JPS624371B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫反応性、特に抗体形成および抗原
によつて誘発され得る細胞反応性の刺激剤に関す
る。 抗原の適用によつて刺激された生物体の免疫応
答がある種の物質の添加によつて影響を受けるこ
とは周知である。免疫的に活性な物質の前記支持
成分の影響が促進的である場合、そのような物質
はアジユバントとよばれる。アジユバントは極め
て異なつつた種類の物質を包含する。それらの作
用機構は依然として推測の対象となつている。そ
れらの性質は比較試験によつてのみ試験可能であ
るに過ぎないから、未試験物質のアジユバントと
しての作用に関するどのような予見も非常に困難
である。 一連の疾患の予防および治療における免疫剤の
高度の経済的重要性にかんがみて、ある物質のア
ジユバントとしての作用の発見は経済上非常に興
味深い。 今や、驚くべきことに、本発明によれば、酵素
ノイラミニダーゼ（グリコプロテイン−Ｎ−アセ
チルノイラミニル−ハイドロラーゼ；分類EC、
３、２、１、18）が価置ある免疫刺激剤すなわち
所謂アジユバントであることが見出された。 グリコプロテイン類の免疫原性は酵素ノイラミ
ニダーゼの助けによつてＮ−アセチルノイラミン
酸を除去することによつて有意に増大されること
が知られている。しかしながら、この場合、免疫
原性の増大は、前記グリコプロテインのグリコシ
ド部分に対する酵素的攻撃により新規な抗原決定
基を遊離させる前記ノイラミニダーゼの抗原に対
する作用によつて明瞭に説明される。Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸基の分離後、該デシアロ
（desialo）−グリコプロテインはノイラミニダー
ゼとは別に免疫化に使用され得る。 本発明によれば、抗原の支持成分としてのノイ
ラミニダーゼが免疫原における抗原の作用を増進
させることが見出された。従つて、本発明の主題
は第一に抗原およびノイラミニダーゼの混合物か
らなる、免疫反応性の刺激剤にある。 さらに、本発明は宿主の免疫反応性を刺激する
方法ならびに前記の刺激剤の適当な投与によつて
抗血清を製造する方法に関する。 前記刺激剤においてノイラミニダーゼは0.01〜
150、好ましくは0.5〜50、そして多くの場合５〜
50単位／免疫量の量で使用されるのが適当であ
る。 ノイラミニダーゼという用語はノイラミン酸含
有グリコプロテイン類からノイラミン酸を開裂さ
せうる一連の既知の酵素を包含する。その単離お
よび精製法は文献に記載されている。本発明にお
ける意味においてアジユバントとして利用されう
るノイラミニダーゼはノイラミン酸と糖部分との
間のα−ケト配糖体結合を加水分解する作用を有
することを特徴とする。好適には、２→３、２→
４、２→６および２→８結合を加水分解するノイ
ラミニダーゼが使用される。すべての４種のタイ
プの結合を加水分解しうることが知られているビ
ブリオ・コレラエ（Vibrio Cholerae）から得ら
れるノイラミニダーゼが特に有効である。クロス
トリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium
perfringens）のノイラミニダーゼもまた同様の
作用を有する。しかしながら、たとえ細菌性酵素
の広い特異性を有していなくても、ウイルス性ノ
イラミニダーゼが本発明の意味において活性であ
る。微生物から単離されるノイラミニダーゼのほ
かに、脊推動物の血漿または組織から得られるノ
イラミニダーゼもまた使用されうる。 医薬の製造に必要なあらゆる注意を払つて製造
されたノイラミニダーゼ製品をアジユバントとし
て使用するのが適当である。 抗原の用量当りに添加されるべきノイラミニダ
ーゼアジユバントの量は該酵素の活性単位であら
わされるのが適当である。本発明において使用さ
れる１ノイラミニダーゼ単位はPH値5.5を有する
0.05モルの酢酸ナトリウム緩衝液中塩化ナトリウ
ム９mg／mlおよび塩化カルシウム１mg／mlの添加
により人α_１−グリコプロテイン（オロソムコイ
ド）からＮ−アセチルノイラミン酸１μｇを37℃
において15分間で遊離させるのに要する前記酵素
の量である（E.モールおよびG.シユラム両氏著
「Z.Naturf.」15b、第568頁（1960年）および同シ
ユワルツ氏外著（1958年）参照）。前記シユラム
およびモール両氏により定義される酵素活性とノ
イラミニダーゼの酵素活性のその他の定義との比
較がシツクおよびチルグ両氏（1977年）により行
なわれている。ノイラミニダーゼがノイラミン酸
含有抗原に対して抗原変形（antigen−
modifying）活性を示す可能性にかんがみて、本
発明の範囲内において行なわれる試験においては
大抵の場合ノイラミン酸不含の抗原が使用され
た。しかしながら、これは本発明の範囲を前記化
合物に限定するものではない。そしてこのことは
従来ノイラミニダーゼが免疫のためにノイラミン
酸含有抗原と共に使用されたことがないことにか
んがみてなおさらである。一般に、ノイラミニダ
ーゼでインキユベートされたグリコプロテイン抗
原はインキユベーシヨン後数回洗浄された。こう
してノイラミニダーゼは除去された。 抗原に対して最初に添加されたノイラミニダー
ゼのある量を除去（洗浄）することは前記抗原に
対する免疫応答を有意に刺激しない。ノイラミン
酸不含の大腸菌懸濁液は一方でマウスに対してノ
イラミニダーゼの存在下においてより迅速な抗体
反応を生起するが、他方ではノイラミニダーゼ不
含の細菌懸濁液の場合よりも血清中の抗体レベル
が一層高い。 このことは次の試験によつて証明された。 マウスを２×10⁸個の大腸菌死菌／マウスおよ
び各種の量のビブリオ・コレラエノイラミニダー
ゼにより腹膣内的に免疫化した。前記のマウスの
一部に対してはノイラミニダーゼを最初に前記大
腸菌の死菌に添加し、次にノイラミニダーゼを前
記細菌から遠心分離により除去し、該細菌を適当
な緩衝液媒体中に再懸濁させ、以上の処置を３回
くり返した。前記マウスのその他の部分には前記
大腸菌をビブリオ・コレラエノイラミニダーゼと
共に与えた。 次の表１は前記の免疫化が行なわれた後５日目
および20日目の各種マウス群の血液中の抗体力を
示す。 上記試験において、マウスは平均体重15ｇ異系
交配NMRIマウス（特定の病原体不含、ハノーバ
ー産）を用い、刺激剤の媒体としてNaCl 154ミ
リモル／およびCaCl₂9ミリモル／を含有す
る酢酸ナトリウム緩衝液0.05モル／、PH5.5を
用いた。抗体力価は殺菌力価を測定することによ
り検定された。殺菌力価測定は自然抗体を除去す
るために過剰の大腸菌0111K58で吸収されたモル
モツトの血清を補体源として用い、J.Bact.、
95、1647（1968）に記載されたRowleyの変法に
従つて行なわれた。

【表】 免疫応答の刺激は抗原およびノイラミニダーゼ
の投与方法、例えば、腹腔内、皮下、皮内または
筋肉内投与とは無関係に有効になる。指示された
抗体は殺菌活性試験により測定された。 ビブリオ・コレラエによる免疫試験においても
同様の結果が得られた。ビブリオ・コレラエリボ
多糖類の助けによる間接的赤血球凝集試験におい
て、前記表１に示される結果に類似の結果が得ら
れた。 ノイラミニダーゼのアジユバントとしての活性
はウイルス性抗原例えば風疹ウイルスに関しても
証明された（表２参照）。 風疹ウイルスによるマウスの免疫化誌験は次の
ようにして実施された。 20匹ずつのマウスからなる各群のマウスの腹腔
内に2560個のの赤血球凝集（HA）単位の不活化
風疹ウイルス／マウスおよび種々の投与量のビブ
リオ・コレラエ・ノイラミニダーゼ（VCN）を
注射した。マウスは平均体重15ｇの異系交配
NMRIマウス（特定の病原体不含、ハノ−バー
産）を用いた。不活化風疹ウイルスは、ツイーン
（Tween）−エーテルで不活化された［Proc.Soc.
Exp.Biol.Med.、111、814（1962）］風疹ウイル
ス株B1272をベーリングヴエルケ社（西独）より
入手して用いた。１個のアンプルには2560個の赤
血球凝集単位が含まれていた。 VCNは高度に精製したVCN［Behring Inst.
Mitt.、55、123（1974）］を西独のベーリングヴ
エルケ社から入手して用いた。このものの１mlは
オルセイン法［Biochem.Zt.、329、490（1958）
により測定して500単位を含有していた。この酵
素製剤のプロテイン含量は40μｇ／mlであり、検
出しうるプロテアーゼ、アルドラーゼおよびレシ
チナーゼＣを含有していなかつた。また、発熱性
物質を含んでいない。即ち、ヨーロツパ薬局方に
よるウサギでの発熱原試験において何ら反応を示
さなかつた。刺激剤の媒体としてNaCl 154ミリ
モル／およびCaCl₂9ミリモル／を含有する
酢酸ナトリウム緩衝液0.05モル／、PH5.5を用
いた。 第14日目に各群のうちの10匹のマウスに同一投
与量のワクチンおよびVCNをブースター注射し
た。第21日目に全マウスの血液を採取し、そして
抗風疹力価をNew England Med.、276、554に記
載の方法に準じた赤血球凝集抑制試験により測定
した。 ５単位／マウスの最適投与量におけるVCNは
１回の注射で抗体応答を刺激した。興味深いこと
に、50単位は１回の注射で抗体応答を強化させな
かつた。しかしながらブースター注射後にはいく
らかの刺激が見出だされた。VCN単独は全く抗
風疹ウイルス応答を生じなかつた。

【表】 前記と同一の系により第２回の免疫化（ブース
ター免疫化）が極めて成攻裏に実施可能であり、
さらにこの場合にもノイラミニダーゼと併用され
るウイルス懸濁液が増大された免疫応答を刺激す
ることが立証されうる。 大腸菌、ビブリオ・コレラエおよび風疹ウイル
スの細菌懸濁液による実例で示されているような
特定の抗原物質によるかわりに、アジユバントと
しての活性は可溶性抗原によつても証明されう
る。 例えば、マウスの免疫化が牛血清アルブミンに
よつて実施される場合には免疫応答の増大は前記
の場合と同様にノイラミニダーゼが添加された抗
原製品において見出される。それは牛血清アルブ
ミンで負荷された去勢雄羊の赤血球の間接的赤血
球凝集の助けによつて証明されることができる。 さらに、ノイラミニダーゼは免疫寛容を破壊す
ることができる。この目的に対しては用量当り約
0.5〜５単位のノイラミニダーゼ量が有効である
ことが証明された。これに対して明らかに一層高
い用量はより明瞭でない反応を生起した。 アジユバントとしてのノイラミニダーゼによれ
ば、羊赤血球に対する抗体反答はさらに実験的に
増大されうる。これはヤーン法として知られる、
免疫化された動物の脾臓における「プラク形成細
胞」を証明する方法の助けによつて立証可能であ
る。この試験方法によればさらにノイラミニダー
ゼによつてインキユベートされた赤血球を続いて
洗浄しても免疫応答は刺激されないことも証明さ
れる。 酵素ノイラミニダーゼの助けによつて抗体形成
を増大させる前述の試験のほかに、本発明のアジ
ユバントは各種の伝染病に対する改良された抵抗
性を生ずる。 後記の表３はマウスをアジユバントの添加によ
り、あるいは添加なしにザルモネラ・チフイムリ
ウムで免疫化した試験の結果を示す。この目的に
対して、マウスにそれぞれ４×10⁷個のザルモネ
ラ・チフイムリウムの死菌を第１日目および第14
日目に投与した。第１回の注射後第28日目にマウ
スを２×10⁵個のウイルス性ザルモネラ・チフイ
ムリウムにより静脈内感染させた。免疫化の成果
を測定するために前記各群から若干の誌験動物を
前記感染操作後第１日目、第３日目そして第８日
目に殺して肝臓および脾臓を滴出し、それらに含
まれる生存細菌を測定した。次の表は前記の生存
細菌数を示す。前記各群のその他の動物に関して
は第28日目まで観察を続け、生存動物数を測定し
た。次の表３においてさらに前記試験動物の％生
存率を同時に示す。 上記試験において、マウスは平均体重15ｇの異
系交配NMRIマウス（特定の病原体不含、ハノー
バー産）を用い、刺激剤の媒体としてNaCl 154
ミリモル／およびCaCl₂9ミリモル／を含有
する酢酸ナトリウム緩衝液0.05モル／、PH5.5
を用いた。

【表】 ノイラミニダーゼを含有する抗原ザルモネラ・
チフイムリウムは前述の器官における生存細菌数
を明らかに減少させ試験動物の生存率を改良し
た。 以上の試験例によつて示されるように、ノイラ
ミニダーゼは大部分の各種抗原製品に対してアジ
ユバントとして利用されうる。従つて、ノイラミ
ニダーゼを可溶性でありしかも微生物またはそれ
以上の高等動物種から単離されることのできる生
抗原または死抗原と併用することが本発明の目的
である。本発明の本質的な持色はノイラミニダー
ゼを、それに対して処理宿主の特異的に増大され
た免疫応答が達成される抗原と同時に投与するこ
とである。前記アジユバントはとりわけ感染に対
する抵抗性の増大において特に実用上重要であ
り、さらに組織細胞例えば腫瘍組織の組織細胞の
投与の際の免疫応答の増大においても重要性を有
する。ノイラミニダーゼは特定の抗原に対する抗
血清の製造においてアジユバントとして非常に有
利に使用される。それは、この場合、所要抗原の
同量が免疫化動物の血清から単離されるべき抗体
の収量の重要な増大をもたらすからである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗原およびノイラミニダーゼの混合物からな
   る、免疫反応性刺激剤。 ２ 抗原用量あたり0.01〜150単位のノイラミニ
   ダーゼを含有する、特許請求の範囲第１項記載の
   免疫反応性刺激剤。