JPS6231693B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はトリコモナス症候群の治療処置に価値
を有する新規な異種ワクチンに関する。 膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）属
は原虫類（protozoa）に属し、人間の医学におい
て重要な原生動物門の系統的分類に従えば、原生
動物門の１綱である鞭毛虫類（Mastigophora）
あるいは鞭毛滴虫類（Flagellata）に分類され
る。膣トリコモナスは女性および男性の泌尿生殖
器系に見出される基本的には病原性の寄生虫であ
り、主として性交によつて伝搬されるが関節間の
分節を経由する感染も証明されている。 男性は女性の場合と同様、屡々この病原体の感
染に曝されてはいるが、男性の場合、臨床的症状
の発現の頻度は実質的に少ない。トリコモナス保
菌者の大部分は症状の訴えがなく、尿道炎の症状
である排尿量の過少に注意を払わない。 女性に対する、この病原体の感染の実際的な意
義はまず第一に膣の完全な化膿性炎症の結果、屡
屡正常な夫婦生活に決定的な影響を与える様な生
殖器管の症状の訴えにある。一般にこの病原体の
感染部位は膣のみに限定されるものではなく、病
原性の混合菌相を伴つて、ほとんどの場合トリコ
モナド（trichomonads）によつて上部生殖器管
系に運ばれ、卵管妊娠あるいはフアロピオ
（Fallopian）管の閉塞（不妊症）の危険を伴つた
子宮附属器の炎症（附属器炎）を誘導する。慢性
感染症ならびに再発の両者とも膣上部ならびに子
宮頚部の実質的な炎症を経過する。これら症状に
進行に従つて局所の組織は可逆的な形成障害から
頚部癌の初期的段階に至る範囲に変化する。トリ
コモナス症候群の複合的な臨床的相様の概略を下
記に述べる。 メトロニダゾール（Metronidazole）〔１−（２
−ヒドロキシエチル）−２−メチル−５−ニトロ
イミダゾール〕製剤は膣トリコモナス
（Trichomonas vaginalis）を破壊するために完
全に適合した製剤であり、この目的に適用させる
ため実際の治療に導入されてきたにも拘らず、多
くの場合この症候群は減少せず、場合によつて
は、むしろ増加の傾向にあり、国によつては人口
の3.5〜88％がこの病原体の感染による悩みを訴
えており、病気の伝染の比率は人口全体に及んで
いる。 感染症に拡散および繰辺し観察される再感染症
は男女乱交の増加によつて大いに拍車をかけられ
ている。それに加えて、この感染症の難治性およ
び治療に対するある種の抵抗は、すべての卵巣内
分泌減退条件、すなわち身体が産生する卵巣分泌
ホルモンの相対的欠除が膣内上皮の増殖を阻害す
ることが知られているために一定の割合で拡大さ
れつつある排卵抑制ステロイド類の常用によつて
影響を受けている。 さて、ラクトバクテリウム・アシドフイラム
（Lactobacterium acidophilum）、さらにはラク
トバチラス・アシドフイラス（Lactobacillus
acidophilus）、乳酸菌（lactic acid
bacterium）、ラクトバクテリウム
（lactobacterium）、乳酸桿菌（lactic aeid
rhabdobacillus）、デーデルライン桿菌（Ｄｏ¨
derlein’ｓ rhabdobacillus）あるいはデーデル
ライン菌（Ｄ¨ｏderlein’ｓ bacterium）として
呼ばれている自然界に存在する多数の菌株（現在
約4000種もの異なつた菌株が知られている）の中
のある種のものからトリコモナス症候群の治療に
価値を有する異種ワクチンの製造が可能であるこ
とが見出された。 それぞれの菌株は1976年この症候群で悩んでい
る入院中の女性の膣から採取された。これらの菌
株は1977年10月17日付で凍結乾燥された状態のも
のがオランダ国バールン（Baarn）所在のCBS
（Centraalbureau voor Schimmelcultures）に
CBS465.77〜CBS472.77（ブタペスト条約にもと
ずく国際寄託）（８種類の菌株）という番号を付
けて寄託された。 前記の夫々の異ならる菌株は、形態学的に異な
つており、なかでも形成されるコロニーの大きさ
について言えば、ある菌株のコロニーは非常に小
さく、透明で円形をしており、いつぽう別のコロ
ニーは大形で表面が溝状である菊座形の形状を持
つている。顕微鏡的な観察によれば、前記８種類
の菌株はグラム陽性の多形性細菌に属しており、
連鎖状または柵状の形態を示している。 前記菌株の生化学的挙動は種々の炭素源につい
ての生育に関して次のような特徴を示す。（第１
表）

【表】

【表】 前記菌株のうちCBS466.77，467.77および
469.77の菌株は生化学的性質または醗酵的性質が
同じであることを示している。 本発明による異種ワクチンは生理的に容認され
た溶液中に分散された前記の好酸性乳酸桿菌
（Lactobacterium acidophilum）菌株の不活性化
された微生物菌体より成り、その微生物菌体は前
記菌株の一部あるいは全部であり、各菌株につい
て、ほぼ同一の菌体数を有するものである。少な
くとも３種の微生物がこのワクチンの中に存在す
ベきである。 本発明による異種ワクチンは前記のラクトバク
テリウム・アシドフイラム（Lactobacterium
acidophilum）の菌株の一部または全部を好気的
条件の下で液状養培地中で別個に培養し、培養終
了後、生成した生物学的材料を分離、不活性化
し、各々の菌株から得られた不活性化された微生
物菌体を、その個数が培養終了後あるいは不活性
化後に測定された培地中の濃度（培地１ml当りの
微生物菌体数）に対して、ほぼ反比例するように
生理的に容認された溶液中で相互に混合すること
により製造され得る。 前記の菌株は８種類の菌株全部を用いる製造法
を実施するように選ばれ、あらゆる場合に有効な
ワクチンが得られる。このあらゆる場合に有効な
ワクチンという用語はそのワクチンが全ての女性
患者に実際的に有効であるか、または、そのワク
チンを用いることによりトリコモナス症候群を感
染源の種類に関係なく有効に治療し得るワクチン
であることを意味する。すなわち、本発明のワク
チンにおいて、前記８種類の菌株の不活性化され
た微生物菌体の存在するものが、本発明において
好ましい形であり、前記８種類の菌株を用いるワ
クチンの製造が本発明方法の好ましい態様であ
る。 前記菌株の培養には微生物学において通常使用
されている各種の液状栄養培地を用いることがで
きる。下記の組成を有する栄養培地が実際に有利
であることが証明されている。

【表】 前記の液状培地はPH値を6.1〜6.8、好ましくは
約6.5に調整し、オートクレーブ中で115℃の温度
において20分間滅菌される。 滅菌された栄養培地は、例えばエルレンマイヤ
ー・フラスコのような滅菌された容器中に分注
し、各容器の内容物に前記各菌株のサンプルを接
種する。次に培養は温度32〜45℃、好ましくは約
37℃で、例えば48時間有利に実施される。この培
養時間後、または意図するワクチンの製造に対し
て十分な量の生物学的材料が生成されたならば、
その生物学的材料を無菌的条件の下で採取し、遠
心分離法で、例えば前記材料を毎分3000回転で１
時間遠心分離することにより材料に付着している
栄養培地を除去する。 生物学的材料から成る沈積物は、好ましくは生
理的塩化ナトリウム溶液中に再度懸濁状態にさ
れ、次に通常の方法によつて不活性化される。こ
の不活性化の方法として、ホルムアルデヒドおよ
びフエノールによる処理法が特に適している。前
記の懸濁液に対して、ホルムアルデヒドは0.3重
量％の濃度、フエノールは0.5重量％の濃度、処
理時間は３−５日間が有利であることが証明され
ている。不活性化された生物学的材料から、不活
性化するために使用し不活性化剤を除くため、ま
たは過剰のホルムアルデヒドおよびフエノールを
除くために不活性化処理後、懸濁液は例えば毎分
3000回転で１時間再度遠心分離される。 各々の菌株から得られた生物学的材料は、好ま
しくは生理的塩化ナトリウム溶液中に再度懸濁さ
れ無菌状態を試験され、そして次に述べる方法に
従つて、生育し得る乳酸菌の存在の有無が試験さ
れる。もし両方の試験の結果が陰性であることが
証明されたならば、すなわち前記の生物学的材料
が本発明のワクチンの製造に適するならば、培地
の濃度あるいは培地液体１ml当りの微生物菌体の
個数を各菌株について測定する。 もし何等かの理由に基づいて、不活性化後、直
ちに各々の生物学的材料の混合が可能でない場合
には、対応する懸濁液は暫時約４℃の温度で保存
することが可能である。さらに各々の菌株の不活
性化された微生物菌体は凍結乾燥し、その状態で
約４℃の温度で保存することも可能である。この
凍結乾燥された菌株は、この温度を変更しなけれ
ば、少なくても３年間の期間保存することができ
る。前記の凍結乾燥に適する保護コロイドとして
は特に5.6重量％のゼラチン、37.5重量％の蔗糖
および0.5重量％のラクトビオン酸カルシウム
（calcium lactobionate）を含む媒体があり、凍結
乾燥は24時間行なうことが有利である。 最終的には、各々の菌株から得られ、不活性化
された生物学的材料は得られたワクチン１ml当り
の各々の菌株の微生物菌体数がほぼ同数になるよ
う混合される。得られたワクチンは、その１ml当
りに約14×10⁹個の菌体を含有する濃度に達する
よう生理的塩化ナトリウム溶液で有利に希釈され
る。 前記のワクチンは通常、その乾燥物を基準とし
て3.68mg％の総窒素分（キエルダール法による測
定）を含有する。前記のワクチンには、例えばホ
ルムアルデヒドあるいはフエノール（ホルムアル
デヒドまたはフエノールの濃度は例えば0.25重量
％）、あるいはエチル−メルクリチオサリチル酸
ナトリウム（チオメルサール“Thiomersal”）の
ような保存剤の添加が有利であることが証明され
ており、ワクチンはアンプルに充填する前に熟成
するために温度４℃において約30日間保存され
る。充填されたアンプルには前述のワクチン0.5
mlを含有することが好ましい。勿論、これらの最
終工程は無菌条件下で発熱物質の存在しないガラ
ス器具中で行なわなければならない。 前記アンプル内容物もまた凍結乾燥することが
可能であり、使用するまでの間、乾燥アンプルの
形で望ましくは約４℃の温度にて保存することが
可能である。前記ワクチンの貯蔵寿命は、通常の
アンプルの形であれ、または乾燥アンプルの形で
あれ、貯蔵温度が２−８℃（通常の冷蔵庫の温
度）であれば少なくとも３年間は保つ；貯蔵温度
が約20℃の場合ワクチンの貯蔵寿命は約６ケ月で
ある。不活性化ワクチン（死菌ワクチン）に対し
て国連世界保健機関（World Health
Organization）によつて許されている使用までの
最長貯蔵寿命は３年間であることにもまた注意す
べきである。 治療に使用するに先立ち、前記ワクチンに対し
て下記の試験を実施しなければならない。 １ 無菌試験（第１次無菌試験） ２ 毒性試験 ３ 抗原作用試験 ４ 生育し得る乳酸菌（lactobacteria）の存在験
（第２次無菌試験） これらの試験は世界保健機関の規定
（Requirements for Biological Substance，
Technical Reports of WHO No.323，1966）お
よび欧州薬局方第版〔European
Pharmacopoeia （1971）〕の規定に従つて実
施することが望ましい。 無菌試験は１mlづつのワクチンをチオグリコレ
ート栄養培地の入つた試験管ならびにサブロー・
ブイヨン（Sabouraud′s bouillon）の入つた試験
管に注入し、これらの試験管を温度37℃において
10日間保温する、同様に処理された対応する試験
管も同様に温度25℃において同じ長さの期間保温
した。両方の系統の全ての試験管が無菌状態であ
ることが判明した。 毒性試験はモルモツトおよび白ネズミについて
実施した。５mlのワクチン（ヒトの患者に対して
計画された使用量の10倍以上の量）を平均体重が
300ｇのモルモツト５匹の各々に筋肉内注射で投
与した、25mlは各々の後脚に注射した。14日間の
観察期間後、５匹の試験動物の健康状態には変化
が見られず、処置した脚部に何等の反応も観察さ
れなかつた。さらに、平均体重が20ｇの白ネズミ
10匹の各々の後脚に0.5mlづつのワクチンを筋肉
内注射で投与した。14日間の観察期間後、10匹の
ネズミの健康状態には変化が見られなかつた。 抗原作用試験は最初モルモツトについて生体内
試験を行なつた。前述のパラグラフに示した試験
動物のうちの３匹の各々に14日後１mlのワクチン
を胃内（intracardially）投与した；相対的に高
投与量であつたにも拘らず、アナフイラキシ一様
の反応は観察されなかつた。次に前記のワクチン
は健康人血清のサンプルに対してオクテルロニー
免疫拡散法による試験管内試験を行なつた。陽性
反応は何等観察されなかつた。 生育し得る乳酸菌の存在試験については、これ
ら微生物の分離、同定に適する固形の栄養培地上
でワクチンの試料を培養した。この目的のために
は下記の組成を有する栄養培地が適している： 水 800ml トリプカゼイン（Tripcasein） 16ｇ 溶液No.１ 50ml 溶液No.２ 10ml 溶液No.３ 10ml 溶液No.４ 10ml 新鮮なイースト 100ｇ ウイツト・ペプトン（Witte peptone） 10ｇ 可溶性デンプン、0.5重量％（溶液の形で） ５ｇ 水を加えて全量を 1000ml に調製する。 〔上述の溶液No.１〜４は全て水溶液であり、下
記の組成を有する： 溶液No.１：10重量％のNaClを含有 溶液No.２：２重量％のKClならびに５重量％の
Na₂Co₃を含有 溶液No.３：２重量％のCaCl₂ならびに１重量％の
MgCl₂を含有 溶液No.４：2.5重量％のK₂HPO₄を含有〕 最終的に得られた栄養培地の溶液に25ｇの寒天
を加え、PH値を5.5−6.7、望ましくは約6.0に調整
し、オートクレブ中で115℃の温度にて20分間滅
菌する。次に100mlの水の中に３ｇの麦芽糖、10
ｇのブドウ糖および10ｇの乳糖を含有する溶液を
添加し、１重量％のシステイン塩酸塩を含む溶液
30mlを加える。これら各々の溶液は最初、例えば
G₅ガラスフイルターのような滅菌フイルターで
滅菌した。最後にフイブリンを除去した人血の10
重量％をこの培地に添加した。このようにして調
製された血液寒天栄養培地に前記ワクチンの試料
を接種し、37℃の温度で培養した。対照試料とし
て同一条件下でラクトバクテリウム・アシドフイ
ラム（Lactobacterium acidophilum）の試料を
接種、ならびに培養に用いた。 これらの試験において、前記のワクチン中に生
育し得る菌体は検出されなかつた、これはホルム
アルデヒドおよびフエノールを用いる望ましい方
法による不活性化が完全であることを証明するも
のである。したがつて、本発明によるワクチン
は、所謂死菌ワクチンである。いつぽう本発明の
ワクチンは使用した微生物とは異なるタイプの微
生物、すなわち膣トリコモナス（Trichomonas
vaginalis）によつて起される感染に対して作用
し、その２次的現象を示すので、異種ワクチンの
カテゴリーに属するものである。 本発明のワクチンはラクトバクテリウム・アシ
ドフイラム（Lactobacterium acidophilum）に
対する、特にトリコモナス症候群の場合、膣のPH
値の病理学的変化に対して部分的に役立つ前記好
酸性乳酸桿菌の変則的かつ多形の形態に対する特
別の抗体を形成させる作用を有するものである。
この免疫性を与える作用は下記に述べるように動
物実験ならびに臨床試験の両方によつて証明され
ている。 動物実験において、体重が夫々2950ｇおよび
3200ｇの２匹のウサギを用い、各回0.5mlづつの
ワクチンを２週間の間隔で２回静脈内に接種し
た。２回目の処置の１ケ月後、試験動物から採血
し、血清を分離した。もし抗体が生成されていれ
ば、この血清は少なくとも１：50の希釈率におい
て、ワクチンを製造した乳酸桿菌と特異的な凝集
反応を起す筈である。；この場合、試験した時の
希釈率において前記の血清は陽性の凝集素力価を
示す。１匹目ならびに２匹目のウサギの場合、
各々血清希釈率が１：10の時接種前の凝集素力価
は陰性であつた；２回目の処置の１ケ月後には希
釈率が夫々１：160および１：80の場合、凝集素
力価は陽性であつた。 本発明の新規なワクチンはトリコモナス症候群
および急性、慢性ならびに無症候性のトリコモナ
ス症に対する治癒的かつ予防的処置を可能にす
る。治癒的使用の場合でも、また予防的使用で
も、次に示す用量が推奨される：すなわち0.5ml
（約７×10⁹個の菌体数）の量を筋肉内に３回、２
週間の間隔で投与し、次にこの処置の１年後に同
量（0.5ml）の注射を補強のために行なう。 臨床試験は前述の用量を適用して行ない、97名
の女性患者から採取した血液について血清学的検
査を行なつた。血液は所定のスケジユールに従つ
て患者から採血し、乳酸桿菌抗体の存在を検出す
るために分離した血清を検査した。この目的のた
めに幾何級数的の比率（１：10〜１：1280）に希
釈された血清は抗原または対応する凝集原で処理
され、凝集反応を観察した。使用した凝集原は新
しく製造された同一菌株の好酸性乳酸桿菌の不活
性化した菌体をワクチン自身と同じ比率で同一の
濃度（14×10⁹個の菌体数）に懸濁して製造した
懸濁液で製造してから３ケ月以内の鮮度のもので
あつた；不活性化には懸濁液に対してフエノール
を0.25％の濃度になるよう用いた。培養の結果、
時間の経過に伴つて発現し、増加する血清中の凝
集素は下記の第２表に示すような力価を明示す
る。

【表】 減少は、幾人かの患者が検査を受けるた
めの来院をしなくなつた結果である。）
上記の力価の幾何平均値から、例えば培養終了
２週間後に力価が6.3の平均フアクターによつて
上昇したことが判る。接種開始１年後、すなわち
補強的に投与した注射（booster injection）時に
凝集素力価は依然として前よりも2.1倍も大き
く、これによりワクチン接種により永続的な成功
をある程度説明することができる。 ワクチン接種直後、すなわち第１回目と第２回
目の採血の間の期間における凝集素力価の増加を
測定すれば、患者数に関して第３表のとおり分布
データーが得られる。

【表】 下記に纒めた臨床報告は本発明のワクチンを使
用して得た処置の成功の概要を示す。年令が15−
59才に亘りトリコモナス症候群で悩んでいる200
名の女性の外来患者をワクチン（前述の８種類の
菌株から製造されたもの）を用いて処置した；検
査は、長期間に亘り行なわれある患者の場合、２
年以上に亘つて行なつた（患者のうち２名はもは
や検査のための通院をしなくなつた。）135名、す
なわち患者数全体の69％は経口用または膣用製剤
特にメトロニダゾールによつて以前再三治療を施
されていたが、再感染のために長期間の成功を治
めたことはなかつた。本発明のワクチンによる治
療開始前に血液および尿検査に加えて診膣鏡およ
びパパニコロー（Papanicolaou）膣内容物塗沫標
本検査を含む婦人科学的検査を実施した；加うる
に膣内容物標本は外陰、膣、頚管および尿道から
採取し、これらの無処理の標本ならびにグラム
（Gram）染色標本ならびにギムザ（Giemsa）染
色標本を調製し、膣トリコモナス（Trichomonas
vaginalis）の培養を始めた。これらの検査は治
療処置開始後、６週間、４ケ月および12ケ月繰返
した。 治療開始前、200名の女性患者のうち145名
（72.5％）は重篤な膣炎、〓痒症、多量の緑黄
色、悪臭を有する膣分泌物、性交不快症、排尿障
害および類似の症状を伴つたトリコモナス症候群
であることを宣告されており；膣鏡による検診に
よつて膣上皮ならびに膣頚管の水腫および発赤が
観察された。加うるに61名の患者は膣頚管の紅色
肥厚症を示し、他の13名は慢性の子宮頚管炎を示
していた。残りの55名（27.5％）の患者の症状は
顕著ではなく−軽度の膣炎であつた。 治療は前述の用量のワクチンを用いて実施され
た。軽度の膣炎の場合は急性の症状を軽減するた
めに、追加の治療を施すことなく、抗生物質を局
所に適用し、重症の場合にはモニリア症
（Moniliasis）に対して有効なラクトバクテリウ
ム・アシドフイラム（Lactobacterium
acidophilum）の菌株から成る菌体製剤を局所に
併用した。しかしながら、何れの場合にもメトロ
ニダゾール（metronidazole）あるいは類似する
ニトロイミダゾール（nitroimidazole）の誘導体
は投与しなかつた。 膣分泌物がジロベツク（Jirovec）〔W.リツツ
エルフエルト（W.Ritzerfeld）、デル・ギネコロ
ゲ（Der Gyａ¨kologe）第２巻第１号、第２−６
頁（1969年）〕の記載に基づく下記の区分に分類
されるならば、治療の成功は第４表に示されたと
おり明白である。 クラス：健康な女性の分泌物 クラス：非化膿性の細菌性分泌物 クラス：化膿性の細菌性分泌物 （クラス：淋疾−本発明の検査には発見例な
し） クラス：トリコモナス症（陽性の無処理標本） クラス：膣糸状菌病（鵞口瘡カンジダ症）

【表】 ９名の患者については接種終了の３ケ月後に行
なつた第２回目の検査時に依然として膣トリコモ
ナス（Trichomonas vaginalis）が顕微鏡的に検
査され、治癒困難な状態であり、トリコモナス撲
滅剤を経口的に投与する処置を講じてもこの状態
は変化しなかつた。さらに、12ケ月後であつても
慢性子宮頚管炎または塊状の紅色肥厚症の形の頚
管の変化はなかつた。多分、これらの失敗は、適
切に接種したにも拘らず、これらの女性患者が十
分な量の抗体を産生する悩力を持つていないとに
起因しているのであろう。 治療を受けた198名の患者のうち、189名（95.5
％）は12ケ月後、膣分泌物の区分がクラスおよ
びであることを示し、トリコモナス症に関する
限り治癒したものということができる。この治癒
率は何等追加の治療を施さなかつた軽度の膣炎の
55名の患者について達成された。前記の患者達は
継続して診察を受けており、ある患者は２年以上
に亘つて診察を受けている；この期間内に再発ま
たは再感染症の発現はなく、これは、この分野の
医学における新しい進歩であり、トリコモナド
（trichomonad）を撲滅するための安定した膣炎
治療手段の再出現を示唆するものである。最後に
本発明のワクチンは頚部の変化ならびに膣頚部の
病変に対しても有益な効果を持つているように見
受けられる。本発明のワクチンの総合的な成果
は、患者の大部分がすでに各種の化合物を用いる
局所的ならびに系統的な治療を受けていながら、
僅かに一時的な成果しか得ていなかつたことを思
い浮べれば、極めて顕著なものである。 注射部位に屡々見られる発赤または僅かな腫張
を除けば、本発明のワクチンを用いる治療期間中
あるいはその直後、何れの患者についても望まし
くない副作用は見られなかつた。さらにアレルギ
ー性反応または毒性反応も観察されなかつた。 本発明のワクチンは急性の熱性感染症、造血系
統の疾病または重篤な腎不全症の場合には使用す
べきではない。 本発明のワクチンを用いて治療を受けている女
性の配偶者に対して同時に処置を施すことは明ら
かに望ましいことであるが、その女性はワクチン
接種の結果、免疫性を獲得するので、女性患者の
観点から考慮すれば絶体的な必要性があるもので
はない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ CBS465.77、CBS466.77、CBS467.77、
   CBS468.77、CBS469.77、CBS470.77、
   CBS471.77およびCBS472.77の寄託番号を有する
   ラクトバクテリウム・アシドフイラムの菌株を不
   活性化した微生物と、生理的に容認された溶液か
   ら成り、この微生物が菌株の一部あるいは全部で
   あり、菌体数が菌株毎にほぼ等量存在することを
   特徴とするトリコモナス疫候群治療処置用異種ワ
   クチン。 ２ 存在する不活性化された微生物は寄託された
   菌株の少なくとも３種からなる、特許請求の範囲
   第１項記載の異種ワクチン。 ３ 不活性化された微生物菌体を１ml当り約14×
   10⁹個含む、特許請求の範囲第１項または第２項
   記載の異種ワクチン。 ４ 保存剤を付加的に含有する、特許請求の範囲
   第１項から第３項のいずれか１項に記載の異種ワ
   クチン。