【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はヒト由来のアリルスルフアターゼＢを
主成分とするアレルギー性疾患治療剤に関する。
気管支喘息、血清病、自己免疫疾患など抗原抗
体反応の関与するアレルギー性疾患の治療には多
くの問題が残されており、本疾患を治療すべく、
多大な努力がはらわれている。
アレルギー性疾患はその症状、あるいは成因か
ら４つの型に分類される。すなわち、組織固着性
抗体により引きおこされ、血管透過性亢進と平滑
筋収縮を特徴とする型アレルギー（アナフイラ
キシー型）、補体の存在下に引きおこされ、細胞
障害を特徴とする型アレルギー（細胞溶解
型）、抗原−抗体複合体が血管壁に蓄積し、補体
と多形核白血球の関与で引きおこされ、炎症反応
を特徴とする型アレルギー（アルツス型）、細
胞性免疫により引きおこされ、ツベルクリン反応
の如く、過敏症反応が出現する事を特徴とする
型アレルギーに分類される。
ヒトのアレルギー性疾患のうち、例えば、気管
支喘息には型、型、型が関与しており、そ
のおのおのが独立にあるいは組みあわされて、喘
息発作を誘発するものと考えられる。また、これ
らのアレルギー性疾患の発症機転について、次の
ように考えられる。
生体に侵入した抗原はマクロフアージにより処
理され、Ｔ細胞−Ｂ細胞系に情報が伝達される。
情報を受けたＢ細胞は免疫グロブリン（型アレ
ルギーでは主としてIgE，型および型アレル
ギーでは主としてIgG）を産生し、この内IgE抗
体は流血中の好塩基球あるいは組織中の肥満細胞
に固着して、感作状態が成立する。その後、ふた
たび侵入した抗原は細胞に固着した抗体と結合し
て、これらの細胞から、ヒスタミン、Slow
reacting substance of anaphylaxis（SRS−Ａ）
などのケミカルメデイエーターを遊離させる。遊
離したケミカルメデイエーターは平滑筋の攣縮や
毛細血管の透過性亢進による紅斑、浮腫、あるい
は、腺細胞分泌亢進などを生ぜしめてアレルギー
症状を惹起する。一方、IgG抗体は多核白血球と
結合して感作が成立し、ケミカルメデイエーター
としてSRS−Ａの分泌も考えられている。
抗アレルギー剤はこれらの一連の過程のいずれ
かを抑制する事により治療目的を達成することが
できる。
たとえば、喘息の治療にはキサンチン系薬剤、
β受容体刺激剤またはステロイド剤などが使用さ
れているが、これらのものには好ましくない副作
用がしばしば認められている。たとえば、キサン
チン系薬剤およびβ受容体刺激剤では、心悸亢
進、頻脈などが報告されている。さらにステロイ
ド剤は消火管潰瘍の発生、あるいは細菌感染の合
併などの副作用を有している。また、抗ヒスタミ
ン剤は喘息発作に対して有効でなくかえつて、気
道分泌物の喀出を困難にするため、喘息を悪化さ
せることがある。
このようなことから、最近、肥満細胞や好塩基
球からのヒスタミン、SRS−Ａなどのケミカルメ
デイエーターの遊離を抑制する薬剤としてDSCG
（クロモグリク酸ナトリウム）が開発され、喘息
等のアレルギー性疾患の治療に用いられるように
なつた。
しかし、DSCGはIgG関与の白血球からのケミ
カルメデイエーターの遊離を抑制しないので
（Japan.J.Pharmacol27巻、31頁、1977年A.
Koda），IgGが関与するタイプのアレルギー性疾
患には無効である。さらに、DSCGはケミカルメ
デイエーターの遊離を抑制するという機作から容
易に推定されるように、抗原抗体反応が起り、ケ
ミカルメデイエーターが遊離され、アレルギー症
状が発現した後には、アレルギー性疾患の治療剤
としては用いられていない。
従つて、抗原抗体反応が生じた後においても有
効な抗アレルギー剤の開発が必要とされる。さら
に、抗ヒスタミン剤は蕁麻疹等には有効である
が、一般的には、気管支喘息やその他のアレルギ
ー性疾患には無効である。
このことは、アレルギー性疾患において、ヒス
タミンは重要な役割を有さず、SRS−Ａがより重
要であるとする報告によつても裏づけられている
（J.Immunology 112巻、897頁、1974年、J.A.
Grantら）。
SRS−Ａの放出はIgEあるいはIgGを吸着した
肥満細胞、好塩基球や多核白血球が再度抗原の刺
激を受けた時に生じることが知られている
（Immunology51巻、813頁、1976年TurnbullらJ.
Immunology 114巻、645頁、1976年Wasseman
ら）。試験管内ではSRS−Ａはアリルスルフアタ
ーゼによつて水解され不活性化することが知られ
ている。肥満細胞からはSRS−Ａの他、好酸球遊
走因子なども分泌され、好酸球をアレルギー局所
にひきつけアレルギー反応を制御しているものと
考えられている。すなわち、アリルスルフアター
ゼ産生細胞は抗原抗体反応部位に集り、肥満細胞
や好塩基球から放出されたSRS−Ａを不活性化せ
しめる作用をする。
このように本来、生体はホメオスタシスを維持
するための機構を有しているが、病的状態にあつ
ては、肥満細胞や好塩基球から放出されたSRS−
Ａを不活性化せしめるに充分なアリルスルフアタ
ーゼが供給されず、種々のアレルギー症状が発現
するものと推定される。従つて、ヒトにおけるア
レルギー性疾患の重要な因子と考えられるSRS−
Ａの拮抗剤やそれを不活性化する薬剤の開発もま
た期待される。
本発明者らは、これらの点に注目して、研究を
進めた結果、ヒト胎盤より精製したアリルスルフ
アターゼＢが優れた抗アレルギー作用を有するこ
とを見出し、本発明を完成した。
以下に本物質の取得方法および物性について簡
単に述べる。
アリルスルフアターゼには等電点、分子量を異
にする３種のタイプが報告されている。
すなわち、等電点が酸性のアリルスルフアター
ゼＡ、塩基性のアリルスルフアターゼＢ、さら
に、ミクロゾーム由来のアリルスルフアターゼＣ
である。
ヒトの胎盤からアリルスルフアターゼＢを得る
には公知の方法を用いて精製することができる
（Acta Biochmica Polonica 19巻、181頁、1972
年 Szulzycka）。例えば、ヒト胎盤をホモジエ
ナイズし、アリルスルフアターゼ分画を適当な溶
媒で抽出し、硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フイー（CM−セルロース、DEAE−セルロース
等）、ゲルクロマトグラフイー（セフアデツクス
Ｇ−100等）を行なつて、精製されたアリルスル
フアターゼＢを得ることができる。アリルスルフ
アターゼＢは公知の物質であり、等電点は7.6−
9.2、分子量は48000−72000であり、合成基質パ
ラニトロカテコールサルフエイトを水解する作用
を有している（Biochimi et Biophysica Acta、
317巻、164頁、1973年 W.S Bleszynski等、
Clin.Chim.Acta ９巻、334頁、1964年 J.Gniot
等Biochem.J.134巻、183頁、1973年M.
Workwood等）。
アリルスルフアターゼＢの臨床投与方法は吸収
可能な方法、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経
気道、鼻腔内から、あるいは坐剤の形で投与する
ことができる。
また臨床投与量は、通常好ましくは１日あた
り、100−100万単位であるが、症状の軽重、年
令、性別、投与方法に応じて増減されるべきもの
であり、必ずしも上記の投与量に限定されるもの
ではない。
アリルスルフアターゼＢはミリポアフイルター
などを用いて、除菌し、バイアルまたは、アンプ
ルなどの適当な容器に充填して使用することがで
きる。このとき、１mlあたり、１−10000単位の
濃度で使用でき、容器は１−100mlのものが使用
できる。アリルスルフアターゼＢを溶解せしめる
溶媒は通常、人体に注射用のものとして用いられ
る塩類、糖類など、およびそれらの混合物を用い
ることができる。
またアリルスルフアターゼＢはバイアルまたは
アンプル中で凍結乾燥して、提供することもで
き、ゼラチン、アルビミン、マンニトールなどの
適当な賦形剤を用いることができる。
容器あたりの含量は10−100000単位の範囲で使
用されうるが、臨床投与量に応じて変更されるべ
きものであり、必ずしも、上記の範囲に限定され
るものではない。
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。
実施例 １
生産後、ただちに−20℃に凍結保存したヒト胎
盤40Kgをホモジエナイズした。これに20の純水
を加え、16N酢酸でPH5.0に調整後、氷冷下に、
エタノール15、クロロホルム３を加えた。撹
拌後、遠心分離して上清50を得た。この上清
に、終濃度40％になるように冷アセトンを添加
し、遠心分離して沈殿を得、0.02Mトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解して、一夜、同緩衝液で充
分透析した。同緩衝液で平衡化したCM−セフア
デツクスカラム（10×38cm）にアリルスルフアタ
ーゼＢを吸着させ、0.125M食塩含有の同緩衝液
で溶出し、活性画分を限外濃縮した。この時、ア
リルスルフアターゼＡは非吸着画分として得ら
れ、アリルスルフアターゼＢと分離した。
ついで、0.9％食塩水を展開溶媒に用いたセフ
アデツクスＧ−100ゲル（10×86cm）でゲル過
を行ない、活性画分を濃縮後、0.02Mトリス塩酸
緩衝液（PH8.0）に対して充分透析した。同緩衝
液で平衡化したCM−セフアデツクスカラム（2.6
×21cm）にアリルスルフアターゼＢを吸着させ、
同緩衝液に食塩を０−0.2M加えたグラジエント
溶出をし、活性画分を得た。再度、セフアデツク
スＧ−100によるゲル過を行ない、30mgのアリ
ルスルフアターゼＢを得た。
比活性は8970U／mgであつた。また、アリルス
ルフアターゼＡは、0.02M酢酸緩衝液（PH5.5）
で平衡化したDEAE−セフアデツクスカラムにて
吸着後、同緩衝液に０−0.2Mの食塩を加えたグ
ラジエント溶出して、得られた。さらにセフアデ
ツクスＧ−100ゲルを用いたゲル過により、400
mgのアリルスルフアターゼＡを得た。この比活性
は2050U／mgであつた。
アリルスルフアターゼの活性測定はパラニトロ
カテコールサルフエイトを基質とし、パウムの方
法を用いて行なつた（Chin Chin.Acta ４巻、
453頁、1959年 Baum等）。
公知のように、天然物の薬理作用を調べる場
合、発熱性物質が含まれていると、薬理作用の効
果に大きな影響を与えることがしられているの
で、発熱性物質の混入について充分な注意を払つ
て精製を行なつた上、さらに、実施例−１に示す
ようなゲル過等の発熱性物質を除去する工程を
行ない、日本薬局方に基づく、発熱性物質試験の
結果、30万Ｕ／Kgを家兎に投与しても発熱を示さ
ないことを確認したアリルスルフアターゼＢを使
用した。
実施例 ２
実施例−１で得たアリルスルフアターゼＢを濃
度が３mg／mlになるように調製して、孔径0.25μ
ｍのミリポアフイルター（ミリポア社製）を用い
て、無菌的に過した後、１mlずつアンプルに充
填した。
実施例 ３
実施例−２で得たアリルスルフアターゼＢにヒ
ト血清アルブミンを0.5％になるように添加後、
１mlずつ分注し、凍結乾燥した。
以下に、実施例−２で得られたアリルスルフア
ターゼＢを用いて、毒性実験、各薬理実験を実施
した。
実験例 １
アリルスルフアターゼＢの急性毒性実験
アリルスルフアターゼＢを3000000単位／Kgの
割合で、体重20−25ｇのddY系雄性マウス10匹に
静脈内投与し、１週間観察した。その結果、体
重、症状、剖検所見に何ら異常は認められず、本
酵素は極めて毒性の低いものであることが判明し
た。さらに重要なことは、本発明の酵素が次の利
点を有していることである。即ち、ヒト由来の蛋
白質であるため、ヒトに非経口的に投与されても
抗原性にもとづく副作用は全く認められないとい
う点である。現在、臨床に多くの酵素が用いられ
ているが、異種蛋白製剤を非経口的に投与する時
には、種々のアレルギーシヨツクが起こり、時に
は致命的でさえある。ところが本発明のアリルス
ルフアターゼＢは、毒性が低く、かつ抗原性によ
る副作用のない、すぐれたものである。
実験例 ２
アリルスルフアターゼＢのSRS−Ａ不活性化作
用
ラツトの腹腔からオレンジ（R.P.Orange）の
方法（Ｊ Immunology 113巻、316頁 1974年
R.P.Orange）に従い、SRS−Ａを取得し、モ
ルモツトの回腸の収縮高を測定し、その生物学的
活性を定量した。SRS−Ａ溶液（1000U／ml）と
アリルスルフアターゼＢ溶液を37℃でインキユベ
ーシヨンし、上記方法にて、30分、90分後の残存
するSRS−Ａ活性を測定した。
結果を第１図に示した。第１図に示すように、
SRS−ＡはアリルスルフアターゼＢによつて、用
量依存的に、また、時間的に不活性化された。し
かしながら、同じくヒト胎盤から取得できるアリ
ルスルフアターゼＡにはこのようなSRS−Ａを不
活性化する作用を認めなかつた。
従来、笠貝、カタツムリから得られるアリルス
ルフアターゼが試験管内においてSRS−Ａを不活
性化させることは知られていたが、ヒト胎盤由来
のアリルスルフアターゼＢがSRS−Ａを不活性化
することを見いだしたのは本発明者らがはじめて
である。
実験例 ３
多形核白血球からのSRS−Ａ不活性化作用
ラツトの腹腔内から採取した多形核白血球浮遊
液（108個／ml）0.4mlに抗卵白アルブミン抗体
0.2mlを加え、４分間、37℃にてインキユベーシ
ヨンした。ついで、これに第１表に示した薬物を
加えて１分間インキユベーシヨンした後、卵白ア
ルブミン（2.5mg／ml）を0.2ml加えさらに30分間
インキユベーシヨンした。反応終了後、遠心分離
して、上清を得、モルモツトの回腸を用いたマグ
ヌス法にて上清に含まれるSRS−Ａ活性を測定し
た。本系に、抗ヒスタミン剤（マレイン酸メピラ
ミン）を加え、ヒスタミン300μｇ／mlの濃度ま
で、収縮しない事を確認した。結果は、対照の収
縮高を100として示した。
第１表に示すように、アリルスルフアターゼＢ
添加により回腸収縮は完全に抑制され、SRS−Ａ
が不活性化されたことを示している。一方、
DSCGによつても、収縮の若干の抑制が認められ
るが、その程度は僅かであつた。本系は大部分、
IgG関与の抗原抗体反応であり、DSCGが、本タ
イプのケミカルメデイエーターの遊離を抑制しな
いとする諸家の報告と一致するものである。
The present invention relates to a therapeutic agent for allergic diseases containing human-derived allyl sulfatase B as a main component. Many problems remain in the treatment of allergic diseases involving antigen-antibody reactions, such as bronchial asthma, serum sickness, and autoimmune diseases.
A huge amount of effort is being put into it. Allergic diseases are classified into four types based on their symptoms or causes. In other words, the anaphylactic type of allergy is caused by tissue-fixing antibodies and is characterized by increased vascular permeability and smooth muscle contraction, and the anaphylactic type of allergy is caused in the presence of complement and is characterized by cell damage. lytic type), antigen-antibody complexes accumulate on the blood vessel wall, and are triggered by the involvement of complement and polymorphonuclear leukocytes; type allergy characterized by an inflammatory response (Arthus type); triggered by cell-mediated immunity. It is classified as a type of allergy characterized by the appearance of a hypersensitivity reaction, such as a tuberculin reaction. Among human allergic diseases, for example, bronchial asthma is associated with types, types, and types, and each type is thought to induce asthma attacks either independently or in combination. Furthermore, the onset mechanism of these allergic diseases is thought to be as follows. Antigens that have entered the body are processed by macrophages, and information is transmitted to the T cell-B cell lineage.
The B cells that receive the information produce immunoglobulin (mainly IgE in type allergy, and mainly IgG in type and type allergy), of which IgE antibodies adhere to basophils in blood or mast cells in tissues, A sensitized state is established. After that, the antigen that has invaded again combines with the antibodies that have adhered to the cells, and these cells release histamine, Slow
reacting substance of anaphylaxis (SRS-A)
liberates chemical mediators such as The liberated chemical mediator causes erythema and edema due to smooth muscle spasm and increased capillary permeability, or increased secretion of glandular cells, thereby causing allergic symptoms. On the other hand, IgG antibodies bind to polynuclear leukocytes to achieve sensitization, and secretion of SRS-A is also considered to be a chemical mediator. Antiallergic agents can achieve therapeutic purposes by inhibiting any of these series of processes. For example, xanthine drugs are used to treat asthma.
Beta receptor stimulators or steroids have been used, but these often have undesirable side effects. For example, heart palpitation, tachycardia, etc. have been reported with xanthine drugs and β receptor stimulants. Furthermore, steroids have side effects such as the occurrence of fire tract ulcers and complications of bacterial infection. Furthermore, antihistamines are not effective against asthmatic attacks, and on the contrary, they may make asthma worse because they make it difficult to cough up airway secretions. For this reason, DSCG has recently been used as a drug to suppress the release of chemical mediators such as histamine and SRS-A from mast cells and basophils.
(Cromoglycate sodium) was developed and began to be used to treat allergic diseases such as asthma. However, DSCG does not suppress the release of chemical mediators from IgG-related leukocytes (Japan. J. Pharmacol vol. 27, p. 31, 1977 A.
Koda), is ineffective against types of allergic diseases involving IgG. Furthermore, as can be easily inferred from the mechanism that DSCG suppresses the release of chemical mediators, after an antigen-antibody reaction occurs, chemical mediators are released, and allergic symptoms appear, DSCG is used to treat allergic diseases. It is not used as an agent. Therefore, there is a need to develop anti-allergic agents that are effective even after antigen-antibody reactions have occurred. Further, although antihistamines are effective against urticaria and the like, they are generally ineffective against bronchial asthma and other allergic diseases. This is also supported by reports that histamine does not play an important role in allergic diseases, and SRS-A is more important (J. Immunology vol. 112, p. 897, 1974). , J.A.
Grant et al). It is known that the release of SRS-A occurs when mast cells, basophils, and polynuclear leukocytes that have adsorbed IgE or IgG are stimulated again by antigens (Immunology, Vol. 51, p. 813, 1976, Turnbull et al., J.
Immunology vol. 114, p. 645, 1976 Wasseman
and others). It is known that SRS-A is hydrolyzed and inactivated by allyl sulfatase in vitro. In addition to SRS-A, mast cells also secrete eosinophil migration factors, which are thought to attract eosinophils to allergic areas and control allergic reactions. That is, allylsulfatase-producing cells gather at antigen-antibody reaction sites and act to inactivate SRS-A released from mast cells and basophils. In this way, living organisms inherently have mechanisms to maintain homeostasis, but in pathological conditions, SRS-released from mast cells and basophils
It is presumed that sufficient allyl sulfatase to inactivate A is not supplied and various allergic symptoms occur. Therefore, SRS- is considered to be an important factor in allergic diseases in humans.
The development of antagonists of A and drugs that inactivate it is also expected. The present inventors focused on these points and conducted research, and as a result, discovered that allyl sulfatase B purified from human placenta has an excellent antiallergic effect, and completed the present invention. The method for obtaining this substance and its physical properties are briefly described below. Three types of arylsulfatase have been reported that differ in isoelectric point and molecular weight. That is, arylsulfatase A whose isoelectric point is acidic, arylsulfatase B whose isoelectric point is basic, and arylsulfatase C derived from microsomes.
It is. Allyl sulfatase B can be purified from human placenta using known methods (Acta Biochmica Polonica Vol. 19, p. 181, 1972
Szulzycka). For example, human placenta is homogenized, the allyl sulfatase fraction is extracted with an appropriate solvent, the ammonium sulfate fraction is subjected to ion exchange chromatography (CM-cellulose, DEAE-cellulose, etc.), gel chromatography (Sephadex G-100), etc. etc.) to obtain purified allyl sulfatase B. Aryl sulfatase B is a known substance, and its isoelectric point is 7.6-
9.2, the molecular weight is 48,000-72,000, and it has the effect of hydrolyzing the synthetic substrate para-nitrocatechol sulfate (Biochimi et Biophysica Acta,
Volume 317, page 164, 1973 WS Bleszynski et al.
Clin.Chim.Acta vol. 9, p. 334, 1964 J.Gniot
Biochem. J. vol. 134, p. 183, 1973 M.
Workwood et al.) Methods of clinical administration of arylsulfatase B can be by absorbable methods, such as intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intratracheally, intranasally, or in the form of suppositories. In addition, the clinical dosage is usually preferably 1 million to 1 million units per day, but it should be increased or decreased depending on the severity of symptoms, age, gender, and administration method, and the above dosage may not necessarily be the same. It is not limited. Allyl sulfatase B can be used by sterilizing it using a Millipore filter or the like and filling it into a suitable container such as a vial or ampoule. At this time, it can be used at a concentration of 1 to 10,000 units per ml, and containers of 1 to 100 ml can be used. As the solvent for dissolving arylsulfatase B, salts, saccharides, etc., which are normally used for injection into the human body, and mixtures thereof can be used. Aryl sulfatase B can also be provided lyophilized in vials or ampoules, and suitable excipients such as gelatin, albumin, mannitol, etc. can be used. The content per container may be used in the range of 10-100,000 units, but should be varied depending on the clinical dosage and is not necessarily limited to the above range. Examples are shown below, but the present invention is not limited to these Examples. Example 1 Immediately after production, 40 kg of human placenta, which had been frozen and stored at -20°C, was homogenized. Add 20% pure water to this, adjust the pH to 5.0 with 16N acetic acid, and cool on ice.
15 portions of ethanol and 3 portions of chloroform were added. After stirring, centrifugation was performed to obtain 50% supernatant. Add cold acetone to this supernatant to a final concentration of 40%, centrifuge to obtain a precipitate, dissolve in 0.02M Tris-HCl buffer (PH8.0), and leave overnight with the same buffer. Dialyzed. Allyl sulfatase B was adsorbed onto a CM-Sephadex column (10 x 38 cm) equilibrated with the same buffer, eluted with the same buffer containing 0.125M NaCl, and the active fraction was ultraconcentrated. At this time, allyl sulfatase A was obtained as a non-adsorbed fraction and separated from allyl sulfatase B. Next, gel filtration was performed on Sephadex G-100 gel (10 x 86 cm) using 0.9% saline as the developing solvent, and after concentrating the active fraction, it was sufficiently divided into 0.02M Tris-HCl buffer (PH8.0). Dialyzed. CM-Sephadex column equilibrated with the same buffer (2.6
× 21 cm) to adsorb allyl sulfatase B,
Gradient elution was performed by adding 0-0.2M of sodium chloride to the same buffer to obtain an active fraction. Gel filtration using Sephadex G-100 was performed again to obtain 30 mg of allyl sulfatase B. The specific activity was 8970U/mg. In addition, allyl sulfatase A was prepared using 0.02M acetate buffer (PH5.5).
After adsorption with a DEAE-Sephadex column equilibrated with 100% DEAE-Sephadex column, the product was obtained by gradient elution with 0-0.2M sodium chloride added to the same buffer. Furthermore, by gel filtration using Cephadex G-100 gel, 400
mg of allyl sulfatase A was obtained. This specific activity was 2050 U/mg. The activity of arylsulfatase was measured using paranitrocatechol sulfate as a substrate and using the method of Paum (Chin Chin. Acta Vol. 4,
453 pages, Baum et al. 1959). As is well known, when investigating the pharmacological effects of natural products, it is known that the presence of pyrogenic substances can greatly affect the effectiveness of the pharmacological effects, so care must be taken to avoid contamination with pyrogens. In addition to purification, a process to remove pyrogenic substances such as gel filtration as shown in Example 1 was performed, and as a result of a pyrogenic substance test based on the Japanese Pharmacopoeia, 300,000 U. Allyl sulfatase B, which was confirmed not to cause fever even when administered to rabbits at a dose of /Kg, was used. Example 2 Allyl sulfatase B obtained in Example-1 was prepared to have a concentration of 3 mg/ml, and the pore size was 0.25μ.
After aseptically filtering the mixture using a Millipore filter (manufactured by Millipore), 1 ml of the mixture was filled into ampoules. Example 3 After adding human serum albumin to arylsulfatase B obtained in Example-2 to a concentration of 0.5%,
The mixture was dispensed into 1 ml portions and freeze-dried. Below, toxicity experiments and various pharmacological experiments were conducted using the allyl sulfatase B obtained in Example-2. Experimental Example 1 Acute toxicity experiment of arylsulfatase B Arylsulfatase B was intravenously administered at a rate of 3,000,000 units/Kg to 10 male ddY mice weighing 20-25g, and observed for one week. As a result, no abnormalities were observed in body weight, symptoms, or autopsy findings, indicating that this enzyme has extremely low toxicity. More importantly, the enzyme of the invention has the following advantages. That is, since it is a human-derived protein, no side effects due to antigenicity are observed even when administered parenterally to humans. Currently, many enzymes are used clinically, but when foreign protein preparations are administered parenterally, various allergic reactions occur, sometimes even fatal. However, the allyl sulfatase B of the present invention is superior in that it has low toxicity and has no side effects due to antigenicity. Experimental Example 2 SRS-A inactivation effect of arylsulfatase B Rat abdominal cavity method (RPOrange) (J Immunology vol. 113, p. 316 1974)
According to RPOrange), SRS-A was obtained, the contraction height of the guinea pig ileum was measured, and its biological activity was quantified. The SRS-A solution (1000 U/ml) and the allyl sulfatase B solution were incubated at 37°C, and the residual SRS-A activity was measured after 30 and 90 minutes using the method described above. The results are shown in Figure 1. As shown in Figure 1,
SRS-A was inactivated by arylsulfatase B in a dose-dependent and temporal manner. However, arylsulfatase A, which can also be obtained from human placenta, was not found to have such an effect of inactivating SRS-A. Previously, it was known that allyl sulfatase obtained from shellfish and snails inactivates SRS-A in vitro, but allyl sulfatase B derived from human placenta inactivates SRS-A. The present inventors are the first to discover that. Experimental Example 3 SRS-A inactivation effect from polymorphonuclear leukocytes Anti-ovalbumin antibody was added to 0.4 ml of a polymorphonuclear leukocyte suspension (10 8 cells/ml) collected from the intraperitoneal cavity of a rat.
0.2 ml was added and incubated for 4 minutes at 37°C. Next, the drugs shown in Table 1 were added thereto and incubated for 1 minute, followed by addition of 0.2 ml of ovalbumin (2.5 mg/ml) and further incubation for 30 minutes. After the reaction was completed, the mixture was centrifuged to obtain a supernatant, and the SRS-A activity contained in the supernatant was measured by the Magnus method using guinea pig ileum. An antihistamine (mepyramine maleate) was added to this system, and it was confirmed that there was no contraction of histamine up to a concentration of 300 μg/ml. The results were shown with the control contraction height as 100. As shown in Table 1, arylsulfatase B
Ileal contraction was completely suppressed by the addition of SRS-A.
indicates that it has been inactivated. on the other hand,
Some inhibition of contraction was also observed with DSCG, but the extent was small. Most of this system is
This is an antigen-antibody reaction involving IgG, and is consistent with various reports that DSCG does not suppress the release of this type of chemical mediator.
【表】
実験例 ４
皮膚アナフイラキシー（PCA反応）に対する
アリルスルフアターゼＢの作用
丸山らの方法（日本薬理学雑誌、74巻、179頁
1978年 丸山ら）に従い、ラツトの背部皮内
に、抗卵白アルブミン抗体0.1mlを投与し、48時
間後に卵白アルブミン25mg／Kgおよびエバンスブ
ルー12.5mg／Kgを静脈内に投与した。さらに60分
後、断頭し、皮内色素漏出量を測定した。
対照群の色素漏出量を100とし、結果を第２表
に示した。アリルスルフアターゼＢは抗原投与直
前に静脈内に投与した。[Table] Experimental example 4 Effect of arylsulfatase B on skin anaphylaxis (PCA reaction) Method of Maruyama et al. (Japanese Pharmacological Journal, Vol. 74, p. 179)
According to Maruyama et al. (1978), 0.1 ml of anti-ovalbumin antibody was administered intracutaneously to the back of rats, and 48 hours later, 25 mg/Kg of ovalbumin and 12.5 mg/Kg of Evans Blue were intravenously administered. After a further 60 minutes, the animals were decapitated and the amount of intradermal pigment leakage was measured. The amount of dye leakage in the control group was set as 100, and the results are shown in Table 2. Aryl sulfatase B was administered intravenously immediately before antigen administration.
【表】
第２表に示すように、本酵素はヒスタミン関与
のPCA反応に対しては、強い抑制作用を認めな
かつた。
また、本酵素は、ヒスタミン、セロトニン、ブ
ラジキニン、アセチルコリン、プロスタグランジ
ンF2αなどの周知のケミカルメデイエーターを
分解する作用を試験管内で有しないことも、発明
者は確認した。
従つて、本酵素はSRS−Ａの不活性化に特異的
であることを示すものである。
実験例 ５
実験的喘息に対するアリルスルフアターゼＢの
作用
ラツトで実験的に作製した喘息モデルに対する
アリルスルフアターゼＢの有効性を第３表に示し
た。方法は以下の通りである。
Wistar系雄性ラツト、体重180−200ｇを１群
10匹とし、卵白アルブミン0.5mg／Kgを足蹠に投
与し、さらに、３種混合ワクチン（武田薬品）１
ml／Kgを腹腔内に投与した。12−14日後に卵白ア
ルブミン５mg／Kgを静脈内投与し、実験的喘息を
誘発した。アリルスルフアターゼＢは、卵白アル
ブミン投与１分前に静脈内投与した。アナフイラ
キシーによつて生じる気道抵抗の上昇を、コンツ
エツトとレスラーの方法（Arch.Exptl.Path
Pharmakol 195巻 71頁 1940年）に準じて測定
し、完全に気道が閉塞した場合を100％とし、得
られた気道収縮率を、対照のそれを100として示
した。第３表で示したように、アリルスルフアタ
ーゼＢは用量依存的に本反応を抑制した。[Table] As shown in Table 2, this enzyme did not have a strong inhibitory effect on the histamine-related PCA reaction. The inventors also confirmed that this enzyme does not have the effect of degrading well-known chemical mediators such as histamine, serotonin, bradykinin, acetylcholine, and prostaglandin F 2 α in vitro. This indicates that this enzyme is specific for inactivating SRS-A. Experimental Example 5 Effect of Allyl Sulfatase B on Experimental Asthma Table 3 shows the effectiveness of Allyl Sulfatase B on an asthma model experimentally produced in rats. The method is as follows. One group of Wistar male rats weighing 180-200g.
10 animals were administered ovalbumin 0.5 mg/Kg into their footpads, and 3 types of mixed vaccine (Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.)
ml/Kg was administered intraperitoneally. After 12-14 days, 5 mg/Kg of ovalbumin was administered intravenously to induce experimental asthma. Aryl sulfatase B was administered intravenously 1 minute before administration of ovalbumin. The increase in airway resistance caused by anaphylaxis can be reduced by
Pharmakol, Vol. 195, p. 71, 1940), and the case where the airway was completely obstructed was taken as 100%, and the obtained airway contraction rate was shown as that of the control, which was taken as 100. As shown in Table 3, arylsulfatase B inhibited this reaction in a dose-dependent manner.
【表】
さらに、興味深いことに、アリルスルフアター
ゼＢは、抗原刺激後に投与しても、抗喘息作用を
示すことである。たとえば、前記と同方法にて作
製した喘息モデルにおいて、抗原刺激１分後に静
脈内投与しても喘息を抑制した。これに反して
DSCG1mg／Kgでは本喘息モデルに全く有効であ
つた。結果を第４表に示した。[Table] Furthermore, it is interesting that arylsulfatase B exhibits anti-asthmatic effects even when administered after antigen stimulation. For example, in an asthma model prepared by the same method as described above, asthma was suppressed even when administered intravenously 1 minute after antigen stimulation. Contrary to this
DSCG of 1 mg/Kg was completely effective in this asthma model. The results are shown in Table 4.
【表】
実験例 ６
アリルスルフアターゼＢの経気道投与による抗
喘息作用
実験例−５と同一の方法で作製した実験的アレ
ルギー性喘息発作のとき、アリルスルフアターゼ
Ｂを、抗原刺激１分前に気道内に、3000U／Kgの
割合で投与したところ、喘息を抑制した。
結果を第５表に示した。[Table] Experimental Example 6 Anti-asthmatic effect of allyl sulfatase B administered through the respiratory tract During an experimental allergic asthma attack produced in the same manner as in Experiment Example 5, allyl sulfatase B was administered for 1 minute after antigen stimulation. Previously, when administered into the respiratory tract at a rate of 3000 U/Kg, it suppressed asthma. The results are shown in Table 5.
【表】
このように、アリルスルフアターゼＢは、
SRG−Ａを試験管内において用量依存的に不活
性化し、動作実験においても、抗原抗体反応によ
る気道抵抗の上昇を強く抑制する。
このように、アリルスルフアターゼＢが実験的
喘息に対して、抑制作用を有することを証明した
のは本発明者らによつてはじめてなされたもので
ある。[Table] In this way, arylsulfatase B is
It inactivates SRG-A in a dose-dependent manner in vitro and strongly suppresses increases in airway resistance caused by antigen-antibody reactions in operational experiments. Thus, the present inventors were the first to demonstrate that arylsulfatase B has a suppressive effect on experimental asthma.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は実験例−２の結果を示すグラフを表わ
す。
FIG. 1 shows a graph showing the results of Experimental Example-2.