JPS6236486B2

JPS6236486B2 -

Info

Publication number: JPS6236486B2
Application number: JP55110295A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Takahashi; Kazuo Takechi; Eiichi Hasegawa
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1980-08-13
Filing date: 1980-08-13
Publication date: 1987-08-07
Also published as: JPS5735521A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アルブミン、γ−グロブリンのよう
な血漿蛋白質を含有する水溶液よりその中に夾雑
する型物質及び発熱性物質の徐去法に係る。アルブミン、γ−グロブリンを分画する一般的
な方法として次のような方法がある。 (a) 硫酸アンモニウムおよび類似の塩類による沈
デン、 (b) 冷エタノールまたはアセトンおよび他のアル
コール類およびケトン類による有機溶媒沈デ
ン、 (c) 与えられたタンパク質が電荷をもたない点へ
PHを調節することによる等電点沈デン、および (d) CM−セルロース、DEAE−セルロースのよ
うな吸着剤の使用または「セフアデツクス」ゲ
ルロ過法によるクロマトグラフイー。さらに、選択的に分画し、精製するために最近
開発された操作は、グリシンおよびβ−アラニン
のようなアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコールおよびポリオキシエチレ
ン−ポリオキシプロピレン共重合体のような水溶
性有機ポリマー、ジメチルアミンプロピルイミド
基のような塩基アミノ基を含有している水不溶性
高分子電解質を分画剤として使用することなどで
ある。これらの方法は、アルブミン、γ−グロブリン
のような血漿蛋白質の回収には各々特徴を有して
おり、高度に有用であり且つ経済性を満たすもの
である。しかしながら、これらの方法においても未だな
お満足されない技術事項として、血漿蛋白製剤中
に夾雑する型物質及び発熱性物質などの除去の問
題がある。これは、これらの物質が物理化学的に
広範囲にわたる性質を有することに原因してお
り、通常の方法では従来除去することはきわめて
困難であつた。これらの物質の除去法として今日
開示された方法としては、総量に対する55％以上
濃度のエタノールによる分画、−５℃〜−10℃の
温度でトリクロロ酢酸を加えて物質を除去する方
法（特開昭（49−85218号、同49−85219号）、及
びポリエチレングリコール分画による型物質を除
去する方法（特開昭53−127808号）等がある。しかし前三者の方法は、タンパク変性（沈澱）
剤であるトリクロロ酢酸の使用によるタンパク変
性の危険性並びに引火性危険物である、アルコー
ルの高濃度使用並びに−５゜〜−10℃低温維持操
作のための冷却を常に必要とし、工程の安全性の
上で難点を有し、又経済性に劣る。後者は、きわめて経済的でありかつ完全な効果
が期待できるが独立のポリエチレングリコール分
画をおこなう必要があること、分画に用いるポリ
エチレングリコールの回収が容易でないことなど
の欠点を有している。本発明の目的は、ヒト・アルブミン、γ−グロ
ブリンのような血漿蛋白質を含有する水溶液中よ
り、夾雑している型物質・発熱性物質を除去する
ための経済的、且つ安全な方法を提供するにあ
る。本発明者らは、ヒト・アルブミン、γ−グロブ
リンのような人血漿蛋白質を回収するために種々
検討を加えた結果、そこに夾雑する型物質及び発
熱性物質のような糖蛋白質を極めて簡単に完全に
分離する方法を見いだし、本発明に到達した。本発明によりヒトのアルブミン及び／又はγ−
グロブリンを含有する水溶液にアルミニウム塩を
終濃度0.05〜10ｍＭ、および亜鉛塩を終濃度0.5
〜100ｍＭとなるように添加し、血漿蛋白質を沈
澱させると共に夾雑する型物質及び発熱性物質を
上清に残存させることを特徴とするヒト血漿蛋白
質より型物質及び発熱性物質の除去方法が提供さ
れる。本発明の方法を適用する対象は、ヒト・アルブ
ミン、γ−グロブリンのような血漿蛋白質を含む
かぎり特に限定されず、従来公知の方法に従つて
各々の高度精製物であつてもよいが、粗精製段階
のものでもよい。製造工程における効率化の観点
から粗精製段階のものが好ましい。対象となる水溶液は、蛋白質を１〜40ｇ／に
含有することが好ましい。さらにこの水溶液は、
部分的に溶血した血液又は胎盤抽出液、胎盤後血
その他人血液由来の血漿から得られた型物質、発
熱性物質を夾雑するアルブミン、γ−グロブリン
のような血漿蛋白質のすべての水溶液が当てはま
る。アルミニウム塩としては、ミヨウバン、硫酸ア
ルミニウム、塩化アルミニウム等があげられる。亜鉛塩としては、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、塩化亜
鉛等があげられるが、より好ましいものとして
は、酢酸亜塩である。その添加量は、単独に使用
する場合にはアルミニウム塩0.05〜10ｍＭ、亜鉛
塩0.5〜100ｍＭの濃度で効果があり他の分画法と
併用した場合には、さらに低濃度で使用できる。
なおアルミニウム塩と亜鉛塩との添加順序は何れ
が先でもよく、また同時であつてもよい。アルミニウム塩及び亜鉛塩による処理条件とし
ては、PHは６〜８に調整してあることが好まし
く、温度は０〜35℃で十分であるが、４〜25℃が
より好ましい。処理は、蛋白質水溶液中に亜鉛塩
を含有する水溶液を混入させ撹拌後静置し、沈澱
と上清を分離し、沈澱はアルブミン、γ−グロブ
リンのような血漿蛋白質が回収され、上清は型物
質及び発熱性物質を含むものとして除去される。本方法によつて分離除去されたものは、糖蛋白
質である血液型物質が代表的であり、それはＡ
型、Ｂ型、Ｈ型、Le型、のいずれもが50〜90％
に達する糖を含んでいる。その分子量は数万から
数百万に亘り、また分子内シアル酸含有量に大差
があるため等電点も酸性から弱アルカリ性まで広
い範囲に分布しているもので、その物理学的性質
が広範囲に亘るところから従来分離は困難とされ
ていたものである。また、細菌の細胞外壁を構成するリポ多糖蛋白
も、蛋白含量は少なく、リピドと多糖部分が全体
の50％以上を占め、発熱性物質として作用する物
質であるが、この蛋白も本方法によつて蛋白水溶
液から分離除去することが可能である。回収された沈澱は、アルブミン、γ−グロブリ
ンのような血漿蛋白成分を含有しており、高度精
製されたものは、要すればEDTAの様なキレート
剤によつてイオンの回収・除去処理をおこない、
粗精製の場合は、アルブミン、γ−グロブリン
個々に特有の分画法を適用して高度精製をおこな
う。なお医薬製剤化のための通常の操作、すなわ
ち脱塩、除菌過及び脱水等の処理は必要により
実施される。かくして本発明によるときは、型物質及び発熱
性物質等の糖含量の多い蛋白成分を経済的に且つ
完全に除去することができることから、これらに
よつて生じる副作用の心配のないアルブミン、γ
−グロブリンのような血漿蛋白製剤を効率的に得
られる。この方法を従来技術の血漿蛋白製剤の製
造法と組み合わせることは、該製剤の供給方法と
して医療上極めて有益である。以下、実験例、実施例によつて本発明を説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。尚実施例中型物質の測定は、赤血球凝集阻止試
験（検体希釈法）〔E.A.Kabat.“Blood Group
Substance”、Academic Press、New York.P.56
（1956）〕に従い、発熱性物質の測定は、厚生省薬
務局監集「生物学的製剤基準」（1979、細菌製剤
協会刊行｝の発熱性物質試験法による。実験例１型物質を夾雑するヒト胎盤由来アルブミン（以
下Ｐ−Ａ）を使用して型物質の除去効果に関する
実験をおこなつた。10のＰ−Ａを含む水溶液
（蛋白質濃度２％になるよう生理食塩水を加える
ことによつて調整。）にミヨウバン、硫酸アルミ
ニウム、塩化アルミニウムを各々終濃度0.1、
0.5、1.0、５ｍＭに添加し、1N−苛性ソーダまた
は1N−塩酸によりPHを7.0±0.1に調整後、硫酸亜
鉛、酢酸亜塩、塩化亜鉛を各々終濃度10、15、
20、25ｍＭに添加し、1N−苛性ソーダまたは1N
−塩酸によりPHを7.0±0.1に調整後、約30分間撹
拌した。約１時間静置後、遠心して、Ｐ−Ａを沈
澱として回収し、これを10ｍＭのEDTA・3Na液
に溶解させ、透析後５％蛋白質濃度の水溶液を調
整しこれを型物質の測定に供した。結果は表１に示す。この結果アルミニウム塩0.1〜５ｍＭ、亜鉛塩
10〜25ｍＭの濃度で処理したＰ−Ａは末処理Ｐ−
Ａにくらべて型物質含量が1/50以下になつた。

【表】

【表】実験例２生理学的製剤基準の発熱性物質試験に不合格と
なつたヒトタイバン由来Ｐ−Ａを使用して発熱性
物質の除去効果に関する実験をおこなつた。Ｐ−
Ａを含む水溶液20（蛋白質濃度２％に生理食塩
水によつて調整）にミヨウバン、硫酸アルミニウ
ム、塩化アルミニウムを各々終濃度0.1、0.5、
１、５ｍＭに添加し1N−NaOHまたは1N−HClで
PH7.0±0.1に調整後、それぞれに硫酸亜鉛、酢酸
亜鉛、塩化亜鉛を各々終濃度10、15、20、25ｍＭ
に添加し、PHを7.0±１に1N−NaOHまたは1N−
HClによつて調整し、約30分間撹拌した。約１時
間静置後遠心して、Ｐ−Ａを沈澱として回収し、
10ｍＭ EDTA水溶液に溶解・透析後５％蛋白質
濃度の水溶液（等張）を調整した。これを10ml／
Kg１群３匹のウサギに投与し、前記発熱性物質試
験法に準拠して三試料につき検定した。判定は、
各実験につき３匹の体温上昇の合計値（℃）で示
した。この実験は３回繰り返した。その結果を表２に示す。この結果より、10〜20
ｍＭの濃度で処理したＰ−Ａはいずれも陰性とな
り発熱性物質の除去が完全であることを示した。実験例３実験例１、実験例２のヒト胎盤由来Ｐ−Ａの代
りに型物質及び発熱性物質をそれぞれ夾雑するヒ
ト胎盤由来γ−グロブリンを使用して同じ実験を
繰り返えしたが、型物質、発熱性物質の除去とも
に十分の効果を得た。

【表】実施例１娩出後直ちに凍結して保存したヒト胎盤を使用
して特公昭51−40132に準じた硫安分画法および
有機酸存在下での加熱処理によつて得たアルブミ
ン96％、α−グロブリン及びβ−グロブリン４％
の蛋白組成からなる血漿蛋白製剤を２％水溶液
（含0.2％NaCl）に調整し、この1000にミヨウ
バンを終濃度0.1ｍＭ添加した。さらに1M硫酸亜
鉛を終濃度10ｍＭに添加した。撹拌後１時間静置
し遠心分離（3000R.P.M.）によつて沈澱を回収
し、30ｍＭ EDTA200中に溶解し、約10分撹
拌後、これをセロフアンチユーブに入れ冷却流水
に対して透析し、このものをカプリル酸ナトリウ
ム存在下で60℃、10時間の加熱処理をおこない人
血漿蛋白製剤を得た。血漿蛋白の収量は、胎盤１
コ当り約2.5ｇであつた。蛋白組成は電気泳動法
分析で99％アルブミンであつた。型物質試験及び
発熱性物質試験は陰性であつた。実施例２ヒト胎盤の代りに胎盤後血及び溶血血漿をそれ
ぞれ使用して、実施例１をくりかえし各々１当
り、それぞれ約13ｇ、約20ｇの血漿蛋白を回収し
た。得られた血漿蛋白は電気泳動法分析でどちら
も99％アルブミンであつた。又、型物質試験、発
熱性物質試験はどちらも陰性であつた。実施例３娩出後凍結保存された胎盤を800個使用し、蒸
溜水で洗浄後、ミンチ状に細砕した。これに１％
食塩水560を加え、12℃以下の温度で45分間撹
拌して血液成分を抽出し、この上清を分離した。
この抽出液１当り285ｇの硫酸アンモニウムを
添加して沈澱を分離回収した。この沈澱を２％
W/V濃度の水溶液（生理食塩水）に調整後、ミ
ヨウバンを終濃度0.5ｍＭ、硫酸亜鉛を終濃度10
ｍＭに添加し、10分間撹拌した。２時間静置後遠
心分離し回収した。この沈澱を特開昭53−20415のポリエチレング
リコール分画法（ポリエチレングリコール濃度４
％W/V、５％W/V、12％W/Vを使つて分画する
方法。）に準じて分画をおこない、γ−グロブリ
ン400ｇの凍結乾燥製剤を得た。このものは型物
質試験、発熱性物質試験はどちらも陰性であつ
た。実施例４血漿蛋白＋沈澱画分を出発物として、これ
を２％蛋白濃度の水溶液に蒸溜水で調整し、ミヨ
ウバンを終濃度0.5ｍＭに添加しこれに1Mの硫酸
亜鉛水溶液を添加し、終濃度12ｍＭとし、撹拌し
た。２時間静置後遠心分離をおこない、沈澱を回
収する。この沈澱に対して、ポリオキシエチレン
−ポリオキシプロピレンコポリマー（M.
W.10800）による分画法（特開昭49−81519：６
〜8.5％でPH４〜５で沈澱させ、上澄液を再びPH
4.5〜5.5、8.5〜10％で沈澱、上澄液をPH6.5〜
7.5、14〜16％で沈澱、この沈澱を回収）をおこ
ない抗補体価１６の凍結乾燥ガンマ・グロブリン
製剤を得た。このものは、発熱性物質試験、型物
質試験ともに陰性であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒトのアルブミン及び／又はγ−グロブリン
を含有する水溶液にアルミニウム塩を終濃度0.05
〜10ｍＭ、および亜鉛塩を終濃度0.5〜100ｍＭと
なるように添加し、血漿蛋白質を沈澱させると共
に夾雑する型物質及び発熱性物質を上清に残存さ
せることを特徴とするヒト血漿蛋白質より型物質
及び発熱性物質の除去方法。２アルミニウム塩がミヨウバン、硫酸アルミニ
ウム又は塩化アルミニウムである特許請求の範囲
の第１項記載の方法。３亜鉛塩が酢酸亜鉛、硫酸亜鉛又は塩化亜鉛で
ある特許請求の範囲の第１項記載の方法。４ヒトのアルブミン及びγ−グロブリンがヒト
の血液、血漿又は胎盤、胎盤後血由来のものであ
る特許請求の範囲の第１項記載の方法。