JPS623796A - インタ−ロイキン２の製造法 - Google Patents
インタ−ロイキン２の製造法Info
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- JPS623796A JPS623796A JP60143675A JP14367585A JPS623796A JP S623796 A JPS623796 A JP S623796A JP 60143675 A JP60143675 A JP 60143675A JP 14367585 A JP14367585 A JP 14367585A JP S623796 A JPS623796 A JP S623796A
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- interleukin
- plasmid
- gene
- bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明はインターロイキン２（以下「ＩＬ２Ｊと記す
）の製造法に関する。ＩＬ２は免疫不全あるいは、腫瘍
等の治療薬として使用できる可能性が大きい。
）の製造法に関する。ＩＬ２は免疫不全あるいは、腫瘍
等の治療薬として使用できる可能性が大きい。
従来の技術
ＩＬ２の製造法の一つとして、ＩＬ２をコードする遺伝
子が挿入されているプラスミドを有する大腸菌を培養す
る方法が知られている（欧州特許出願公開筒００９１５
３９号）。しかし従来の組換えＤＮＡ法によシ育種され
た微生物は、いずれも細胞内にＩＬ２は生成蓄積され、
ＩＬ２を回収するためには、細胞破砕と、細胞質蛋白の
ＩＬ２の分離といり繁雑な工程を必要としていた。
子が挿入されているプラスミドを有する大腸菌を培養す
る方法が知られている（欧州特許出願公開筒００９１５
３９号）。しかし従来の組換えＤＮＡ法によシ育種され
た微生物は、いずれも細胞内にＩＬ２は生成蓄積され、
ＩＬ２を回収するためには、細胞破砕と、細胞質蛋白の
ＩＬ２の分離といり繁雑な工程を必要としていた。
発明が解決しようとする問題点
従ってこの発明の目的は、微生物Ｉｖｌｉｆｌ胞外にＩ
Ｌ２を生成せしめることによるＩＬ−２の製造法を開発
することにある。
Ｌ２を生成せしめることによるＩＬ−２の製造法を開発
することにある。
問題点を解決するだめの手段
上述の問題点に対し、本発明者らはシグナル４１グチド
のＤＮＡと同ＤＮＡに接続されているＩＬ２遺伝子を有
するプラスミドが導入されているバチルス属の細菌を培
養し、同細菌の細胞外にＩＬ２を生成蓄積せしめること
よシなるＩＬ２の製造法を見出した。
のＤＮＡと同ＤＮＡに接続されているＩＬ２遺伝子を有
するプラスミドが導入されているバチルス属の細菌を培
養し、同細菌の細胞外にＩＬ２を生成蓄積せしめること
よシなるＩＬ２の製造法を見出した。
バチルス属の細胞内で機能する分泌ベクターＤＮＡとし
ては、α−アミラーゼのシグナル配列を有するｐＴＵＢ
２２６ （Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ９５ 、８
７−９３（１９８４）参照） 、 ｐＴＵＢ２８５（Ｇ
ｅｎｅ 、３４ 、１−３（１９８５）参照）などがあ
る。これらのベクターへのＩＬ２遺伝子の挿入箇所はそ
れぞれ上記文献に記載されている。
ては、α−アミラーゼのシグナル配列を有するｐＴＵＢ
２２６ （Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ９５ 、８
７−９３（１９８４）参照） 、 ｐＴＵＢ２８５（Ｇ
ｅｎｅ 、３４ 、１−３（１９８５）参照）などがあ
る。これらのベクターへのＩＬ２遺伝子の挿入箇所はそ
れぞれ上記文献に記載されている。
ＩＬ２遺伝子として、欧州特許出願公開第００９１５３
９号に記載されているｐＩＬ２−５０Ａなどすべての遺
伝子が使用できる。
９号に記載されているｐＩＬ２−５０Ａなどすべての遺
伝子が使用できる。
上記ベクターＤＮＡとＩＬ２遺伝子を接続して、組換え
ＤＮＡを調製する方法は、例えば第１図に示すように合
成りＮＡ リンカ−を用いて接続する方法、その他通常
の方法が使用できる。
ＤＮＡを調製する方法は、例えば第１図に示すように合
成りＮＡ リンカ−を用いて接続する方法、その他通常
の方法が使用できる。
得られた組換えＤＮＡを用いてバチルス属細菌を形質転
換する方法も又、通常の方法である。即ち宿主として用
いるバチルス属細菌トしては、バチルス・ズブチリス、
マーパーグ株、バチヤス、メガテリウム１ノゞチルス０
プミリス、パチルスーアミロリキファシエンス、バチル
ス・リフェニフォルミス、バチルス・プレビス、バチル
ス−ステアロサーモフィラム等の中で修飾、制限系を有
しない宿主として利用可能な菌株が考えられる。
換する方法も又、通常の方法である。即ち宿主として用
いるバチルス属細菌トしては、バチルス・ズブチリス、
マーパーグ株、バチヤス、メガテリウム１ノゞチルス０
プミリス、パチルスーアミロリキファシエンス、バチル
ス・リフェニフォルミス、バチルス・プレビス、バチル
ス−ステアロサーモフィラム等の中で修飾、制限系を有
しない宿主として利用可能な菌株が考えられる。
このようなバチルス属細菌宿主を上記組換えＤＮＡによ
り形質転換する方法は、Ｃｏｈｅｎらのプロトプラスト
形質転換法（Ｃｈａｎｇ ＋ Ｓ、 ＋ ａｎｄ Ｃｏ
ｈｅｎ ＋Ｓ、 Ｎ、 、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 、 １６８ 、１１１ （１９７９）参
照）やＤｕｎｃａｎらのコンピテントセル法（Ｄｕｎｃ
ａｎ ＋Ｃ，Ｈ，＊ Ｗｉｌａｏｎ ｌｃ、Ａ、 ＋−
ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ｌＦ、Ｅ、 ｅＧｅｎｅ 、 １
、１５３ （１９７７）参照）がある。
り形質転換する方法は、Ｃｏｈｅｎらのプロトプラスト
形質転換法（Ｃｈａｎｇ ＋ Ｓ、 ＋ ａｎｄ Ｃｏ
ｈｅｎ ＋Ｓ、 Ｎ、 、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 、 １６８ 、１１１ （１９７９）参
照）やＤｕｎｃａｎらのコンピテントセル法（Ｄｕｎｃ
ａｎ ＋Ｃ，Ｈ，＊ Ｗｉｌａｏｎ ｌｃ、Ａ、 ＋−
ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ｌＦ、Ｅ、 ｅＧｅｎｅ 、 １
、１５３ （１９７７）参照）がある。
これらの方法を使ってＩＬ２発現プラスミドを形質転換
し、ベクターＤＮＡ上の選択マーカー形質、及びＩＬ２
産生能の有無によシ形質転換株を選択できる。ＩＬ２の
定性及び定量分析は英国特許出願公開第９１５３９号に
記載された方法によシ行うことができる。
し、ベクターＤＮＡ上の選択マーカー形質、及びＩＬ２
産生能の有無によシ形質転換株を選択できる。ＩＬ２の
定性及び定量分析は英国特許出願公開第９１５３９号に
記載された方法によシ行うことができる。
得られた形質転換株であるＩＬ２生産能を有するバチル
ス属細菌を用いてＩＬ２を生産する方法は、ＩＬ２生産
能を有する微生物を炭素源、窒素源、及び無機イオン、
更に必要によシビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて培養すればよい。培養方
法は好気条件下で通常３０℃から４０℃の範囲で行う。
ス属細菌を用いてＩＬ２を生産する方法は、ＩＬ２生産
能を有する微生物を炭素源、窒素源、及び無機イオン、
更に必要によシビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて培養すればよい。培養方
法は好気条件下で通常３０℃から４０℃の範囲で行う。
得られた培養液よシＩＬ２ｙｌｌ被グチｋを採取する方
法は遠心によシ菌体を除去した後、培養上清を硫安分画
等によシ濃縮し、英国特許出願公開第９１５３９号に記
載されている方法で行うことができる。
法は遠心によシ菌体を除去した後、培養上清を硫安分画
等によシ濃縮し、英国特許出願公開第９１５３９号に記
載されている方法で行うことができる。
実施例
（１）ＩＬ２遺伝子のｐＴＵＢ２８５への組込みは第１
図に示すように行った。ｐＩＬ２−５ＯＡを制限酵素Ｈ
ｇ ｉＡＩ及びＤｒａＩにょシ切断して生じる約４５０
ｂｐの断片を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
シ分離、精製した。次にこの断片を３３ｍＭＴｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ （Ｐ［（７，９） 、６６ ｍＭ酢酸
カリヮム、１０ ｍＭ ｈ １ｌｆ２マグネシウム、０
．５ ｍＭジチオスレイトール、１００μ々驚牛血清ア
ルブミン、０．２ｍＭｄＡＴＰ 、 ｄｃＴＰ 、 ｄ
ＧＴＰ 、 ｄＴＴＰ存在下で４単位の７４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（全酒造ｉＲ）と３７℃で１５分間反応させ
、平滑末端化した。これと別にＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧな
るＨｌｎｄ ｍリンカ−（全酒造製）を６６ ｍＭＴｒ
ｌｓ−ＨＯ２（ｐＨ７，６） 、１０ ｍＭＭｇ（ｔ２
．１ ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン塩酸塩、１５
ｍＭジチオスレイトール、２００ Ａｉｉ’７匂牛血清
アルブミン反応液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
全酒造製）３単位と３７℃で１時間反応させてリン酸化
した。続いて同じ゛反応液中で上記の平滑末端化した断
片へのリン酸化したリンカ−の付加を、Ｔ ４ ＤＮＡ
リガーゼ（全酒造製）１．４単位と４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。反応終了後等量の水飽和フェノー
ルと混和し、水層を回収した。水層は等量のクロロホル
ムで一回抽出し、水層よＪ ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収した。
図に示すように行った。ｐＩＬ２−５ＯＡを制限酵素Ｈ
ｇ ｉＡＩ及びＤｒａＩにょシ切断して生じる約４５０
ｂｐの断片を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
シ分離、精製した。次にこの断片を３３ｍＭＴｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ （Ｐ［（７，９） 、６６ ｍＭ酢酸
カリヮム、１０ ｍＭ ｈ １ｌｆ２マグネシウム、０
．５ ｍＭジチオスレイトール、１００μ々驚牛血清ア
ルブミン、０．２ｍＭｄＡＴＰ 、 ｄｃＴＰ 、 ｄ
ＧＴＰ 、 ｄＴＴＰ存在下で４単位の７４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（全酒造ｉＲ）と３７℃で１５分間反応させ
、平滑末端化した。これと別にＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧな
るＨｌｎｄ ｍリンカ−（全酒造製）を６６ ｍＭＴｒ
ｌｓ−ＨＯ２（ｐＨ７，６） 、１０ ｍＭＭｇ（ｔ２
．１ ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン塩酸塩、１５
ｍＭジチオスレイトール、２００ Ａｉｉ’７匂牛血清
アルブミン反応液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
全酒造製）３単位と３７℃で１時間反応させてリン酸化
した。続いて同じ゛反応液中で上記の平滑末端化した断
片へのリン酸化したリンカ−の付加を、Ｔ ４ ＤＮＡ
リガーゼ（全酒造製）１．４単位と４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。反応終了後等量の水飽和フェノー
ルと混和し、水層を回収した。水層は等量のクロロホル
ムで一回抽出し、水層よＪ ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収した。
ＤＮＡは１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ）１７．５
） 、７ｍＭ ＭｇＣｌ２．６０ ｍＭ ＮａＣ４に
溶解し、５０単位のＨＩｎｄＩ［［を加え３７℃で４時
間反応させ、ＨＩｎｄＩＩＩの付着末端を生じせしめた
。反応終了、後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、
エタノール沈澱の後、５％のｚ ＋７アクリルアミドグ
ル電気泳動によりｖンカーの除去を行った。
） 、７ｍＭ ＭｇＣｌ２．６０ ｍＭ ＮａＣ４に
溶解し、５０単位のＨＩｎｄＩ［［を加え３７℃で４時
間反応させ、ＨＩｎｄＩＩＩの付着末端を生じせしめた
。反応終了、後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、
エタノール沈澱の後、５％のｚ ＋７アクリルアミドグ
ル電気泳動によりｖンカーの除去を行った。
ベクターＤＮＡは以下のように調製した。ｐＴＵＢ２８
５をＨＩｎｄ ｍで切断後生じる大きい方の断片（５，
３ｋｂｐ ）を１．０％アガロース電気泳動によシ分離
・精製した。
５をＨＩｎｄ ｍで切断後生じる大きい方の断片（５，
３ｋｂｐ ）を１．０％アガロース電気泳動によシ分離
・精製した。
このベクターＤＮＡと上記のリンカ−を付加したＩＬ２
遺伝子断片との結合は、２０μ！の６６ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｔ（ｐＨ７，６） 、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭ ＡＴＰ 。
遺伝子断片との結合は、２０μ！の６６ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｔ（ｐＨ７，６） 、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭ ＡＴＰ 。
１０ｍＭジチオスレイトールの反応液中で１．４単位の
Ｔ ４ ＤＮＡ リガーゼを加え、４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。
Ｔ ４ ＤＮＡ リガーゼを加え、４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。
（２）組換えプラスミドのバチルス・ズプチ藻ス２０７
−２５株への導入はＳ、 Ｃｈａｎｇ ｒ Ｓ、Ｎ、
Ｃｏｈｅｎらのプロトゲラスト形質転換法（Ｍｏ１ｅ、
Ｇｅｎ。
−２５株への導入はＳ、 Ｃｈａｎｇ ｒ Ｓ、Ｎ、
Ｃｏｈｅｎらのプロトゲラスト形質転換法（Ｍｏ１ｅ、
Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ４ｃｍ 、 １６８ 、１１１ （１９７９
）参照）によった。パーツ ｆ ルス−ｘ”ブチ、ｐス２０７−２５株を１００ｒｒ
Ｌ／！のペンアッセイ培地中で３７℃で２時間培養した
後５ＪＭしｌＱｍ／の１０■のリゾチームを含む０．５
Ｍシェークロース、２．０ｒｎＭマレイン酸、２０ｍ
ＭＭｇＣｔ２（以下「Ｓ八ツ」と記す）に懸濁し、３７
℃で１時間保温することによシプロトプラスト化した。
）参照）によった。パーツ ｆ ルス−ｘ”ブチ、ｐス２０７−２５株を１００ｒｒ
Ｌ／！のペンアッセイ培地中で３７℃で２時間培養した
後５ＪＭしｌＱｍ／の１０■のリゾチームを含む０．５
Ｍシェークロース、２．０ｒｎＭマレイン酸、２０ｍ
ＭＭｇＣｔ２（以下「Ｓ八ツ」と記す）に懸濁し、３７
℃で１時間保温することによシプロトプラスト化した。
上記の連結されたＤＮＡを含む溶液２０μｌに２倍濃度
の８ＭＭ溶液２０μｌとこのプロトゲラスト溶液０．５
ｄを加え、更に４０％ＰＫＧ６０００ １．５−を加え
てよく混合し、２分間室温に放置後、。
の８ＭＭ溶液２０μｌとこのプロトゲラスト溶液０．５
ｄを加え、更に４０％ＰＫＧ６０００ １．５−を加え
てよく混合し、２分間室温に放置後、。
ＳＭＭ ５ ｍを加え、低速遠心でプロトプラストを集
めた。そして、集められたプロトプラストは標準濃度の
インアッセイ培地を含むＳＭＭに懸濁した。
めた。そして、集められたプロトプラストは標準濃度の
インアッセイ培地を含むＳＭＭに懸濁した。
なお、４０チＰＥＧ ６０００溶液とは４０？のＰＥＧ
６０００を５ＷＬｌ！の２倍濃度−のＳＭＭにあわせ蒸
留水で１００−としたものである。プロトプラストを上
記培地中で３７℃で３時間振とり培養した後、１００μ
に徳のカナマイシンを含むＤＩ（３培地のプレート（０
，８％寒天、０．５Ｍコハク酸Ｎａ ２．０．５％カザ
ミノ酸、０．５％イーストエキストラクト、０．３５％
に２ＨＰＯ４，０，１５％藷、、ＰＯ４，０，５％りｋ
：ｆｆ −ス、０．０２ ＭＭｇＣｔ２．０．０１％
牛血清アルブミン）上に敷き、３７℃で７２時間培養し
、再生させた。ｐＴＵＢ２８５にはカナマイシン耐性を
示す遺伝子があるので、プラスミドを保持する宿主細菌
のみがコロニーを再生する。再生コロニーはランダムに
選択し保持するプラスミドを分離・精製し制限酵素によ
る切断試験を行いＩＬ２遺伝子が挿入されたプラスミド
ｐＹＴ−ａｍｙ ＩＬ２Ｂ４２を保持するクローンを同
定した。
６０００を５ＷＬｌ！の２倍濃度−のＳＭＭにあわせ蒸
留水で１００−としたものである。プロトプラストを上
記培地中で３７℃で３時間振とり培養した後、１００μ
に徳のカナマイシンを含むＤＩ（３培地のプレート（０
，８％寒天、０．５Ｍコハク酸Ｎａ ２．０．５％カザ
ミノ酸、０．５％イーストエキストラクト、０．３５％
に２ＨＰＯ４，０，１５％藷、、ＰＯ４，０，５％りｋ
：ｆｆ −ス、０．０２ ＭＭｇＣｔ２．０．０１％
牛血清アルブミン）上に敷き、３７℃で７２時間培養し
、再生させた。ｐＴＵＢ２８５にはカナマイシン耐性を
示す遺伝子があるので、プラスミドを保持する宿主細菌
のみがコロニーを再生する。再生コロニーはランダムに
選択し保持するプラスミドを分離・精製し制限酵素によ
る切断試験を行いＩＬ２遺伝子が挿入されたプラスミド
ｐＹＴ−ａｍｙ ＩＬ２Ｂ４２を保持するクローンを同
定した。
（３） ｐＹＴ−ａｍｙ ＩＬ２Ｂ４２を保持する形
質転換株を０．５チイーストエキストラクト、１．０％
ポリ４グトン、０、５４ ＮａＣＬ 、 ０．２％グル
コース、ｓ ｔｔｔ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７，５の
培地１００ｍＡ’中で３７℃で振とり培養し、菌体を遠
心分離によシ除去した培養上清をＩＬ２活性アッセイ用
サンプルとした。その結果１０，０００〜１５，０００
単位／ ｍｌのＩＬ２活性が認められた。
質転換株を０．５チイーストエキストラクト、１．０％
ポリ４グトン、０、５４ ＮａＣＬ 、 ０．２％グル
コース、ｓ ｔｔｔ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７，５の
培地１００ｍＡ’中で３７℃で振とり培養し、菌体を遠
心分離によシ除去した培養上清をＩＬ２活性アッセイ用
サンプルとした。その結果１０，０００〜１５，０００
単位／ ｍｌのＩＬ２活性が認められた。
ｐＴＵＢ ２８ ｓ （第２図参照）は以下の手順で構
築された。ｐＴＵＢ ４はｐＵＢｌｌｏのＢ ａｍＨＩ
部分にα−アミラーゼの全遺伝子を含んだ２．３ｋｂの
ＤＮＡ断片が組込まれたプラスミドである。この組込ま
れたＤＮＡ断片の全塩基配列はすでに決定されている（
文献Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５６ 、３２７ （
１９８３）参照）。
築された。ｐＴＵＢ ４はｐＵＢｌｌｏのＢ ａｍＨＩ
部分にα−アミラーゼの全遺伝子を含んだ２．３ｋｂの
ＤＮＡ断片が組込まれたプラスミドである。この組込ま
れたＤＮＡ断片の全塩基配列はすでに決定されている（
文献Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５６ 、３２７ （
１９８３）参照）。
またｐＵＢ １１０はバチルス属細菌内で増殖可能なプ
ラスミドでクローニング・ベクターとして広く用い
−られている。ｐＴＵＢ４をＥｃｏＲＩで切断すると、
４．９ｋｂと１．９ ｋｂの断片にわかれる。４．９ｋ
ｂの断片について大腸菌ＤＮＡ Ｊリメラーゼ■のクレ
ノー７ラグメントによシ平滑末端とした後、Ｈ１ｎｄｌ
ｌｌリンカ−を付加したのち、Ｔ ４ ＤＮＡ ’）ガ
ーゼによりｆｆｌ状化させて得られるプラスミドがｐＴ
ＵＢ２０１である。
ラスミドでクローニング・ベクターとして広く用い
−られている。ｐＴＵＢ４をＥｃｏＲＩで切断すると、
４．９ｋｂと１．９ ｋｂの断片にわかれる。４．９ｋ
ｂの断片について大腸菌ＤＮＡ Ｊリメラーゼ■のクレ
ノー７ラグメントによシ平滑末端とした後、Ｈ１ｎｄｌ
ｌｌリンカ−を付加したのち、Ｔ ４ ＤＮＡ ’）ガ
ーゼによりｆｆｌ状化させて得られるプラスミドがｐＴ
ＵＢ２０１である。
次Ｋ １．９ ｋｂの断片をＡｌｕＩによシ切断し、α
−アミラーゼのプロモーター、及びシグナル配列を含ん
だ４２４ ｂｐの断片を分離・精製し、これにＨｌ ｎ
ｄ ｍリンカ−を付加して上記のｐＴＵＢ２０１のＨ１
ｎｄｕ部位に組込んで得られるプラスミドがｐＴＵ８２
１８である。ｐＴＵＢ ２１８をＨｌｎｄＩＩ［で部分
分解した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー フ
ラグメントによシ干滑末端化しＴ ４ ＤＮＡ ＩＪガ
ーゼにより環状化し、さらにこれをＨｌｎｄ ｍで切断
した後、ｐＫＴＨ７４よ、りＨ１ｎｄＩＩＩで切シ出さ
れる１、４ ｋｂの断片ヲ組込ミ、バチルス・サチルス
・マーパーク株に導入すると、β−ラクタマーゼ産生能
を付与するプラスミドがｐＴＵＢ ２８５である。ｐＫ
ＴＨ７４はｐＢＲ３２２にコードされるβ−ラクタマー
ゼ遺伝子のうち、そのシグナル配列を欠いた部分がＧＣ
ＡＡＧＣＴＧＣなるＨｌｎｄｌ［リンカ−を介して、ｐ
ＢＲ３２２のＨｌｎｄ ｌｌ［部分に組込まれたもので
ある（文献Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
−アミラーゼのプロモーター、及びシグナル配列を含ん
だ４２４ ｂｐの断片を分離・精製し、これにＨｌ ｎ
ｄ ｍリンカ−を付加して上記のｐＴＵＢ２０１のＨ１
ｎｄｕ部位に組込んで得られるプラスミドがｐＴＵ８２
１８である。ｐＴＵＢ ２１８をＨｌｎｄＩＩ［で部分
分解した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー フ
ラグメントによシ干滑末端化しＴ ４ ＤＮＡ ＩＪガ
ーゼにより環状化し、さらにこれをＨｌｎｄ ｍで切断
した後、ｐＫＴＨ７４よ、りＨ１ｎｄＩＩＩで切シ出さ
れる１、４ ｋｂの断片ヲ組込ミ、バチルス・サチルス
・マーパーク株に導入すると、β−ラクタマーゼ産生能
を付与するプラスミドがｐＴＵＢ ２８５である。ｐＫ
ＴＨ７４はｐＢＲ３２２にコードされるβ−ラクタマー
ゼ遺伝子のうち、そのシグナル配列を欠いた部分がＧＣ
ＡＡＧＣＴＧＣなるＨｌｎｄｌ［リンカ−を介して、ｐ
ＢＲ３２２のＨｌｎｄ ｌｌ［部分に組込まれたもので
ある（文献Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ７９ 、５５８２ （１９８
２）参照）。
２）参照）。
以上のようにｐＴＵＢ ２８５はｐＵＢｌｌｏのＢａｍ
ＨＩ部位に、その塩基配列がすべて決定されている２、
３ｋｂの外来ＤＮＡ断片が挿入された・ぐチルス属細菌
内で増殖可能なプラスミドである。
ＨＩ部位に、その塩基配列がすべて決定されている２、
３ｋｂの外来ＤＮＡ断片が挿入された・ぐチルス属細菌
内で増殖可能なプラスミドである。
第１図は、本発明のインターロイキン２遺伝子を有する
プラスミドの造成経過説明図である。 第２図は、本発明において使用されたプラスミドベクタ
ーｐＴＵＢ ２８５の説明図である。 特許用゛願大 味の素株式会社 第１図 ＩＬ２ ζＯＮ＾ ｉ Ｈ９１ＡＩ／ Ｏｒａ＋
プラスミドの造成経過説明図である。 第２図は、本発明において使用されたプラスミドベクタ
ーｐＴＵＢ ２８５の説明図である。 特許用゛願大 味の素株式会社 第１図 ＩＬ２ ζＯＮ＾ ｉ Ｈ９１ＡＩ／ Ｏｒａ＋
Claims (2)
- （１）シグナルペプチドのＤＮＡと同ＤＮＡに接続され
ているインターロイキン２遺伝子を有するプラスミドが
導入されているバチルス属の細菌を培養し、同細菌の細
胞外にインターロイキン２を生成蓄積せしめることを特
徴とするインターロイキン２の製造法。 - （２）シグナルペプチドが以下のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60143675A JPS623796A (ja) | 1985-06-28 | 1985-06-28 | インタ−ロイキン２の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60143675A JPS623796A (ja) | 1985-06-28 | 1985-06-28 | インタ−ロイキン２の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS623796A true JPS623796A (ja) | 1987-01-09 |
Family
ID=15344319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60143675A Pending JPS623796A (ja) | 1985-06-28 | 1985-06-28 | インタ−ロイキン２の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS623796A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05105542A (ja) * | 1991-10-14 | 1993-04-27 | Akechi Ceramics Kk | 通気性耐火物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1985
- 1985-06-28 JP JP60143675A patent/JPS623796A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05105542A (ja) * | 1991-10-14 | 1993-04-27 | Akechi Ceramics Kk | 通気性耐火物 |
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