JPS6236200A - コレステリンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコレステリン、しかも総フレステリンまたは結
合形コレステリンの定量法に関する。

コレステリンは例えば、血清等の生物的物質中に一部は
遊離のまま、一部は結合してエステルとして存在してい
る。結合形コレステリンまたは総コレステリンを定量す
るためには、先ず結合形のコレステリンを遊離させるこ
とが必要であるが、そのことは従来、アルカリ性条件、
例えばアルコール性水酸化カリウム溶液を用いる鹸化に
よって行われた。そうして、遊離したフレステリンは公
知方法により、化学的ないしは酵素的に定量された。化
学的定量法としては、例えばリーベルマン・ブルヒアル
ト（Ｌｌｅｂｅｒｍａｏｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ）の方法
があり、酵素的定量はコレステリンオキシターゼ、フレ
ステリンデヒドロゲナーゼ又はコレステリンエステラー
ゼを用いて行うことができる。

周知のように種々の異なるコレステリンエステル並びに
遊離のコレステリンは吸光係数が異なっているから、化
学的定量法の場合には予めコレステリンエステルをアル
カリ性で加水分解して遊離コレステリンに変える必要が
あった。

この結合型コレステリンのアルカリ性鹸化は煩雑で時間
がかかる。その上、使用される腐蝕性の強い試薬かコレ
ステリンを分解してしまう可能性がある。その様な分解
を阻止し、分析結果を適正なものとするためには、温和
な条件下でその加水分解を行わなければならないが、そ
の場合、定量のための所要時間が増大する。

そして、加水分解に続いてコレステリンの定量を酵素的
方法により行おうとする場合は、アルカリ性でフレステ
リンを遊離させることは有利でない。強いアルカリ性媒
体中では酵素は不活性化されてしまうので、加水分解後
の生成物に酸を添加して、そのｐＨを５〜８に調整しな
ければ、酵素による測定は実施できない。それらのこと
によって、総コレステリン又は結合型フレステリンの定
量のためには時間がかかり、かつ操作費用も嵩むのであ
る。

従って本発明の課題は、その様な欠点を除去した、総コ
レステリン又は結合型コレステリンの定量法を創製する
にある。

この課題は本発明により、結合型コレステリンをコレス
テリンエステラーゼを用いてコレステリンを遊離させ、
次いで遊離したコレステリンを公知方法により定量する
ことによって達成された。

コレステリンエステラーゼを用いるとき結合型コレステ
リン加水分解は迅速かつ定量的に行うことができる。

この方法はその後の遊離コレステリンの定量をも酵素、
例えばコレステリンオキシターゼ又はコレステリンエス
テラーゼを用いて行う場合に、極めてｆ「利である。こ
うして、本発明の方法により、全酵素的なコレステリン
の定量が可能となる。従って医学的な診断法は著しく改
良され、自動分析機（Ａｎａ　１ｙｓｅｎａｕｔｏｉ＋
ａｔ　）を用いてのその方法の実施が可能となる。

なるほど肝臓、膵臓中にコレステリンエステラーゼ作用
があることは既に公知であった。しかし、この種の酵素
が定量的な分析法を可能ならしめる程度にコレステリン
のエステルを迅速完全な鹸化に好適であろうとは予想で
きなかった。それというのも確認された分解率は定量的
ではな（、最高８０％にしか達しなかったからである（
Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｗ、　　２０〕　、　［ｉ６５　
−　６７０　　（１９５４）　　　＊照）。

結合型フレステリンは生物的物質中に種々の異なる酸の
エステルとして存在している。コレステリンエステラー
ゼが分析方法として使用できるためには、存在する全て
のエステルをほぼ同じ速度で且つ同じ精度で定量的に分
解する能力を持っていることが必要である。しかし、公
知のコレステリンエステラーゼは異なるコレステリンエ
ステルに対する分解性能が著しく相異なっていることか
知られていた。そのような酵素の性能からして、フレス
テリンエステラーゼが存在する全てのコレステリンエス
テルを極めて短期間に定量的に分解しつるということは
驚（べきことである。

今、微生物からのコレステリンエステラーゼが本発明に
特に好適であることが実証された。このコレステリンエ
ステラーゼは分解速度および種々の異なるコレステリン
エステルに対する作用に就いてその他の起源のコレステ
リンエステラーゼより優れていることが実証され、従っ
て本発明において有利に使用される。

更に、種々の微生物そのものは、特に有効なコレステリ
ンエステラーゼを含有していて、本発明においてコレス
テリンエステラーゼを分離精製することなく、そのまま
で使用できることが判った。そのことは、特にそれらは
人手が容易な詐りでなく、コレステリンエステラーゼを
分離したりｙｆａ縮したりする必要がないため、異なる
コレステリンエステルに特異的な作用を持つ多くのエス
テラーゼの混合物が持っている、すべての結合型コレス
テリンを定量的に測定するという可能性が、その精製の
際に損なわれてしまうという危険性が回避できるという
利点を有している。

その上、一般にリポイド被膜に結合したコレステリンエ
ステラーゼの精製は煩雑であり、それゆえ、精製せずに
使用できる微生物製剤に比較して価格の点からしても有
利でなく、日常的診断にはむしろ不適当な製剤ができる
。

本願の原出願の発明による方法で、カンジダ・ルゴサ（
Ｃａｎｄｌｄａ　ｒｕｇｏｓａ）　［シリントラシア（
Ｃｙｌｌｎｄｒａｃｅａ）ともいわれるコＡＴＣＣ１４
８３０またはＷＳ９００３１およびアスペルギルスｅｓ
ｐｅｃ、Ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　５ｐｅｃ、）　ＷＳ
９００３０からのコレステリンエステラーゼを使用する
と特に有利な結果が得られた。これら２′８類の微生物
はその発明において、そのまま、又は前処理した形、例
えばアセトン乾菌末（Ａｃｅｔｏｎｔｒｏｃｋｅｎｐｕ
ｌｖｅｒ）として使用することができる。しかしながら
該微生物からの濃縮したフレステリンエステラーゼ製剤
を使用することも可能である。その際、特に有利な点は
確実な濃縮をこの場合には非常に容易に成し遂げつると
いうことである。前記のカンジダ・ルゴサは大工業的に
生産され、市場で入手しうる微生物である。慣用の市販
形はラクトースで安定化されたアセトン乾菌末であるが
、その発明に特に好適であることが実証された。類似の
有利な特性は下記のものに於いても明らかになっている
。

アクチノミセス・アラレオベル　Ｗ３　９０００２チシ
リウム（Ａｃｔｌｎｏｍｙｃｅｓ　　ａｕｒｅｏｖｅｒ
ｔｌｃｌｌｌｌｕｍ　）アクチノミセス・シアネオフス
　Ｗ８　９０００３カツス（Ａｃｔｌｎｏｉｉｙｃｅｓ
　　　ｃｙａｎｅｏｆｕｓｃａｔｕｓ）アクチノミセス
・グリセオミシ　Ｗ８９０００４二　（Ａｃｔｌｎｏｍ
ｙｃｅｓ　　　　　ｇｒｌｓｅｏｍｙｃｌｎｌ）アクチ
ノミセス・ロンギスポル　Ｗ３　９０００５スーｆ１．
　（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　Ｉｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ
　−ｆｌ、　）アクチノミセス・マラキチクス　Ｗ３　
９０００［１（Ａｃｔｌｎｏｓ＋ｙｃｅｓ　　　ｍａｌ
ａｃｈｌｔｌｃｕｓ）アクチノミセス・ロゼオルス　　
ＷＳ９０００７（Ａｃｔｌｎｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏ
ｌｕｓ　）アクチノミセス・トキシトリシ　ＷＳ　　９
０００８二（ＡｃｔＩｎｏＩＩｙｃｅｓ　ｔｏｘｙｔｒ
ｌｃｌｎ＋　）アクチノミセス・パリアビリス　ＷＳ　
　９０００９（Ａｃｔｌｎｏｍｙｃｅｓ　　ｖａｒｌａ
ｂｌｌｌｓ　　）ストレプトミセス　５ｐｅｃ、　　　
　ＷＳ　　９０Ｇ１０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５
ｐｅｃ、　）ストレプトミセス・アウトトロ　ＷＳ９０
０１１フィクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ａｕｔ
ｏｒｏｐｈｉｃｕｓ）ストレプトミセス・カネスセン　
ＷＳ９００１２ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｃａ
ｎｅｓｃｅｎｓ　）ストレプトミセスｅカルトレウ　Ｗ
Ｓ　　９００１３ンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｃｈａｒｔｒｅｕｓｌｓ　）ストレプトミセス・ミキガ
ネン　ＷＳ９００１４ンス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　　　ｍｌｃｈｉｇａｎｅｎｓｌｓ　　）ストレプト
ミセス・ムリヌス　　ＷＳ　　９００１５（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　　ｍｕｒｌｎｕｓ　　）ストレプトミ
セス・ハキジョエ　Ｗ３９００１６ンシス（Ｓ　ｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｈａｃｈｌ　ｊｏｅｎｓｌｓ）ス
トレプトミセス・カエレステ　Ｗ８９００＋７ス　（Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｃａｅｌｅｓｔｅｓ　　
）ストレプトミセス・テンダニ　　Ｗ８９００１８（Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｔｅｏｄａｅ）カンジダ
・アルビカンス　　　　ＷＳ　　９００２１（Ｃａｎｄ
ｌｄａ　ａｌｂｌｃａｎｓ　）カンジダ・アルビカンス
　　　　ＷＳ　　９００２２（Ｃａｎｄｌｄａ　ａｌｂ
ｌｃａｎｓ　）カンジダ・アルビカンス　　　　ＷＳ　
　９００２３（Ｃａｎｄｌｄａ　ａｌｂｌｃａｎｓ　）
カンジダ　５ｐｅｃ、　　　　　　　　ＷＳ　　９００
２４（Ｃａｎｄｌｄａ　５ｐｅｃ、） クニングハメラ・エレガンス　　Ｗ８９００２５（Ｃｕ
ｎｎｌｎｇｈａｍｅｌｌａ　　ｅｌｅｇａｎｓ　）ムコ
ル・ムセド　　　　　　　　ＷＳ　　９００２Ｂ（Ｍｕ
ｃｏｒ　　ｍｕｃｅｄｏ） ペニンリウム　５ｐｅｃ、　　　　　　ＷＳ　　９００
２８（Ｐｅｎｌｃｌｌｌｕｍ　　５ｐｅｃ、　　）アス
ペルギルス　５ｐｅｃ、　　　　　ＷＳ　　９００２９
（Ａｓｐｅｒｇｌ　Ｉ　ｌｕｓ　５ｐｅｃ、）本発明は
上記微生物以外の例えば リゾプス　５ｐｅｃ、　　　　　　　　　ＷＳ　　９０
０２７（Ｒｈｌｚｏｐｕｓ　５ｐｅｃ、　） ノカルデア・ルブラ　　　　　　ＷＳ９００１９（Ｎｏ
ｃａｒｄｌａ　ｒｕｂｒａ　） 等の微生物由来のコレステリンエステラーゼを使用する
ものである。

これら微生物起源の優れた上記コレステリンエステラー
ゼの他に、その他の微生物起源の種々の微生物由来のコ
レステリンエステラーゼを使用することもできる。

既述の様に、本発明方法の特に重要な利点は、全酵素的
な総コレステリンの定量が可能になるという点に存する
。その際、微生物からの有利なフレステリンエステラー
ゼ製剤を用いてエステルからコレステリンを迅速かつ定
】的に遊離させることができることは重要である。特に
前記の有利な微生物を用いて、これを直接添加すること
によって非常に僅かな量で、かつ後続するコレステリン
の酵素的定量で望まれるｐＨ値−及び温度条件下で、数
分間以内にコレステリンを定量的に分離することが可能
である。その際、この種の微生物に使用される炭水化物
を基体とする常用の安定化剤はこの全酵素的フレステリ
ン定量法の実施の障害とならなことが判明した。

前述の様に、微生物から分離濃縮したコレステリンエス
テラーゼを本発明による方法に使用することもできる。

好適な濃縮は、微生物またはその他の生物的物質のアセ
トン乾菌末を原料とし、かつ該粉末に透析、弱塩基性の
陰イオン交換体を用いる処理及び硫酸アンモニウム分別
を行うことによって、達成する巳とができる。このよう
にして容易にコレステリンエステラーゼの２０ないし３
０倍のγ口縮が達成される。弱塩基性の陰イオン交換体
としては、ジエチルアミノエタノール基で変性した炭水
化物を基体とする製品が特に好適であると実証された。

硫酸アンモニウム分別で有利には硫酸アンモニウム１．
８と２．４モルの間のフラクションが得られる。こうし
て得た酵素フラクションを次いで有利には前記交換体材
料でクロマトグラフィーにかける。

特に有利な結果は、コレステリンエステル含ａの培養媒
体を用いて培養した微生物を用いて得られる。その場合
、培養の間にコレステリンエステル又はコレステリンエ
ステルの混合物を唯一の炭素源として添加してもよいし
、又はその他の炭素源と共に使用してもよい。多工程培
養法で得られた微生物を使用するのが有利であり、その
際、該微生物を第一工程では例えばグリセリンの様な好
適な炭素供給体上で培養し、かつ第二工程ではコレステ
リンエステル上で培養する。好適な培養法は例えば西ト
イ持許公開公報第２２２４１３３号及び同第２３０７５
１８号に詳説されている。

本々＠”Ａ：；　妙　により有利に使用されるカンジダ
・ルゴサＡＴＣＣからのコレステリンエステラーゼはｐ
Ｈ５とｐＨ８，５の間の弱酸性範囲で非常に良好な安定
性を有する。この酵素の至適１）Ｈ値は７．５である。

酵素の特性は、反応媒体の塩含有量が比較的高い場合に
特に良好な接触反応が進行することである。従って有利
には０．２〜０．８モル、特に０．４〜０．６モルの緩
衝溶液中で操作する。ｐＨ値は４．５と７．５の間の範
囲であってよく、イｆ利には前記したり８５〜６．５の
範囲である。有利にはコレステリンエステラーゼの作用
は表面活性物質の添加により高められる。特に有利なの
はヒドロキシポリエトキッドデカンを添加することであ
る。既述の様に、特に有利には完全に酵素的に、すなわ
ち後続するコレステリン定量を同様に有利にはコレステ
リンオキシダーゼを使用して酵素的に実施される。しか
しながらコレステリンエステラーゼ又はコレステリンデ
ヒドロゲナーゼを使用することもできる。

コレステリンオキシダーゼを用いる定量は例えば特開昭
４９−６２１９３号に記載されている。該公開公報に記
載の方法は有利に本発明の方法と組合せることができる
。その際、原則的には酵素消費量、ＨＯ生成又はコレス
テノン生成を測定することができる。

酵素消費量の測定は例えばガスクロマトグラフィー、ポ
ーラロメトリーにより又は偏光法により実施することが
できる。該測定法は自体公知である。生成した過酸化水
素は滴定分析、電位差滴定法、ポーラログラフイー及び
比色分析Ｉびに酵素法により定量することができる。

カタラーゼ又はベルオキシターゼを使用する酵素定量が
有利であり、特にβ−ジケトン、例えばアセチルアセト
ン、低級アルコール及びアンモニウムイオンを含有する
緩衝液の存在下でのカタラーゼを用いる定量又は発色体
、例えば２．２′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸
の存在でベルオキンターゼを用いる定量が有利である。

コレステノンはケト試薬、例えば２，４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンを用いるか又は２４０ｎｍで光度計を用
いて測定される。

総コレステリン又は結合型コレステリンをコレステリン
エステラーゼを用いて全酵素的に定量する場合、有利に
はノカルヂィア・エリトロポリス（Ｎｏｃａｒｄｌａ　
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｌｓ）ＡＴＣＣ１７８９５、ノカ
ルヂィア・エリトロポリス　ＡＴＣＣ４２７７、ノカル
ヂィア・ホルミカ（Ｎｏｃａｒｄｌａ　ｆｏｒｍｌｃａ
　）　ＡＴＣＣ１４８１１又はプロアクチイノミセス・
エリトロポリス（Ｐｒｏａｃｔ　Ｉｎｏ鵬ｙｃｅｓ　ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｌｌｓ）　ＮＣＩ　Ｂ　　９１５８か
らのオキシダーゼを使用する。

その他、本発明はコレステリンエステラーゼ及び遊離コ
レステリンの定量用試薬からなるコレステリン定量試薬
に関する。有利にはこの種の試薬は、微生物起源のコレ
ステリンエステラーゼ、コレステリンオキシダーゼ、Ｈ
２Ｏ２測定用の系、コレステノン測定用の系からなって
いる。その際、コレステリンエステラーゼとして前記微
生物の一つが特にアセトン乾菌末の形で使用されている
か又はそれから得られるコレステリンエステラーゼ活性
を有する蛋白フラクションを使用した試薬が極めて有利
である。

詳細かつ有利な実施例ではこの種の試薬は、コレステリ
ンオキシダーゼ、前記微生物の一つからのコレステリン
エステラーゼ製剤、カタラーゼ、アセチルアセトン、メ
タノール及びアンモラムイオン含有の緩衝剤（単独又は
混同して）からなる。その他の有利な実施例では試薬コ
レステリンエステラーゼ、本発明で使用さるべき微生物
からのコレステリンエステラーゼ活性を有する製剤、ベ
ルオキシターゼ、発色体及び緩衝剤（単独又は混同して
）からなっている。発色体としては２，２′−アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸が有利である。

その他のを利な実施例では本発明による試薬はコレステ
リンオキシダーゼ、微生物の一つからのコレステリンエ
ステラーゼ製剤及びヒドラゾン生成下にケト基と反応す
るヒドラジン誘導体並びに場合により緩衝剤からなる。

ヒドラジン誘導体としては２，４−ジニトロフェニルヒ
ドラジンが佇（７である。

前記の有利な試薬組合物は、前記成分の他に付加的に常
用の溶剤、安定化剤又は（及び）表面活性物質を含有し
てもよい。これらの添加物はすべて当業者に公知で、過
酸化水素又はコレステノンの検出系に常用されている。

有利には前記の試薬組合せ物は主成分を下記の量比で含
有する： （１）ｐＨ５〜７のアンモラムイオン含有の緩衝剤１０
０１中にコレステリンオキシダーゼ１３〜１５０！１微
生物・コレステリンエステラーゼ０．０５〜０．５■ｇ
１カタラーゼ２Ｘ１０４〜５Ｘ１０５！ｌｊ位、アセ千
ンアセト７０．０５〜０．２鵬ｌ及びメタノール２〜１
０ｍ１ｆｃＦニ、場合により表面活性剤、有利にはヒド
ロキンポリエトキシドデカン０．０２〜０．３醜１０（
２）ｐＨ８〜８の緩衝剤１００■１中、フレステリンｔ
＊シ９ーーｉ’３〜４０単位、微生物・コレステリンエ
ステラーゼ０．０５〜０，５鵬ｇｆびにペルオキシター
ゼ２×１０　〜ｌＸｌ０　　単位、２．２′−アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸５０〜２００腸ｇｔＬびに場
合により表面活性剤、特にヒドロキシポリエトキシデカ
ン０．０５〜０．５園１。

（３）ｐＨ６〜８の乾緩衝剤１０ｍ１中、コレステリン
オキシダーゼ０．１〜１単 テラーゼ０．０５〜０．５鵬ｇ１２＋　４−ジニトロフ
ェニルヒドラジンの１ミリモル溶液１〜５膳１並びに場
合により表面活性剤０．００５〜０．１１。

（４）ｐＨ５〜９の緩衝剤、有利にはｐＨ７．５の０。

５モルの燐酸ナトリウム緩衝剤５０＋ｌ中、コレステリ
ンｔ＊シ９ーゼ２〜１００単位、微生物・コレステリン
エステラーゼ０．０５〜０．５篇ｇ韮びに場合により表
面活性剤（有利にはヒドロキシポリエトキシドデカン）
０。

１〜２．　０腸１。

本発明による方法及び試薬を用いて結合型コレステリン
の極めて迅速で完全な鹸化を行なうことができる。そし
てカンジダ・ルゴサＡＴＣＣ１４８３０又はアスペルギ
ルス５ｐｅｃ、Ｗｓ　　９００３０のアセトン乾菌末を
０゜１〜Ｏ，：ｌＪ＋ｇの量を用いる場合と同様、本発
明の微生物コレステリンエステラーゼを添加する場合に
は、コレス　。

テリンオキ／ターゼを用いるフレステリン測定の条件ド
で本発明による結合型フレステリンの定量的分解は１〜
３分間以内に達成される。

次に本発明を実施例につき詳説する。

参考桝−１ 特開昭４９−８２１１３３号の例１に記載の方法を使用
して血清中の遊離コレステリンの含量的６３■ｇ％（１
００鵬ｌ中６３脂ｇ）を測定した。結合型コレステリン
を測定するためにその血清の比較試料をアルコール性水
酸化カリウム溶液で３０分間７０゛Ｃで処理した。中和
し、かつ存在するコレステリンを新たに測定して、コレ
ステリンの総合Ｑ１８１ｍｇ％が得られた。そのことか
ら、１００１当りコレステリン１１８ｍｇが結合型で存
在していたことが半噌る。

同じ方法を未処理血清を用いて繰返した。測定の始めに
市販のカンジダ・ルゴサ　ＡＴＣＣ１４８３０−アセト
ン乾菌末（プロティンに対し）Ｏ，：ｌＪ＋ｇを添加し
た。３分間後にポーラログラフイーによる測定で、総コ
レステリン含ｆｆ１１８３霧ｇ％が得られた。

釡考例−２゜ コレステリンエステラーゼ活性度を増大するためにカン
ジダ・ルゴサ　ＡＴＣＣ１４８３０を燐酸カリウム緩衝
液に溶かし、同一の緩衝液で透析した。安定化剤として
含有するラクトースを除去した後、透析した溶液中にコ
レステリンエステラーゼ比活性度０．３単位／蛋白質纏
ｇが得られた。

こうして得た溶液をジエチルアミノエタノール基で変性
したデキストランを基体とするイオン交換体と撹拌混合
し、ｐＨＥ３．０の０．２Ｍ燐酸塩緩衝液で溶離した。

溶１！物中にフレステリンエステラーゼ比活性度１．２
’ｔＬ位／■ｇが得られた。

こうして得た溶液に硫酸アンモニウム分別を行った。

１．８と２．４Ｍの間の硫酸アンモニウムで沈殿するプ
ロティンフラクションを分離した。該フラクションはコ
レステリンエステラーゼ比活性度２．５単位／■ｇを何
していた。

得られた生成物を新たにｐＨ８，０の燐酸塩緩衝液に溶
かし、同じ緩衝液に対して透析して塩を除去し、次いで
前記のものと同じ陰イオン交換体を充填したカラムを用
いてクロマトグラフィーにかけた。後、再びｐＨ８゜０
の０．２Ｍ燐酸塩緩衝液を用いて溶離した。コレステリ
ンエステラーゼ活性を有するフラクションで７単位／蛋
白質■ｇの比活性度が得られた。

こうして得た濃縮コレステリンエステラーゼ製剤を例１
に記載したようにコレステリン測定に使用した。しかし
ながら使用量はプロティンに対してＯ，００１ｍｇにす
ぎなかった。結果は例１の結果に対応している。

カンジダ・ルゴサからのコレステリンエステラーゼは酵
素精製の常法により、更に精製することができる。前記
濃縮工程の代りにその他の常用の生物化学的精製工程、
例えばポリエチレンイミン、有機溶剤又は塩を用いる沈
殿又は分別、分子篩を用いるクロマトグラフィー又はノ
エチルアミノエタノール基以外の官能基を仔する弱い陰
イオン交換体、プロタミンスルフェート沈殿法等も使用
することができる。

養！Ｊ１−１ 血清もしくはコレステリン標準液０．５閣ｌに、０，４
％のヒドロキシポリエトキシドデカンを含有するｐＨ７
゜５の０．５Ｍ燐酸カリウム緩衝液１．０ｍｌ及び例２
のコレステリンエステラーゼ２．５単位を添加する。該
反応混合物を３７”Ｃで４０分間恒温で保持する。次い
で該溶液０．２５ｍ１を酢酸２部、無水酢酸３部、及び
硫酸１部を含有するコレステリン試薬３１１１に加える
（リーベルマン・ブルヒアルト試薬）。

標！１液を対照として、代表的試料中の総フレステリン
１７０１ｇ％の値が得られた。コレステリンエステルを
アルコール性水酸化カリウム溶液を用いて鹸化する比較
定量の結果は１８５ｍｇ％であった。

釡色桝−生 血清０．０２鵬１にヒドロキシポリエトキシドデカン０
゜４％を含有する０、５Ｍ燐酸カリウム緩衝液１０履１
及び例２のコレステリンエステラーゼ０．２単位を添加
する。

反応溶液を３７°Ｃで６０分間恒温に保持する。その後
、適当な分光光度計中で２４０ｎｍで吸光度（Ｅ　　）
を読み取りかつ、反応をブレビバクテリウム・ステロリ
クム（Ｂｒｅｖｌｂａｃｔｅｒｌｕｍ　　５ｔｅｒｏｒ
ｌｃｌｕ履）からのステリングヒドラーゼ０．１単位を
用いて開始させる。１５分間後に新に吸光度（Ｅ２）を
読み取る。生成したΔ４−コレステノンの濃度、従って
コレステリンの濃度は、２４０ｎｍにおけるΔ４−コレ
ステリンのモル吸光係数を考慮して第１回目の読み取り
との差から計算される。典型的試料の測定により総コレ
ステリン１８３ｍｇ％が得られた。

ステリンデヒドラーゼの代りにコレステリンフイー、、
　、、ｔｙ−＋−ゼ［ノカルヂィア・エリトロポリス（
Ｎｏｃａｒｄｌａ　　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｌｓ　）か
ら］を用いる比較定量では総コレステリン１８１ｍｇ％
であった。

実施桝−１ 燐酸水素ニアンモニウムｌｏｇを水１００１に溶かし８
５％の燐酸でｐＨ７，０に調整する。次いでカタラーゼ
１０　単位を添加する。こうして得た溶液で、アセチル
アセトン０．２ｍｌ、メタノール１０１及びヒドロキノ
ポリエトキシドデカン０．１ｇの混合物を１００１にす
る。該溶液にリゾプス５ｐｅｃ、　　（Ｒｈｌｚｏｐｕ
ｓ　５ｐｅｃ、）　ＷＳ９００２７からのコレステリン
エステラーゼ２．５単位を添加する。

こうして得た溶液５．０■ｌを血清０．０２ｍ１もしく
はフレステリン２００ｍｇ％を含有するフレステリン標
準溶液０．０２層ｌと混合する。血清含有の試料の少ｈ
ｔに、コレステリンオキシターゼ各々０．１単位を添加
し、３７゛Ｃで６０分間恒温に保持する。次いで生成し
た色素を試料ゴ検値を考慮して４０５ｎｍで光度計を用
いて測定する。

血清含有試料のコレステリン含量は、標準液をＭＱ！１
として用いて、総フレステリン１５４■ｇ％であった。

リソ７’ス５ｐｅｃ、　ｗｓ　　９００２７からのコレ
ステリンエステラーゼの代りに、カンジダ・ルゴサＡＴ
ＣＣ１４８３からのコレステリンエステラーゼを用いる
対照測定でも、同一の値が得られた。

夫胤桝−２ 胆ｌｔ酸ナトリウム３ｍモル／１．４−アミノツェナフ
ッ０．８２ｍモル／１、フェノール１４ｍモル／ｌ、燐
酸ナトリウム−緩衝液ｐＨ８，７の１００ｍモル／１、
カルボワックス−６０００の０．１７ｍモル／１及びベ
ルオキンターゼ５．７膳ｇ／ｌを含む試薬１１に、総コ
レステリン含量１４２■ｇ／ｄｌのヒト血清０．０１ｉ
＋Ｉ及びフレステリンオキシターゼ０．０２ｍ１　（１
ｍｇ／ｍｌ）を加えた。遊離コレステリンの測定は２分
間以内で終了した。

このテストバッチに膵臓からのコレステリンエステラー
ゼ０．０５腸１（１，１７ｍｇ／ｍｌ）を加えて行うエ
ステル化コレステリンの測定は３０分間続いた。

この実験を膵臓からのコレステリンエステラーゼの代り
に等量の微生物（リゾプス５ｐｅｃ、ＷＳ　　９００２
７）からのコレステリンエステラーゼを使用して繰返し
た場合、反応即ち、総コレステリンの測定は８分間以内
で終了した。

コレステリンエステラーゼとしてリゾプス５ｐｅｃ、　
ＷＳ９００２７の代わりにプソイドモナス　５ｐｅｃ、
ＤＳＭ　　１２８０からのものを用いても同様の結果が
得られた。

復代理人弁理士（８３３４）砂川　丘部電話　（４０２
）９０８８ 昭和６１年４月２０日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アクチノミセス属、ストレプトミセス属、カンジダ属、
   クニングハメラ属、ムコル属、ペニシリウム属およびア
   スペルギルス属を除く、プソイドモナス属、シゾフィル
   ム属、クロモバクテリウム属、ノカルヂィア属、リゾプ
   ス属等の微生物由来のコレステリンエステラーゼを用い
   て結合型コレステリンからコレステリンを遊離せしめる
   ことを特徴とする、結合型コレステリンを鹸化し、続い
   て遊離したコレステリンを酵素的又は化学的な方法によ
   り測定する結合型もしくは全コレステリンの定量方法。