JPH042239B2 - - Google Patents
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- JPH042239B2 JPH042239B2 JP60173929A JP17392985A JPH042239B2 JP H042239 B2 JPH042239 B2 JP H042239B2 JP 60173929 A JP60173929 A JP 60173929A JP 17392985 A JP17392985 A JP 17392985A JP H042239 B2 JPH042239 B2 JP H042239B2
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- Japan
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- cancer
- cells
- antibody
- esophageal cancer
- esophageal
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、高分化型食道癌由来細胞株（TE−
１）を免疫原として作製されたハイブリドーマの
産生する特定の特性を持つモノクローナル抗体に
関する。 〔従来技術〕 癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す
物質と探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。 免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブレツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。ミルステイン（Milsltein）
らによつて開発されたモノクローナル抗体〔ケー
ラー、ジーよおびミルステイン、シー：ネーチヤ
ー（Ko¨hler，G.and Milstein，C.：Nature）
256，495，（1975）〕は、この壁を打ち破るもので
あり、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗
原を特異的に認識するモノクローナル抗体を得る
ことにより、正常組織へのダメージを与えずに癌
細胞のみを特異的に排除できるものと期待され
る。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あ
るいは検査試薬は、正常血清成分に対する交叉反
応がなく、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を
検出できるものと思われる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、食道癌、特に食道癌の細胞膜抗原に
対して特異的に反応するモノクローナル抗体より
なるものである。 本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブレツトをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。その操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。 抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫された動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞と
しては、高分化型食道癌由来の株化癌細胞（TE
−１）が例示される。 免疫させる動物としてはマウス、ラツト、馬、
ヤギ、ウサギなどが例示される。 抗体産生細胞は、例えば、次のようにして製造
される。即ち、高分化型食道癌由来細胞TE−１
を超音波処理等で破壊し、遠心分離（例、10000
〜20000G、10〜60分）を行つて、細胞抽出液を
得、この上清を分子量10万〜200万の物質の分離
が可能なゲル濾過担体（例、セフアデツクス、セ
フアクリル、セルフアロース、バイオゲル等）を
使用して分子篩し、高分子画分と低分子画分とに
分離する。かくして得られた分子量が約70万〜
150万の高分子画分は、例えば、完全フロインド
アジユバント（Freund Complete Adjuvant）と
混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動
物の皮下、筋肉内或いは腹腔内に約1.5×105〜
108cell相当分／回を注射することにより行われ、
初回免疫より約３〜５週間毎に３度免疫を行い、
更に約３ケ月後に最終免疫を行う。最終免疫より
約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取
する。 骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由
来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄腫細
胞とは同種動物由来のものであることが好まし
い。 細胞融合は、たとえば、ジー ガルフアーら
（G.Galfre）〔ネーチヤー（Nature）266，550，
（1977）〕に記載の方法又はこれに準ずる方法によ
つて行われる。この際、30〜50％ポリエチレング
リコール（平均分子量1000〜4000）を用いて30〜
40℃の温度下、約１〜３分間程度反応させること
によつて行われる。 細胞融合によつて得られた細胞は目的とするモ
ノクローナル抗体を産生するクローンのスクリー
ニングに付される。即ち、当該細胞を、例えばマ
イクロプレート中で培養し、増殖の見られたウエ
ルの培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法な
どによつて測定し、適切な抗体を産生しているウ
エルを得る。このようなウエルから更に例えば限
界希釈法によつてクローニングを行うてクローン
を得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したBALB／Ｃマウスの腹腔内へ
移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃
度に含む腹水を採取し、検定する。選ばれたクロ
ーンの産生するモノクローナル抗体の回収は、免
疫グロブリンの精製法として従来既知の硫安分画
法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
変換体を応用することで、容易に達成される。 〔発明の効果〕 本発明によつて得られたモノクローナル抗体
は、食道癌細胞に特異的に反応し、細胞膜表面抗
原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、正常組
織とは反対せず、癌特異的な抗体を認識するもの
と推定される。即ち、本発明からなるモノクロー
ナル抗体は腫瘍のイメージング及び制癌剤のコン
ジユゲートさせ、ターゲテイング セラピイ
（target−ing therapy）等への臨床応用が期待さ
れる。 実施例 (1) 免疫用癌関連抗原の調製： 株化食道癌細胞（TE−１株）を超音波処理
法で破壊し、遠心分離（15000G、30分）を行
い細胞抽出液を得た。この上清をセルフアロー
ス4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画
分と低分子画分とに分離した 分子量が約70万〜150万の高分子画分を、完
全フロインドアジユバントと混和後、マウスへ
約１ケ月毎に３度免疫を行い、更に３ケ月後に
最終免疫を行つた。 最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し、以下の細胞融合に用いた。 (2) 細胞融合およびクローニング： 上記のマウス脾細胞と、マウスミエローマ
P3U1〔カレント トピツクス イン、マイクロ
バイオロジー アンド イムノロジー（Curr.
Top.Mic−robiol.Immunl.）81，１，（1978）〕
とを約３：１の割合で混合し、ケーラー
（Ko¨hler）らの方法〔イムノロジカル メソツ
ド（アカデミツク プレス），ニユーヨーク
（Immunological Method（Academic Press），
New York，391，1979）〕を一部改変して、
45％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を用いて２分間反応させることにより細
胞融合を行つた。 本細胞を96ウエルマイクロプレートに植え込
み、HAT培地（表１）で９〜14日間培養後、
HT培地（表１）に移行し、更にフラスコ（25
cm2）に培養できるようになつてからＤ−MEM
培地（表１）で培養した。増殖の見られたウエ
ルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法により測
定し、適切なウエルから限界希釈法により、求
めるハイブリドーマのクローニングを行つた。 即ち、マイクロタイタープレートにウエル当
たり25000個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、
次にＤ−MEM培地で、10、５、2.5、１個／
0.1mlとなるようにハイブリドーマを希釈し、
これをマイクロタイタープレートに0.1mlずつ
植え込み培養した。４日後にＤ−MEM培地を
0.1ml加え、以後４〜７日に１度、培地の半量
交換を行つた。培養開始後10〜20日で肉眼で認
められるコロニーが形成され、クローン株を得
た。 【表】 (3) スクリーニング法： 得られたハイブリドーマについて目的とする
モノクローナル抗体を産生するクローンのスク
リーニングを次のように行つた。 (イ) 方法の説明 以下のようにして酸素抗体を法を行つた。 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関
連抗原または正常細胞）をコートしたマイク
ロプレートに検体を加え、37℃で１時間反応
させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス
免疫グロブリン（IgG＋IgA−IgM）ウサギ
抗体を加え、さらに37℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄除去後、Ｏ−フ
エニレンジアミン液を加え、室温にて30分間
反応させた後、2M硫酸を加えて反応を停止
させ、490nｍの吸光度を測定した。この方
法で各種細胞との反応性を調べた。癌胎児性
抗原（CEA）との交叉反応性は、CEA感作
血球を用いPHA法で行つた。 モノクローナル抗体がTE−１の分泌物抗
原か或いは細胞膜抗原のどちらを認識してい
るのかの検討のために、TE−１の培養上清
でモノクローナル抗体とTE−１細胞そのも
のと反応性が阻害されるかどうかを調べた。 酵素抗体法を用いたインヒビジヨン テス
ト（Inhibition Test）の具体的な方法は、
以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの
培養上清を酵素抗体法でタイトレーシヨン
（titration）を行い、それより判断して適当
な希釈倍率を決める。次に、TE−１培養上
清を５〜25倍濃縮したものを原液として、
１：５、１：52…１：5n希釈したものを適当
に希釈したハイブリドーマ培養上清にそれぞ
れ等量加え、１時間、37℃でインキユベーシ
ヨンする。そして、通常の酵素抗体法（ター
ゲツト：TE−１）の系でアツセイ（assay）
を行つた。 (ロ) スクリーニングの流れ １次スクリーニング：ターゲツトセル
（TE−１）および正常由来細胞
（CCD45-SK）を用いた酵素抗体法で、TE−
１に対して陽性でCCD45-SKに対して陰性な
ウエルを選抜。 ２次スクリーニング：さらに他の正常由来
細胞株を用いたアツセイ（assay）系ですべ
てに陰性のウエルを選抜。 ３次スクリーニング：以上で選抜された細
胞株を２〜３回クローニングし、その培養上
清を多くの癌由来の株化細胞との反応性を検
討するとともに、分泌型或いは細胞膜型抗原
のどちらを認識するかを、酵素抗体法を用い
たインヒビジヨン テストで同定する。 (4) モノクローナル抗体の回収、精製： (イ) 上記のスクリーニングによつて得られたク
ローン株を予め0.5ml／匹プリスタンを投与
した４週令以後のBALB／Ｃマウス（雄）
の腹腔内へ2.0〜3.0×107cell／匹移植し、10
〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取した。 この腹水を0.9％NaCl液を加え５〜10倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを40％濃度とな
るように加え、沈澱画分を分取した。この沈
澱画分をなるべく少量の0.9％NaCl液で溶解
させた後、0.9％NaCl液を外液として透析し
た。透析終了後、高速液体クロマトグラフイ
ー（TSK−Gell Ｇ−3000SW）を行い、
IgM画分を得、精製モノクローナル抗体とし
た。 (ロ) 本クローン株は、BSA含無血清培地中で
も増殖させることができる。即ち、0.5％
BSA含無血清培地（RITC55−９培地）中で
増殖させ、培養上清を集めた。この上清に硫
酸アンモニウムを40％濃度となるように加
え、沈澱画分を分取し、これに0.9％NaCl液
を加え、溶解させた後、更に硫酸アンモニウ
ムを40％濃度となるように加え沈澱画分を分
取した。この沈澱画分をなるべく少量の0.9
％NaCl液で溶解させた後、0.02M生理的リ
ン酸緩衝液を外液として透析した。透析終了
後、DEAE−セルロフアインカラムに加え、
カラムクロマトグラフイーを行つた。DEAE
−セルロフアインクロマトグラフイーの最初
のピーク部分を精製モノクローナル抗体とし
た。 (5) モノクローナル抗体の特性： かくしてスクリーニングされたクローンの産
生するモノクローナル抗体の性状は、表２及び
表３のとおりである。免疫グロブリンのクラス
はオクタロニー法で検定した。 なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネツ
ト（Kennett）らの方法〔モノクローナル ア
ンチボデイー（プレニウム プレス）ニユーヨ
ーク ロンドン，376，（1980）〕に準じて細胞
をそのまま利用するエンザイム リンクトウ
イムノソルベント アツセイ（Enzyme
Linked Immunosorbent Assay）〔エリザ
（ELISA）〕法（以下、CELISAと略す）であ
る。 【表】 【表】 【表】 CELISA反応性は、＋は反応陽性と判定される
測定検体の程度で示した。−は陰性を示した。
CELISA法におけるOD490値 −：０〜0.049 ±：0.050〜0.099 ＋：0.100〜0.399 ＋＋：0.400〜0.699 ＋＋＋：0.700〜
１）を免疫原として作製されたハイブリドーマの
産生する特定の特性を持つモノクローナル抗体に
関する。 〔従来技術〕 癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す
物質と探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。 免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブレツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。ミルステイン（Milsltein）
らによつて開発されたモノクローナル抗体〔ケー
ラー、ジーよおびミルステイン、シー：ネーチヤ
ー（Ko¨hler，G.and Milstein，C.：Nature）
256，495，（1975）〕は、この壁を打ち破るもので
あり、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗
原を特異的に認識するモノクローナル抗体を得る
ことにより、正常組織へのダメージを与えずに癌
細胞のみを特異的に排除できるものと期待され
る。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あ
るいは検査試薬は、正常血清成分に対する交叉反
応がなく、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を
検出できるものと思われる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、食道癌、特に食道癌の細胞膜抗原に
対して特異的に反応するモノクローナル抗体より
なるものである。 本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブレツトをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。その操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。 抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫された動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞と
しては、高分化型食道癌由来の株化癌細胞（TE
−１）が例示される。 免疫させる動物としてはマウス、ラツト、馬、
ヤギ、ウサギなどが例示される。 抗体産生細胞は、例えば、次のようにして製造
される。即ち、高分化型食道癌由来細胞TE−１
を超音波処理等で破壊し、遠心分離（例、10000
〜20000G、10〜60分）を行つて、細胞抽出液を
得、この上清を分子量10万〜200万の物質の分離
が可能なゲル濾過担体（例、セフアデツクス、セ
フアクリル、セルフアロース、バイオゲル等）を
使用して分子篩し、高分子画分と低分子画分とに
分離する。かくして得られた分子量が約70万〜
150万の高分子画分は、例えば、完全フロインド
アジユバント（Freund Complete Adjuvant）と
混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動
物の皮下、筋肉内或いは腹腔内に約1.5×105〜
108cell相当分／回を注射することにより行われ、
初回免疫より約３〜５週間毎に３度免疫を行い、
更に約３ケ月後に最終免疫を行う。最終免疫より
約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取
する。 骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由
来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄腫細
胞とは同種動物由来のものであることが好まし
い。 細胞融合は、たとえば、ジー ガルフアーら
（G.Galfre）〔ネーチヤー（Nature）266，550，
（1977）〕に記載の方法又はこれに準ずる方法によ
つて行われる。この際、30〜50％ポリエチレング
リコール（平均分子量1000〜4000）を用いて30〜
40℃の温度下、約１〜３分間程度反応させること
によつて行われる。 細胞融合によつて得られた細胞は目的とするモ
ノクローナル抗体を産生するクローンのスクリー
ニングに付される。即ち、当該細胞を、例えばマ
イクロプレート中で培養し、増殖の見られたウエ
ルの培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法な
どによつて測定し、適切な抗体を産生しているウ
エルを得る。このようなウエルから更に例えば限
界希釈法によつてクローニングを行うてクローン
を得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したBALB／Ｃマウスの腹腔内へ
移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃
度に含む腹水を採取し、検定する。選ばれたクロ
ーンの産生するモノクローナル抗体の回収は、免
疫グロブリンの精製法として従来既知の硫安分画
法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
変換体を応用することで、容易に達成される。 〔発明の効果〕 本発明によつて得られたモノクローナル抗体
は、食道癌細胞に特異的に反応し、細胞膜表面抗
原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、正常組
織とは反対せず、癌特異的な抗体を認識するもの
と推定される。即ち、本発明からなるモノクロー
ナル抗体は腫瘍のイメージング及び制癌剤のコン
ジユゲートさせ、ターゲテイング セラピイ
（target−ing therapy）等への臨床応用が期待さ
れる。 実施例 (1) 免疫用癌関連抗原の調製： 株化食道癌細胞（TE−１株）を超音波処理
法で破壊し、遠心分離（15000G、30分）を行
い細胞抽出液を得た。この上清をセルフアロー
ス4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画
分と低分子画分とに分離した 分子量が約70万〜150万の高分子画分を、完
全フロインドアジユバントと混和後、マウスへ
約１ケ月毎に３度免疫を行い、更に３ケ月後に
最終免疫を行つた。 最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し、以下の細胞融合に用いた。 (2) 細胞融合およびクローニング： 上記のマウス脾細胞と、マウスミエローマ
P3U1〔カレント トピツクス イン、マイクロ
バイオロジー アンド イムノロジー（Curr.
Top.Mic−robiol.Immunl.）81，１，（1978）〕
とを約３：１の割合で混合し、ケーラー
（Ko¨hler）らの方法〔イムノロジカル メソツ
ド（アカデミツク プレス），ニユーヨーク
（Immunological Method（Academic Press），
New York，391，1979）〕を一部改変して、
45％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を用いて２分間反応させることにより細
胞融合を行つた。 本細胞を96ウエルマイクロプレートに植え込
み、HAT培地（表１）で９〜14日間培養後、
HT培地（表１）に移行し、更にフラスコ（25
cm2）に培養できるようになつてからＤ−MEM
培地（表１）で培養した。増殖の見られたウエ
ルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法により測
定し、適切なウエルから限界希釈法により、求
めるハイブリドーマのクローニングを行つた。 即ち、マイクロタイタープレートにウエル当
たり25000個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、
次にＤ−MEM培地で、10、５、2.5、１個／
0.1mlとなるようにハイブリドーマを希釈し、
これをマイクロタイタープレートに0.1mlずつ
植え込み培養した。４日後にＤ−MEM培地を
0.1ml加え、以後４〜７日に１度、培地の半量
交換を行つた。培養開始後10〜20日で肉眼で認
められるコロニーが形成され、クローン株を得
た。 【表】 (3) スクリーニング法： 得られたハイブリドーマについて目的とする
モノクローナル抗体を産生するクローンのスク
リーニングを次のように行つた。 (イ) 方法の説明 以下のようにして酸素抗体を法を行つた。 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関
連抗原または正常細胞）をコートしたマイク
ロプレートに検体を加え、37℃で１時間反応
させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス
免疫グロブリン（IgG＋IgA−IgM）ウサギ
抗体を加え、さらに37℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄除去後、Ｏ−フ
エニレンジアミン液を加え、室温にて30分間
反応させた後、2M硫酸を加えて反応を停止
させ、490nｍの吸光度を測定した。この方
法で各種細胞との反応性を調べた。癌胎児性
抗原（CEA）との交叉反応性は、CEA感作
血球を用いPHA法で行つた。 モノクローナル抗体がTE−１の分泌物抗
原か或いは細胞膜抗原のどちらを認識してい
るのかの検討のために、TE−１の培養上清
でモノクローナル抗体とTE−１細胞そのも
のと反応性が阻害されるかどうかを調べた。 酵素抗体法を用いたインヒビジヨン テス
ト（Inhibition Test）の具体的な方法は、
以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの
培養上清を酵素抗体法でタイトレーシヨン
（titration）を行い、それより判断して適当
な希釈倍率を決める。次に、TE−１培養上
清を５〜25倍濃縮したものを原液として、
１：５、１：52…１：5n希釈したものを適当
に希釈したハイブリドーマ培養上清にそれぞ
れ等量加え、１時間、37℃でインキユベーシ
ヨンする。そして、通常の酵素抗体法（ター
ゲツト：TE−１）の系でアツセイ（assay）
を行つた。 (ロ) スクリーニングの流れ １次スクリーニング：ターゲツトセル
（TE−１）および正常由来細胞
（CCD45-SK）を用いた酵素抗体法で、TE−
１に対して陽性でCCD45-SKに対して陰性な
ウエルを選抜。 ２次スクリーニング：さらに他の正常由来
細胞株を用いたアツセイ（assay）系ですべ
てに陰性のウエルを選抜。 ３次スクリーニング：以上で選抜された細
胞株を２〜３回クローニングし、その培養上
清を多くの癌由来の株化細胞との反応性を検
討するとともに、分泌型或いは細胞膜型抗原
のどちらを認識するかを、酵素抗体法を用い
たインヒビジヨン テストで同定する。 (4) モノクローナル抗体の回収、精製： (イ) 上記のスクリーニングによつて得られたク
ローン株を予め0.5ml／匹プリスタンを投与
した４週令以後のBALB／Ｃマウス（雄）
の腹腔内へ2.0〜3.0×107cell／匹移植し、10
〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取した。 この腹水を0.9％NaCl液を加え５〜10倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを40％濃度とな
るように加え、沈澱画分を分取した。この沈
澱画分をなるべく少量の0.9％NaCl液で溶解
させた後、0.9％NaCl液を外液として透析し
た。透析終了後、高速液体クロマトグラフイ
ー（TSK−Gell Ｇ−3000SW）を行い、
IgM画分を得、精製モノクローナル抗体とし
た。 (ロ) 本クローン株は、BSA含無血清培地中で
も増殖させることができる。即ち、0.5％
BSA含無血清培地（RITC55−９培地）中で
増殖させ、培養上清を集めた。この上清に硫
酸アンモニウムを40％濃度となるように加
え、沈澱画分を分取し、これに0.9％NaCl液
を加え、溶解させた後、更に硫酸アンモニウ
ムを40％濃度となるように加え沈澱画分を分
取した。この沈澱画分をなるべく少量の0.9
％NaCl液で溶解させた後、0.02M生理的リ
ン酸緩衝液を外液として透析した。透析終了
後、DEAE−セルロフアインカラムに加え、
カラムクロマトグラフイーを行つた。DEAE
−セルロフアインクロマトグラフイーの最初
のピーク部分を精製モノクローナル抗体とし
た。 (5) モノクローナル抗体の特性： かくしてスクリーニングされたクローンの産
生するモノクローナル抗体の性状は、表２及び
表３のとおりである。免疫グロブリンのクラス
はオクタロニー法で検定した。 なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネツ
ト（Kennett）らの方法〔モノクローナル ア
ンチボデイー（プレニウム プレス）ニユーヨ
ーク ロンドン，376，（1980）〕に準じて細胞
をそのまま利用するエンザイム リンクトウ
イムノソルベント アツセイ（Enzyme
Linked Immunosorbent Assay）〔エリザ
（ELISA）〕法（以下、CELISAと略す）であ
る。 【表】 【表】 【表】 CELISA反応性は、＋は反応陽性と判定される
測定検体の程度で示した。−は陰性を示した。
CELISA法におけるOD490値 −：０〜0.049 ±：0.050〜0.099 ＋：0.100〜0.399 ＋＋：0.400〜0.699 ＋＋＋：0.700〜
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 高分化型食道癌由来細胞株（TE−１）を免
疫原として作製されたハイブリドーマの産生する
以下の特性を持つモノクローナル抗体： Igクラス：IgM 認識抗原タイプ：細胞表面抗原 癌細胞との反応性：次の癌細胞に対して陽性
を示す。 食道癌（TE−１）、食道癌（TE−２）、食道
癌（TE−３）、食道癌（TE−５）、食道癌
（TE−７）、食道癌（TE−10）、肺癌（PC−
３）、子宮内膜癌（ISHIKAWA）、胃癌
（MKN−28）、胃癌（KATO−）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60173929A JPS6233199A (ja) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60173929A JPS6233199A (ja) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6233199A JPS6233199A (ja) | 1987-02-13 |
| JPH042239B2 true JPH042239B2 (ja) | 1992-01-16 |
Family
ID=15969687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60173929A Granted JPS6233199A (ja) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6233199A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236397A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-17 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6242999A (ja) * | 1985-08-16 | 1987-02-24 | Shichisaburo Abo | モノクロ−ナル抗体 |
-
1985
- 1985-08-06 JP JP60173929A patent/JPS6233199A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6233199A (ja) | 1987-02-13 |
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