JPS6242932A - ヘモフイルス・プルロニユ−モニエの粉状ワクチン製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明はへモフィルス・プルロニューモニエ（Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕ＋５ｏｎｉａ）
の粉状ワクチ製造法に関する。

〔発明の背景〕

ヘモフィルス・プルロニューモニエは、ブタの繊維性胸
膜肺炎の原因菌でダラム陰性菌の一つとして公知であり
、前記菌に感染発病したブタは、発熱、元気食欲の減退
ないし廃絶がみられる。また湿性の咳、開口腹式呼吸な
ど激しい呼吸器症状を呈し、おう吐するものもみられ致
命率は高い。

しかし菌自体の伝播力は弱く、爆発的な流行を呈するこ
とは少ないが、一度発生すると常在化し易く、養豚界に
及びす被害は甚大である。

また木柄に対するワクチンは、既に多くの研究者によっ
て試作され、その感染防御効果は認められている。

ところで、一般的方法に従って製造されるワクチンには
、病原微生物をホルマリン等の化学的手段を用いて死菌
化する不活化ワクチンと、病原微生物を生物学的手段を
用いて弱毒化する弱毒生ワクチンとがあり、前記へモフ
ィルス拳プルロニューモニエ菌についての前記試作ワク
ヂンもこれら前記に属する。

１−かしこれらのワクチンは、微生物南東の々ンパク、
糖、脂質などを含んでいる′への理由から、抗原に１．
を長１ｒＪＩに一１ｉって＃持する、二とがＩ月難であ
る。そこで長期保存のために（Ｊ、凍結乾燥、凍結、冷
蔵保イＦ等の条件が採用されるが、このうち最も保存効
果の優れたものときれる凍結乾燥法では、これを実施す
るために多大な設備投資が必要になりまた電力消費も大
きいという問題がある。

このような現状から、抗原性の寿命が長ｊＵＩに亘るワ
クチンの簡便な製造法の提供がｑＪよれる。

また前記病原菌に対するワクチンの製造に際して望まれ
る他の課題は、製造されたワクチンの運搬、取扱い性の
容易化を実現することである。従来の液状または凍結乾
燥ワクチンでは、犬星連搬に難があったり特殊力づ１ｆ
搬手段が必要になるからである。

〔発明の「１的〕 本発明は、１ｊ１１述［７た従来ワクチンとはＷなり、
ホルマリンで菌のみ１り１染（／１とｉ（ｉ素をイぐ活
化し。

た菌液のｐＨをドげ、＋１ｖ定の極Ｐ１溶奴を使用する
ことによつ−Ｃ＼士フイルスープルロニ、−モニ、工閑
の回収を図ると１（に、更に極＋を溶媒又はエーテルを
使用した簡便なる方法により菌の脱水乾燥を図り、抗ｌ
１１１性の寿命が長期に１ｆる粉状ワクチンを提供する
ことを「目的とする。

また本発明の別の目的は、常温ドでも保イｆできる粉状
ワクチンをＪＪ、！　ｌＪｊするところにある。

〔発明のａｉ費〕

前記１．た［１的を実現するためになされた本発明の特
徴は、ヘモフィルス・ブルロ、−、ユーモニ工菌のポル
マリン不活化培ａｒｉｉ液番こ、あるいはこれより沈殿
分離した前記菌をＮａＣ、Ｑ添加＃ｌ衝液又は生理含塩
水に懸濁させた菌液番コ、該菌液の２〜・６倍早の極性
溶媒を加えてＪｌ、成、載る沈殿を回収し、回収した沈
殿を極性溶媒又は１−チルに懸濁させてｒＦＪ度沈殿を
回収し、これを減圧下で乾燥させるようにしたところに
ある。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明においては、ヘモフィルス・プルロニューモニエ
菌を含む液を製造材ネ゛１として下記操作を順次に行な
うことにより、感染性の不活化された抗原が脱水乾燥さ
れた粉状のものとして好適に製造される。

（ａ）極性溶媒を用いた閑の回収 （ｂ）極性溶媒又はエーテルを用いた菌の脱水乾燥 製造材料 本発明において使用される製造材料には、ヘモフィルス
−７’ルロニユーモニエの培Ｍ　菌液が用いられる。

ワクチンにＩシ入する培地成分等を積極に分離除去する
場合には、遠心法を用いて１８養菌液中の培地成分を除
去し、得られた菌分画をＮａＣＪｌを含む緩衝液（リン
酸１１！緩衝液、）・リス１Σム酸緩衝液＃）又は生理
食塩水に懸濁させた菌液を用いてもよい。

菌のＪ）〜養は一般的方法に従って行なわれるが、使用
される培地の・例を示せば次の通りである。

培地：　１０００　ｍＱ、’１１ ！吠肉製ペプトン　　　　　　１０　ｇ醇ｆ８）　、ｘ
ギス　　　　　　　　　５ｇブドウ糖　　　　　　　　
　　　５ｇ 塩化すトリウム　　　　　　　５ｇ ５　Ｗ／Ｖ　Ｘ　β−ＮＡＩＩ液※１ｍＭ２５　Ｗ／Ｖ
％乾燥酵ｉＢ抽出液※１２．５ｍＵ−ウシ心筋浸出液　
　　　　　　残部 ※は、ろ過鍼菌し、他の組成を　１２１℃、１５分間高
圧滅菌して、冷却ｌ、たのも添加する。

菌の不活化および回収 菌の不活化ｌよ、ｒｔＨ記製造拐料としての菌液に、通
常０．２５Ｖ／ＶＬｔ：　Ａｙ　？　１Ｊ　７を加エテ
３７°Ｃで一夜静置することによってｔｊなわれる。

菌の回収においては、［：記不活化菌液に１１！酸を添
加しｐＨを４．５位に下げた後極性溶媒を加えて攪はｈ
２する。その後所定時間静置し、沈殿が生じて沈殿と」
二部が明確に区分できる時点で−１−清を除去し、沈殿
を回収する。

前記極性溶媒としては、メタノール、エタノール、アセ
トンが挙げられる。

前記菌液に加えるべき極性溶媒は、冷却して用いること
が望ましい。また菌液に対して加えるべき量は通常は２
〜６倍量、好ましくは２〜３倍祉とされる。

極性溶媒を加えることにより、菌液中の懸濁物は誘電率
の低下に伴なって凝集沈殿を生じるが、極性溶媒の加え
る量が少ないと沈殿の生成が充分でなく、反対に多すぎ
る場合には、（ｆｊられる沈殿が塊状のものとなって次
段の脱水乾燥の操作の際に、充分な脱水が達成されない
ことになる。

なお、菌の回収のためには、前記極性溶媒の他にｇｔ　
ＷＡアンモニウム、ポリエチレングリコール等も使用で
きるが、次段の脱水乾燥の操作に先立ってこれらの除去
操作を行なう必要があるため、簡便な製造方法を実現す
る目的から適当でない。

また極性溶媒を加えることで生成される沈殿分画は、一
般的には遠心分離により回収されるが、その他口紙、ホ
ロファイバー、メンズレインフィルター等を用いた口過
によってもよい。

また沈殿と」−澄みの明確な区分を得るには、極性溶媒
を加えた溶液を少なくとも１時間以−１−５好ましくは
２〜３時間程度静置することが望ましい。

閑の脱水乾燥 菌の脱水乾燥においては、前記により回収された菌の沈
殿分画を特定の有機溶媒に懸濁させた後、沈殿を回収し
て減圧下で乾燥する。

前記溶媒としては、菌の回収操作において使用される極
性溶媒（メタノール、エタノール、アセトン）、又はエ
ーテルが使用されるが、極性溶媒の場合、菌の回収で用
いたものと同一であることは要しない。

前記の溶媒は、冷却して用いることが望ましい。菌の沈
殿を懸濁させる前記溶媒の量は特に制限されないが、製
造に用いた菌液の約半綴程度とされることが望ましい場
合が多い。

また沈殿の回収は、一般的には遠心分離又は口過によっ
て行なわれる。なお沈殿の回収に先立って懸濁液は１時
間程度以」−１好ましくは２〜３時間静置することがよ
い。

減圧乾燥は、回収した沈殿より溶媒を蒸散させるもので
あり、減圧（真空）容器内に前記回収した沈殿を収容さ
せて行なわれる。

以−Ｉ−の菌の脱水乾燥の操作は、前段における菌の回
収の操作による緩やかな脱水作用に相まって、製造され
るワクチンの好適な乾燥を実現するが、必要ならば脱水
乾燥の操作を２回以上繰り返して行なうようにしてもよ
い。

前述した菌の回収および脱水乾燥によって製造された粉
状ワクチンは、これをマウスに接種することで行なった
検定試験において好適な感染防御効果を示すことが確認
された。

また粉状ワクチンは、２２°Ｃを越えない条件の下で抗
原性の安定な保存が可能であり、４°Ｃ以下の最適条件
下では、２年以」二に亘り長期保存もできる。

本発明のフローシートを一例として示すと次の通りであ
る。

粉状ワクチンの作製工程木！ 培養菌液　５００ｍ文 ホルマリン　１．２５　ｍ見 添加、３７°Ｃ−夜装置 ↓ １２０００ｒＰＩｌｌ、２０分 遠心して菌を洗浄第２ ↓ または冷アセトンに懸濁 し、０〜４℃で２〜３時 間静置オ６ ↓ １２００ｏｒｐｍ、２０分遠心 ↓ 沈殿を減圧ドで乾燥よ。

↓ ４°Ｃで保存木。

末！　全工程は０〜４℃で行なわれる。

リ　菌以外の培地成分が略除去される。

才、　　リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ） Ｎａ０文　　　　　　　８．０ｇ ＫＧ文　　　　　　　　０．２ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４１，１５ｇ ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇ 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００　ｍｌとし、その
５００　ｍｌに菌を懸濁させる。

本。　菌を略１０ｏｚ回収した含水状態の沈殿物。

＊５　菌を略１０ｏｚ回収し、菌以外の培地成分もいく
らか含む含水状態の沈殿物。

ｌＩ′６　　本操作以降は、沈殿＊４、沈殿第５につい
て共通。

木７　真空デシケータ内に一夜収容。

稲　乾燥した粉状のワクチンのまま。

〔発明の実施例〕

（ｊ＞’ｔ、養菌液） ヘモフィルスφプルロニューモニエ５）ＩＰ−１株（血
清型２）について、前記−例として示１７た液体培地に
より、３７°Ｃ１通気、攪はんの条ヂＩで１７賎間培養
した後、ホルマリンを添加して不活化して培養菌液を作
製した。

ヘモフィルス・プルロニューモニエ５ＨＰ−１株は財団
法人［１木生物科学研究所より分ケーされたものである
。

（乾燥粉状ワクチンの製造） 前記した培養菌液を製造材料として、前述のフローシー
トの手順に従い粉状ワクチンを製造した。

その結果を表１に示す。なお菌の回収および脱水乾燥の
ためにはアセトンを使用した。

表１ （粉状ワクチンの力価試験法） 製造された粉状ワクチン、ロット３のＯ，Ｉｍｇを、　
２．５ｍｇの水酸化アルミニウムゲル月０を含むリン酸
塩緩衝液（ｐＨ７，２〜７．４）３９０．５　ｍｌに溶
解し、これをマウスの腹腔内に注射する。注射後２週日
にＩＯＷ／Ｖ＄ｚ、ヂン液に浮遊した１〜２Ｘ　１０９
ＣＦＵのへモフィルス・プルロニューモニ工５ＨＰ−１
株を腹腔内に注射し、その後１週間生死を観察すること
で行なった。

また、同ワクチンを約１カ月齢のへモフィルス・プルロ
ニューモニエに対する抗体フリーの子豚２頭に２週間間
隔で第１回２．５　ｒａｎ、第２回５　ｍｌずつをそれ
ぞれ筋肉内に注射し、第２回注射後３週目に採血し抗体
を測定することで行なった。

オ９　リンｍ塩緩衝液　（ＰＢＳ） Ｎａ０文　　　　　　　　　　　　　　　８．ＯｇＫＣ
旦　　　　　　　　　　　　　　　０，２　　ｇＮａ２
ＨＰＯ４１，１５３ ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇ 上記試薬を蒸留水に溶解して ｔｏｏｏ　ｍ見とする。

家１０水酸化アルミニウムゲル 硫酸アルミニウム　　１４９．４　ｇ アンモニア水　　　　８５．３ｍ文 上記試薬を蒸留水に溶解して １０００　ｍＫ！、とする。

なお、粉状ワクチンの力価判定は、マウスの生死の結果
を、ワクチン非接種群について同様の菌感染を行なった
ものを対照として、その生死を対比することで行なった
（表２−１　、２−２参照）。

表２−２ さらに、ブタでは１頭を非接種対照としてラテックス吸
着凝集抗原を用いた凝集反応により抗体価を測定した。

抗原はへモフィルス・フルロニューモニエ５ＩＰ−１株
培養菌液を超音波処理した遠心」二部をラテックス浮遊
液に吸着させたもので、術式はマイクロタイター法によ
った（表３参照）。

表　　３ また粉状ワクチンの抗原性の長期間安定性を判定するた
めに、一定期間保存後の粉状ワクチン、ロットｌおよび
２について前記試験を同様に行なった。

なお、ワクチン注射後２遅目のマウスについて、全採血
し血清中のラテックス凝集抗体価も測定した。その結果
を表４−１　、４−２に示す。

表４−２ 以−１−の表２〜４の結果より明らかなように、本発明
よりなる粉状ワクチンは、対照との比較において、マウ
スの生死およびラテックス凝集抗体価のいずれにおいて
も抗原性が確認され、また長期保存後においても抗原性
（Ｊ維持されていた。ブタにおいても表３の通りであり
、抗原性が確認された。

〔発明の効ｉＶ〕

本発明によれば、抗原１ノ］の／１命かに：　ｔｉｌｌ
　＋こ１ｌ−）−Ｃ安定し５、かつ製造設備も安価なも
のによ−）で青らねる粉状ワクチンか１ｈ」供され、へ
千ブイルス・フルロニー１−七ご王の感染・防御用ワク
チンとしての４１川に１は極め下品く、その効果１オ大
なるものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヘモフィルス・プルロニューモニエ菌のホルマリン不活
   化培養菌液に、あるいはこれより沈殿分離した前記菌を
   ＮａＣｌ添加緩衝液又は生理食塩水に懸濁させた菌液に
   、該菌液の２〜６倍量の極性溶媒を加えて生成する沈殿
   を回収し、回収した沈殿を極性溶媒又はエーテルに懸濁
   させて再度沈殿を回収し、これを減圧下で乾燥させるこ
   とを特徴とするヘモフィルス・プルロニューモニエの粉
   状ワクチン製造法。