JPH031949B2 - - Google Patents

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JPH031949B2
JPH031949B2 JP59225485A JP22548584A JPH031949B2 JP H031949 B2 JPH031949 B2 JP H031949B2 JP 59225485 A JP59225485 A JP 59225485A JP 22548584 A JP22548584 A JP 22548584A JP H031949 B2 JPH031949 B2 JP H031949B2
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coprinus cinereus
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cinereus
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description

【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野） 本発明は微生物によるペルオキシダーゼの製造
法、更に詳しくはコプリヌス属に属する担子菌に
よつて生産され、４−アミノアンチピリン（以下
「４−AA」と略す）−フエノール系、３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下
「MBTH」と略す）−ジエチルアニリン（以下
「DEA」と略す）系、及び２，2′−アジノ−ジ−
（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸
（以下「ABTS」と略す）を水素供与体として発
色するペルオキシダーゼの製造法に関する。 （従来技術） ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で
種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診
断用試薬として、グルコース、コレステロール、
リン脂質及び尿酸の定量に種々のオキシダーゼと
共に使用されており、又、酵素免疫試験法におけ
る標識酵素として使用されているが、その供給源
としては、主に西洋ワサビ、大根等の植物が用い
られている。しかしながら、これらの植物由来の
ペルオキシダーゼには、性質が僅かずつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純
粋な酵素を得るにには、アイソザイムを分離する
必要があり、非常に手間を要するという問題があ
る。 微生物起源のペルオキシダーゼも各種知られて
おり、例えば細菌及び糸状菌の生産するチトクロ
ームＣペルオキシダーゼやNADHペルオキシダ
ーゼなどがあるが、これらは通常の西洋ワサビ及
び大根のそれぞれに由来するような非特異的なペ
ルオキシダーゼではなく、その特異性の面で、臨
床診断用試薬に用いるには不適である。又、近年
Ｏ−ジアニシジンを水素供与体とするペルオキシ
ダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属する微
生物から生産されたが、Ｏ−ジアニシジンは発癌
作用を有するため、その臨床診断薬への使用は回
避される傾向にあり、やはり上記診断試薬として
の使用には適していない。 （発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、従来の西洋ワサビ或いは大根に
由来するペルオキシダーゼと同様に、臨床診断用
試薬及び酵素免疫試験における標識酵素などとし
て使用し得るペルオキシダーゼを増殖の速い微生
物から得るために、種々の微生物について、４−
AA−フエノール系、MBTH−DEA系及び
ABTS等の発色剤により呈色するペルオキシダ
ーゼの生産性を検討した。その結果、コプリヌス
属に属し、ペルオキシダーゼ高生産能を有する微
生物を見出し、本発明を完成した。 （発明の構成） 本発明においてコプリヌス属に属するペルオキ
シダーゼ生産能を有する微生物としては、財団法
人発酵研究所（IFO）に保管されているコプリヌ
ス・シネレウス f.ミクロポラス（Coprinus
cinereus） f.microsporous）IFO 8371、コプ
リヌス・シネレウスIFO30114、コプリヌス・シ
ネレウスIFO30627、コプリヌス・シネレウス
IFO30628、コプリヌス・シネレウスIFO31333等
があげられる。 これらの菌株を培養するためには、その菌株の
胞子、菌糸あるいは予め培養して得られた前培養
液を液体培地に接種し培養する。液体培地の場合
に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、
キシロース、サツカロース、マルトース、可溶性
澱粉、糖密、グリセロール、マンニトール等の一
般的に使用されるものがいずれも使用できる。窒
素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキ
ス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカ
ー等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源な
らびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無
機窒素源を用いることができる。この他必要に応
じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅
等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使
用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害
しない濃度であれば特に制限はない。実用上一般
に、炭素源は0.1〜10重量％、好ましくは１〜５
重量％、窒素源は0.01〜５重量％、好ましくは
0.1〜２重量％の濃度とするのがよい。又、培養
温度は10〜42℃、好ましくは30〜37℃とし、培地
のPHは４〜10、好ましくは６〜９として、通気撹
拌培養、振盪培養もしくは静置培養を行なう。培
養は通常３〜14日間で行なわれる。 この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無機
塩類、微量栄養源を加えることができる。大量培
養のためには液体培地を使用することが好まし
い。 このように培養して培養液中にペルオキシダー
ゼが生成蓄積する。培養液中からペルオキシダー
ゼの採取は次のごとく行なう。 培養終了後、培養液より遠心分離及び過など
の固液分離手段により菌体及び不溶物を除いて粗
酵素を得る。 このようにして得られた粗酵素液から例えば有
機溶媒分別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法
及びカラムクロマトグラフイー等通常の酵素精製
方法を単独にあるいは組合せて用いることにより
精製されたペルオキシダーゼを得ることができ
る。 本発明のペルオキシダーゼ活性の測定は、水素
供与体として例えば４−AA−フエノール系を使
用して次のように行なう。即ち、0.1Mリン酸バ
ツフアー（PH7.0）１mlに、0.1％フエノール溶液
1.3ml、0.2％４−AA溶液0.25ml及び0.02％過酸化
水素溶液0.2mlを加え、37℃に予熱後、これに酵
素液0.25mlを加えて10分間反応させる。反応後20
％アジ化ナトリウム溶液0.2mlを加え、500nmの
吸光度を測定して反応値とする。別にコントロー
ルとして過酸化水素溶液の代わりに水0.2mlを加
えて反応を行ない、同様の操作によつて吸光度を
測定しコントロール値とする。ペルオキシダーゼ
力価の単位Ｕ（ユニツト）は１分間に1μモルの４
−AA−フエノールを酸化する（即ち1μモルの過
酸化水素を消費する）酵素量として表わされ、酵
素液又は培養液のペルオキシダーゼ力価（Ｕ／
ml）は0.198×△0.D.500×（酵素液又は培養液の希
釈率）で求められる。なお、上式において△0.D.
500は反応値からコントロール値を引いた値を示
す。 次に本発明で得られるペルオキシダーゼの性質
を示す。 (1) 作用特異性； 本酵素は過酸化水素の存在下で種々の化合物
の酸化を触媒する。その作用機構は次式に示す
通りである。 H2O2＋AH2ペルオキシダーゼ ―――――――――→ 2H2O＋Ａ 〔但し式中AH2は水素供与体を、又、Ａは酸化
された水素供与体を示す〕 (2) 水素供与体に対する特異性； 本酵素の種々の水素供与体に対する特異性を
第１表に示す。
【表】
【表】 (3) 至適PH； PH3.5〜5.5の範囲は0.1M酢酸バツフアー、PH
5.5〜8.0の範囲は0.1Mリン酸バツフアー、PH
7.5〜9.0の範囲は0.1Mトリス−塩酸バツフア
ー、PH8.5〜9.0範囲は0.1Mグリシン−水酸化ナ
トリウムバツフアーを使用して、活性測定と同
様の配合比率で検討した。その結果を第１図に
示す。 (4) 至適作用温度； 10〜90℃における酵素活性を測定した結果を
第２図に示す。 (5) PH安定性 PH3.5〜5.0の範囲は0.1M酢酸バツフアー、PH
6.0〜8.0の範囲は0.1Mリン酸バツフア、PH8.0
〜9.0は0.1Mトリス−塩酸バツフアー、PH9.0〜
12.0は0.1Mグリシン−水酸化ナトリウムバツ
フアーを使用し、これらのバツフアー溶液0.9
mlに酵素液0.1mlを加えた後、30℃に16時間放
置した。この処理酵素液を0.02Mリン酸バツフ
アー（PH7.0）で10倍に希釈した後、活性を測
定した。その結果を第３図に示す。 (6) 温度安定性； 0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）1.9mlに酵
素液0.1mlを加えて調製した酵素液を10〜90℃
の種々の温度に30分間保ち、処理後、直ちに氷
水で10分間冷却し、残存酵素活性を測定した。
その結果を第４図に示す。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ グルコース１％、ポリペプトン0.5％、酵母エ
キス0.3％を含む培地（PH6.0）10mlを径24mmの試
験管に入れ、120℃で15分間殺菌した。コプリヌ
ス・シネレウスIFO8371の１白金耳を接種し、振
盪培養機（300rpm）により30℃で６日間振盪培
養した。培養液を過し、液のペルオキシダー
ゼ力価を測定した結果、1.3U／mlであつた。 実施例 ２ 実施例１に準じ、コプリヌス・シネレウス
IFO30627を同様にして７日間培養した結果、培
養液のペルオキシダーゼ活性は、3.4U／mlで
あつた。 実施例 ３ 実施例１と同じ組成の培地100mlを500ml容三角
フラスコに入れ、120℃で20分間殺菌した。コプ
リヌス・シネレウスIFO30628の１白金耳を接種
し、レシプロシエーカー（110rpm）により34℃
で６日間振盪培養した。培養液を過し、液の
ペルオキシダーゼ力価を測定した結果、1.7U／
mlであつた。
【図面の簡単な説明】
第１図は反応PHと本発明ペルオキシダーゼの相
対活性との関係を示すグラフであり、第２図は反
応温度と相対活性との関係を示すグラフであり、
第３図はPH安定性を示すグラフであり、第４図は
温度安定性を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ コプリヌス・シネレウス（Coprinus
    cinereus）に属するペルオキシダーゼ生産能を有
    する微生物を液体倍地で倍養し、液体培地中に分
    泌された、アイゾザイムを実質的に含まないペル
    オキシダーゼを採取することを特徴とするペルオ
    キシダーゼの製造方法。 ２ 微生物が、 コプリヌス・シネレウス f.ミクロスポラス
    （Coprinus cinereus f.microsporous） IFO
    8371； コプリヌス・シネレウス IFO 30114； コプリヌス・シネレウス IFO 30627； コプリヌス・シネレウス IFO 30628； および コプリヌス・シネレウス IFO 31333； からなる群から選択される、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
JP59225485A 1984-10-26 1984-10-26 ペルオキシダ−ゼの製造法 Granted JPS61104784A (ja)

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CA000493834A CA1256815A (en) 1984-10-26 1985-10-25 Process for producing peroxidase
DE8585113598T DE3585133D1 (de) 1984-10-26 1985-10-25 Verfahren zur herstellung von peroxydase.
EP85113598A EP0179486B1 (en) 1984-10-26 1985-10-25 Process for producing peroxidase
AT85113598T ATE71407T1 (de) 1984-10-26 1985-10-25 Verfahren zur herstellung von peroxydase.
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