JPS6154455A

JPS6154455A - タンパク質又は核酸の高感度検出方法

Info

Publication number: JPS6154455A
Application number: JP59176734A
Authority: JP
Inventors: Akira Onishi; 明大西; Satoru Kawakatsu; 川勝　哲
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1984-08-27
Filing date: 1984-08-27
Publication date: 1986-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、支持体中に電気泳動分離された生体成分の高
感度検出方法に関する。更に詳しくは、支持体中に電気
泳動分離されたタンパク質あるいは、核酸のような生体
成分を微量でも検出可能とする方法に関する。

〔従来の技術〕

血漿、尿、脳を髄液、羊水等の体液中のタンパク質や、
ＤＮＡ、　ＲＮＡ等の核酸などの検出及び同定には、支
持体を用いた電気泳動法が広く利用されておシ、生化学
、生物学、及び臨床医学の分野の研究に大きな貢献をし
てきた。

通常、支持体としては、ゼラチン、寒天ゲル、Ｐ＃　７
’ンプンゲル、セルロースアセテート膜、ポリアクリル
アミドゲル、アガロースゲル等が用いられ、電気泳動法
には、ゲル電気泳動、５ＤＥＩ電気泳動、等電点電気泳
動、免疫電気泳動等がある。また、二次元電気泳動によ
り、血漿タンパクのような複雑な組成のタンパク質混合
物からの分離も可能となった。

電気泳動分離されたタンパク質を検出する方法として、
従来色素により染色して行っていた。

最も普通に用いられている染料は、クーマツジ−ブリリ
アントブルーであシ、その他に、アシドブラック、クリ
スタルバイオレット及びファストグリーン等が使用され
ている。また、電気泳動分離されたＤＮＡやＲＮＡは、
エチジウムブロマイドによる染色が行われている。しか
し、これらの染色法では、検出感度が低いため、尿や脳
を髄液のようなタンパク質濃度の低い試料を分析する場
合には、泳動前に回線操作が必要であり、そのため分析
の操作が煩雑となシ、また、濃縮時Ｋ、成分の変化を伴
うという欠点がある。

また、高感度検出という点から、ラジオアイソトープに
よる標識をして、検出することが行われ、オートラジオ
グラフィーとして用いられているが、放射性物質を取扱
うことから、実験操作上の危険性、複雑さに加えて、ア
イソトープの廃棄の問題等容易に行える技術とは、いい
難い。

近年、電気泳動により分離されたタンパク質及び核酸等
の高感度検出方法として銀染色法が開発された。銀染色
法の工程は、主に支持体中で分離されたタンパク質おる
いは核酸を固定する工程、銀イオン又は銀錯イオン溶液
に浸漬して、銀と結合させる工程、及び還元剤で処理す
る工程からなる。その例としては、クリニカルケミスト
リー　アクタ　（Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ　
−ｒｙ　Ａｃｔａ　）第３８巻第４６５〜４６７頁（１
９７２″）Ｘアナリテカル　バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌｙｔｉ−ｃａｌ　Ｂｉｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　
　第９８巻第２３１〜２３７頁（１９７９）、エレクト
ロフオレシス（１ｌｎｅｃｔｒＯｐｈｏｒｅｓｉ１３）
第２巻第１３５頁及び第１４１頁（１９８１）、及び同
第３巻第１７〜２３頁（１９８２）等の文献に記載され
た諸方法があり、また「生化学」第５２巻第４１１〜４
１３頁（１９８０）、「臨床検査」第２６巻第２１５〜
２２２頁（１９８２）及び［蛋白質・核酸・酵素」第７
２巻第１２７７〜１２７９頁（１９８２）等の総説があ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

これらの銀染色法は、前記の色素染色による検出方法に
比べると高感度であるが、いまだ十分な検出力があると
はいい難い。

本発明の目的は、電気泳動により分離された生体成分、
特にタンパク質及び核酸を銀染色法により染色した後、
高感度な検出を可能とする検出方法を提供することにあ
る。

第３５５頁（１９５５年）に記載されている化合物を挙
げることができる。例えば、２，３．５−トリフェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、２，３−ジ（ｍ−
ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムパークロラー
）、２ｔ５−ジフェニル−５−シアノ−２■−テトラゾ
リウムクロライド、２，３−ジフェニル−５−メチル−
２■−テトラゾリウムクロライド、２−（ベンゾチアゾ
ール−２−イル）　−ｓ、ｓ−ジフェニル−２Ｈ−テト
ラゾリウムブロマイド、２，３−ジフェニル−３−（ｐ
−メチルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド
、２，３．５−トリー（ｐ−メチルフェニル）−２Ｈ−
テトラゾリウムクロライドなどが挙げられる。

ここで用いられるテトラゾリウム塩を含有する溶液とは
、これらのテトラゾリウム塩の一種以上を、水又は水可
溶性の有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、ベン
ジルアルコール、酢酸、ジメチルホルムアミド、メチル
セロソルブなど）の一種以上と水との混合溶媒に溶解し
たもので〔問題点を解決するための手段〕本発明を概説すれば、本発明は分離されたタンパク質又
は核酸の高感度検出方法に関する発明であって、電気泳
動により分離された支持体中のタンパク質又は核酸を銀
染色法により染色する工程、及び得られた金属銀核に、
テトラゾリウム塩を含有する溶液を作用させることによ
り該銀核上でホルマザン色素を形成させる工程の各工程
を包含することを特徴とする。

すなわち、銀染色後に、テトラゾリウム塩を含浸させる
と、金属銀核の還元作用によってテトラゾリウム塩が還
元され、ホルマザン色素に変換され、結果としてタンパ
ク質及び核酸を銀プラス色素により染色することができ
、銀染色の場合よりも高感度に検出できる。

この場合に用いられるテトラゾリウム塩は、英国特許第
９０　ａ２９９号、米国特許第へ６４２，４７８号、同
第５．６５５．５８２号、同第４６７１．２４４号、同
第３Ｖ６７６．１５５芳容明細書及びケミカル　レビュ
ー　ス（（！ｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｖｒｓ）第５
５巻、ある。

更に好ましい溶液として、上記溶液中に銀錯化剤を添加
することができる。これらの銀錯化剤としては、シアン
化カリ、シアン化ナトリウム、などのシアン化合物、米
国特許第３，６４２，４７８号明細書に記載されている
化合物、例えば水可溶性チオ硫酸塩（例えばチオ硫酸ナ
トリウム、チオ硫酸カリ、チオ硫酸アンモニウム等）、
チオ尿素、エチレンチオ尿素、水可溶性チオシアン酸塩
（例えばチオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウ
ム、チオシアン酸アンモニウム等）、水可溶性のジオー
ル（例えば３，６−ジテアー１，８−オクタンジオール
、５，６．９−　トリチア−１，１１−ウンデカンジオ
ール、３，６，９．１２−テトラチア−１，１４−テト
ラデカンジオール等）、水可溶性の硫黄原子を含む二塩
基酸（例えば、エチレンビス−チオグリコール酸又ハ塩
、３，６゜？、１２−テトラチアー１，１２−ドデカン
ジカルボン酸又は塩等）等を挙げることができる。その
他リン酸二ナトリウム、炭酸カリ１．炭酸ナトリウム等
の無機塩も添加してもよい。

検出方法としては、一般に、目視による検出方法が容易
であり、まだ色素濃度を」１１定することにより半定量
的に検出することができる。

また、本発明の検出方法においては、テトラゾリウム塩
は、支持体中に含浸させるのが好ましい。この場合、テ
トラゾリウム塩の溶液中に浸漬させる方法、あるいは該
溶液をスプレーする方法等がある。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　　第２２７巻第６８０
頁（１９７０）Ｋ示された方法を基に、ＥｊＤＢ　−名
只泳動建よシ、タンパク質の分離を行った。

１０％ポリアクリルアミドゲル（１６ｃｒｎＸ１２ｃｒ
ｒ１）、厚さ１醜を作成して、電気泳動分離を行った後
、エレクトロ７オレシス（Ｋｌｅｃｔｒｏｐｈｏ−１０
８１日）第２巻第１４１頁（１９８１）の方法に従って
、銀染色法により染色を行った。すなわち、ゲルを５０
％メタノール／１０％酢酸水溶液２００　ｍｌに３０分
間浸漬し、次に１５％メタノール水溶液２００−に１０
分ずつ３回浸漬後、６％グルタルアルデヒド２００　ｍ
ｅに３０分間浸漬、１５％メタノール水溶液浸漬、更に
水洗して、メルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリ
ウムなどの除去及びタンパク質の固定化を行った。次に
、アンモニア性硝酸銀溶液（０，０２Ｎ　　ＮａＯＨ１
６０−に２５％アンモニア水６ＩＩＩｔと２０％硝酸銀
８−を加え、水で２００ｍ１にする）Ｋ１０分間（２５
℃）浸漬し、水洗後、Ｑ、００５％クエン酸２００　ｍ
ｅに５７％ホルマリン０．１コを加えた溶液に１銀像ス
ポツトが現れるまで約１０分間浸漬し、水洗して銀染色
したゲルを得た。

次に、この銀染色したゲルを用いて、色素形成による高
感度染色を行った。

すなわち、下記の組成のテトラゾリウム塩含有溶液（１
）に前記ゲルを５分間浸漬し、ホルマザ７色素を生成さ
せた。

溶液（１）の組成（使用直前に調製した）タンパク質と
してオポアルプミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を使用し、
段階希釈して濃縮ゲルの溝に、それぞれ１０ｎ？、５ｎ
ｌＦ、Ｉｎｔ、　０．５ｎ？、０．１　ｎｓ’　　を加
え、５ＤＥｌ−’Ｉｌｌ気泳動後、銀染色処理をした。

その結果、１ｎ１のオボアルプミンは検出できたが、α
５ｎｆのものは検出できなかった。

次に、銀染色ゲルで本発明による処理を行ったところ、
０．１ｎＰのオボアルブミンを検出することができた。

同様（（、ホスホリラーゼＢ　（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ａｓｅＢ）を用いて検出を行りたところ、銀染色法では
、５ｎ２のホスホリラーゼＢしか検出できなかったが、
本発明による処理を加えることにより、０．５ｎＳＦの
ホスホリラーゼＢを検出することができた。

このようにして、本発明により、従来の銀染色後に簡単
な処理操作を付加することによりタンパク質を高感度に
検出することができた。

実施例２血漿タンパク質を、一次元目を等電点電気泳動（４，５
％ポリアクリルアミドゲル、ｐＨグラジェント３．５〜
９．５）分離し、二次元口を、ＳＤＳ電気泳動（１０％
ポリアクリルアミドゲル、ゲルＮ　ｊ　ｔｒａｎ　）分
離した。このゲルを実施例１で用いた銀染色法に従って
、染色を行った。

こうして得られた銀染色ゲルを、下記組成の溶液（２）
に５分間浸漬させてホルマザン色素を生成させた。

溶液（２）の組成このようＫ、二次元電気泳動においても、高感度染色を
行うことができた。

実施例３８％ポリアクリルアミドゲル（厚さ０．７　ｍｇ　）を
作成し、バクテリオファージλ（Ｃ工８５７　　Ｓａｍ
７）のＤＮＡをＥｏ。Ｒ工制限酵素で処理したＤＮＡ断
片を、量を変えて電気泳動法により展開し、実施例１で
示した銀染色法により染色を行った。

こうして得られた銀染色ゲルを下記組成の溶液（３）　
Ｋ　Ｓ分間浸漬させて、ホルマザン色素を生成させた。

溶液（３）の組成りＮＡ断片の１０　Ｏｎ？、５０ｎ？、　　１０ｎ？、
５１Ｆ、１ｎりを電気泳動により展開し、銀染色後では
、１０ｎｌＦのＤＮＡ断片しか検出できなかったが、本
発明による処理を加えると、５ｎ７のＤＮＡ断片を検出
することができた。

〔発明の効果〕

以上説明したように１本発明の方法によれば、従来の銀
染色法に色素形成の簡単な操作を付加することによって
、電気泳動分離されたタンパク質及び核酸の染色濃度が
増強されて、高感度の染色を行うことができた。また、
銀染色法では可視化できない微量の上記成分の検出が可
能となった。

Claims

【特許請求の範囲】

１、電気泳動により分離された支持体中のタンパク質又
は核酸を銀染色法により染色する工程、及び得られた金
属銀核に、テトラゾリウム塩を含有する溶液を作用させ
ることにより該銀核上でホルマザン色素を形成させる工
程の各工程を包含することを特徴とする分離されたタン
パク質又は核酸の高感度検出方法。