JPS6245599A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS6245599A JPS6245599A JP18577885A JP18577885A JPS6245599A JP S6245599 A JPS6245599 A JP S6245599A JP 18577885 A JP18577885 A JP 18577885A JP 18577885 A JP18577885 A JP 18577885A JP S6245599 A JPS6245599 A JP S6245599A
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- JP
- Japan
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- cells
- cancer
- antibody
- monoclonal antibody
- cell
- Prior art date
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、肺・中等度分化型偏平上皮癌由来株（ＰＣ−
１０） を免疫原として作〕ム°Ｊされたハイプリド
−マの１里小する特定のＮ性を持つモノクローナル抗体
に関する。
１０） を免疫原として作〕ム°Ｊされたハイプリド
−マの１里小する特定のＮ性を持つモノクローナル抗体
に関する。
（従来技術）
癌研究の究極の目標は、抗癌、開所作用を示ず物質の探
索と、１θ１の早期発見、即ち早期診断法の確立にある
といえる。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬
が開発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりで
なく、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如伺に有効
な薬剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限
されているのが現状である。
索と、１θ１の早期発見、即ち早期診断法の確立にある
といえる。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬
が開発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりで
なく、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如伺に有効
な薬剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限
されているのが現状である。
免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のザブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。ミルスティン（
Ｍｉｌθｔｅｊ、ｎ） ラによって開発されたモノクロ
ーナル抗体〔ケーラー、ジーおよびミルスティン、シー
：ネーチャー（Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ 、 Ｃ，： Ｎａｔｕｒｅ ） ２５６゜
４９５ （１９７５）） は、この壁を打ち破るもの
であシ、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を
特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることにより
、正常組織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的
に排除できるものと期待される。
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のザブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。ミルスティン（
Ｍｉｌθｔｅｊ、ｎ） ラによって開発されたモノクロ
ーナル抗体〔ケーラー、ジーおよびミルスティン、シー
：ネーチャー（Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ 、 Ｃ，： Ｎａｔｕｒｅ ） ２５６゜
４９５ （１９７５）） は、この壁を打ち破るもの
であシ、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を
特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることにより
、正常組織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的
に排除できるものと期待される。
また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは検査
試薬は、正常血清成分に対する交叉反応がなく、感度良
く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思われ
る。
試薬は、正常血清成分に対する交叉反応がなく、感度良
く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思われ
る。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供するものである。
クローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定層に対する抗原検出用試薬を
提供するものである。
提供するものである。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明は、肺・中等疫分化型偏平上皮癌の細胞膜表覆型
抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体よシ
なるものである。
抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体よシ
なるものである。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下肥細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下肥細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫された動物からの牌細胞、リンパ節細胞、１
３ ＋ リンパ球である。
よって免疫された動物からの牌細胞、リンパ節細胞、１
３ ＋ リンパ球である。
株化癌細胞としては、肺・中等疫分化型偏平上皮癌由来
の株化癌細胞（ＰＣ−１０） が例示される。
の株化癌細胞（ＰＣ−１０） が例示される。
免疫される動物としてはマウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。
サギなどが例示される。
抗体産生細胞は、たとえば次のようにして製造される。
すなわち、肺・中等疫分化型偏平上皮癌由来細胞株（Ｐ
Ｃ−１０）を超音波処理号で破壊し、遠心分離（例＋
１０，０００〜２０．０００Ｇ、１０〜６０分）を行
って細胞抽出液を得、この上清を分子量１０万〜２００
万の物質の分離が可能なゲル濾過担体（例、セファデッ
クス、セファクリル、セファロース、バイオゲル等）を
使用して分子篩し、高分子画分と低分子画分とに分離す
る。かくして得られた分子量が約７０万〜１５０万の高
分子画分は、たとえば、完全７゜インドアジュバント（
Ｆ’ｒθｕｎｄＣｏｍｐ１ｅｔｅ Ａｄ、ｊｕｖａｎｔ
）と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物
の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５Ｘ１０５〜１
０８ｃｅ’ｌ’ｌ相当分／回を注射することにより行わ
れ、初回免疫より約３〜５週間ごとに３度免疫を行い更
に１〜３ケ月後に最終免疫を行う。最終免疫より約３〜
５日後、免疫動物から抗体産生Ａｌ１胞を分取する。
Ｃ−１０）を超音波処理号で破壊し、遠心分離（例＋
１０，０００〜２０．０００Ｇ、１０〜６０分）を行
って細胞抽出液を得、この上清を分子量１０万〜２００
万の物質の分離が可能なゲル濾過担体（例、セファデッ
クス、セファクリル、セファロース、バイオゲル等）を
使用して分子篩し、高分子画分と低分子画分とに分離す
る。かくして得られた分子量が約７０万〜１５０万の高
分子画分は、たとえば、完全７゜インドアジュバント（
Ｆ’ｒθｕｎｄＣｏｍｐ１ｅｔｅ Ａｄ、ｊｕｖａｎｔ
）と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物
の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５Ｘ１０５〜１
０８ｃｅ’ｌ’ｌ相当分／回を注射することにより行わ
れ、初回免疫より約３〜５週間ごとに３度免疫を行い更
に１〜３ケ月後に最終免疫を行う。最終免疫より約３〜
５日後、免疫動物から抗体産生Ａｌ１胞を分取する。
骨髄ｌ１ｌｌｊ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等
由来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
は同種動物由来のものであることが好ましい。
由来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
は同種動物由来のものであることが好ましい。
細胞融合は、例えばジー、ガルファー（Ｇ。
Ｇａ１ｆｒｅ ） （ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）
２６６、５５０． （１９７７））に記載の方法または
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０チポリエチレングリコール（平均分子ｉｉｉ １．（
１００〜４，０００ ）を用いて３０〜４０℃の温度下
、約１〜３分間程度反応させることによって行われる。
２６６、５５０． （１９７７））に記載の方法または
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０チポリエチレングリコール（平均分子ｉｉｉ １．（
１００〜４，０００ ）を用いて３０〜４０℃の温度下
、約１〜３分間程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート中
で培讐し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗体
を産生じているウェルを得る。このようなウェルからさ
らに例えば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ
移植し、１０〜３０日後にモノクローナル抗体を高濃度
に含む腹水を採取し、検定する。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート中
で培讐し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗体
を産生じているウェルを得る。このようなウェルからさ
らに例えば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ
移植し、１０〜３０日後にモノクローナル抗体を高濃度
に含む腹水を採取し、検定する。
選ばれたクローンの産生ずるモノクローナル抗体の回収
は、免疫プロプリンの精製法として従来既知の硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、 エタノール分画法、陰イオン交換
体を応用することで、容易に達成される。
は、免疫プロプリンの精製法として従来既知の硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、 エタノール分画法、陰イオン交換
体を応用することで、容易に達成される。
（発明の効果）
本発明によって得られたモノクローナル抗体は。
肺・中等度分化型偏平上皮癌に特異的と考えられ、細胞
膜表布型抗原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤
血球、白血球及び正常組織とは反応せず、砂１特異的な
抗原を認識するものと推測される。
膜表布型抗原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤
血球、白血球及び正常組織とは反応せず、砂１特異的な
抗原を認識するものと推測される。
すなわち、本発明からなるモノクローナル抗体は診断薬
、腫瘍のイメージング、抗体単独で抗腫搗剤として、及
び制癌剤とのコンジュゲート（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ）
によるターゲティング療法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅ
ｒａｐｙ ）等への臨床応用が期待される。
、腫瘍のイメージング、抗体単独で抗腫搗剤として、及
び制癌剤とのコンジュゲート（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ）
によるターゲティング療法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅ
ｒａｐｙ ）等への臨床応用が期待される。
実施例
（１）免疫用癌関連抗原の調製：
株化肺癌細胞（ＰＣ−１０株）を超音波処理法で破壊し
、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽出
液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用い
、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した。
、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽出
液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用い
、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した。
分子ｈ１が約７０万〜１５０万の高分子画分を、完全フ
ロイビアジュバントと混和後、マウスへ３週１おきに３
度免疫した後、更に２力月後に最終免疫した。
ロイビアジュバントと混和後、マウスへ３週１おきに３
度免疫した後、更に２力月後に最終免疫した。
最終免疫より４日後にマウス牌臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。
胞融合に用いた。
（２）細胞融合およびクローニング：
上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＸ６３％６゜
５．３、〔ジャーナル オヴ イムノロジー（Ｊ、 工
ｍｍｕｎｏ１゜し狙、 １５４８ （１９７９）））
とを１：１の割合で混合し、Ｋ６ｈｘｅｒ らの方法
イムノロジカル メンラドアカデミツク プレス ニュ
ーヨーク（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ）、 Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、 ３９１゜（１９７９））を一部改変して、４２
．６％ポリエチＷグリコール（平均分子量１０００ ）
を用いて１分間反応させることによ多細胞融合を行
った。
５．３、〔ジャーナル オヴ イムノロジー（Ｊ、 工
ｍｍｕｎｏ１゜し狙、 １５４８ （１９７９）））
とを１：１の割合で混合し、Ｋ６ｈｘｅｒ らの方法
イムノロジカル メンラドアカデミツク プレス ニュ
ーヨーク（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ）、 Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、 ３９１゜（１９７９））を一部改変して、４２
．６％ポリエチＷグリコール（平均分子量１０００ ）
を用いて１分間反応させることによ多細胞融合を行
った。
本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地（表１ ） テｘｏ 〜１４ 日１１１［善後、
ＨＴ培地（表１）に移行し、さらにフラスコ（２５ｃｍ
” ）に培養できるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（
表１）で培養した。増殖の見られたウェルの培養上清中
の抗体価を酵素抗体法によシ測定し、適切なウェルから
限界希釈法によシ、求めるハイプリドーマのクローニン
グを行った。
Ｔ培地（表１ ） テｘｏ 〜１４ 日１１１［善後、
ＨＴ培地（表１）に移行し、さらにフラスコ（２５ｃｍ
” ）に培養できるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（
表１）で培養した。増殖の見られたウェルの培養上清中
の抗体価を酵素抗体法によシ測定し、適切なウェルから
限界希釈法によシ、求めるハイプリドーマのクローニン
グを行った。
すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当た９２
５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次ＫＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個／旧ゴとなる
ようにハイプリドーマを希釈し、これをマイクロタイタ
ープレー） Ｋ Ｏ，１ｍｅ スつ植え込み培養した。
５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次ＫＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個／旧ゴとなる
ようにハイプリドーマを希釈し、これをマイクロタイタ
ープレー） Ｋ Ｏ，１ｍｅ スつ植え込み培養した。
４日後［Ｄ−ＭＥ：Ｍ培地’ｔ Ｏ，１ｘｉ加え、以後
４〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１
０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、ク
ローン株を得た。
４〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１
０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、ク
ローン株を得た。
表 １
（イ） Ｄ−ＭＥＭ培地：
ダルベツコの修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （
日永製薬社製））に以下の添カロ物を加えたもの。
ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （
日永製薬社製））に以下の添カロ物を加えたもの。
添加物：
（終濃度） （成分）
１０％ 馬血清 （ＦｌｏＷ ）３００１ｔ
ｌｆ／ｌ ジーグルタミン１１０７／１７／ｌ
ンディウム ピル（−ト１００１、Ｕ／−
はニジリン １００μυ宏 ストレプトマイシン３．５１／ｌ
グルコース ３．７ｇ／１ＨｃＬＨＣＯ３ （ロ） ＨＡＴ培地： Ｄ−ＭＥＭ培地に以下の添加物を添加 ｌＸｌ０ Ｍ ヒポキサンチン４Ｘ１０−７Ｍ
アミノプテリン１．６ Ｘ １０ Ｍ
チミジン←→ Ｉ（Ｔ培地： ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（３）スク
リーニング法 得られたハイプリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
ｌｆ／ｌ ジーグルタミン１１０７／１７／ｌ
ンディウム ピル（−ト１００１、Ｕ／−
はニジリン １００μυ宏 ストレプトマイシン３．５１／ｌ
グルコース ３．７ｇ／１ＨｃＬＨＣＯ３ （ロ） ＨＡＴ培地： Ｄ−ＭＥＭ培地に以下の添加物を添加 ｌＸｌ０ Ｍ ヒポキサンチン４Ｘ１０−７Ｍ
アミノプテリン１．６ Ｘ １０ Ｍ
チミジン←→ Ｉ（Ｔ培地： ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（３）スク
リーニング法 得られたハイプリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
（イ）方法の説明
以下のようにて酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原または
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（工ｇＧ＋ＩｇＡ ＋ＩｇＭ
）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた
。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニレンジア
ミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ硫
酸を加えて反応を停止させ、４９０ ｎフルの吸光度を
測定した。
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（工ｇＧ＋ＩｇＡ ＋ＩｇＭ
）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた
。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニレンジア
ミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ硫
酸を加えて反応を停止させ、４９０ ｎフルの吸光度を
測定した。
この方法で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球と
の交叉反応性はβ−ガラクトシダーゼ標識抗体を用いた
。その他、ヒト赤血球との交叉反応性、ヒ）Ａ、Ｂ、０
型赤血球を混合し、ＰＨＡ法で検討した。癌胎児性抗原
（ＣＥＡ） との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用
いＰＨＡ法で行った。
の交叉反応性はβ−ガラクトシダーゼ標識抗体を用いた
。その他、ヒト赤血球との交叉反応性、ヒ）Ａ、Ｂ、０
型赤血球を混合し、ＰＨＡ法で検討した。癌胎児性抗原
（ＣＥＡ） との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用
いＰＨＡ法で行った。
モノクローナル抗体がＰＣ−ＩＱの分泌物抗原か或いは
細胞膜表布型抗原のどちらを認識しているかの検潤のた
めに、Ｐ Ｃ−１０の培養上清でモノクローナル抗体と
ＰＣ−１０細胞そのものとの反応性が阻害されるかどう
かを調べた。
細胞膜表布型抗原のどちらを認識しているかの検潤のた
めに、Ｐ Ｃ−１０の培養上清でモノクローナル抗体と
ＰＣ−１０細胞そのものとの反応性が阻害されるかどう
かを調べた。
酵素抗体法を用いたインヒビジョン テスト（Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ ）の具体的な方法は、以下の
通りである。即ち、ハイブリドーマの培養上清を酵素抗
体法でタイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ） ヲ
行い、それより判断して適当な希釈倍率を決める。
ｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ ）の具体的な方法は、以下の
通りである。即ち、ハイブリドーマの培養上清を酵素抗
体法でタイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ） ヲ
行い、それより判断して適当な希釈倍率を決める。
次にＰ Ｃ−ＩＱ培養土清を５〜２５倍濃縮したものを
原液として１：５，１：５２・・・・・・・・・１．：
５ｎ希釈したものを、適当に希釈したハイプリドーマ培
養上清にそれぞれ等量加え、１時間３７℃でインキュベ
ーションする。そして１通常の酵素抗体法（ターゲット
（ｔａｒｇｅｔ） ： ＰＣ−１０）の系で分析を行っ
た。
原液として１：５，１：５２・・・・・・・・・１．：
５ｎ希釈したものを、適当に希釈したハイプリドーマ培
養上清にそれぞれ等量加え、１時間３７℃でインキュベ
ーションする。そして１通常の酵素抗体法（ターゲット
（ｔａｒｇｅｔ） ： ＰＣ−１０）の系で分析を行っ
た。
（ｒ２）スクリーニングの流れ
１次スクリーニング：ターゲット セル（Ｔａｒｇｅｔ
ｃｅｌｌ）（ＰＣ−１０）及び正常由来細胞（Ｆ’ｌＯ
Ｗ ２０００）を用いた酵素抗体法で、Ｐ Ｃ−ＩＱに
対して陽性でＦ’ｌＯＷ −２０００に対して陰性なウ
ェルを選抜。
ｃｅｌｌ）（ＰＣ−１０）及び正常由来細胞（Ｆ’ｌＯ
Ｗ ２０００）を用いた酵素抗体法で、Ｐ Ｃ−ＩＱに
対して陽性でＦ’ｌＯＷ −２０００に対して陰性なウ
ェルを選抜。
２次スクリーニング：さらに他の正常由来細胞株及び赤
血球、白血球を用いた分析系ですべてに陰性のウェルを
選抜。
血球、白血球を用いた分析系ですべてに陰性のウェルを
選抜。
３次スクリーニング二以上で選抜された細胞株を２〜３
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来のｃｅ
ｌｌ １ｉｎｅ との反応性を検討するとともに、分
泌型或いは細胞膜表布型抗原のどちらを認識するかを、
酵素抗体法を用いたインヒビジョンテスト（工ｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ ）で同定する。
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来のｃｅ
ｌｌ １ｉｎｅ との反応性を検討するとともに、分
泌型或いは細胞膜表布型抗原のどちらを認識するかを、
酵素抗体法を用いたインヒビジョンテスト（工ｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ ）で同定する。
（４） モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記
のスクリーニングによって得られたクローン株を予め０
．５ ｍＵ匹ズブリスタン投与した４週令以後のＢ Ａ
Ｌ Ｂ／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．ＯＸ
１０７ｃθ１１／匹移植し、１０〜１４日後にモノク
ローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
のスクリーニングによって得られたクローン株を予め０
．５ ｍＵ匹ズブリスタン投与した４週令以後のＢ Ａ
Ｌ Ｂ／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．ＯＸ
１０７ｃθ１１／匹移植し、１０〜１４日後にモノク
ローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水を０．９ ”Ｉ＝ ＮａＣｊ’液を加え５〜１
０倍希釈した後、硫酸アンモニウムを４０幅浪度となる
ように加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなる
べく少量の０．９係ＮａＣ１！液で溶解させた後、０．
９チＮａＣ１液を外液として透析した。透析終了後、高
速液体りＯ”Ｔトゲラフイー（ＴＳＫ−Ｇｅｌｌ Ｇ−
３０００３Ｗ）を行い、工、９Ｍ画分を得、精製モノク
ローナル抗体とした。
０倍希釈した後、硫酸アンモニウムを４０幅浪度となる
ように加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなる
べく少量の０．９係ＮａＣ１！液で溶解させた後、０．
９チＮａＣ１液を外液として透析した。透析終了後、高
速液体りＯ”Ｔトゲラフイー（ＴＳＫ−Ｇｅｌｌ Ｇ−
３０００３Ｗ）を行い、工、９Ｍ画分を得、精製モノク
ローナル抗体とした。
仲）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖さ
せることができる。すなわち、Ｑ、５４ＢＳＡ含無血清
培地（Ｒ工ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上清
を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度と
なるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９ ’
Ｉ＝ ＮａＣｌ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸ア
ンモニウムを４０ｔｌ）濃度となるように加え沈澱画分
を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の０．９チＮ
ａＣ１液で溶解させた後、０．０２ Ｍ生理的リン酸緩
衝液を外液として透析した。
せることができる。すなわち、Ｑ、５４ＢＳＡ含無血清
培地（Ｒ工ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上清
を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度と
なるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９ ’
Ｉ＝ ＮａＣｌ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸ア
ンモニウムを４０ｔｌ）濃度となるように加え沈澱画分
を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の０．９チＮ
ａＣ１液で溶解させた後、０．０２ Ｍ生理的リン酸緩
衝液を外液として透析した。
透析終了後、この溶液をＤＥＡＦＪ−セルロファイン力
ラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
ラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
（５）モノクローナル抗体の特性
かくしてスクリーニングされたクローンのＦ’ｆｆｌ
住ｇするモノクローナル抗体の性状は、表２及び表３の
とおりである。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー
法で検定した。
住ｇするモノクローナル抗体の性状は、表２及び表３の
とおりである。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー
法で検定した。
なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネット（Ｋｅｎ
ｎθ１１）らの方法〔モノクロナルアンチボディー（フ
レニウム プレス）ニューヨーク ロント５ン。
ｎθ１１）らの方法〔モノクロナルアンチボディー（フ
レニウム プレス）ニューヨーク ロント５ン。
３７６、 （１９８０））に準じて細胞をその−まま利
用するエリザ（ＥＬＩＳＡ）法〔セルラーエンザイム
リンクトウ イムノンルベント アッセイ（Ｃθｕｕｌ
ａｒ ＥｎｚｙｍθＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ ） ） （以下、Ｃｌｌ５Ａと
略す）である。
用するエリザ（ＥＬＩＳＡ）法〔セルラーエンザイム
リンクトウ イムノンルベント アッセイ（Ｃθｕｕｌ
ａｒ ＥｎｚｙｍθＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ ） ） （以下、Ｃｌｌ５Ａと
略す）である。
表 ２
表 ３ 抗ＰＣ−ＩＱモノクローナル抗体の反応特異性
上表のＣＥＬＩＳＡ反応性は＋は反応陽性と判定される
６１す定検体の程度で示した。−は陰性を示した。ＣＥ
Ｌ工ＳＡ法における０Ｄ４９ｏ値は一：０．０５未満、
±：０．０５以上０．１未満、十： ０．１以上０．４
未満であった。
上表のＣＥＬＩＳＡ反応性は＋は反応陽性と判定される
６１す定検体の程度で示した。−は陰性を示した。ＣＥ
Ｌ工ＳＡ法における０Ｄ４９ｏ値は一：０．０５未満、
±：０．０５以上０．１未満、十： ０．１以上０．４
未満であった。
代理人 弁理士（ｓｔ０７）佐々木ｆ＃隆（ほか２名）
７ 手続補正書 昭和６０年１１月１？ 日
７ 手続補正書 昭和６０年１１月１？ 日
Claims (2)
- （１）肺・中等度分化型偏平上皮癌由来株（ＰＣ−１０
）を免疫原として作製されたハイブリドーマの産生する
以下の特性をもつモノクローナル抗体。 ［１］Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＭ（ｋ）［２］
認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 ［３］癌細胞との反応性： 少なくとも肺癌（ＰＣ−１０）細胞に対して陽性を示す
。 - （２）癌細胞との反応性がさらに食道癌（ＴＥ−３）細
胞に対して陽性を示す特許請求の範囲第（１）項記載の
モノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18577885A JPS6245599A (ja) | 1985-08-26 | 1985-08-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18577885A JPS6245599A (ja) | 1985-08-26 | 1985-08-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6245599A true JPS6245599A (ja) | 1987-02-27 |
Family
ID=16176725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18577885A Pending JPS6245599A (ja) | 1985-08-26 | 1985-08-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6245599A (ja) |
-
1985
- 1985-08-26 JP JP18577885A patent/JPS6245599A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.NATI.CANCER INST.=1983 * |
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