JPS6235261A - タンパク質又は核酸の高感度検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、支持体中に電気泳動分離された生体成分の高
感度検出方法に関する。更に詳しくは、支持体中に電気
泳動分離されたタンパク質あるいは、核酸のような生体
成分を微量でも検出可能とする方法に関する。

〔従来の技術〕

血漿、尿、脳を髄液、羊水等の体液中のタンパク質や、
ＤＮＡ、　ＲＮＡ等の核酸などの検出及び同定には、支
持体を用いた電気泳動法が広く利用されており、生化学
、生物学、及び臨床医学の分野の研究に大きな貢献をし
てきた。

通常、支持体としては、ゼラチン、寒天ゲル、ｆ紙、デ
ンプンゲル、セルロースアセテート膜、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル等が用いられ、電気泳動法に
は、ゲル電気泳動、８Ｄ８電気泳動、等電点電気泳動、
免疫電気泳動等がある。１ｆｔ：、、二次元電気泳動に
工す、血漿タンパクのような複雑な組成のタンパク質混
合物からの分離も可能となった。

電気泳動分離されたタンパク質を検出する方法として、
従来色素により染色して行っていた。

最も普通に用いられている染料は、クーマツジ−ブリリ
アントブルーであり、その他に、アシドプラツク、クリ
スタルバイオレット及びファストグリーン等が使用され
ている。また、電気泳動分離され几ＤＮＡやＲＮＡは、
エチジウムブロマイドによる染色が行われている。しか
し、これらの染色法では、検出感度が低いため、尿や脳
を髄液の工うなタンパク質濃度の低い試ｙｐｒを分析す
る場合には、泳動前に濃縮操作が必要であり、そのため
分析の操作が煩雑と瀝す、また、濃縮時に、成分の変化
を伴うという欠点がある。

また、高感度検出という点から、ラジオアイソトープに
よる標１＆にして、検出することが行われ、オートラジ
オグラフィーとして用いられているが、放射性物質を取
扱うことから、実験操作上の危険性、複雑さに加えて、
アイソトープの廃棄の問題等容易に行える技術とは、い
い難い。

近年、電気泳動にニジ分離されたタンパク質及び核酸等
の高感度検出方法として例えば銀染色法が開発された。

銀染色法の工程は、主に支持体中で分離されｆｃタンパ
ク質あるいは核酸を固定する工程、銀イオン又は銀錯イ
オン溶液に浸漬して、銀と結合させる工程、及び還元剤
で処理する工程からなる。その例としては、クリニカル
　ケミストリー　アクタ（０’ｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　Ａｃｔａ　）　　第５８巻第４６５〜４６
７頁（１９７２）ｓアナリチカル　バイオケミストリー
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）　ｔｇ　９８巻第２３１〜２３７頁（１９７９）、エ
レクトロフオレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
　）　ｆｉｇ　２巻第１５５頁及び第１４１頁（１９８
１）、及び同第３巻第１７〜２３頁（１９８２）等の文
献に記載された諸方法があり、また「生化学」第５２巻
第４１１〜４１３頁（１９ＢＤ）、「臨床検査」第２６
巻第２１５へ２２２頁（１９８２）及び「蛋白質・核酸
・酵素」第７２巻第１２７７〜１２７９頁（１９８２）
等の総説がある。

〔発明が解決しょうとする問題点〕

これらの銀染色法は、前記の色素染色にぶる検出方法に
比べると高感度であるが、いまだ十分な検出力がるると
はいい難い。

本発明の目的は、電気泳動にニジ分離され次生体成分、
特にタンパク質及び核酸を金属染色法に工り染色した後
、高感度な検出全可能とする検出方法を提供することＶ
ｃるる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分離タンパク質又は核酸
の高感度検出方法に関する発明でろって、電気泳動に１
夕分離された支持体中のタンパク質又は核酸を金属染色
法にニジ染色する工程、及び得られた金属核に１酸化カ
ップリング反応に工り色素を形成する化合物の存在下、
過酸化水素を作用させて、該金属核上で検知可能な化合
物を形成させる工程の各工程を包含する分離タンパク質
又は核酸の検出方法において、該酸化カンプリング反応
にＬシ色素を形成する化合物が、２当量カグラーを含有
することを特徴とする。

本発明者らは、特願昭５９−１８８，２１１号明細誉で
説明した手段について、鋭意検討したところ、２当量カ
プラーを含有する色素形成化合物と過酸化水紫とを組合
せて使用することにニジ、更に高感麓な検出が可能であ
ることを見出した。

金属染色法にエリ染色する工程は、支持体中で分離され
たタンパク質又は核酸を固定する工程、金属塩の水溶液
中に浸漬して該金属イオンと結合させる工程、及び還元
剤で処理する工程の各工ａを包含するものである。

固定化工程は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド
、パラアルデヒド、トリクロロ酢酸、酢酸、鉛あるいは
、オスミウムの酸化物等を用いて行うことができる。一
般には、酢酸とメタノール及び／又はエタノールと水と
の混合溶液が広く用いられている。

本発明方法における金属染色法で用いる金属塩には、銀
塩、金塩、白金塩、パラジウム塩化イリジウム酸が利用
でき、具体的には、硝酸銀、アンモニア性硝酸銀、シュ
ウ１！ｌ！銀、塩化第二台酸、塩化白金酸、塩化パラジ
ウム酸、塩化イリジウム酸等が挙げられる。金Ｆ４塩と
しては、銀、白金、金、パラジウム、イリジウムエりな
る群から選択した少なくとも１ｆ１！の金属を含む水溶
性金属塩が用いられる。好ましくは、容易に入手でき安
価な水溶性錯塩である。

還元工程で用いられる還元剤としては、ホルムアルデヒ
ド、パラホルムアルデヒド、ヒドロキノン、フェニドン
、ピロガロール、ｐ−フェニレンジアミン類、ｐ−アミ
ンフェノール類のような有機化合物及び鉄、タングステ
ン、バナジウム、モリブデン、ニッケル等の金属化合物
がある。前記文献等で知られる銀染色法で用いられてい
るホルムアルデヒド及び／又はバラホルムアルデヒドが
好ましい。

本発明でいう酸化カップリング反応に工り色素を形成す
る化合物とは、ある種の化合物が酸化反応を受けた後、
該酸化体が更にらる穆の写真業界でいう２当量カプラー
とカップリング反応して色素を形成する化合物群を意味
する。

金属による染色後に、酸化カップリング反応に工υ色素
全形成する化合物の存在下、過酸化水素を作用させると
、金属核上で色素が形成され、結果としてタンパク質及
び核ｔＩＲｔ金属プラス色素により染色することができ
る。

本発明でいう酸化カップリング反応にニジ色素を形成す
る化合物、すなわち、ある種の化合物が酸化反応を受け
た後、該酸化体が更にある種の写真業界でいう２当量カ
プラーとカップリング反応して色素を形成する化合物群
については、例えば、Ｔ、Ｈ，ジエムズ（Ｔ、ＨｏＪａ
ｍｅｓ　）著［ザｅセオリー−オプーザ・フォトグラフ
ィック・プロセスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　
ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇ−ｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅａｅ
　）（第４版）第１１章及び第１２章に詳しい。

以下、具体的に説明する。酸化反応を受ける化合物とし
ては、例えば、フェニレンジアミン系又は、アミノピラ
ゾロン系のいわゆる写真用発色現像主薬が用いられる。

また、複素環式ヒドラジン類も酸化カップリング反応に
工す色素全形成することができる。

フェニレンジアミン糸の発色現像主薬とじては、芳香族
Ｍ１級アミン発色現像主薬が好ましく、米国特許第３，
７９１，８２７号明細書に記載されているオニウム塩を
形成したｐ−アミノフェノール系現像主薬、米国特許第
２，９８３，６０６号明細書に記載されている色素現像
薬等も用いることができる。ｐ−フェニレンジアミン系
発色現像主薬の具体例としては、例えば４−アミノ−Ｎ
、　Ｎ−ジエチルアニリン、３−メチル−４−アミノ−
Ｎ、　Ｎ−ジエチルアニリン、４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアニリン、６−メチル−４
−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアニ
リン、５−メチル−４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−
メタンスルホンアミドエチルアニリン、５−メ？ルー４
−アミノーＮ−エテル−Ｎ−β−メトキシエチルアニリ
ン、５−β−メタンスルホンアミドエチル−４−アミノ
−Ｎ、　Ｎ−ジエチルアニリン、５−メトキシ−４−ア
ミノ−Ｎ−エテル−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアニリン
、３−メトキシ−４−アはノーＮ−エチル−Ｎ−β−メ
トキシエチルアニリン、５−アセトアミド−４−アミツ
ーＮ、　Ｎ−ジエチルアニリン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−
ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−β−〔β−（β−
メトキシエトキシ］エトキシ〕：に、ｆｆ１ｖ−５−メ
チル−４−アミノアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−β−（β
−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−４−アミノ
アニリンやこれらの塩例えび硫酸塩、塩酸塩、亜硫酸塩
、ｐ−）ルエンスルホン酸塩などである。

また、これら発色現像主薬は、特開昭５８−１２９４５
０号公報等に記載される工うに、フェニドン誘導体等の
黒白現像主薬を組合せて使用しても工い。

アミノピラゾロン系の発色現像主薬としては、具体的に
４−７ミノアンチビリン等が挙けられる。また複素環式
ヒドラジン類としては、具体的に、３−メチル−２−ベ
ンゾアゾリンしドラΔ シン等が挙げられる。これら、酸化を受ける化合物は、
金属銀核上で過酸化水素の作用に工り酸化され、その酸
化生成物は、ｂらかしめ支持体中又は処理液中ＶＣ存在
させておいた写真業界でいう２肖量カグラーと反応し、
色素を形成することができる。

現在用いられている普通のカラー写真は、写真乳剤の潜
像を現像して、金属銀画像音生底すると同時に、色素画
像を生成する発色現像に工ってつくられている。すなわ
ち、現像反応によって発色現像主薬が酸化されると、酸
化生成物がカプラー（発色剤）と反応して色素を形成す
る。ここで用いられるカプラーは、カップリング位置に
置換基をもつ場合には、画像銀原子と色素の割合が２：
１となり、２当量カプラーと呼ぶ。一方、該カプラーが
、カップリング位置に置換基のない場合に鉱、画像銀原
子と色素の割合が４＝１となり、４当貴カプラーと呼ぶ
。

本発明の写真業界でいう２当量カグラーとは、上述のよ
うに、特に写真業界で一般に用いられている、用語でラ
シ、以下に具体例を挙げて説明する。

２当量カグラーとは、カップリング位置に置換基を有す
るカプラー全ｆ：味し、２尚量カプラーとしては、例え
ば、シアン色の色素を形成するカプラーとしてフェノー
ル系カプラー等が挙げられ、マゼンタ色の色素を形成す
るカプラーとして、５−ピラゾロン系カプラー、ピラゾ
ロトリアゾール系カプラー及びシアノアセチル系カプラ
ーが挙げられ、黄色の色素を形成するカプラーとしては
、開鎖ケトメチレン系カプラーが挙げられ、黒色の色素
を形成するカプラーとして、ｍ−アミンフェノール系カ
プラーカ挙ケられる。これらカプラーは、１種若しくＦ
ｉ２ａ以上を組せて使用しても工い。

カップリング位置の置換基としては、具体的には、ハロ
ゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、
ヨウ素原子］、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エ
トキシ基、ｎ−１０ボキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｎ−へ
キシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基等）、アリール
オキシ基（例えばフェノキシ基環Ｊ１アルキルチオ基゛
（例工ばメチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチ
オ基、ｎ−ブチルチオ基等］、了り−チオ基（例えば、
フェニルチオ基等）、アニルオキシ基、ペンチリルオキ
シ基、ベンゾイルオキシ基等ン、アリールアゾ基（例え
ば、フェニルアゾ基、ナフチルアゾ基等ン、アルキルス
ルホニルオキシ基（例えば、メタンスルホニルオキシ基
、エタンスルホニルオキシ基等）、了り−ルスルホニル
オキシ基（例、ｔば、”；ｒｃニルスルホニルオキシ基
等）、更に複素環基（例えば、モルホリノ基、イミダゾ
リル基、ウラゾリル基、スクシイミジル基、ヒダントイ
ニル基、ピリドニル基等）が挙げられる。これらカップ
リング位置の置換基は、更に任意の置換基例えばアルキ
ル基、アリール基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アル
コキシ基、アリールオキシ基、スルホ基、ハロゲン原子
、アミノ基、ニトロ基、アシルオキシ基、アシルアミノ
基、カルバモイル基、等で置換されてもよい。

特に好ましい２当量カグラーとしては、２当貴フエノー
ル系カプラー、２当ｆｉ５−ピラゾロプラーであり、以
゛下具体例を挙げて説明するが、本発明による２当量カ
プラーとしては、これらに限定されるものではない。

２当量フエノール系カプラーの例としては、以下のもの
が挙げられる。

０、Ｈ。

（Ｂ）　　　　ｏＨ（９）　　　　０Ｈ８ｏ、Ｈ ２ｆｉｉ５−ピラゾロン系カグラーの例としては、以下
のものが挙げられる。

ＣＩＱ　　　　　　　　　ａカ ＠　　　　　　　　　　　　　　　の ０４　　　　　　　　　　　　　　　　（ハ）２当量開
鎖ケトメチレン系カプラーの例としては、以下のものが
挙げられる。

＠　　　　　　　　　■ ＠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（支）（
至）　　　　　　　　　　　　　　　（至）本発明の検
出方法においては、酸化カップリング反応に工９色素を
形成する化合物は、支持体中に含浸させるのが好ましい
。この場合、支持体を酸化カップリング反応により色素
を形成する化合物の溶液中に浸漬させる方法、あるいは
、該溶液をスプレーする方法等がある。

過酸化水素全金属核に作用させる方法としては、上記と
同様に、溶液を用いる浸漬又はスプレー等の方法がある
。

また、酸化カップリング反応にニジ色素を形成する化合
物と過酸化水素とを同一溶液として、１回の操作で支持
体中に含浸させることもでき、処理操作を短縮すること
ができる。

本発明の方法において、電気泳動分離されたタンパク質
又は核酸を染色する処理工程は、通常、 ＋１１　　’ＩＥ気泳動工程−固定化工程−金属イオン
との結合工程−還元工程−補力工程 （２）電気泳動工程−固定化工程−金属イオンとの結合
工程−還元・補力工程 を基本としている。更に、電気泳動後の各工程の前後に
水洗工程を設けても工い。

上記補力工程とは、酸化カップリング反応にニジ色素を
形成する化合物の存在下、過酸化水素を作用させて、金
属核上で色素を形成させる工程を意味する。

酸化カップリング反応にニジ色素を形成する化合物の溶
液及び過酸化水嵩の溶液には、苛性ソーダ、苛性カリ、
炭酸ソーダ、炭酸カリ、第三リン酸ソーダあるいはカリ
、メタホウ酸カリ、ホウ砂等のアルカリ剤や、リン酸水
素二ナトリウムあるいはカリ、リン酸二水素ナトリウム
あるいはカリ、重炭酸ソーダあるいはカリ、ホウ酸、酢
酸ナトリウムあるいはカリ、硫酸ナトリウムあるいはカ
リ等の種々の塩を適時選んで含有して工い。

また、上述の各処理工程にカプリ防止剤を添、加するこ
とができる。カプリ防止剤としては、臭化カリウム、臭
化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化カリウムの工つ
なアルカリ金属ノ１０ゲン化物及び有機カプリ防止剤が
使用できる。

有機カプリ防止剤としては、含窒素複素環化合物（例え
ば、ベンゾトリアゾール、６−ニトロベンゾイミダゾー
ル、５−ニトロインインダノール、５−メチルベンゾト
リアゾール、５−二トロペンソトリアゾール、５−クロ
ロベンゾトリアゾールなど）、メルカプト置換複素環化
合物（例えば、１−フェニル−５−メルカプトテトラゾ
ール、２−メルカプトベンゾイミダゾール、２−メルカ
プトベンゾチアゾールなどンメルカブト置換芳香族化合
物（例えばチオサリチル酸など）ｋ挙げることができる
。

添加量は、溶液１を轟り１ｍＦ〜５ｔの範囲で使用する
。

また、酸化カップリング反応にエリ色素を形成する化合
物の溶液及び過酸化水嵩の溶液には、アルカリ金属の亜
硫酸塩の工うな保恒剤、メタノール、エタノール、イソ
プロピルアルコール、アセトン、ベンジルアルコール、
及ヒジエチレングリコールの１うな有機溶剤、ポリエチ
レングリコール、第四級アンモニウム塩、アミン類のよ
うな現像促進剤を適時含有させてよい。

また、過酸化水素の溶液の安定化のために、写真業界で
知られている有機ホスホン酸類、ポリビニルピロリドン
、ポリビニルアルコール又は、アミンオキシド類を含有
させてもＬい。

検出方法としては、一般に、目視による検出方法が容易
であり、また色素濃度を測定することにＬり半定量的又
は定量的に検出することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例にニジ更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　　第２２７巻第６８０
頁（１９７０）に示され次男法を基に、１０％ポリアク
リルアミドゲル（１６ａｎＸ　１２ｃｍ）、厚さ１簡の
ゲルを作成し、試料として、電気泳動用分子量マーカー
（ファルマシア社）を用いて、５Ｄｓ−を気泳動を行っ
た。電気泳動分離後エレクトロフオレシス（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）　第２巻第１４１頁（１９８
１）の方法に従って、銀染色法に工り染色を行った。す
なわち、グル全５０％メタノール／１０％酢酸水溶液２
００ｄに３０分間浸漬し、次に１５％メタノール水溶液
２００−に１０分ずつ３回浸漬後、６チグルタルアルデ
ヒド２００−に５０分間浸漬、１５チメタノール水溶液
浸漬、更に水洗して、メルカグトエタノール、ラウリル
硫酸ナトリウムなどの除去及びタンパク質の固定化を行
った。次に、アンモニア性硝酸銀溶液（αＱ２ＮＮａＯ
１（１６０−に２５％アンモニア水６ｄと２０チ硝酸銀
８−を加え、水で２００−にする）に１０分間（２５℃
）浸漬し、１０分間水洗後、α００５チクエン酸２００
−に３７％ホルマリンα１−を加えた溶液に約１０分間
浸漬し、水洗して銀染色したゲルを得た。

次に、この銀染色したゲルを用いて、色素形成による高
感度染色を行った。

まず、下記の組成の液（１）に、ゲルを５分間（室＠）
振とり浸漬した。

液組成（１）（使用直前に調製した） 次に、ゲルを３ａ秒間水洗し、下記の組成の液（２）に
浸漬した。

液組成（２） 浸漬後発色し始め、５分後ゲルを数回水洗し、染色した
ゲルを得九。

一方、液組成（２）に代えて、下記の組成の液（３）を
用いた以外は、すべて上記と同様の処理をして、染色ゲ
ルを得た。

液組成（３）（使用直前に調製し７’ｊ）その結果、オ
ボアルブミン［ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　）を基準としてみ
ると、段階希釈して濃縮ゲルの溝に、それぞれ１０ｎｆ
、　５ｎｆ、　Ｉｎ？、（Ｌ　５　ｎ９％（Ｌｌｎｆ　
ｆ加えて、８Ｄ８−電気泳動を行ったが、色素染色した
ゲルで、液組成（３）のクロラミンＴｉ用い次処理では
、１　ｎｆの微量タンパク質が検出できたが、液組成（
２）の過酸化水素を用いた処理では、更に１α１　ｎｆ
　（目視判定Ｊの微量タンパ１Ｊｊｌが検出できた。こ
のように、２当量フエノール系カプラーを用いたときに
、補力剤として特に過酸化水素と組合せて、使用するこ
とにニジ、更に高感度検出できることがわかった。

実施例２ 実施例１と同様にして、電気泳動用分子量マーカーを用
いて、７．５％ポリアクリルアミドゲルを作成し、５Ｄ
Ｓ−電気泳動により分離全行った。次に、銀染色法によ
る染色を行った。すなわち、ゲルを、５０％メタノール
７１０％酢酸水溶液４００−に３０分間振とうしながら
浸漬し、次に１５％エタノール水溶液４００−に１５分
間振とり浸漬後、水洗してタンパク質の固定化を行った
。次に、　１０”−”Ｍ／Ｌの濃度の硝酸銀水溶液２０
０−に浸漬し、１５分間水洗後、５５チホルマリン（Ｌ
ｌｓｄを加えたα１チ炭酸ナトリウム水溶ｆｉ２００−
に１０分間浸漬し、水洗して銀染色ゲルを得た。更に、
このゲルを以下の補カニ程で処理を行った。

下記の組成の液（４）に、ゲルを室温で振とうしながら
浸漬した。

液組成（４）（使用直前に調製したＪ 浸漬後、速かに発色が始まシ、１０分後、ゲルを数回水
洗して染色したゲルを得た。

その結果、オボアルプミンを基準としてみると段階希釈
して濃縮ゲルの溝にそれぞれ１０ｎｆ。

５ｎｌＦ、１　ｎ？、α５ｎｆ％ＣＬ　１　ｎｆ′ｆｔ
加えて５ＤＳ−電気泳動全行ったが、染色したゲルで（
Ｌ５ｎｆ（目視判定ンの微量タンパク質が検出で＠友。

このように、酸化カップリング反応に工り色素を形成す
る化合物と過酸化水素とを同一の溶液として、用いても
高感度検出ができ、しかも、処理操作が簡易となる点で
好ましいことがわかった。

また過酸化水素にかえて、補力剤として亜臭素酸ナトリ
ウムを用いて上記と同じ処理を行ったが、検出されたオ
ボアルプミンは、５ｎｆ〜１ｎｆ　　でメジ、補力剤と
して過酸化水素を用いる方が、より高感度な検出ができ
ることがわかった。

実施例３ 産漿タンパク質を、一次元目を等電点電気泳動（４，５
％ポリアクリルアミドゲル、ｐＨグラジェント＆５〜９
５）分離し、二次太目を、ＳＤＳ電気泳動（１０％ポリ
アクリルアミドゲル、ゲル厚１１ＩＩｌ）分離した。こ
のゲルを実施例２で用いた銀染色法に従って、染色を行
った。

こうして得られた銀染色ゲルを、下記の足底の液（５）
Ｋ室温で７分間浸漬し次。

液組成（５）（使用直前にｍＭしＵ 浸漬後、すぐに発色し始めた。７分後、ゲルを数回水洗
した。この工うに、二次元電気泳動においても、本発明
による染色方法にＬ夕、高感度検出をすることができた
。

実施例４ ８％ポリアクリルアミドゲル（厚さ１７　ｍ　）を作成
し、バクテリオファージλ（ＣＩ８５７Ｂａｍ　７　）
のＤＮＡ　′ｆＩ：１ｉｔｃｏＲ工制限酵素で処理した
ＤＮＡ断片を、量をに、ｔて電気泳動法ｔ／ｃニジ展開
し、実施例２で示した銀染色法により染色を行った。

こうして得られた銀染色ゲルを、下記のＭｉ底の液（６
）に、室温で浸漬し次。

液組成（６）（使用直前に調製した］ ２分浸漬後、５０％過酸化水素水５．０−を加え更に７
分間浸漬した。過酸化水素を添加直後、発色が始まった
。

次に、ゲルを数回水洗して、本発明にＬる染色をしたゲ
ルを得た。約５ｎｆのＤＮＡ断片を検出することができ
念。

実施例５ 実施例２で示したのと同様の方法で、８Ｄ８−電気泳動
後、銀染色したゲルを作成し、次にこの銀染色したゲル
を、下記の組成の液（７）に工す、本発明にＬる染色を
行った。

液組成（７）（使用直前に調装した） １０分間室温で浸漬後、ゲルを数回水洗した。

この結果、オボアルプミンを基準としてみるとおよそ、
α５ｎｆの微量のタンノ（り質が検出でき、高感度に染
色できることがわかった。

実施例６ 実施例１と同様にして、電気泳動用分子Ｉ！ｌ−１−カ
ーを用いて、１５％ポリアクリルアミドゲルを作成し、
８Ｄ８−電気泳動に工り分離を行い、次に以下に示す処
理にニジ、銀染色法による染色を行った。すなわち、ゲ
ルを５０％メタノール／１０％酢酸水溶液４００−に２
０分間振とうしながら浸漬し、次に１５％エタノール水
溶液４００ｍｇＫ１５分間振とり浸漬後、水洗して、タ
ンパク質の固定化を行った。次に、５Ｘ１０−３Ｍ　／
　ｔの濃度の硝酸銀水溶液２００−に浸漬し、各１５分
間ずつ２＠十分に水洗後、５５％ホルマリンα５Ｗｔを
加えたα５チ炭酸ナトリウム水溶液２００−に１０分間
浸漬し、水染して、銀染色を行った。ここで得られたゲ
ルには、染色された、タンパク質スポットはみられなか
った。

（目視によるン 更に上記ゲル金、下記の紐取の液（８）に浸漬し、本発
明による補力処理を行った。

液ｆｆ１ａ（８）（使用直前に！１１！ｌ製した）１０
分間振とり浸漬し、数回水洗したところ、銀染色で染色
されなかったタンパク質が、本発明による染色を行うこ
とに工り染色することができた。

オボアルブミンを基準としてみると、段階希釈して濃縮
ゲルの溝にそれぞれ１００ｎｆ、１０ｎｆ、　１ｎｆ、
　［１Ｉｎりを加えて、８Ｄ８−電気泳動を行ったが、
本発明による補力処理を行ったゲルで、１０ｎｆのタン
パク質が染色された。この工うに、本発明による染色法
は、銀染色法で不十分な染色で６つ次ゲルにおいても、
簡単な補力処理を加えることに工り、微量タンパク質を
検出することができることがわかった。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の方法によれば、金属染色
法による染色法に色素形成の簡単な操作を付加すること
によって、電気泳動分離されたタンパク質及び核酸の染
色濃度が増強されて、高感度の染色を行うことができた
。また、金属染色法では可視化できない微量の上記成分
の検出が可能となった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、電気泳動により分離された支持体中のタンパク質又
   は核酸を金属染色法により染色する工程、及び得られた
   金属核に、酸化カップリング反応により色素を形成する
   化合物の存在下、過酸化水素を作用させて、該金属核上
   で検知可能な化合物を形成させる工程の各工程を包含す
   る分離タンパク質又は核酸の検出方法において、該酸化
   カップリング反応により色素を形成する化合物が、２当
   量カプラーを含有することを特徴とする分離タンパク質
   又は核酸の高感度検出方法。