JPS6247555A - シンチレ−シヨン近接定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＢｅｒｓｏｎとＹａｌｏｗによる放射免疫定量法の開発
は、生物学者に最も鋭敏かつ特異的な武器のひとつで提
供することになった。最初に報告されたよ５に、この操
作には、抗体で標識さ九た抗原と標識さｔていない抗原
の競合する両抗原の平衡化１、抗原−抗体複合体の沈殿
、遠心分離、沈殿した抗原−抗体複合体からの上澄液の
分離およびその放射活性の測定が必要である。抗体【固
体支持体たとえばプラスチックスビーズ上に固定化する
ことにより、放射免疫定量法は著しく単純化された。

競合する抗原は抗体で被覆されたビーズに添加さｎ１振
盪下にインキュベートさｎ１遠心分離または濾過後に、
上澄液を除去する。ついでいすｎρ）の相ｔカウントす
ｎばよい。

シンチレーション近接定量法の語は、当時新しい種類の
定量法につげらｎたＨａｒｔとＧｒ１３１３ｎＷａｌｄ
（１９７９）の造語である。この操作では、同じ抗原（
ヒト血清アルブミン）ｒ予め共有結合させた２種の異な
るラテックスビーズが使用された。

このビーズの一万はその中に固定化された発螢光団も”
ｆｉｔ、、第２のビーズはトリチウム（３Ｈ）で標識さ
れた。トリチウム分解時に放出さｎる粒子の飛程は水中
では数μｍにすぎないので、希釈俗を灰中では　３Ｈビ
ーズはそのβ−粒子が発螢光団ピーズを励起させるほど
近接して存在することはほとんどなく、シたがって弱い
螢光が観察さｎるにすぎない。懸濁したビーズに特異的
な抗体？添加すると、凝集が起こり、多数の３Ｈ♂−ズ
が発螢光団ピーズに励起させる範囲内に集ってくる。放
出された螢光は、感度の高い光度計のシンチレーション
カウンター中で測定できる。ＨａｒｔとＧｒθθｎｗａ
１ａによって記載さｎ１米国特許第４．３８８．２９６
号ｃｉ９ｓｓ年６月１４日登録）に開示された操作は、
感度に限界はあるものの、遠心分離もその他の分離操作
も要しない。しかし、この定量法には異なる２種の被覆
ビーズに加えてそｎらと相互作用する巨大分子？必要と
する。３種の成分の衝突の動力学はきわめて緩徐である
ため、著しく長いインキュベーション時間に要ｆる。

しかも、この従来技術は、ペプチドや治療薬剤のような
小さな分子の定量には応用できない。

小さな分子の検出が可能な改良シンチレーション近接定
量法がＧｒｕｎｎｓｒらによって報告さｎている。この
方法では、半透過性のポリアクリルアミドデル層で級覆
され、そのデルの厚さはトリチウムβ電子の平均到達距
離よりも犬とした発螢光団ビーズが使用さｎ、た。デル
を透過できない抗体や受容体は、発螢光団♂−ズの近傍
から離れて透過性のトリチウム化リガンドに結合し、し
たがって放出さｎる螢光は減少する。リガンドがビーズ
の近傍から除去さｎることによる螢光強度の変化が、放
射非活性リガンドの存在を定量する手段となる。

しかしながら、このシステムは、測定可能な螢光を生成
させるため、定量に大量のトリチウムを必要とする、ビ
ーズの被覆が難しい、大きな分子への応用に（は限界が
ある、定量は大量の螢光の中での小さな変化ケ測定する
ので感度が限ら扛てくる等の欠点がある。

したがって、本発明の目的は、迅速かつ信頼性が高く、
調製が簡単な試薬で使用し、大きな分子にもペプチドや
治療薬剤のような小さな分子にも適用できる定量法を提
供することにある。

本発明に、１種類のマイクロビーズ盆使用するシンチレ
ーション近擬定量法（５ＰＲＡ　）に関する。

本発明のマイクロビーズに適当な発蛍光団ｒ＠有し、共
有結合した結合分子に工って被覆されている。結合分子
は所望のリガンドと結合するものが選ばｎる。結合分子
は、抗体−抗涼免役反応機合体または受容体−リガント
結合複合体の１成分である。最近の文献Ｋに、受容体に
関する報告の数が次第に増加しており、関連する生物学
的活性物質の範囲も広がってきている。受容体が明ら１
３）にさｎてきた化合物は、単純なフェニルアルキルア
ミンたとえばアンフェタミンから分子量のきわめて大き
いポリマーたとえば蛋白質１で広範囲に及ぶ。本発明の
他の態様においてに、被覆はレクチン結合分子たとえば
コンカナバリンＡとすることもでき、この場合、ビーズ
は細胞膜中の糖蛋白質と結合できる。

薬剤であるリガンドとしては、麻薬性鎮痛薬、催眠薬、
鎮静薬、鎮痛薬、解熱薬、麻酔薬、幻覚薬、筋弛緩薬、
神経系刺激薬、抗コリンエステラーゼ剤、副又感神経模
倣薬、交感神経模倣系、α−アドナリン作動神経遮断薬
、抗アドレナリン作動薬、神経節刺激および遮断薬、神
経−筋用剤、ヒスタミン類、抗ヒスタミン剤、５−ヒド
ロキシトリプタミンおよびアンタプニスト、心脈管系用
剤、抗リウマチ薬、抗高血圧剤、血管拡張剤、利尿剤、
有害生物殺滅剤（抗菌剤、抗寄生虫剤、殺虫剤、外部沓
生体殺滅剤等）、抗マラリア剤、抗生物質、代謝拮抗剤
、ホルモン、ビタミン、糖、甲状腺および抗甲状腺剤、
コルチコステロイド、インシュリン、経口血糖低下剤等
を挙げることができる。

このよ５な薬剤には、アルカロイド、ステロイド、ポリ
ペプチドおよび蛋白質、プロスタグランジン、カテコー
ルアミン、キサンチン、アリールアルキルアミン、異項
環たとえばチアジン、ヒヘラジン、インドールおよびチ
アゾール、アミノ酸等が包含さｎる。

薬剤以外の他の興味あるリガンドは、工業汚染物質、矯
味剤、食品添加物九とえば防腐剤、ならびに食品汚染物
である。

リガンドは、構造的には、モノマーでもポリマーでも、
非環式、単環式また多環式でも、炭素環でも異項環でも
よい。リガンドは広範囲の官能基、たとえばハロ、オキ
シカルボニル、非オキシカルボニル、アミノ、オキシ〔
ヒドロキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、シクロ
アルキルオキシ（アルキルは１価の脂肪族基金意味する
）〕、チェノオキシ、ジチオ、ヒドラゾおよびこ几らの
組合せｔもっていてもよい。

リガンドは、受容体に対するその生物学的関係に基づい
て、６つの異なるカテゴリーに分類できる。第１のカテ
ゴリーは抗原であり、こｎはを椎動物の血流に導入さｆ
ｉｌ：とき、抗原を形成させる。

第２のカテゴリーはハシテンであり、これは抗原性の担
体に結合し、を椎動物の血流中に導入さｎｔとき、ハプ
テンに特異的な抗体の生成を誘発する。リガンドの第３
のカテゴリーには、リガンドに対して特異的な形で単離
できる生物体および受容体があるリガンドが包含さｎる
。

もちろん、ある動物ｌに固有で、その動物種内に天然の
受容体がある生物学的物質も、それが蛋白質に結合して
同８ｉまたは異種動物に導入さｎるとバッテンにな９得
る。したがって、この分類に、ジエンばがある動物種で
は抗原、他の動物株ではハプテン、第３の動物種では天
然の受容体ｔもつということもあり得る点で固定的なも
のではない。

抗原は、実際大部分が蛋白質またはポリサンカライドで
、そ几が注入された動物に対して外来性である。

リガンドとして重要なものはハプテンである。

注射しても抗体を産生じないが、抗体と特異的に反応す
ることができて沈殿を生じるが沈殿を阻止するものをパ
ブテンと命名さｎている。この定義は、蛋白質に抱合さ
れた場合、特異性の決定因子となり、また沈殿ｒ阻止す
る単純な化学物質のみでなく、ウサギへの一次注射では
抗原性七示さない、肺炎球菌型特異的ポリサッカライド
およびデキストランのような天然起源の物質ケも包含し
て使用さｎてきた（　Ｋａｂａｔほか：　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａ’１工ｍｍｕｎｏ　Ｏｈｅｍｉ　８　ｔｒ７
　＋　０ｈａｒｌｆ３８０−　Ｔｈｏｍａ８１　Ｂｐｒ
ｉｎｇｆｉａｌｃｌ　Ｉ工１１．（１９６７）］。以下
の記述では、ハプテンの語は、人工的に抗原性担体に導
入された基であって、その抗原性担体はそｎらの基に対
する抗体形成を促進するものに限定さｎる。

リガンドの第３の群は、天然に存在する受容体ｔＭする
ものである。受容体は、蛋白質でも、リボ核酸（ＲＮＡ
　）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のような核酸
でも、また細胞に関連する膜であってもよい。天然に存
在する受容体ｔもつ代表的なリガンドには、サイロキシ
ン、多くのステロイド類たとえばニストロジエン、コル
チゾン、コルチコステロンおよびエストラジオール、ポ
リペプチドたとえばインシュリンおよびアンヤオテンシ
ン、ならびに他の天然に存在する生物学的活性化合物が
ある（　Ｍｕｒｐｈｙほか：　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｋｎｄｏ
ｃｒａ＊　２４　＊１８７　（１９６４）　、　Ｍｕｒ
ｐｈｙ：１ｂｉｄ、、　２７　、９７３（１９５７）；
１ｂ１ａ、、２８，３４３（１９６９）。

ＢＢＡ　、　１７６　、２６２　（１９６９）　、　Ｍ
ｃＥｗｅｎは２）：　Ｎａｔｕｒｅ　、　２２６　、２
６３　（１９７０）　＊Ｍｏｒｇａｎほか：　Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ　（１９６６）　ｅ　Ｐａｇｅほか：　Ｊ、Ｃ
１１ｎ、Ｋｎｄｏｃｒ、ｓ　２８　、２００　（１９６
９）参照〕。

リガンドはまた、文献において容認さｎてきた化学的種
族によっても類別する羞％ことができる。

本発明の対象となる種族には、構造が天然に存在するも
のと部分的に類似し、天然物質の生理学的性質？模倣ま
たは阻害する生理的模倣物質が包含さｎる場合もある。

また、合成物質、たとえばバルビッール酸類、アンフェ
タミン類も包含される。

さらに、これらの化合物は、酵素のすべての生物学的活
性が破壊さｎるよ５な部位に結合できるように修飾して
もよい。その他、合成の容易さまたに抗体の性質のコン
トロールのために構造の修飾が行わｎることもある。こ
ｔらの修飾化合物は偽リガンドと呼ばｎる。

とくに興味のあるリガンドの一般的カテゴリーは、薬剤
および化学的に変換された化合物、ならびにこのよ５な
化合物の代謝物である。薬剤【定量することの利点は多
様で、たとえば、特定の禁制薬剤？服用していたかある
いは所持してい定力・どうか、またどんな薬剤を服用し
ていてｐ＞、特定の体液中における薬剤の濃度はどの程
度か′３１−１べるために定量が行わｎる。

定量すべきリガンドは、まず放射活性で標識する。たと
えば、放射活性標識ジエンｒが放射活性抗原であれば、
こ７″Ｌは、特異的抗体によって被覆さ扛たビーズに直
接結合し、その近接によって、放出された飛程の短い電
子でもビーズ中の発蛍光団で励起することになる。液体
サンプル、たとえば組織抽出物中に非８Ａ識リガンドが
存在すｎば、そｎがビーズとの結合で標識リガンドと競
合し、観察さｎる螢光シグナルはその濃度に比例する。

サンプル部加後に観察さｎる螢光シグナル〒１既知量の
リガンドを用いた標準曲線で得らｎる値と比較すｎば、
そのジエンＰで特異的に検知することまたそのりガンＶ
の存在量全定量することが可能になる。

本発明の別の態様においては、ビーズケレクチン結合剤
たとえばコンカナバリンＡで被覆することもできる。こ
ｎ、らのビーズは全細胞または膜上結合させるために使
用され、細胞内部または膜上の放射標識化合物を検知す
ることができる。この方法により、細胞内の代謝物質た
とえば乳糖、グルコース等の蓄積もしくは枯渇、膜の輸
送性、この輸送τ促進もしくは遮断する物質に直接モニ
ターすることができる。

本発明の好ましい態悸において応用さｎるシンチレーシ
ョン近接定量法（５ＰＲＡ　）は、現存の放射免疫定量
法を単純化するものである。丸とえば、本発明の実施に
あたっては、振盪、遠沈、分離のいずれも必要としない
。５ＰＲＡの単純性は、自動化に適している。定値、結
果は、化合物によっては１時間以下で得らｎる。本明細
書に開示された抗体被覆ビーズによる５ＰＲＡは、％異
的抗体へのその結合能によって、高分子、低分子いずｎ
の抗原の検出にも応用できる。逆に、ビーズに抗原を結
合さ一ソることにより、・特異的な抗体を定量すること
も可能である。受容体およびそのリガンド、全細胞、細
胞子粒子ならびに膜への応用もできる。

抗原、抗体、ハプテンまたは他のリガンドの標識には、
通常のヨード化が用いらｎる。したがって、定量システ
ムに利用さ扛る化学は単純で、標識リガンドの放射能は
速やかに崩壊する。

広義には、本発明は、新しい１車類のシンチレーション
近接放射定量法（５ＰＲＡ、　）力）らなる。特定の態
様においては、本発明はシンチレーション近接放射定量
法に関する。さらに特定すｎば、本発明の定量法は、液
体サンプ中の特定の薬剤または分子種たとえばペプチド
、ホルモン、ステロイド等の存在で定量するにあたり、 （ａ）発螢光団含石ビーズに、抗体、抗りもしくは受容
体または膜もしく（グ細胞のような選択的結合分子を共
１ｆｔｊ合で結合させ、 （ｋ））上述の被覆されたビーズを、上述の抗体、抗原
、受容坏、膜または細胞に結合可能でその放射活性標識
がビーズ中の発螢光団ρ箋ら螢光を発生させる放射活性
種ｗｔ特異注リガンドとインキュベートし、 （ｃ）抗不゛よたに抗原被覆ビーズと放射活性標識特異
性リガンドの混６物に、発螢光団から放出さ７Ｌる螢光
を低下させるイ目応するなたは関連の非標識リガンドの
未知量で含むぜ成体サンプルを添加し−（ｄ）　’を夜
体すンプル中すリガンドの未知量の尺度となる螢光の減
少ｄ度ｒ測定−ｊ−ることに’Ｖｊ侭と−ｒる定量法で
ある。

たとえば、本発明を実施“ｒるに際しての好ましい一様
式に２いては、放射活性抗原が、予め特異的９℃体で被
覆されたビーズに直裏結合し、放出さする弱い電子もそ
の近接によ！７発螢光団ｔ１ｉＪＪ起することになる。

たとえば、体液中に存在する非標識リガンドが添加さｎ
ると、それが・譲識リガンドを置換し、螢光シグナルは
減少すめ。螢光シダナ測定できる。

すなわち、競合的免疫定量法のすべての要求は、分離を
要しないで１工程で実施できる。操作に単純かつ迅速で
、小さな分子にも大きな分子にも適用できる。この定量
法にトリチウム標識抗原を用いた場合には、特異的抗体
で破覆されたビーズとの相互作用により有意な螢光が放
出された。しρ）しながら、大量のトリチウムに必要と
し、しかも感度は高くなかった。もつとエネルギーの高
い電子を放出する放射同位元素であｎば、感度は改良さ
ｎ１同位元素の必要量も少なくてすむと考えらｎた。他
の一般に利用さ几る１４ｑおよび３５Ｂの放出粒子は＋
３ＰＲＡ用にはエネルギーが高すぎる。トリチウムβ−
電子のエネルギーは水中での飛程がわずか８μｍである
のに対し、１′Ｃおよび３５Ｂの場合の相当する値は、
そｎ−ｒｎ８５および８９μｍである。このような長い
飛程ではバックグラウンドシグナルが大きくなる。１２
５工は一般にはｒ線放出剤として用いらｎる。しρ）し
ながら、１２５工１、＋？！　　　　　、’ツーｆ７７
Ｎ　　？　　／Ｊ’　　７　　Ｌ　　７１−　７ｗ−大
←ｌ−＋４　　＋　　　　　　Ｚ　　Ｆ　　１ｒＱＶ　
　一本　１噂の転換電子は水中で７〜６０μｍの飛程を
示す。

１２５工は５ＰＲＡにおいてきわめて好都合に使用でき
ることが明らかにされた。１２５工のγ放出の平均飛程
は１５１と、ビーズの直径よりはるかに長く、エネルギ
ーも著しく大きいので、ビーズによるエネルギーの吸収
はほとんどない。こｎは１２５工がビーズに結合してい
ても浴液中にあっても同じである。さらに１２５工の利
点は、リガンドが従来の放射免疫法で用いらｎるヨード
化操作で＃４識できることである。トリチウムは標識の
導入にもつと面倒な方法？必要とする。１２５工は５Ｒ
ＰＡにおいて、まず第一に選ばｎるべき標識である。

ポリビニルトルエン（Ｎｌ１ｉ１Ｑ２Ａ　：　Ｎｕｃｌ
ａａｒ　Ｅｎｔｅｒ−ｐｒｉｓｅｄ　Ｌｔｄ、、Ｓｉｇ
ｈｔｈｉｌｌ、］！；ｄｉｎ’ｂｕｒｇｈ、５ｃｏｔｌ
ａｎｄ　）、好しくは直径１〜１０μｍのものが、本発
明のマイクロビーズとして使用するのに好ましい。他種
の発蛍光団含有ビーズが各種のポリマー、たとえばビニ
ルベンゼン（スチレン）、ビニルトルエン（メチルスチ
レン）およびビニルキシレン（ジメチルスチレン）から
製造でき、こｎらも本発明に使用できる。各種発蛍光団
を含有し、また露出表面にカルボキシル筐たはアミン基
のような反応性の基’に！するマイクロビーズは、現在
では市販品上入手することができ、本発明の災施に際し
使用できる。定量時に溶液中に存在させるのではなく、
固体支持体に結合させたマイクロビーズたとえばｄｉｐ
ｓｔｉｃｋ　、紙片あるいはバイアルもしくは試験の内
側に結合させたマイクロビーズも本発明の範囲内に包含
さｎる。

ポ、リビニルトルエンのビーズの場合は、本技術分野の
熟練者にはよく知ら扛た酸化方法を用いてメチル基ｋ［
化し、付着部位を形成させる必要がある。この場合の一
態様として、ポリビニルトルエン上のメチル基は、好ま
しくは過マンガン酸カリにより、以下の方法でカルボキ
シル基に醗化された。

ビーズ７．１−３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００’１８　
Ｗ　７０−Ｊｌに懸濁し、振盪して親水性とし、遠心分
離した。ビーズのペレットに７０＊の水に懸濁し、振盪
し、遠心分離し、こｆ″Ｌに６回くり返して洗浄した。

洗浄したビーズを水′５６ｄに再懸濁し、−夜冷蔵庫に
保存して沈降させ友。翌朝、上澄液を吸引して微粉末を
除去し、１−ズ【水に再懸濁して最終容量７０ｙとした
。

ビーズ懸濁液の一部７−ｚ（ビーズ約７００ｒｎｌｉ）
ｈｌｏｏｙの丸底フラスコに移し、こｎに水２２ｄおよ
び新たに調製した０、Ｉ　Ｎ　ＫＭｎＯ４７７ｉ液２２
−ｊｔ加えた。フラスコをアルゴンで覆ったのち、６０
′Ｃの浴中に置き、攪拌下に１０時間インキュベートし
た。ついでフラスコを浴から取出し、室温でさらに１２
時間インキュベートした。酸化終了後、重亜硫酸ナトリ
ウム溶液（４０，９／１００ｗ）５＊を攪拌下に、つい
で１ＮＨＯｊ３０ｄｋ加えた。懸濁液上次に遠沈管に移
し、遠心分離後、上澄′ｒｉ、を除去し、ビーズのペレ
ット’ｋＩＮＩ（Ｏ）５ｄで１回洗浄し几。ついで、酸
化されたピーズ上１上澄液の…が中性になるまで、遠心
分離、懸濁ｔくり返して水洗した。最後に、酸化された
♂−ズに１０１Ｌｔの水に懸濁した。生成したカルボキ
シル懸濁液中の♂−ズの定量は比濁法によって行った。

ｌ　ｄ中ビーズ約２００■の懸濁液？冷蔵庫に保存した
。抗体とのカップリング用のサンプルは、振盪してビー
ズ懸濁液に懸濁させて採取した。

抗血清（ポリクロナールまたはモノクロナール抗体）は
カルボキシル基？介して酸化ビーズに結合させた。カッ
プリングは本技術分野における通常の熟練者にはよく矧
ら几たカップリング操作を用いて達成できる。一実施態
様によｎば、カップリングは１−エチル−３−（ジメチ
ルアミノプロピル〕カルボジイミド（５ｔｏｒｙ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　０ｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ、Ｍｕｓｋｅ
ｇｉｎ、Ｍ工）を用いて行うのが好ましいが、抗血清（
または抗原）？！−マイクロビーズ上の反応基にカップ
リングさせる方法として本技術分野でよく矧らｎ′ｆｃ
任意の操作？本発明に使用することができる。以下の実
施例に使用した被覆ビーズは次の操作によって製造した
。５ｄのポリプロピレン管中、抗血７８まｆＣは前免疫
血清サンプル５０μノ七識化ピーズ約４００〜に加えた
。容量７ＰｆＫで＊１　’）　ｍｌ−＋ｕ（’ｙ　１　
ｎ　ｍＭ　ＦＴＯｊ！の滴加ＶＣよりｄ１５．５に調整
したのち、カルボジイミド１０ｒｎ９で加えｔ。管に栓
ｋＬ、ロータリーミキサー上で一夜、回転、振盪させ、
遠心分離した。上澄液？除去し、抗体被覆ビーズ’ｌ（
ＩＪン酸緩衝食塩溶液（ｐ８７．４　）５、ｆｆｉ／で
２回洗浄し、カップリングしなかった憑白質および未反
石カルボジイミｖｔ除去した。抗体被覆ビーズｔ１最後
の洗浄、遠心分離後に、０．１係ウシ血清アルブミンお
よび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−ｉｏ。

含有すン酸緩衝食塩渚液の既知容量に再懸濁した。

この懸濁液の一部でとって水で希釈し、比濁定量後、抗
体被覆ビーズの濃度’に２０ｍｆ／ｄに調整した。この
生成物〒４℃に保存し、定量用に一部２採阜する場合は
その都度、注意深く振盪した。

本明細書の実施例で使用し比遊離リガンドは、ロイシン
−エンケファリンおよびメチオニン−エンケファリン−
Ａｒｇ’−Ｐｈｅ７（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒ
ａ−ｔｏｒｉｅｓ；Ｂｏｌｍｏｎｔ、ＯＡ　）、ウサギ
抗うットエｇＧ　（ＨおよびＬ鎖特異注、０ａｐｐｅｌ
　；　Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ　）である。モルフインＩ
ｄ　５ｐｅｃｔｏｒ、Ｓ、博士（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｄ
ａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ　）から恵与された
。チロシル−１２５エロイシンーエンケフアリン、１２
１ｉ件２２０３μＯ１／μｍｏｌ　Ｉｄ　Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　（ＢｏＳｔｏｎ、ＭＡ）
かう購入した。［１２５工］−メチオニン−エンケファ
リン−Ａｒｇ’−Ｐｈｅ７（比活性７７５μＯ１／ｎｍ
ｏｌ）およびＣ”’Ｉ］−Ｙ１３−２５９　（比活性５
６０μＯ１／ｎｍｏｌ　）はＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏ、（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、工Ｌ）のヨードピ
ーズハ）ら製造した。〔１２５工コモルフインはＲｏｃ
ｈｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　（ＮｕｔｌｅｙｅＮＪ
　）から供給ケ受け、比活性は約１０μＣ１／ｎｍｏｌ
であった０１２５ニーサイロキシンＵ　Ｒｏｃｈｅ　Ｃ
１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｓ（ＢｕｒｌｉｎｇｔＯｎ、Ｎ
ｏ　）　７）＋１ら供給さｆ１７’ｃ。

ロイシン−エンケファリンおよびメチオニン−エンケフ
ァリン−Ａｒｇ’−Ｐｂ０フに対するウサギポリクロナ
ール抗血６１は、公仰方法を用いて製造した。

力価ばそＡ−ｔ’ｆ′Ｌ１　：　５．Ｃｌ　００ｂｚび
１：１５．［］ＯＯであった。モルフインに対するヤギ
ポリクロナール抗血清、力価１：３００はＲｏｃｈｅ　
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ　Ｒ
ｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｙ、ＮＪ　）　７１）ら供給された
。サイロキシンに対するウサギポリクロナール抗血１９
ｉＪ　ＲＯｃｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｓ　（Ｂ
ｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｎｏ）から（！給された。

実）７Ｍ例におけるこ２１らの試薬の使用は、単に本発
明で例示するためのものであって、いかなる意味におい
ても、本発明の範囲または他のリガンド（抗体１之は抗
原）の定量への応用もしくは他のジエン１２の使用で制
限するものではない。本明細書において用いらｎる「液
体サンプル」の語は、Ｆ２　ｍ操作ｒ行っていない天然
の体液、たとえば血液、唾Ｉｆ、’：ｆたは尿すンプル
？意味する。しかしながら、この語（２、本技術分野に
おける通常の熟練省によく汀らｎている方法により、定
量実施前に液体サンプルから定量を妨害する可能性のあ
る混在蛋白質または池の物質に除去した組織サンプルの
抽出液も包含するものである。″また、反応メジウム、
細胞培養メジウム、製造プラント排出液等盆液体サンプ
ルとして使用する特異的代謝物、生成物、夾雑物、毒物
またほその他の試験化合物の定量も、本発明の範囲内に
包含さｎる。

本発明のシンチレーション近接定量法は、水中ｆ　ｔｙ
’ｚ　−ｄ５　ｊ、ｅ　−ｈ：　−Ｓ　ｌ　　（ｍ　ｎ
β−釣用物質で１１．た抗原を使用するのが好ましい。

特異的抗原と会合していない放射標識の希薄溶液中に少
量の抗体被覆ビーズを懸濁させても、ビーズおよび標識
の濃度に依存する螢光シグナルはわずρ）しρ・生じな
い。

かなりの童の標識特異的抗原の存在下には同量の抗体被
覆ビーズでも、ビーズ上の抗体に抗原が直接結合するの
で、大量のシグナルを生成する。

以下の実施例においては、定量は１．５−のポリプロピ
レンマイクロ遠沈％ｊｆ　（＋３ａｒｓｔθｄｔ、工ｎ
Ｃ１Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ　）中、緩衝液、１２５
ニー抗原、標準サンプルまたは未知サンプル、最後に特
異的抗体被覆ピーズ會順次添加し、容量５０〜２５０μ
ノで実施した。マイクロ遠沈管に栓ｔし、回転させ、ロ
ータリープラットホームミキサー上に置き、特定の温度
で、与えらｎた物質の定量に適当な時間インキュベート
した。初期の研究では、抗体被覆ピーズ勿懸濁状態に維
持するためには絶えず攪拌が必要で、（Ｌｅｕ〕エンケ
ファリンおよび［ｕｅｔ］エンケファリン−Ａｒｇ’−
Ｐｈｅ’についての操作は（下記参照）、この振盪する
方法で記載する。しρ１しながら、その後、反応混合物
に最終濃度１２チのグリセロール全添加するとビーズは
懸濁状態に保たｎ１振盪は不必要となジ、同時にカウン
ト効率も上昇することが明らかにされた。モルフインお
ヨヒサイロキシンについては（下記参照）、クリセリン
法で記載する。インキュベーション後、各マイクロ遠沈
管を透明なガラス裂シンチレーションバイアル中に落と
した。バイアルを液体シンチレーションカウンター中に
置キ、広く開いｆｃ３Ｈウィンドウを用いて２分間カウ
ントした。ＢθｃｋｍａｎＬＳ　７８００カウンター（
Ｂｅｃｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　。

工ｎｃ、）の場合にはウィンドウｔＯ〜４００に開き、
Ｐａｃｋａｒｄ　Ｔｒｉｂ−Ｏａｒｂ　４６Ｑ液体シン
チレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ工ｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔ　Ｃｏ、、工ｎｃ＋ンの場合にはウィンドウ？
０〜１９に開いた。一部の装置たとえばＢｅｃｋｍａｎ
　７８００の場合には、懸濁ビーズによる白濁のために
、カウントプログラムの他の調整が必要になる。

各抗体被覆ビーズについて力価【測定した。こＡＫは、
一定濃度の〔１２５工〕−抗原に対し種々の量の抗体を
用いた。最大（１２５工］−抗原結合の３０〜５０％に
相当する量の抗体被覆ビーズが感度の高い免疫定量の実
施に適当と考えらｎた。

本発明の５ＰＲＡに用いらｎる試薬は、キットの形に包
装するのが便利である。各キットには試薬容器を設げ、
各容器には多数回の分析に十分を試薬を加えておくこと
ができる。このようなキットの第１の容器には、選択的
結合分子により共肩結合で被覆された発螢光団含有マイ
クロビーズが、第２の容器には、上記結合分子に特異的
な放射標識リガンドの既知濃度を含有させる。また、定
量に使用さｎるキットの場合には、所望により、標準曲
線の作成に標準として使用できる既知の、１種の濃度の
リガンドｔ（几ぞｎ＠有する複数個の容器を添付しても
よい。この標準曲線ρ・ら試験サンプル中のリガンドの
濃度？求めることができる。

以下の特定の実施例は、本発明の応用例全例示するもの
であるが、本発明の５ＰＲＡは多くの分子の存在の検出
に使用できるものであることを銘記すべきである。また
、使用された方法は本発明に必須の事項でになく、たと
えばサンプルと試薬の添加順序の変更等は、当然、本発
明の範囲内に包含さｎる。

例　　１ 力価（第１図）から、（Ｌｅｕ］エンケファリンの定量
には、抗体被覆ビーズ０．４５Ｉｎ９に使用することに
決定した。定量用混合物の最終容量は２５０μノトシ、
〔１２５工〕−ロイシン−エンケファリン２０μ、ｔ　
（２４，０（］　Ｏｃｐｍ　）、標準（Ｌｅｕｌ　ｘ　
ｙケファリン２０μ）または分析用サンプル１０〜１０
０μノおよび抗体被覆ビーズ懸濁液１０μノで加えた。

最終容量２５０μノへの調整には、この場合、０．１％
ウシ血清アルブミンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１［］０含有のリン酸緩衝食塩溶液ｒ用い九〇非特異的
結合は、同じ動物の免疫前血清に♂−ズｔカップリング
させて測定した。血清や組織抽出液中にはペプチダーゼ
が存在するので、ペプチドの免疫定量時のインキュベー
ションは一般にイ庄ｉ１１スｆ　Ｒ＋−３ｆ’Ｌふ〜■
、かＩ、ｈがら、留時間室温でインキュベーションした
のち、ついで冷却下に長時間インキュベートすると、ペ
プチドの分解は認めらｎず、操作時間を短縮できること
が明らかにされた。Ｌｅｕ−エンケファリンの定量では
、サンプルで室温で１５分間、ついで４”Ｃで４時間イ
ンキュベートし丸。こｎらの条件および上述の抗体被覆
ビーズと試薬の割合で、１２５工ＬθＵ−エンケファリ
ンの最大結合の約７０％が達成された。非標識Ｌｅｕ−
エンケファリンの添加によって、第２図に示すような置
換？生じ友。こｎから、工Ｃ５０は１４　Ｑ　ｆｍｏｌ
と評価された。この感度は、Ｌａｈｍ。

Ｈ−Ｗら（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　２　’１５　、４２２〜４２９（１９８３）］によ
って報告さ１．ている標準［：　Ｌａｕ　］］ロイシン
ーエンケファリンＲ工の場合と同じオーダーである。下
垂体抽出物の２種のサンプルを両操作によって定量した
ところ、結果に、Ｒ工Ａで９４０　ｆｍｏｌおよび１Ｑ
　９　Ｑ　ｆｍｏｌ、ｓｐ工で１０００　ｆｍｏｌおよ
び９５　［］　ｆｍｏ］−であツタ。

例　　２ ヘプタペプチドの定量 プロエンケファリン生成物［Ｍｅｔ　］］エンケファリ
ンーＡｒｇ’−ｐｈｅ’の特異的５ＰＲＡ　ｋ開発する
ために、類似の操作法を使用した。抗体被覆ビーズ０．
１６１Ｖｋ用い、４時間で工Ｃ５０７８ｆｍｏｘの最大
結合？得ることが可能であった。（Ｍｅｔ　）エンケア
　７１Ｊン−Ａｒｇ６−Ｐｈｅ７（ヘプタペプチド）の
場合、容量５０μノでの力価測定によＶ（第６図）、抗
体被覆ビーズ０．１６〜は約３０俤の標識リガンドの結
合し、高感度の定量に理想的であることが示唆された。

最終的な定量成分は、緩衝標準液または未知サンプルの
いずｎか２０μ、ｇ、　　（１２５１１−へブタペプチ
ド２０μ）（約２０．０００　ｃｐｍ　）および抗体被
０ビーズ（０，１６Ｉｎ９）　２０μノとした。

Ｌｅｕ−エンケファリンについては、室温で１５分間つ
いで冷室（４°Ｃ）で４時間インキュベーションを行っ
た。こｎらの条件で、ヘプタペプチドも最大結合が達成
された。冷室での後半のインキュベーションは、最大結
合は増加させず、再度の定量時の再現性を改善するよ５
に思わｎた。置換曲線（第４図）から工Ｃ５０は７３　
ｆｍｏｌと測定された。

同じ抗血清による標準Ｒ工Ａの場合は５９　ｆｍｏｌで
ある。

例　　６ モルフインの定量 モルフインのＳＰＡでは、ビーズケヤギ抗モルフイン血
清とカップリングさせた。力価（第５図）から、抗体被
覆ビーズ０．４Ｉｎ９が標識６０％と結合し、したがっ
て定量に遇していることが明ら力・にさｆ’した。定量
混合物は〔１２５目−モルフイン１００μｔ　（３０，
０００Ｃｐｍ　）、標準モルフイン４０μｍ。

ま′たは分析用未知サンプル１０〜５０μノ、グリセロ
ール６０μノおよび抗体被覆ヒース（０，４ｒ１９）４
０μノ？リン酸緩衝食塩浴Ｍ（ｐＨ７−４）で総容量２
５０μノとした。最大結合は、抗体被覆ビーズ七像識と
室温で７２＃、間１でインキュベートしたときに得らｎ
ｉ（第５図）。競合研究では、インキュベーションは６
７℃で１時間実施し、この時点で最大結合の６９％が達
成さ’ｎ−ｆｃ　ｏ標準置換−！１（第６図）によジ、
工Ｃ５ｏ　２６　ｐｇの個が得らｎた（第６図〕。この
５ＰＲＡは、尿中のモルフイン測定用に市販さｎている
Ｒ工Ａキツ）　（Ａｂｕｓｃ−ｒｅｅｎ■、　Ｌｉｏｆ
ｆｍａｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｓ工ｎｃ、）に匹敵した。

５ＰＲＡの感度は高いので、定量用サンプル１０μノを
採取するルｉＪに、尿は５０倍に希釈した。６種の尿サ
ンプル中の添Ｍｕモルフイン濃度を測定したところ、Ｒ
ＩＡ　Ｔｒｉ　５６８．２０５＞ヨＣＦ２９５　ａｍｙ
ｚｔ−Ｃ”、ＳＰ上コＡテハそルぞｎ５０６．１２６お
よび２４５ｎσｄであつ九。

例　　４ Ｔ　４Ｃｌ）　５ＰＲＡ　ＶＣは、ピーズｔウサイ抗で
４　血清とカンシリングさせた。第７図に示すように、
力価から、抗体被覆じ−ズ０．５１ｎｇは添加した標識
Ｔ４の約６０％と結合し、筒感度の定量に適することが
示唆さ几た。定量混合物は、血清または血清中標準のい
ず才しか２Ｇμノ、〔１２５０Ａｎ−Ｔ、。

１００μｉ（約５０．０００ガン−ｒＣ，ｐ、ｍ、）、
グリセロール５３　％　’ｘ名名するＰＢＳ−ＥＤＴＡ
　１−１（７，４緩衝液９０μ）、２工び抗体−晟覆ピ
ーズ（０，５〜）懸濁６４０μノであり、総容量２５０
μノとした。

試験管を回転後、６７℃で１時間インキュベートした。

標準置換曲線２第８図に示す。ＴＣ５ｏはＴ４１．５ｎ
ｇであった。

インキュベーション時間で長くすると、総結合が増加し
、したがって感度は高くなるが、工０５０は事実上変化
しなかった。　　　　　　　　−

【図面の簡単な説明】

第１図は、ロイシン−エンケファリン抗体被覆ビーズの
量で変化させた場合の　（１２５工〕−ロイシン−エン
ケファリンの結合に対する影＊’ｃ示すグラフである。 第２図は、非標識ロイシン−エンケファリンの量で変化
させた場合の　（１２５工）ロイシン−エンケファリン
の置換を例示したグラフである。第６図は、ヘプタペプ
チド抗体被覆ビーズの量で変化させた場合の　１２５ニ
ーへブタペプチドの結合に対する影＃を示すグラフであ
る。第４図は、非放射性へブタペプチドによる〔１２５
工〕−メチオニン−エンケファリン〜Ａｒｇ６−Ｐｈθ
７の置換盆例示したグラフである。第５図は、モルフイ
ン抗体被覆ビーズの量勿変化させた場合の〔１２５工］
モルフインの結合に対する影響【示すグラフである。第
６図は、抗体被覆ビーズ０．４１ｎ９に結合する［１２
５工］モルフインの、標準モルフインの一連の希釈系列
による置換ｒ例示するグラフである。第７図は、Ｔ４抗
体ビーズの量を変化させた場合の〔１２５工］　−Ｔ、
の結合に対する影＃ｒ示すグラフである。第８図は、非
標ＲＴ４の量？変化させ７′ｃ場合の［１２５工］　−
Ｔ４の置換７例示し定グラフである。 第９図ＩＤ、”５Ｈ（３Ｇの抗体被覆ビーズへの結合速
度上＊すグラフである。

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体サンプル中のリガンドの存在を定量するにあ
   たり、（ａ）発螢光団含有マイクロビーズにはそれへの
   選択的結合分子が共有結合で付着していて、その選択的
   結合分子に結合可能な放射活性標識リガンドがその選択
   的結合分子に結合すると、その放射活性標識がマイクロ
   ビーズ中の発螢光団に螢光を発生させるように構成され
   た発螢光団含有マイクロビーズと、未知量の非標識リガ
   ンドを含む液体との混合物を準備し、（ｂ）標識リガン
   ドの結合により、サンプル中の非標識リガンドの濃度に
   対応して生成する螢光を測定することを特徴とするシン
   チレーション近接定量法。
2. （２）マイクロビーズはポリビニルトルエンである特許
   請求の範囲第１項記載の定量法。
3. （３）マイクロビーズの直径は約１〜１０ミクロンであ
   る特許請求の範囲第１項および第２項のいずれか一つに
   記載の定量法。
4. （４）定量法は放射免疫定量法である特許請求の範囲第
   １項から第３項までのいずれか一つに記載の定量法。
5. （５）放射活性標識はＩ＾１＾２＾５である特許請求の
   範囲第４項に記載の定量法。
6. （６）選択的結合分子は抗原である特許請求の範囲第１
   項から第５項までのいずれか一つに記載の定量法。
7. （７）選択的結合分子は抗体である特許請求の範囲第１
   項から第５項までのいずれか一つに記載の定量法。
8. （８）選択的結合分子は受容体または膜である特許請求
   の範囲第１項から第４項までのいずれか一つに記載の定
   量法。
9. （９）定量混合物にはさらに少量のグリセロールを加え
   る特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか一つ
   に記載の定量法。
10. （１０）液体サンプルは体液である特許請求の範囲第１
    項から第９項までのいずれか一つに記載の定量法。
11. （１１）測定はシンチレーション装置を用いて実施する
    特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれか一つ
    に記載の定量法。
12. （１２）（ａ）共有結合した選択的結合分子で被覆され
    た発螢光団含有マイクロビーズを含む第１の容器および
    （ｂ）上記マイクロビーズを被覆する選択的結合分子に
    結合可能な放射活性標識リガンドを含む第２の容器から
    なる、選ばれたリガンドのシンチレーション近接定量を
    実施するためのキット。
13. （１３）その定量法によるそのリガンドの標準曲線を作
    成するのに適当な、それぞれ異なる既知濃度の選ばれた
    リガンドを含有する容器をさらに付加した特許請求の範
    囲第１２項記載のキット。
14. （１４）共有結合した選択的結合分子で被覆された発螢
    光団含有マイクロビーズ。
15. （１５）直径は約１〜１０ミクロンである特許請求の範
    囲第１４項記載のマイクロビーズ。
16. （１６）選択的結合分子は抗原、抗体、受容体または膜
    である特許請求の範囲第１４項記載のマイクロビーズ。
17. （１７）選択的結合分子はレクチン結合分子である特許
    請求の範囲第１４項記載のマイクロビーズ。
18. （１８）レクチン結合分子はコンカナバリンＡである特
    許請求の範囲第１７項記載のマイクロビーズ。
19. （１９）マイクロビーズはレクチン結合分子によって細
    胞膜に結合している特許請求の範囲第１８項記載のマイ
    クロビーズ。
20. （２０）共有結合したレクチン結合分子で被覆された発
    螢光団含有マイクロビーズを細胞または膜に結合させる
    こと、およびその細胞または膜に放射活性標識が存在す
    るとその放射活性標識がマイクロビーズ中に放射活性標
    識の濃度に比例した量の螢光を発生させる放射活性標識
    リガンドを細胞または膜に付与することを特徴とする、
    細胞または膜における特異的リガンドの存在をモニタリ
    ングする方法。
21. （２１）レクチン結合分子はコンカナバリンＡである特
    許請求の範囲第２０項記載の方法。
22. （２２）放射活性標識は＾１＾２＾５Ｉである特許請求
    の範囲第２０項記載の方法。
23. （２３）特異的リガンドは乳糖である特許請求の範囲第
    ２０項記載の方法。