JPS62429A - ヒト子宮組織由来プラスミノ−ゲン活性化因子製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化因子
製剤に関し、特に遺伝子組換技術によシ生産さｎたヒト
子宮ｍ＃プラスミノーゲン活性化因子製剤に関するもの
である。

（従来の技術） 近年、ウロキナーゼと構造ならびに免疫学的にも異なシ
、更に強いフィブリン親和性を有する組織プラスミノー
ゲン活性化因子が見い出さｎ１ウロキナーゼに勝る血栓
溶解剤として、その応用が期待さｎている。

本発明者らはヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化
因子を遺伝子組換技術により大量に生産し、精製し、製
剤化することを試みた。

（発明の解決しようとする問題点〕 ところが遺伝子組換えにより生産さｎたｕＴＰＡは不安
定であシ、徐々に七の生物学的活性を失った 社。また凍結融解あるいは凍結乾燥時にはその生物学的
活性の減少は著しく、医薬品として遺伝子操作によシ生
産されたｕＴＰＡｌ提供するには何らかの安定化方法を
施すことが必要であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはｕＴＰＡの安定化方法について種々検討を
加えたが、意外にもｕＴＰＡ溶液に対しポリオキシエチ
レン硬化ヒマシ油誘導体を添加することにより著しくそ
の安定性が改善さｎること？見い出し、更にポリオキク
エチレン硬化ヒマ７油誘導体を添加し、凍結乾燥するこ
とによシ、凍結乾燥でのｕＴＰＡの活性をも著しく安、
定住させるという新規なる知見を得、本発明を完成させ
るに至った。

すなわち本発明はヒト子宮組織由来グラスミノーゲン活
性化因子２よびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体
上含有することに％徴とするヒト子宮組織由来プラスミ
ノ＝ゲン活性化因子製剤であるＯ 本発明に用いるヒト子宮組織由来プラスミノ−宮組繊か
ら採ったｕＴＰＡを含む。

遺伝子組換技術により生産したｕＴＰＡ　、！：は、ｕ
ＴＰＡ遺伝子に有するベクターを挿入さｎた大腸菌、酵
母、動物細胞などが生産するｕＴＰＡである。

本発明に用いるｕＴＰＡは例えば以下のようにして製造
芒ｆＬる〇 ■　ヒト子宮組織をグアニジ／チオシアネートの如きＲ
ＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で破砕した後、遠心分離操
作により全ＲＮＡ１単離した。

■　得らｎたヒト子宮ｍ織全ＲＮＡからオリゴｄＴアフ
ィニティーカラムクロマトによりメツセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を単離し、更にシロ糖密度勾配沈降法によ
り該ｍ　ＲＮ　Ａをサイズ分画した。ｕＴＰＡ　特異的
ｍＲＮＡ１含む分画はノザンイロット法によって得た。

■　上記の様にして同定されたｕＴＰＡ特異的ｍＲＮＡ
ｆ含む分画からＲＮＡ（ｚ回収し、該ＲＮＡに対応する
一重鎖ｃ　ＤＮＡを逆転写酵素を用いて作製し、該−重
鎖ｃＤＮＡからＤＮＡポリメラーゼにより二重鎖ｃＤＮ
Ａｉ作製した。

■　得らｎた二重鎖ｃＤＮＡｉ　Ｓ　Ｉ　＝ユークレア
ーゼで処理した後、オリゴｄｃテール勿末端に付与しオ
リゴｄａ末端を有するｃＤＮＡｆ作製した。

■　前記の如く得らｎたオリゴｄｃ末端を有するｃ　Ｄ
ＮＡをオリゴｄＧ末端を有する直鎖ｐＢＲド′ ８２２プラスミガに挿入した。得らｎたベクター１−使
用し、大腸菌を形質転換しｃ　ＤＮＡライブラリーを作
製した。

■　前記の如く作製されたｃＤＮＡライブラリーからコ
ロニーハイプリダイゼイシッン法によりポジティブなｃ
ＤＮＡクローンを単離した。

単離したクローンからプラスミドＤＮＡ１単離し該ＤＮ
Ａの配列を決定した。

■　以上の様にして得らｎ、配列を決定さｎた複数のＣ
ＤＮＡ？ＤＮＡ側限酵素による切断とＤＮＡライゲース
による結合を組合せて、全ｕＴＰＡ　＝ｒ−ディング部
を含むｕＴＰＡ　ｃＤＮＡ　ｌｉ構築した。

■　上記の様にして構築したｕＴＰＡｃＤＮＡを適当な
制限酵素による切断と末端の修飾処理とＤＮＡライゲー
スによる結合とを組合せて適当な発現ベクター罠挿入し
た。

■　本発明にかかわる発現ベクターは下記のＤＮＡ配列
？含む。すなわちｕＴＰＡｃＤＮＡ以外に牛乳頭腫ウィ
ルスＤＮＡ配列の全部もしくは一部と、ｐＢＲ８２２プ
ラスミドＤＮＡの一部とｕ　ＴＰＡ　ｃ　ＤＮＡの発現
に必要なりＮＡ配列と転写停止に必要なりＮＡ配列全含
み、場合によっては発現ベクターによる形質転換体を選
別するのに有効なりＮＡ配列も含む。

■　前記の如く得らｎた発現ベクターを適当な宿主細胞
、例えばマウス細胞Ｃ１２７に形質転換し、得られ念形
質転換細胞を培養によシ増殖させ、目的とするｕＴＰＡ
ｉ培地中に培地量生させた。

本発明に用いるポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体
とは、ヒマシ油構成分子中の二部結合部位に水素全添加
して得らｎる硬化ヒマシ油に、酸化エチレンを付加重合
して得らｎる非イオン性界面活性剤の一種であシ、例え
はＨＣＯ−４００，ＨＣＯ−６０■（日光ケミカルズ■
〕が好適に利用さｎる。

ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体の添加量は特に
規足はないがｕＴＰＡ溶液に対して好ましくは０．００
１ｗ／ｖ％〜０．ｌＷ／′ｖ％となるよう添加すること
が適当である。

本発明では、ｕＴＰＡ溶液にポリオキシエチレン硬化ヒ
マシ油誘導体を添加するが、ｕＴＰＡの培養、精製、凍
結あるいは凍結乾燥、いずｎの工程で添加してもよく、
培養時から添加することがｕ　ＴＰＡの安定性勿増し、
収率を高める意味から特に好筐しい。

本発明のｕ　ＴＰＡ製剤を医薬品として提供するに際し
、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、賦形剤等
全通常の方法に従い添加しても良い・（実施例） 以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明
はこれらによυ何ら限定さｎるものではない。

実施例１ ｕＴＰＡ遺伝子を有するベクターを挿入したマウスＣ−
１２７細胞を培養し、精製して得らｒしたｕＴＰＡｉ用
いて８０００単位／１１Ｉｔの活性を有するｕＴＰＡ溶
液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ２，０）ａ−得た。この
ｕＴＰＡ溶゛液にポリオキシエチレン硬化ヒマシ油にツ
コーケミカルズ製ＨＣＯ−６０■）　ｋ　Ｏ，０１ｗ／
ｖチとなるように添加し、２５℃でポリプロピレン製容
器中に保存し、経時的にサンプリングし残存活性を測定
した。得られた測定値より残存活性率（％）を算出し第
１表に示した。対照としてポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油然添加ｕＴＰＡ溶液にりいて同様に実験した。

なり活性測定はり、、Ｃ，Ｒｉ　ｊｋｅｎ　Ｓ、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　５８０１４０（１９７９）に従ってフィブリ
ンクロットライシスタイム法を用す測定した。活性は標
準としてウロキナーゼを希釈して用いフィブリン塊の溶
解時間を比較して求めた。

実施例２ ８０００単位／−の活性を有するｕＴＰＡ’溶液Ｃ″０
．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０）にポリオ午ジエチレン
硬化ヒマシ油にツコーケミカルズ製ＨＣＯ−６００）’
ｋ　Ｏ，０００１，０，００１，０，旧、０．０８＋０
．１ｗ／ｖ％となるよう添加した。このｕＴＰＡ溶液を
ポリプロピレン製試験管に調製し、凍結（−８０℃）、
融解を繰）返した（１回、３回）。その残存活性を測定
し、残存活性率（％）を第２表に示した。

Ｗｃ２表 実施例８ 実施例２で調製したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油含
１ｕＴＰＡ溶液を通常の方法により凍結乾燥した＠得ら
れたｕＴＰＡ凍結乾燥粉末を再溶解し残存活性全測定し
て安定化作用を比較した。その結果を第８表に示した。

第８表 以上の実施例から明らかなように、本発明の安定化方法
によｎば溶液状態あるいは凍結融解、凍結乾燥など各操
作中に２いて、遺伝子操作により生産さｎたｕ　ＴＰＡ
は安定な状態に保つことが可能である。

したがってポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体はｕ
　ＴＰＡの培養、ｎ製缶工程での使用か可能であシ、か
つ、無害である為その１！ｕＴＰＡ製剤として医薬品に
使用することが可能である。

実施例４ 実施例１と同様に遺伝子操作により生産されたｕＴＰＡ
の溶液（１−中に２００００単位のｕＴＰＡ　ｆ含む）
にポリオキシエチレン硬化ヒマシ油にツコーケミカルズ
製ＨＣＯ−６０■）、マンニトールをそれぞｎ最終濃度
０．０１　％、１．０１となるよう添加し、これを凍結
乾燥し安定なｕＴＰＡ製剤を得ることができた。

（発明の効果） 本発明では遺伝子組換え技術により生産さｎたｕＴＰＡ
にポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体を添加するこ
とによシ、著しくその安定性が改善さｎる。さらに凍結
乾燥してもその安定化効果は失わｎない。また本発明の
ｕＴＰＡ製剤を血管に投与しても溶血が生じない。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化因子およびポ
   リオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体とを含むことを特
   徴とするヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化因子
   製剤。