JPS6236674B2 - - Google Patents
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- JPS6236674B2 JPS6236674B2 JP55036777A JP3677780A JPS6236674B2 JP S6236674 B2 JPS6236674 B2 JP S6236674B2 JP 55036777 A JP55036777 A JP 55036777A JP 3677780 A JP3677780 A JP 3677780A JP S6236674 B2 JPS6236674 B2 JP S6236674B2
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- Japan
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- threonine
- strain
- methionine
- serratia
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/88—Serratia
- Y10S435/881—Serratia marcescens
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- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- General Chemical & Material Sciences (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるL−スレオニンの製法に
関する。 従来、L−スレオニンを発酵法により製造する
方法としてセラチア属以外の微生物ではL−スレ
オニンの生合成に関与するアミノ酸を要求する変
異株、あるいはスレオニンの代謝拮抗物質に耐性
を有する変異株を用いる方法が知られている(特
公昭45−26708号、同46−33195号、同46−34193
号、同46−34194号および同48−44876号)。又、
セラチア属微生物を用いる方法としてスレオニン
分解酵素欠損性でかつスレオニン代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株を用いる方法も知られている
が(特公昭52−48195号)、いずれの方法もL−ス
レオニンの生成蓄積量においてまだ満足し得るも
のではなかった。 本発明は、セラチア・マルセツセンスに属し、
L−スレオニン生産能を有する微生物のメチオニ
ン代謝拮抗物質に耐性な変異株を培養して培養液
中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、該培養液
からL−スレオニンを採取することを特徴とする
発酵法によるL−スレオニンの製法である。本発
明方法の如く、セラチア属微生物のメチオニン代
謝拮抗物質耐性変異株がL−スレオニンを生成蓄
積せしめ得ることは、まだ知られていない。 本発明方法で用いる菌株は、バージース・マニ
アル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー(Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology)第8版、第326頁にセラチア・マ
ルセツセンスの菌学的性状として記載されている
諸性状を有し、かつL−スレオニン生産性とメチ
オニン代謝拮抗物質(例えばエチオニン、ノルロ
イシン等)耐性とを併有する変異株である。 本発明方法で使用するこのような菌株は、セラ
チア・マルセツセンスに属する公知のL−スレオ
ニン生産性変異株、例えば変異特性として各種ア
ミノ酸(イソロイシン、リジン、メチオニン、ジ
アミノピメリン酸等)要求性、アミノ酸アナログ
(ハイドロキシノルバリン;S−2−アミノエチ
ルシステイン等)耐性、スレオニン分解酵素(L
−スレオニン脱水素酵素、L−スレオニンデアミ
ナーゼ等)欠損性等を付与されるか、あるいはア
スパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素に
対するスレオニンによるフィードバック阻害が解
除されスレオニン生合成の代謝が調節されている
変異株を親株とし、それらより更に変異誘導せし
めたものであってもよい。このような親株として
は、スレオニン分解酵素(L−スレオニン脱水素
酵素およびL−スレオニンデアミナーゼ)欠損性
およびイソロイシン要求性を有するセラチア・マ
ルセツセンスD−60株〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジイ、VoL.135、No.2(1978)、318〜
323頁〕、スレオニン分解酵素欠損性、イソロイシ
ン要求性およびハイドロキシノルバリン耐性を有
するセラチア・マルセツセンスHNr53株〔アプラ
イド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバ
イオロジイ、VoL.35、No.5(1978)、第834〜840
頁〕、スレオニン分解酵素欠損性、イソロイシン
要求性、並びにハイドロキシノルバリンおよびS
−2−アミノエチルシステイン耐性を有するセラ
チア・マルセツセンスAECr301株〔同上、
VoL38、No.5(1979)、第777〜782頁〕、スレオニ
ン分解酵素欠損性、イソロイシン要求性およびハ
イドロキシノルバリン耐性を有し、更にアスパル
トキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素の活性が
スレオニンによるフィードバック阻害の解除され
たセラチア・マルセツセンスT−570〔同上、
VoL38、No.6(1979)、第1045〜1051頁〕等があ
げられる。 本発明方法で用いる微生物の代表例としてセラ
チア・マルセツセンスSr41のP−103株(微工研
菌寄第5413号)をあげるが、本菌株はセラチア・
マルセツセンスAECr301株から誘導されたもの
でメチオニン代謝拮抗物質のうちエチオニンに耐
性な変異株である。その他上記のようなL−スレ
オニン生産性変異株を更に通常の変異誘導操作例
えば紫外線照射するか、あるいは変異誘起剤(例
えばN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジン、エチルメタンスルホネート等)で処理
することによってメチオニン代謝拮抗物質に耐性
な変異特性を附与せしめたもので、メチオニン代
謝拮抗物質1〜20mg/mlを添加した平板培地(例
えばデービスの最小培地)に30℃にて2〜4日間
培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分解するこ
とにより単離取得せる変異株が使用出来る。例え
ば親株の細胞をエーデルバーグ等の方法
〔Biochem.Biophys.Res.Commun.、18、第788〜
795頁(1965年)〕によってN−メチル−N′−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジンで処理して該細胞
に変異を誘起せしめ、この細胞をDL−エチオニ
ン10mg/mlを添加した寒天培地(ブドウ糖0.5
%、硫安0.1%、リン酸第一カリウム0.3%、リン
酸第二カリウム0.7%、硫酸マグネシウム7水和
物0.01%、L−イソロイシン0.01%を含む最小培
地)に塗布する。次に30℃にて4日間培養し、生
じた大きなコロニーを釣菌分離すれば、エチオニ
ン耐性株を採取することが出来るのでこのような
変異株を使用すればよい。 また、本発明方法では、上記の如くして取得さ
れるエチオニン代謝拮抗物質耐性株に、必要によ
り更に前記アミノ酸要求性やアミノ酸アナログ耐
性、スレオニン生合成の代謝調節変異等の特性を
通常の変異誘導操作あるいは形質導入法によって
適宜付与することが出来るのでこのような変異株
を使用することも出来る。 本発明方法において、L−スレオニン生産用培
地としては、炭素源としてブドウ糖、庶糖、糖密
の如き糖類、フマール酸、クエン酸の如き有機
酸、グリセロールの如きアルコール類等を10〜20
%、窒素源として酢酸アンモニウムの如き有機ア
ンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウムの如き無機アンモニウム塩、尿素等を1〜2
%、有機栄養物としてコーンステイープリカー、
ペプトン、酵母エキス等を0〜1%の範囲でそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いることが出
来る。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネ
シウム等を少量加え、更に培地のpHを6〜8に保
つため炭酸カルシウムあるいは必要に応じアンモ
ニアを添加してもよい。また更にこのような培地
にスレオニン生合成に関与する物質、例えばL−
アスパラギン酸、L−ホモセリン、L−リジン、
L−メチオニン、L−イソロイシン等を適宜添加
した培地を使用することも出来る。 本発明方法によれば、上記培地に前記メチオニ
ン代謝拮抗物質に耐性な変異株を接種し、25〜37
℃にて強振とうする如き酸素供給の良好な条件下
で5〜6日間培養することによって培地中にL−
スレオニンを著量蓄積せしめることが出来る。か
くして発酵終了液中には、L−スレオニンが生成
蓄積されてくるが、L−スレオニン以外の副生ア
ミノ酸の蓄積は極めて少量であるので生成したL
−スレオニンは例えばイオン交換樹脂を用いる通
常の分離精製操作によって容易に採取することが
出来る。 実施例 1 庶糖17.5%、第二リン酸カリウム0.1%、硫酸
マグネシウム7水和物0.1%、硫酸アンモニウム
0.05%、尿素1.75%、コーンステイープリカー0.1
%、L−メチオニン0.1%および炭酸カルシウム
1%を含む発酵培地(pH7.0)15mlを500ml容振と
うコルベンに注入し、加熱滅菌した。但し、庶糖
およびL−メチオニンは別滅菌後添加した。別に
庶糖12.5%、第二リン酸カリウム0.1%、硫酸マ
グネシウム7水和物0.1%、硫酸アンモニウム
0.05%、尿素1.5%、コーンステイープリカー0.1
%、L−メチオニン0.1%および炭酸カルシウム
1%を含む培地に30℃、20時間培養したセラチ
ア・マルセツセンスSr41のp−103株(微工研菌
寄第5413号)の培養液0.5mlを上記発酵培地に植
菌した。30℃、140回転/分、振幅7cmの条件下
で120時間培養した。培養液中のL−スレオニン
の生成量は45.5mg/mlであった(尚、L−スレオ
ニンの確認はペーパークロマトグラムのニンヒド
リン反応によって、その定量はロイコノストツ
ク・メツセンテロイデスp-60によるバイオアツ
セイによって行った)。 上記菌株の培養液1を集め、熱処理したのち
ロ過する。ロ過をアンバーライトIR−120(H
型)を充填したカラムに導通し、水洗後、吸着し
たL−スレオニンを5%アンモニア水で溶出し
た。L−スレオニン区分を集め、減圧濃縮し脱色
ロ過した。ロ液にメタノールを加え、生じた粗結
晶を含水メタノールより再結晶することにより、
L−スレオニン35gを得た。 尚、セラチア・マルセツセンスAECr301株を
上記と同一条件に培養したところ、培養液中のL
−スレオニンの生成量は9.0mg/mlであった。 参考例 1 下記第1表に示す各菌株を栄養寒天斜面培地上
で20時間培養し、生育した菌株をそれぞれかきと
り、生理的食塩水で洗浄した。この菌体のけん濁
液を、DL−エチオニン0.1または10mg/mlの
割合で添加した最少培地(培地組成:ブドウ糖
0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.3%、リ
ン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム・7
水和物0.01%、およびL−イソロイシン0.01%)
3mlに植菌して30℃にて20時間培養し、各菌株の
生育度を調べた。その結果は第1表に示す通りで
あり、本発明方法で使用するエチオニンに耐性な
変異株(セラチア・マルセツセンスSr41のp−
103株)では、高濃度のエチオニンによっても生
育が全く阻害されず、強いエチオニン耐性を獲得
していることを示している。 【表】
関する。 従来、L−スレオニンを発酵法により製造する
方法としてセラチア属以外の微生物ではL−スレ
オニンの生合成に関与するアミノ酸を要求する変
異株、あるいはスレオニンの代謝拮抗物質に耐性
を有する変異株を用いる方法が知られている(特
公昭45−26708号、同46−33195号、同46−34193
号、同46−34194号および同48−44876号)。又、
セラチア属微生物を用いる方法としてスレオニン
分解酵素欠損性でかつスレオニン代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株を用いる方法も知られている
が(特公昭52−48195号)、いずれの方法もL−ス
レオニンの生成蓄積量においてまだ満足し得るも
のではなかった。 本発明は、セラチア・マルセツセンスに属し、
L−スレオニン生産能を有する微生物のメチオニ
ン代謝拮抗物質に耐性な変異株を培養して培養液
中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、該培養液
からL−スレオニンを採取することを特徴とする
発酵法によるL−スレオニンの製法である。本発
明方法の如く、セラチア属微生物のメチオニン代
謝拮抗物質耐性変異株がL−スレオニンを生成蓄
積せしめ得ることは、まだ知られていない。 本発明方法で用いる菌株は、バージース・マニ
アル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー(Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology)第8版、第326頁にセラチア・マ
ルセツセンスの菌学的性状として記載されている
諸性状を有し、かつL−スレオニン生産性とメチ
オニン代謝拮抗物質(例えばエチオニン、ノルロ
イシン等)耐性とを併有する変異株である。 本発明方法で使用するこのような菌株は、セラ
チア・マルセツセンスに属する公知のL−スレオ
ニン生産性変異株、例えば変異特性として各種ア
ミノ酸(イソロイシン、リジン、メチオニン、ジ
アミノピメリン酸等)要求性、アミノ酸アナログ
(ハイドロキシノルバリン;S−2−アミノエチ
ルシステイン等)耐性、スレオニン分解酵素(L
−スレオニン脱水素酵素、L−スレオニンデアミ
ナーゼ等)欠損性等を付与されるか、あるいはア
スパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素に
対するスレオニンによるフィードバック阻害が解
除されスレオニン生合成の代謝が調節されている
変異株を親株とし、それらより更に変異誘導せし
めたものであってもよい。このような親株として
は、スレオニン分解酵素(L−スレオニン脱水素
酵素およびL−スレオニンデアミナーゼ)欠損性
およびイソロイシン要求性を有するセラチア・マ
ルセツセンスD−60株〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジイ、VoL.135、No.2(1978)、318〜
323頁〕、スレオニン分解酵素欠損性、イソロイシ
ン要求性およびハイドロキシノルバリン耐性を有
するセラチア・マルセツセンスHNr53株〔アプラ
イド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバ
イオロジイ、VoL.35、No.5(1978)、第834〜840
頁〕、スレオニン分解酵素欠損性、イソロイシン
要求性、並びにハイドロキシノルバリンおよびS
−2−アミノエチルシステイン耐性を有するセラ
チア・マルセツセンスAECr301株〔同上、
VoL38、No.5(1979)、第777〜782頁〕、スレオニ
ン分解酵素欠損性、イソロイシン要求性およびハ
イドロキシノルバリン耐性を有し、更にアスパル
トキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素の活性が
スレオニンによるフィードバック阻害の解除され
たセラチア・マルセツセンスT−570〔同上、
VoL38、No.6(1979)、第1045〜1051頁〕等があ
げられる。 本発明方法で用いる微生物の代表例としてセラ
チア・マルセツセンスSr41のP−103株(微工研
菌寄第5413号)をあげるが、本菌株はセラチア・
マルセツセンスAECr301株から誘導されたもの
でメチオニン代謝拮抗物質のうちエチオニンに耐
性な変異株である。その他上記のようなL−スレ
オニン生産性変異株を更に通常の変異誘導操作例
えば紫外線照射するか、あるいは変異誘起剤(例
えばN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジン、エチルメタンスルホネート等)で処理
することによってメチオニン代謝拮抗物質に耐性
な変異特性を附与せしめたもので、メチオニン代
謝拮抗物質1〜20mg/mlを添加した平板培地(例
えばデービスの最小培地)に30℃にて2〜4日間
培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分解するこ
とにより単離取得せる変異株が使用出来る。例え
ば親株の細胞をエーデルバーグ等の方法
〔Biochem.Biophys.Res.Commun.、18、第788〜
795頁(1965年)〕によってN−メチル−N′−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジンで処理して該細胞
に変異を誘起せしめ、この細胞をDL−エチオニ
ン10mg/mlを添加した寒天培地(ブドウ糖0.5
%、硫安0.1%、リン酸第一カリウム0.3%、リン
酸第二カリウム0.7%、硫酸マグネシウム7水和
物0.01%、L−イソロイシン0.01%を含む最小培
地)に塗布する。次に30℃にて4日間培養し、生
じた大きなコロニーを釣菌分離すれば、エチオニ
ン耐性株を採取することが出来るのでこのような
変異株を使用すればよい。 また、本発明方法では、上記の如くして取得さ
れるエチオニン代謝拮抗物質耐性株に、必要によ
り更に前記アミノ酸要求性やアミノ酸アナログ耐
性、スレオニン生合成の代謝調節変異等の特性を
通常の変異誘導操作あるいは形質導入法によって
適宜付与することが出来るのでこのような変異株
を使用することも出来る。 本発明方法において、L−スレオニン生産用培
地としては、炭素源としてブドウ糖、庶糖、糖密
の如き糖類、フマール酸、クエン酸の如き有機
酸、グリセロールの如きアルコール類等を10〜20
%、窒素源として酢酸アンモニウムの如き有機ア
ンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウムの如き無機アンモニウム塩、尿素等を1〜2
%、有機栄養物としてコーンステイープリカー、
ペプトン、酵母エキス等を0〜1%の範囲でそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いることが出
来る。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネ
シウム等を少量加え、更に培地のpHを6〜8に保
つため炭酸カルシウムあるいは必要に応じアンモ
ニアを添加してもよい。また更にこのような培地
にスレオニン生合成に関与する物質、例えばL−
アスパラギン酸、L−ホモセリン、L−リジン、
L−メチオニン、L−イソロイシン等を適宜添加
した培地を使用することも出来る。 本発明方法によれば、上記培地に前記メチオニ
ン代謝拮抗物質に耐性な変異株を接種し、25〜37
℃にて強振とうする如き酸素供給の良好な条件下
で5〜6日間培養することによって培地中にL−
スレオニンを著量蓄積せしめることが出来る。か
くして発酵終了液中には、L−スレオニンが生成
蓄積されてくるが、L−スレオニン以外の副生ア
ミノ酸の蓄積は極めて少量であるので生成したL
−スレオニンは例えばイオン交換樹脂を用いる通
常の分離精製操作によって容易に採取することが
出来る。 実施例 1 庶糖17.5%、第二リン酸カリウム0.1%、硫酸
マグネシウム7水和物0.1%、硫酸アンモニウム
0.05%、尿素1.75%、コーンステイープリカー0.1
%、L−メチオニン0.1%および炭酸カルシウム
1%を含む発酵培地(pH7.0)15mlを500ml容振と
うコルベンに注入し、加熱滅菌した。但し、庶糖
およびL−メチオニンは別滅菌後添加した。別に
庶糖12.5%、第二リン酸カリウム0.1%、硫酸マ
グネシウム7水和物0.1%、硫酸アンモニウム
0.05%、尿素1.5%、コーンステイープリカー0.1
%、L−メチオニン0.1%および炭酸カルシウム
1%を含む培地に30℃、20時間培養したセラチ
ア・マルセツセンスSr41のp−103株(微工研菌
寄第5413号)の培養液0.5mlを上記発酵培地に植
菌した。30℃、140回転/分、振幅7cmの条件下
で120時間培養した。培養液中のL−スレオニン
の生成量は45.5mg/mlであった(尚、L−スレオ
ニンの確認はペーパークロマトグラムのニンヒド
リン反応によって、その定量はロイコノストツ
ク・メツセンテロイデスp-60によるバイオアツ
セイによって行った)。 上記菌株の培養液1を集め、熱処理したのち
ロ過する。ロ過をアンバーライトIR−120(H
型)を充填したカラムに導通し、水洗後、吸着し
たL−スレオニンを5%アンモニア水で溶出し
た。L−スレオニン区分を集め、減圧濃縮し脱色
ロ過した。ロ液にメタノールを加え、生じた粗結
晶を含水メタノールより再結晶することにより、
L−スレオニン35gを得た。 尚、セラチア・マルセツセンスAECr301株を
上記と同一条件に培養したところ、培養液中のL
−スレオニンの生成量は9.0mg/mlであった。 参考例 1 下記第1表に示す各菌株を栄養寒天斜面培地上
で20時間培養し、生育した菌株をそれぞれかきと
り、生理的食塩水で洗浄した。この菌体のけん濁
液を、DL−エチオニン0.1または10mg/mlの
割合で添加した最少培地(培地組成:ブドウ糖
0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.3%、リ
ン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム・7
水和物0.01%、およびL−イソロイシン0.01%)
3mlに植菌して30℃にて20時間培養し、各菌株の
生育度を調べた。その結果は第1表に示す通りで
あり、本発明方法で使用するエチオニンに耐性な
変異株(セラチア・マルセツセンスSr41のp−
103株)では、高濃度のエチオニンによっても生
育が全く阻害されず、強いエチオニン耐性を獲得
していることを示している。 【表】
Claims (1)
- 1 セラチア・マルセツセンスに属し、L−スレ
オニン生産能を有する微生物のメチオニン代謝拮
抗物質に耐性な変異株を培養して培養液中にL−
スレオニンを生成蓄積せしめ、該培養液からL−
スレオニンを採取することを特徴とする発酵法に
よるL−スレオニンの製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3677780A JPS56134993A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Preparation of l-threonine by fermentation method |
| US06/244,348 US4463094A (en) | 1980-03-21 | 1981-03-17 | Fermentation production of L-threonine |
| DE19813110789 DE3110789A1 (de) | 1980-03-21 | 1981-03-19 | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin |
| GB8108731A GB2072185B (en) | 1980-03-21 | 1981-03-20 | Fermentative production of l-threonine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3677780A JPS56134993A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Preparation of l-threonine by fermentation method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56134993A JPS56134993A (en) | 1981-10-22 |
| JPS6236674B2 true JPS6236674B2 (ja) | 1987-08-07 |
Family
ID=12479195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3677780A Granted JPS56134993A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Preparation of l-threonine by fermentation method |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4463094A (ja) |
| JP (1) | JPS56134993A (ja) |
| DE (1) | DE3110789A1 (ja) |
| GB (1) | GB2072185B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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