JPS6233878B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (a) 産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための培養方法
に関するものである。さらに詳しくは、大規模に
細胞培養を行うに施した方法に関するものであ
り、効率よく細胞に栄養分を与え、一方副生する
生育阻害、物質を除去する目的で作られたサスペ
ンジヨン型細胞培養システムにおける細胞培養方
法に関するものである。 (b) 従来技術 大規模による細胞大量培養は例えばウイルス、
ワクチン、インターフエロンなどの抗ウイルス
剤、あるいはホルモンなどの生物薬品の製造に必
須である。殊に近年特定タンパク質などを標的と
するモノクローナル抗体の生産は抗体産生細胞と
ミエローマによるハイブリドーマ大量培養による
ものであり、その技術の解決は工業的に重要なテ
ーマである。 従来、細胞培養は一般にシヤーレ試験管、培養
びんなどを用いて実験室的規模で行なわれてい
る。 一方近年細胞の大量培養法及びそのための装置
として、いくつかの提案がなされている。これら
の提案は、大きく分けて付着培養（anchorage
dependent culture）と浮遊培養、つまりサスペ
ンジヨン培養（suspension culture）との２つの
方式に分類されるが、これらの方式は培養される
細胞の特性によつていずれかに決められる。 本発明はサスペンジヨン型の細胞培養における
改良方法に関する。そのサスペンジヨン培養によ
つて細胞を培養する方法に関し、最近いくつかの
提案があり、例えばマグネテイツクスターラーも
しくは機械的に駆動されるシヤフト上の羽根車に
よつて、スピナーフラスコの中に調整された撹拌
機能を設けた培養方法などが提案されている（例
えば特開昭57−65180号公報参照）。 しかし上記の方法においては、一定量の栄養分
の中で培養されるため細胞の生長増殖は比較的低
い密度で停止する。 (c) 発明の構成 そこで本発明者らは、前記した如き従来法にお
ける欠点を克服し、サスペンジヨン培養法よつ
て、大量且つ高密度の培養が可能な培養方法につ
いて研究を進めた結果、本発明に到達した。 すなわち、本発明はサスペンジヨン型細胞培養
槽のサスペンジヨン液中に、細胞培養に必要な栄
養分及び生育阻害物質を実質的に透過するが、細
胞は実質的に透過しない壁膜より形成された中空
糸の多数よりなる毛管束であつて、その毛管束の
両端は固着層により固着されたユニツトの少くと
も１個が収納され、(i)サスペンジヨン液中の培養
液をユニツトの中空糸の壁膜を介してユニツトの
両端又は一端から導管を通じて培養槽外へ排出
し、(ii)しかる後、培養槽外から細胞培養に悪影響
を与えない水性液体媒体を導管を通じて該ユニツ
トの両端又は一端へ供給して該液体媒体を中空糸
の壁膜を介してサスペンジヨン液中へ流入し、前
記排出と流入とを交互に繰返すことを特徴とする
細胞培養方法である。 さらに前記本発明方法は、サスペンジヨン型細
胞培養槽のサスペンジヨン液中に、少くとも２個
の該ユニツトが収納され、それぞれのユニツトは
前記排出と流入が交互に繰返されるように作動さ
れ、且つ該培養槽中のサスペンジヨン液中の培養
液の排出が停止しないように各ユニツトの排出と
流入の間隔を互いに制御することによつて一層有
利に培養することができる。 かくして本発明の培養方法によれば、サスペン
ジヨン型の培養槽におけるサスペンジヨン液中
に、少くとも１個の前記毛管束よりなるユニツト
が沈められており、細胞が産出した老廃物、代謝
産物、その他生育阻害物質を含んだ古い培養液
が、サスペンジヨン液から中空糸の壁膜を介して
中空糸中へ流れユニツトの両端又は一端から導管
を経て培養槽外へ排出され、或る時間経過すると
この排出を停止し、次いで培養槽外から細胞培養
に悪影響を与えない水性液体媒体を導管を通じて
ユニツトの両端又は一端へ供給して該液体媒体を
中空糸の壁膜を介してサスペンジヨン液へ流入せ
しめられる。 従つて、本発明方法においては、サスペンジヨ
ン液中に沈められたユニツトによつて、それに設
けられた多数の中空糸の壁膜を介して水性液体媒
体のサスペンジヨン液中への供給と、サスペンジ
ヨン液中からの古い培養液へ排出とが交互に繰返
されるので、中空糸の壁膜の細孔に細胞やその他
固形物が詰り実質的な壁面積の効率低下を来すこ
とはなく、有利に水性液体媒体の供給と、古い培
養液の排出とをスムースに行うことができ、極め
て高密度の細胞培養が可能となる。 特に本発明方法においては、ユニツトを２個以
上別々に或いは適当に組合せてサスペンジヨン液
中に浸入することもでき、また簡単に２個以上を
直列又は並列に連結して使用することもできるの
で、細胞の種類と密度、培養条件、培養の規模の
変化に応じて容易に中空糸の壁膜の面積を適応さ
せることが可能である。 また本発明においては、少くとも２個のユニツ
トの組合せて使用し、それぞれのユニツトは、培
養槽のサスペンジヨン液中において液の供給と古
い培養液の排出が繰返されるように作動され、且
つ少くとも１個のユニツトは古い培養液の排出が
常時行なわれるように、つまり培養槽中のサスペ
ンジヨン液中の培養液の排出が停止しないように
各ユニツトにおける液の排出と流入の間隔を互い
に制御することができる。 本発明の細胞培養方法はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或い
は細胞を微小担体（マイクロキヤリアー）に担持
して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細
胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊
に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培養する
方式に有利に用いられる。 本発明の細胞培養方法において培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞であつてもよい。殊に本発明の培養
方法は、動物細胞の培養に適している。 本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養槽
中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的に
水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン
類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質など
の通常細胞培養に使用される添加成分が加えられ
ている。また培養液には血清を加えることもでき
るし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することも出来る。 本発明方法において、培養槽外からサスペンジ
ヨン液中にあるユニツトへ導管を通じて供給され
る“細胞培養に悪影響を与えない水性媒体”とし
ては、減菌水を主体としてこの中に前記添加成分
の一種又はそれ以上を加えて使用することができ
る。この水性媒体は培養に必要な全ての添加成分
を含んでいる新しい培養液であつてもよく、また
これら成分を全て含んでいる必要はなく、一部は
他の供給手段でサスペンジヨン液中に導入するこ
ともできる。また水性媒体としては、本発明方法
に従つてユニツトから導管を通じて培養槽外へ排
出された培養液（以下これを“古い培養液”とい
うことがある）を一部として使用することも可能
である。 本発明方法に使用されるユニツトを構成してい
る中空糸毛管は、種々の重合体よりなるものであ
ればよく、その重合体としては例えばセルロース
アセテート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリ
ル、弗素系ポリマーなどが好ましい例として挙げ
られる。 中空糸毛管の壁膜には多数の微細孔を有してお
り、その毛管の壁膜は、栄養分及び細胞の老廃
物、代謝生産物などを透過するが、細胞或いはそ
れが付着した微小担体又はマイクロカプセルは透
過しない大きさの細孔が多数設けられている。細
胞自体を浮遊させて培養させる場合、細孔の大き
さは細胞の大きさによつて左右されるが、一般に
平均孔径が10μ以下、好ましくは８μ以下が適当
である。一方微小担体（マイクロキヤリアー）の
表面に細胞を付着させて培養させる場合又はマイ
クロカプセルを使用して培養させる場合には、そ
れらが透過しない大きさの細孔である必要があ
る。 また、該毛管の壁膜は、水を或る程度透過する
能力を有することが望ましい。すなわち、該壁膜
は水の透過係数（ml／m²・hr・mmHg）が10以
上、好ましくは100以上であるのが有利である。
一方上限は特にないが、20000以下、好ましくは
10000以下が望ましい。 さらに該壁膜としては、栄養分や細胞の老廃
物、代謝生産物などの如き分子量の小さい化合物
は透過するが、分子量の大きい化合物（例えば
1000以上、好ましくは5000以上）は透過しない
膜、例えば限外濾過膜を使用することも可能であ
る。 以下添付図面により本発明の細胞培養装置を更
に詳細に説明する。 添付第１図は、本発明の細胞培養方法を実施す
るための概略図の一例を示すものであり、第２−
Ａ図、第２−Ｂ図及び第２−Ｃ図はそれぞれ本発
明におけるユニツトの概略図の一例を示したもの
である。 第１図は、２つのユニツト３−ａ及び３−ｂを
一対として作動させて培養する場合を示したもの
であり、第１図において、１はサスペンジヨン型
培養槽における培養本体であり、栄養物などを含
む水性媒体は、その供給槽６からポンプ７により
供給導管８を通り切り換え弁１２又は１４を経て
一つのユニツトへ送られる。一方他のユニツトか
らは古い培養液が排出され切り換え弁１３又は１
５を経て排出導管１１を通つてポンプ１０により
古い培養液の貯槽９へ送られる。 第１図に示されている２つのユニツト３−ａ及
び３−ｂは、多数の中空糸よりなる毛管束の両端
は固着層により固着されている。そしてその上部
は液の流出入口になつており、その下部は封止さ
れている構造を有している。 培養槽１には、細胞がサスペンジヨン液中を効
果的に浮遊するように撹拌装置２が第１図に示す
ように備え付けられていてもよい。撹拌２のよう
に回転型撹拌翼に限らずマグネツトスターラーで
あつてもよい。さらにサスペンジヨン液中の細胞
を効果的に浮遊させることができる他の撹拌効果
を奏する手段であつてもよい。 第１図の培養槽においては２つのユニツトが一
対となつている一つの組の場合について示されて
いるが、この一対の組は一つに限らず複数組使用
することもできる。またユニツトは一対の組とし
て使用しないで、一個の独立したユニツトを入れ
このユニツトに培養液の排出と水性液体媒体の供
給とを繰返して操作するようにしてあつてもよ
い。この独立したユニツトを多数使用することが
できることは云うまでもない。 さらに培養槽には、酸素、二酸化炭素や栄養素
の濃度、PHの値を測定し、それらを或る範囲に維
持する装置が一般に設置されているが、本発明の
細胞培養槽にもこれらの装置が備えられてもよい
ことは云うまでもない。しかし第１図にはこれら
の付属装置は省略されている。 本発明の培養槽に供給される新しい培養液は、
この中にブドウ等、蛋白質の如き栄養源、種々ア
ミノ酸、無機質、抗生物質などの細胞培養に必要
な成分を水溶液として含むものが使用されるが、
さらに血清を含んでいてもよく、また含んでいな
くてもよい。これら成分は必要な全てを培養液と
してユニツトを通して供給してもよいが、一部の
成分は他の供給手段によつてサスペンジヨン液中
へ導入することも可能である。一般に細胞培養に
は、酸素、二酸化炭素なども必要であるが、これ
らは新しい培養液に溶存させて供給してもよく、
さらに第１回に示すように弁１６を通してガス供
給管１７より直接サスペンジヨン液へ供給しても
よい。 第２−Ａ図、第２−Ｂ図及び第２−Ｃ図はいず
れも本発明方法に使用されるユニツトの種々の形
態の例を示したものである。これらの図において
矢印→は第１図の培養槽において切り換え弁１
２，１３，１４又は１５のいずれかに接続される
液の流出入口に結合した導管を示している。 第２−Ａ図のユニツトは基本的には、第１図の
ユニツトと同じ形態のものであり、多数の中空糸
よりなる毛管束の両端が固着層により固着され、
一方の端部に液の共通した流入口と排出口が設け
られており、他の端部は封止された構造を有して
いる。第２−Ｂ図は毛管束の両端が固着層に固着
され、その両端には液の出入口が設けられ、この
出入口にはそれぞれ導管が結合され、これら導管
が結合されて共通した液の流入口と排出口を形成
している構造を有している。また第２−Ｃ図は毛
管束の両端が１つの共通した固着層によつて固着
された形態であり、その両端部に液の共通した流
入口と排出口を有している構造を有している。以
上それぞれのユニツトは、基本的な型の一例を示
したものであり、他の若干の変更は当然許容され
る。これらユニツトは任意に複数個組合せて使用
することもできる。 本発明方法において１つのユニツトは、いずれ
も水性液状媒体（例えば新しい培養液）の供給と
古い培養液の排出とを交互に繰返しながら操作さ
れるが、その間隔は、細胞の種類、密度、培養条
件などによつて左右されるが、一般には１分乃至
１日、好ましくは５分乃至10時間の範囲で切り換
えることが出来る。 本発明方法は１つのユニツトをサスペンジヨン
液中に沈めて前述のように液の供給と排出を交互
に繰返しながら操作することもでき、またこのよ
うに操作されるユニツトを２個以上沈めてそれぞ
れ独立して操作してもよい。 しかしながら一般には２個又はそれ以上のユニ
ツトを使用するのが好ましく、その場合複数のユ
ニツトを互いに連動させて操作するのが有利であ
る。 複数のユニツトを互いに連動させて操作する場
合、培養槽におけるサスペンジヨン液の培養液の
槽外への排出が一時期においても停止することが
ないように（つまり常時古い培養液の槽外への排
出が行なわれるように）各ユニツトの液の排出と
流入の間隔を互いに制御するのが一層望ましい。
また２個のユニツトを一対としてサスペンジヨン
液中へ沈め、その一方は水性液体媒体がサスペン
ジヨン液中へ供給され、他のユニツトは古い培養
が排出されるように作動しており、それらの流れ
が交互に逆になるように切り換え弁を切り換える
ように操作してこのように一対のユニツトを交互
に作動させることにより水性液体媒体の供給と、
古い培養液の排出とを常時連続的に行い、かくし
て、しかも培養槽中のサスペンジヨンの液面を一
定の水準に維持することが容易に可能となる。 本発明方法を実施するに当つて、或るユニツト
における水性液体媒体の供給と古い培養液の排出
との間隔は任意に決定することができる。一般に
は古い培養液の排出は、細胞などが中空糸の壁膜
の細孔を塞ぎ排出量が少なくならない限り長時間
行うことができるが、30分以上10日以内が望まし
く、サスペンジヨン液中の細胞密度が小さいとき
は比較的長時間であり、逆に細胞密度が大きくな
ると短時間になる傾向がある。 一方水性液体媒体（例えば新しい培養液）の供
給は、前記排出よりも概して短い時間でよい。普
通１分以上であれば充分である。供給時間は供給
量（面積当り）によつても左右され、多いと短か
くてよい。逆に少ないと長くすることが必要とな
る。特に若干加圧して短時間に水性液体媒体を供
給することが有利であることが多い。 以上説明した本発明の培養方法によれば、サス
ペンジヨン型の培養において、新しい培養液の供
給と古い培養液の排出を連続的或いは半連続的に
行うので、高密度でしかも大量の細胞を培養する
ことが出来る。殊に本発明ではユニツトにおける
中空糸の壁膜の細胞に細胞その他の固形物が一時
的に詰つたとしても、長時間に亘つて詰ることは
なく、従つて効果的に培養液の交換を行うことが
出来、極めて高密度の培養を行うことが可能であ
る。 さらに本発明のユニツトは、単に２個以上或い
はこれを直列又は並列、或いは独立して２本以上
を適当に組合せて、装置の規模、細胞の種類、培
養条件などに合せながら使用することが容易であ
るという利点がある。 以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。 実施例 (1) ユニツトの性状； セルローズアセテート、アクリル酸ポリマー
及び硝酸セルロースよりなるポリマーアロイよ
り形成された中空糸の多数を用いて、添付図面
第２−Ａ図に示されるような片側が封止された
ユニツトを作つた。各中空糸の内径は320μで
あり外径は460μであつて、その壁膜は平均孔
径が0.2μの多数の微細孔を有していた。ユニ
ツトにおける中空糸の有孔長は36mmであり、中
空糸の総有効面積（外径基準）は80cm²であつ
た。なお使用した中空糸の透水率は４／m²・
hr・mmHgであつた。 (2) 培養槽の形状； 添付第１図に示したような構造をした内容積
が500mlのガラス容器を培養積として使用し
た。この培養槽には、第１図に示されているよ
うに２つのユニツトが収納されており、またマ
リン型撹拌子が装着されている。 また、培養槽内には二酸化炭素及び酸素の供
給導管が挿入されているが、これは第１図の５
に該当する。 (3) 新培養液組成； 使用した新しい培養液の組成は下記の通りで
あつた。 単位は特に断わらない限り１当りのｍＭ
（ミリモル）である。 NaCl 110.0ｍＭ KCl 5.0 MgSO₄ 0.55 MgCl₂・6H₂O − Ca（NO₃）₂・4H₂O − CaCl₂・2H₂O 0.74 NaH₂PO₄・2H₂O − Na₂HPO₄・12H₂O 3.41 CuSO・5H₂O 3.0×10^-6 FeSO₄・7H₂O 8.0×10^-4 Fe（NO₃）₃・9H₂O − ZnSO₄・7H₂0 8.0×10^-4 Alanine 0.075 Arginine・HCl 2.76 Asparagine・H₂O 0.63 Asparatic acid 0.30 Cysteine・HCl・H₂O 0.60 Cystine − Glutamic acid 0.27 Glutamine 6.84 Glycine 0.57 Histidine・HCl・H₂O 0.36 Hydroxyproline 0.24 Isoleucine 1.20 Lecine 1.26 Lysine・HCl 1.08 Methionine 0.33 Phenylalanine 0.45 Proline 0.48 Serine 0.81 Threonine 0.93 Tryptophan 0.09 Tyrosine 0.48 Valine 0.93 ｐ−Amino benzoic acid 3.7×10^-3 Biotin 4.1×10^-4 Pantothenate−Ca 2.6×10^-3 Cholin chloride 8.8×10^-2 Folic acid 4.1×10^-3 Inositol 2.6×10^-1 Niacinamide 1.2×10^-2 Pyridoxal・HCl 4.9×10^-3 Pyridoxine・HCl 2.5×10^-3 Riboflavine 5.6×10^-4 Thiamin・HCl 4.7×10^-3 Vitamin B₁₂ 2.5×10^-4 Lipoic acid 2.5×10^-4 Glutathicne 1.6×10^-3 Glucose 19.00 Hypoxanthine 7.5×10^-3 Putrescine・2HCl 2.5×10^-4 Pyruvate−Na 1.0 Thymidine 7.5×10^-3 Linoleic acid 7.5×10^-5 Phenol red 5.0mg／Ｌ HEPES 1.19ｇ／Ｌ NaHCO₃ 12.50ｍＭ Streptomycin 0.1ｇ／Ｌ Penicillin Ｇ 10^-5U／Ｌ Insuline 7.5μｇ／ml Transphclin ２μｇ／ml Ethanolamine 10μＭ／Ｌ Na₂SeO₃ 2.5×10^-9M／Ｌ (4) 培養方法； 前記培養槽に液容積が300mlとなるように新
しい培溶液を入れその中に２つのユニツトを挿
入した。それぞれのユニツトは第１図の６に示
すような新しい培養液供給槽と、古い培養液の
貯槽９とに切り換え弁を介して、それぞれ導管
で結合されている。それぞれの導管の途中に
は、ポンプが設けられており、２つのユニツト
は切り換え弁によつて一方のユニツトが新しい
培養液を培養槽に供給している時には、他のユ
ニツトは古い培養液が槽外へ排出されるように
互に逆の流れをするようになつている。 一方培養槽においてはCO₂ガス及びO₂ガスが
サスペンジヨン液中へ供給され、それらの供給
はそれぞれ系内のPH6.5〜７、溶存酸素量が３
〜4ppmの一定となるように制御された。 培養槽の培養液中にマウスミエローマ細胞
p3u1を親株とするマウスハイブリドーマ
4C10B6細胞株を１×10.⁵個／mlとなるように
加えた。この細胞は免疫グロブリン（IgG）生
産型の株である。 培養中のサスペンジヨン液は27℃に保持さ
れ、またマリン型撹拌子は60rpmの速度で回転
させた。培養開始後、細胞密度が１×10⁶個／
mlになつてから２つのユニツトの作動を開始
し、新しい培養液の供給と古い培養液の排出を
行つた。１つのユニツトにおける供給と排出の
間隔はほゞ12時間単位で行い、１日における新
しい培養液の培養槽への供給は約300mlであつ
た。しかし培養開始後５日経過後は、この新し
い培養液の供給を１日当り最高500mlまで徐々
に増加させた。 (5) 培養結果； かくして９日間培養を行つた結果は下記の通
りであつた。 なお本発明のユニツトを全く使用しない他は
全く同一条件で培養を行つた時の最終の細胞密
度は２×10⁶個／mlであつた。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養方法を実施するため
の概略図の一例を示したものであり、第２−Ａ
図、第２−Ｂ図及び第２−Ｃ図は、それぞれ本発
明の細胞培養方法に用いられるユニツトの形態の
例を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サスペンジヨン型細胞培養槽のサスペンジヨ
   ン液中に、細胞培養に必要な栄養分及び生育阻害
   物質を実質的に透過するが、細胞は実質的に透過
   しない壁膜より形成された中空糸の多数よりなる
   毛管束であつて、その毛管束の両端は固着層によ
   り固着されたユニツトの少くとも１個が収納さ
   れ、(i)サスペンジヨン液中の培養液をユニツトの
   中空糸の壁膜を介してユニツトの両端又は一端か
   ら導管を通じて培養槽外へ排出し、(ii)しかる後、
   培養槽外から細胞培養に悪影響を与えない水性液
   体媒体を導管を通じて該ユニツトの両端又は一端
   へ供給して該液体媒体を中空糸の壁膜を介してサ
   スペンジヨン液中へ流入し、前記排出と流入とを
   交互に繰返すことを特徴とする細胞培養方法。 ２ サスペンジヨン型細胞培養槽のサスペンジヨ
   ン液中に、少くとも２個の該ユニツトが収納さ
   れ、それぞれのユニツトは前記排出と流入が交互
   に繰返されるように作動され、且つ該培養槽中の
   サスペンジヨン液中の培養液の排出が停止しない
   ように各ユニツトの排出と流入の間隔を互いに制
   御することを特徴とする第１項記載の細胞培養方
   法。