通常、
これらの混合緩衝液を用いるのが好ましく、この際、親
水性有機溶媒の混合量は、２０ｗｔ％程度迄で充分であ
り、とくにメタノールの場合ｌＱｗｔ％稈度迄で充分で
あり、８〜１０ｗｔ％が好ましい。

この発明に用いる正電荷を有するカウンターイオン源と
しては、第三級アミン又は第四級アンモニウム塩か適し
ており、例えばトリエチルアミン、１〜リブチルアミン
、テトラブチルアンモニウム塩などが挙げられる。これ
らの移動相中の添加濃度は１〜２０Ｃ１＋Ｍ程度が適し
ている。

一方、この発明に用いるホウ酸の移動相中の添加濃度は
１０〜５００ｍＭ程度が適している。

この発明の方法は、通常の高速液体クロマトグラフ装置
を用いて実施することができる。分析対象の試料は、上
記移動相中に直接導入してもよいが、生体試料を対象と
する場合には夾雑物を予め除いた後に導入すべきであり
、夾雑物が除かれた状態で各代謝物が移動相を通じて分
離カラムへ供給されるようプレカラム、前処理用カラム
等を用いて切換流路構成さた装置を用いるのが好ましい
。

また、検出は蛍光検出が適しているが、電気化学的検出
によって行なってもよい。

（ホ）作用 この発明において、正電荷を有するカウンターイオンは
、逆相イオンペアクロマトグラフィーの原理によりＶＭ
Ａと他成分との相対保持を小さくするよう作用し、これ
により、ＶＭＡと他成分との溶出時間をバランスよく近
接させることが可能となる。さらに、ホウ酸は、上記カ
ウンターイオンの存在下で分離が不充分なＶＭＡ以外の
他成分、ことにＨＭＡやＶＬＡ等を効率良く分離するよ
うに作用する。この作用は、ホウ酸が錯形成能を有する
ＶＬＡと錯体を形成し、カウンターイオンとのイオンベ
ア形成を促進させて１−ＩＶＡに比して選択的に溶出を
遅らせるよう働くためと考えられる。

従って、ベースの緩衝液組成を、意図する保持時間（検
出時間）に適合するよう最適化することにより、各成分
が短時間でかつ明確に分離されることとなり、中性域の
移動相を用いているため、検出感度の点でも好都合であ
る。

〈へ）実施例 第１図は、この発明の分析法を実施するだめの装置を例
示する構成説明図である。図において４は正電荷を有す
るカウンターイオンとホウ酸とを含有する中性域の緩衝
液からなる移動相であり、高圧ポンプ７、プレカラム９
、切換バルブ１１及び前処理用カラム１２を通じて逆相
クロマトグラフィー用カラム１３へ供給され、さらに蛍
光光度計１４へ移送される。なお、１５は記録計であり
、１７は恒温槽を示す。

一方、２及び３は各々前処理液及び後処理液であり、前
者は試料導入部１０から導入された試料を前処理用カラ
ム１２へ移送してそこで一時的に保持させるためのもの
であり、後者は、前処理用カラムを洗浄するためのもの
である。即ち、試料導入部１０から導入される試料は、
まず高圧ポンプ６及びプレカラム８を介して供給される
前処理液により前処理用カラム１２へ移送しそこで一時
的に保持させるためのものであり、後者は、前処理用カ
ラムを洗浄するためのものである。即ち、試料導入部１
０から導入される試料は、まず高圧ポンプ６及びプレカ
ラム８を介して供給される前処理液により前処理用カラ
ム１２へ送られそこで一時的に保持され、伯の夾雑物が
ドレイン１６から除去される（この際、切換バルブ１１
は破線側とされる）。そして夾雑物が除かれた試料成分
は切換バルブ１１の切換により移動相４によりカラム１
３へ移送され、分離分析に供される。

上記装置１において、試料としてＨＶ’Ａ、５−ＨＩＡ
Ａｌｌ−ＩＶＡ及びＶＬＡを各々１００ｇ含む水溶液を
導入して分離分析を行なった。分析条件は以下の通りで
ある。

○移動相４：　　１００＋＋Ｍリン酸と１５０ｍＭトリ
エチルアミンと２００ｍＭホウ酸を含有するｐ）＋６．
７の水溶液１０部とメタノール１部との混合緩衝液（流
量１．５ｉ／／分） Ｏ分Ｍ’）Ｊラム１３　：　　Ｓｈｉｍ　−ｐａｃｈ　
　ＣＬＣ−０ＤＳカラム（■島津製作所製；６ｍｍφ×
１５０１川ｎ　；　　４０　℃　） ○検出波長：　励起波長２８０ｒｖ 蛍光波長３２０ｎｎ＋ Ｏ前処理液：　　２０ｍＭ酢酸（トリエチルアンモニ’
７ム）ＭｔｒＩｌ（ｐＨ４，７）Ｏ前処理用カラム：　
　５ｈｉｉ　−Ｐａｃｈ　　５ＰＣ−ＡＥ　Ｉカラム（
■島津製作所製；４ｍｍφ×１０ｍｍ　：　４０℃） ○後処理液：　　１００ｍＭｔ−リエチルアミンと１０
０１１１Ｍ酢酸をｈむメタノール溶液この結果を、第２
図に示す。図中１はＶＭＡ。

２は５−ＨＩＡＡ、３はＨＶＡ、４はＶＬＡである。

このように、各自律神経代謝物が短時間でかつ明瞭に分
離されていることが判る。従って、各々ピーク強度や面
積に基づいて簡便にその濃度を測定することができる。

なお、古川性及び検量線の直接性についても良好な結果
が得られ、６ケ月児尿を試料として用いた際に明瞭な分
析が行なわれていることが確認された。

（ト）発明の効果 この発明の分析法によれば、従来単一の移動相で同時分
析が困難であったＶＭＡ、５−）ＩＩＡＡ、１−Ｉ　Ｖ
　Ａ及びＶＬＡを、短時間で精度良く分離分析すること
ができる。従って多検体の連続測定に適するものであり
、ルーチン分析に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の分析法を実施する装置の一実施例
を示す構成説明図、第２図は、この発明の分析法により
分析結果を例示するグラフ図である。 ４・・・・・・移動相、 １３・・・・・・逆相クロマトグラフィー用カラム。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、自律神経系代謝物を含む試料を高速液体クロマトグ
   ラフィーに付すことからなり、該クロマトグラフィーの
   分離カラムとして逆相クロマトグラフィー用カラムを用
   い、移動相として、正電荷を有するカウンターイオンと
   ホウ酸を含有しｐＨが中性域に調整された水性溶液を用
   いて自律神経系代謝物を分離分析することを特徴とする
   自律神経系代謝の分析法。 ２、正電荷を有するカウンターイオン源が、第三級アミ
   ン又は第四級アンモニウム塩である特許請求の範囲第１
   項記載の分析法。 ３、水性溶液のベースが、ｐＨ６〜８の緩衝水溶液と親
   水性有機溶媒との混合緩衝液である特許請求の範囲第１
   項記載の分析法。 ４、自律神経系代謝物が、バニリルマンデル酸、ホモバ
   ニリン酸、バニリル乳酸、５−ヒドロキシインドール酢
   酸及びインドール酢酸から選ばれる特許請求の範囲第１
   項記載の分析法。