JPS6010578B2 - 固相免疫ケイ光分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原（又はハプテン）及びその抗体の免疫ケィ
光分析法に関する。 更に詳細には、標識付き免疫学的試薬のその水浮遊液に
おけるケィ光の直接測定を可能としているサイズをした
高分子粒子に共有結合即ちカップリングしている、測定
対象である抗体又は抗原（又はハプテン）に関連した免
疫反応体の使用に関する。水不落性ポリマーへの抗原（
又はハプテン）と抗体の共有カップＩＪングは良く刊行
物に記載されている。 この主題についての代表的レポートは、Ｃａｍｐ戊１１
，Ｄ．日，．Ｌｅｕｓｈｅｒ，Ｅ．，及び戊ｒｍａｎ，
Ｌ．Ｓ．共著“Ｐｒ的．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．３
７，５７５（１９５１）”．Ｗｅｌｉｋｙ，Ｎ．とＷｅ
ｅｔａｌｌ，日．日．の共著“ｌｍｍｕｍ×ｈｅｍｉｓ
ｔび ２，２９３（１９６５）”，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，
Ｄ．日．とＷｅｌｉｋｙ，Ｎ．の共著“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ｌ［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄｌｍｍｕｍｘｈｅｍｉｓｔび”，編者：Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ Ｃ．ＡとＣＭｓｅ，Ｍ．Ｗ．第１巻、アカデ
ミック出版、ニューヨーク（１９６７）である。 上記技術は様々な成分の検出に使用されており、又数個
の特許発明の主題である。 １９７１年１月１２日ＲＥＡｙ．舷ｅｎ等に付与された
アメリカ特許第３５５５１４３号発明においては、抗体
を水不溶性ポリマーに共有結合させも競合結合方法で放
射性蛋白及び未標識付き蛋白と混合した。 １９７５年２月１８日付与されたアメリカ特許第斑６７
５１７号発明においては試験装置を肝炎感応性抗体又は
抗原で被覆し、ついで談抗原又は該抗体を含む溶液と薮
触させた。 その後にこれを放射性アイソトープ脇で標識された肝炎
抗原又は抗体に曝露してサンドイッチを得た。洗浄後「
結合したアイソトープの量を定量できた。Ｍｏｌ雌ｙ等
〔Ｍｏｌｄａｙ，Ｒ．Ｓ．？ Ｄｒｅｙｅｒ？ ＷＪ。 ，Ｒｅｍｂａｍｍり Ａ．及びｙｅｎ亨 ｓ．ｐ。ｓ．
の共著Ｇｎａｔｍｅ２４９Ｗ（亀９７４年５月３日）と
“ＴｈｅＪｏ町雌ｌ ｏｆＣａｌｌ Ｂｉｏｌｏ磯軍
第６４巻”，７５〜斑？１９７５〕は、直径が１３００
Ａないしそれ未満のラテツクス球の合成、この球のケィ
光又は放射性標識ト及びこの球への抗体の共有結合につ
いて報告している。これらはその後「抗原を細胞表面上
に位置させるために使用された。軍ｎｍａｎとＱｉｎｔ
ｚｉｓ〔ｌｎｍａｎ，Ｊ。 Ｋ。とＤｉｎｔｚｊｓ，８Ｍの共著“ＢｊＭｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ”８（１０）４０７４〜４０８２７ １９６９〕
は広範囲の官能基を導入するためのポリァクリルアミド
ビーズの化学的修飾を記述した。イＣ学反応性ビーズ誘
導体を使用して抗体即ち酸素を共有結合した。ついで「
０ｈ血とＳｔａｈｍａ皿（０ｈ肌官 Ｙ．とＳねｈｍ
ａｎｎ，Ｍ．Ａ．の共著“ｌｍｍｕｍＸｈｅｍｉｓ

【ひ
母９”，１０８７〜１０９３蔓 １９７２）は「ペニシ
リンが既に結合されている、サイズが約１０ミクロンの
ビーズがペニシリンに対する抗体の検出に使用される時
には赤血球よりも明白な凝集反応を示すことを確認した
。 免疫化学標識付け技術は“免疫学と免疫化学における方
法”〔編著：Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ａ及びＣ舷ｓｅ蔓
Ｍ．Ｗ．，第１巻「アカデミー出版「ニューヨーク（１
９６７）及び第３巻（１９７１）〕で考察されている。 ケィ光標識付き抗体はＣＭ船〔Ｃ血鵬，Ａ．日．署“Ｆ
！脚ｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎｔｉ舷ｄｙＭｅ仇ぴ虫”，Ｊ
。Ｆ．Ｄａｎｉｅｌｌ（編者）“Ｇｅ聡ｒａＩＣｙＫに
ｈｅｍｉｃａＩ Ｎねｔｈぴ＄”，第１巻，アカデミッ
ク出版〜ニューヨーク、１９５８）〕により考察されて
おり「又ケィ光鏡検法による微生物及び組織の抗原の検
出における幅広い用途が発見されている。 Ｃｏｏｎｓ等〔Ｗｅｌｉｅｒ９ Ｔ．日．及びＣｏｏ船
，Ａ．日．；母‘Ｐｒ比，ＳＭ。 ＥＸｐｔｌ，Ｂｉｏｌ，Ｍｅｄ，”８６亨 ７８９〈１
９５４）〕は更にキ特定抗体とケィ光抗−ｙグログリン
抗体とを使用しての細胞結合抗原の測定法を記載した。
同一著者（Ｃｏｏ船，Ａ．日．，じｄ此，Ｅ．日．及び
Ｃｏ皿ｏｉｌｙ，Ｊ，Ｍ，‘‘Ｊ，ＥＸＰｔｌ，Ｍｅｄ
，１０２，４９，Ｉ９５５＞は特定抗原と特定ケイ光抗
体を使用して細胞結合抗体を測定するための技術も記載
した。Ｃａｐｅ！（ＣａｐｅＬ ＰＪＡ．仏Ｊ．ｏｆ耳
ｍｍ肌ｏｌｏｇｉｃａＩＭｅｔｈｏ船”Ｓ。 １６５〜１７８，１９７４）は４０〜１９０仏のサイズ
のアガロースビーズの表面に抗体又は抗原をアップリン
グごせた。 この実験では彼は条件を調整して抗原がビーズの孔に侵
入するのを防ぎ、侵入の結果として起こる抗原−抗体反
応が妨害されるようにする必要があった。彼の実験にお
いては人耳６Ｇをアガロースビーズに結合させトウサギ
抗一人耳ｇＧ抗体についでフルオレスセィンィソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）標識付けされた馬の抗ーウサギ耳
ｇ血清と反応させた。彼はケィ光鏡検法による可視化に
よりケィ光量を測定した。抗原を測定する時には抗一人
耳ｇＧ抗体をアガロースビーズに結合させト人１ｇＧと
ＥＩＴＣ標識付けされた馬の抗山人重ｇ血清とを加えて
反応させ、ケィ光鏡検法によりケィ光を測定した。まと
めるとも不溶性ポリマーと共有カップリングされた免疫
系反応体の分析における用途においては、放射性トレー
サーかケイ光化合物の何れかで標識付けされた免疫系反
応体を用いている。 放射性トレーサーは寿命に限度がありかつ特別な取扱い
要件があり、又高価な検出装置を必要とするという欠点
がある。ケィ光トレーサーの従来の使用「考慮された用
途に関しては、分析はケィ光鏡検法での可視化による個
々の粒子のケィ光の測定の如き、間接的な則ち比較的退
屈で長時間を要す方法に限定されている。本発明の方法
により「直後分光学法によるケィ光標識付きけされた粒
子の測定が可能になる。 この方法の鍵は、分析実施中に実質的に均質な浮遊液を
与える高分子粒子のサイズの選択にある。直接ケィ光測
定をなすことができるかかる条件はト高分子粒子が約０
．１〜１０ミクロンのサイズを持ち又好ましくは約５ミ
クロンを中心とするこの範囲内の粒律分布を持つ場合に
存在することが発見された。かかる粒子を利用して、測
定対象である未知抗原（又はハプテン）又は抗体にそれ
と免疫学的に同族の適当な免疫系反応体が共有結合され
る。 該粒子、禾知免疫系反応体及びケィ光標識付けされた適
当な免疫系反応体を、未知免疫系反応体の濃度に比例し
た量の標識付き免疫系反応体が直接又は間接に該粒子に
免疫学的に結合されるような条件下で混合する。該粒子
はついで容易に物理的に分離でき、そのケィ光はケィ光
光度計により直接測定できる。本明細書において“免疫
学的に関連のある”とは、その免疫系反応体が言及され
た免疫系反応体と同一であるかその同族体であることを
意味する。 すなわち未知の免疫系反応体と結合する免疫系反応体で
ある。たとえば抗体はそれもまた免疫系反応体である関
連する抗原を有する免疫系反応体であって、これらは互
いに免疫学的に関連するといえる。本発明の重要な点は
未知の抗体、抗原またはハプテンは既知の関連する抗原
、ハプテンまたは抗体を使用することによって検定でき
ることである。抗体はそれを産生した抗原の“免疫学的
同族体”であり、逆も又成立する。ここで“免疫系反応
体”とは抗体、抗原、ハプテンまたは化学的に反応性の
他の免疫系要素をいう。本発明の方法においては抗原と
ハプテンとは全く類似した機能を果す。これは、本明細
書においてそれらを二者択一物として述べることにより
示される。更に詳細には、本発明により、サイズが約０
．１〜１０ミクロンの複数の水不綾性親水性高分子粒子
を提供し「測定対象である抗原（又はハプテン）又は抗
体の免疫学的同族体をそれに共有結合させることからな
る改良免疫ケィ光分析法が提供される。該粒子は水溶液
中で測定対象である抗原（又はハプテン）又は抗体と結
合して両者間に免疫学的結合を形成する。測定対象であ
る抗原（又はハプテン）又は抗体に対応するケイ光標識
付き抗原（又はハプテン）又は抗体は該粒子に免疫学的
に結合される。粒子を水溶液から分離し、そのケィ光を
水浮遊液中でケィ光光度計により測定して未知抗原（又
はハプテン）又は抗体を測定できる情報を得ることがで
きる。本方法は蛋白、ポリベプチド‘こ対する抗体を利
用して蛋白及びポリベプチドから選択される抗原（又は
ハブテン）を測定するのに特に適している。 それら抗体は適当な水不瀞性高分子粒子に共有結合され
る。即ち、好適態様において本数良分析法は、サイズが
約０．１〜１０ミクロンである複数の水不落性親水性高
分子粒子を提供し、これに測定対象である未知抗原（又
はハプテン）の抗体を共有結合させることからなる。未
知抗原（又はハプテン）は水溶液中の該粒子に免疫学的
に結合される。更に、ケィ光標識付き免疫系反応体を組
合せ、その−部が（結合された抗原又はハプテンを通じ
て）直接にか間接に該粒子に免疫学的に結合して結合さ
れた標識を該粒子と共に分離できるようにする。粒子を
未結合免疫系反応体から分離し、液性サスペンションの
ケィ光をケィ光光度計で測定して未知抗原（又はハプテ
ン）分析のための情報を得る。いかなる適当な不溶性高
分子粒子も利用できる。 一般にこの粒子は球形即ちビーズ体をしており、又末端
ｐ−アミノ基、末端カルボキシル基又はヒドラジド基に
誘導できるポリマーから選択される。ついで抗体又は抗
原（又はハプテン）を通常の反応条件下で該粒子に固定
させて両者間に共有結合を形成する。好ましい高分子粒
子は架橋ポリアクリルアミドから形成される。かかる好
ましい基質上での免疫系反応体の固定は前に引用した如
くｌｎｍａｎとＤｉｎｂｉｓにより報告されている。他
の適当な高分子粒子は、アメリカ特許第３５５５１４３
号明細書に詳細に又前に引用した他参考文献に報告され
ているものである。本分折法の実施においては多数の二
者択一的技術を利用できる。 測定対象となる個々の抗原（又はハプテン）又は抗体及
びそれらの入手性に基づいて普通「選択がなされる。一
般には以下の方法を使って最も満足すべき選択がなされ
る。サンドイッチ法 固定抗体（高分子粒子、好ましくは球形則ちビーズ形を
した、に共有結合している）を、適当な溶液中で常に過
剰の抗体が存在するような濃度で二価ないし多価の特異
抗原（又はハプテン）と反応させる。 反応が完了した後に該抗原（又はハプテン）に特異的な
ケィ光標識付き抗体を僅か過剰に加える。該抗原（又は
ハプテン）は２個ないしそれ以上の反応部位を持ち、そ
のうち僅か１個が占有されるだけでないので、第２の標
識付き抗体が抗原（又はハプテン）の非占有部位（単・
複）と反応するであろう。抗原（又はハプテン）及び標
識付き抗体と結合された抗体ビーズを分離し、ケィ光光
度計で測定する。抗原（又はハプテン）の濃度はビーズ
に結合されたケィ光の量と正比例の関係にある。遂次飽
和法 別の方法は過剰量の固定抗体を問題の抗原（又はハブテ
ン）と反応させることである。 反応が起きた後に標識付き抗原（又はハプテン）を加え
ｔ抗体上に残っている利用可能部位を占有さすことがで
きる。固定抗体−抗原（又はハブテン）錆体を分離し、
標識を測定できる。固定された標識付き抗原（即ちハプ
テン）の量はサンプル中の抗原（又はハプテン）の量と
逆比例の関係にある。この方法が一価抗原（又はハプテ
ン）の場合に必要となることがある。抗原が過剰の場合 抗原（又はハフ。 テン）が過剰の時には競合結合法を用いることができる
。抗原（又はハプテン）に特異的な抗体を粒子に結合さ
せる。系に加えられる結合即ち団相抗体の量は有限量の
抗原（又はハプテン）を結合するのに足るものである。
問題の特異抗原（又はハプテン）及びその同族体である
標識付き抗原（又はハプテン）を抗体に加える。固定抗
体上の結合部位の数は有限なので、その部位をめざして
標識付き抗原（又はハプテン）と未標識付き抗原（又は
ハプテン）とが競合する。標識付き抗原（又はハプテン
）の結合量は系中の禾標識付き抗原（又はハブテン）の
濃度と逆比例関係にあり「系中の未標識付き抗原（又は
ハプテン）の定量手段として使用できる。この方法は第
２の抗体法と絹合せることができる。 抗体分画の正確な選択により〜岡相抗体を例えば、抗体
との唯一の結合部位を持つハプテンの分析において第２
抗体として使用できる。この方法において、ハプテン例
えばチロキシン「ジニトロフェノール又はステロイド、
に対する抗体は良く知られた方法により製造される。ハ
ブテンを１種の蛋白と抱合させ、非競合種に注入する。
即ちハプテンを人血清アルブミンに抱合させ、ウサギに
注入できる。このラビットは蛋白−ハプテン抱合体に対
する抗体を産生する。この方法では第２の抗体が必要と
されふそれは例えばウサギグロブリン分画をャギに注入
することによりそれに抗して産生される。 これによりャギ抗−ウサギ抗体が産生される。これらを
例えば小さなポリアクリルアミドビーズに抱合させ「第
１の抗体がラビットで産生されるいかなる系の第２の抗
体としても使用できる。第１種に対する抗体が非競合第
２種で産生される限りいかなる系統の動物も使用してよ
い。この方法では、抗体−ハプテン（又は抗原）結合体
は便利な分離則ち沈殿を可能にするという点においては
未反応抗体と有意には異らない。 第１抗体を産生するために使用された動物のグロブリン
分画に対する、粒子結合した第２抗体を利用して沈殿を
起こさせる。この場合、初めに競合的に結合した抗原−
第１抗体結合体は粒子結合した第２抗体の免疫学的同族
体と考えることができる。別法では、ハプテン蛋白抱合
体が、ハプテンに対する抗体の製造の所で既に述べられ
た方法に似た方法で使用される。ハプテンに対する抗体
はポリアクリルアミドビーズに共有結合され、ハプテン
測定試薬として使用される。ついで同一のハプテン蛋白
抱合体が製造され、蛋白がケィ光標識付けされる。これ
は天然ハプテンを分析する競合結合分析法則ち逐次飽和
分析法で使用される。この方法により増幅された分子ケ
ィ光反応が与えられる。他の変法は抗原をビーズに共有
結合させることである。 ビーズに結合された抗原を、有限量の同族抗体に対する
天然抗原との競合関係に置く。ビーズを分離し「抗原−
抗体鎧体に抗するように仕向けられた過剰量のケィ光標
識付き第２抗体と反応させる。ビーズを分離し、ケィ光
を測定できる。ケィ光量は測定対象である抗原の血清濃
度と逆比例関係にある。本発明では、いかなる適当なケ
ィ光化合物もラベルとして「抗原（又はハプテン）又は
抗体と粗合せて使用できる。 以下は適当な化合物の代表例を、それらのラベルとして
の用途を示す適切な参考文献と共に示したものである。
１ フルオレスセインイソチオシアネートＴｈｅ，Ｔ．
日．とＦｅｌｔｋａｍｐ，Ｔ．Ｅ．Ｗ．の共著４４ｌｍ
ｍｕ肌ｌｏｇｙ’’，１＆ ８６５（１９７０）２ ロ
ダミンＢイソチオシアネートＣｈｅｎ，Ｒ。 Ｅ．著“〜ｃｈ．ＢｉＭｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．”】
３３ ２筋（１９６９）３ ０ＮＳクロリド（５−ジメ
チルアミノ−１−ナフタレンスルホニルクロリド）Ｗｅ
ｂｅｒ，Ｇ．著“ＢｉＭｈｅｍ．Ｊ．”５１，１５５（
１９５２）４ ＮＢＤクロリド（７−クロル−４−ニト
ロベンゾ−２ーオキサ−１，３ージアゾール）Ｇｈｏｓ
ｈ，Ｐ．Ｂ．とＷｈｉにｈｏ偽ｅ，Ｍ。 Ｗ．の共著‘‘ＢｉＭｈｅｍＪ．’’ｉ雌，１５５（１
９斑）５ ＭＤＰＦ〔２ーメトキシ−２，４ージフエニ
ルー３（２Ｈ）ーフラノン〕Ｗｅｉｇｅｌｅ ， Ｍ．
； Ｄｅ Ｂｅｍａｒｄｏ， Ｓ．，戊ｉｍ餌如ｅｒ，
Ｗ．，ＣＩｅｅｌａｎｄ，Ｒ．及びＧｍ他ｅｒｇの共著
“Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
．“私，８斑（１９７３）６ フルオレスカミン〔フル
ラム（ＦＩ川ａｍ）７Ｍ一ローシュ診断学〕Ｂｏｈｌｅ
ｎ，Ｐ．，Ｓにｊｎ，Ｓ．，Ｄａｊ【ｍａｎ，Ｗ．及び
Ｕｄｅｍｒｉ船，Ｓ．の共著“〜ｃｈ．Ｂｉ比ｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈ＄．’’１５５ ２１３（１９７３）７ ０
−フタルアルデヒド＆ｎｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．とＨａｒｅ，
Ｐ．Ｅ．の共著“ＰｒＭ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）７２，６１９（１９７５）８ ＡＮＳ（８ー
アニリノナフタレン一１ースルホネート）Ｈａれｍａｎ
，Ｂ．Ｋ．とＵｄｅ泣ｒｊｅ中の共著“ＡＭ１．ＢｉＭ
ｈｅｍ．“３０，３９１（１９６９）代表的一般法１
抗体ビーズの製造 Ａ Ｏ．２５〜６ミリ当量の官能容量を持つ譲導ポリア
クリルアミドビ−ズを抗体結合用として使用する。 （これらはカリフオルニア州リッチモンドのＢｉｏ−Ｒ
ａｄＬａｂｏねｔｏｒｉｅｓからＡｍ−蛇１７０１，７
０２，７０３ 又はそれらの誘導体として得ることがで
きる）更に、６〜７０００ダルトンの排他限界 （ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｌｉｍｉｔ）を有するポリアクリ
ルアミドビーズは２ＭＮａＯＨで４０℃，１８時間処理
することにより加水分解してもよい。 ビーズはＨＣそで中和し脱イオン水で洗う。ビーズのカ
ルボキシル容器は直接満定ににより測定され、又好まし
くは約６ミリ当量ノタ乾燥量量とすべきである。Ｂ 力
ルボキシレートビーズを０．００３Ｍホスフェト緩衝液
（ｐＨ６．３）に浮遊させ、１０の９ビーズ／肌【の最
終濃度にする。 Ｃ 被検抗原に特異的の抗血清のグロブリン分画を１２
仏タ抗体ノの９ビーズの濃度でビーズに加える。 反応混合物をｐＨ６３に調整する。 Ｄ 水溶怪力ルポジィミド「例えば１−エチル−３−（
３ージメチルアミノプｏピル）カルボジイミド（ＥＯＡ
Ｃ），をビーズ１ミリ当量官能容量当り０．２５ミリ当
量ＥＤＡＣの濃度で加える。 希酸及びノ又は希塩基の添加により反応を１時間冊６。
３に維持する。 最初の１時間経過後はｐ則ま普通一定のままであるが、
４℃で−夜反応を進行させる。Ｅ カップリングさせた
ビーズをＰＢＳ（生理学的に緩衝された塩水、０．１９
ＭＮａＣ〆−０．０１Ｍホスフェート緩衝液「 ｐＨ７
．２）で２度、０．０８Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ７
．５）中のＳＭグァニジンＨＣそで３度、Ｐ斑で２度な
いしそれ以上、そして最後に０．００９Ｍホスフェート
緩衝液（ｐＨ７．５）で２度洗う。 洗液の容量は約５０泌／１００雌ビーズである。抗体活
性を最大とするため洗漆は４℃で実施する。Ｆ ビーズ
を０．０１％のナトリウムアジドを含む４℃の０．００
弧ホスフェート緩衝液中に貯蔵できる。 ０ 抗原過剰分析（競合結合分析） Ａ ２００山どの１０の９′の【抗体ビーズ浮遊液の一
部（抗体ビーズ〜２秘）を１．１の‘のＰＢＳを含む１
３×１０仇廠ボロシリケー汁試験管に入れる。 ビーズを遠心作用（〜８０００夕，〜ｉ分間）でべレツ
ト化する。Ｂ ＩＯ払その標識付き抗原（１０のｐ′泌
の抗原を含む）、血清サンプル（１０山その全血清で当
然１ｇＧの分析範囲に入る）及び全量を１．５の‘とす
る量のＰ斑の添加により反応を開始する。 混合物を渦型ミキサーで振とうさせ、室温で３び分培養
する。Ｃ 培養後に４の‘のＰ母を加える。 混合し、ついで前述の如く遠心作用を加える。上澄み液
を注意深く捨て、ベレットを５の‘のＰ既に再浮遊させ
る。約１の片後に浮遊液に再度遠心作用を加え「再度上
澄み液を捨てる。町 ビーズ表面の標識付き抗原の量を
ケィ光光度計で直接測定する。試験サンプルで測定され
た標識付き抗原の量を対照サンプル（抗体ビーズ十標識
付き抗原ト血清を含まず）で測定された量で割り、対数
−ロジット方眼紙で抗原濃度（磯〆の‘）の関数として
プロットする。困 サンドイッチ分析 Ａ ２００仏ｕの１０の９′の【抗体ビーズ浮遊液の一
部（抗体ビーズ〜２織）をも１２戒のＰＢＳを含む１３
×１０仇舷ボロシリケート試験管に入れる。 遠心作用（〜８０００多，〜１分間）によりビーズをべ
レツト化する。Ｂ 血清の希釈液を作る（再８Ｇの〜１
；１０００ １ｇＭ＋革ｇＡの〜１：１００），希釈液
の１００仏ｕをＡの試験管に加える。 サンプルを禍型ミキサーと混合し、室温で３時間培養す
る。Ｇ ２０〜５０メタの抗体を含む１００山その標識
付き抗体をＢの試験管に加えも更に３粉ご倍議する。 Ｄ 培養後、４の‘のＰ母を加える。 混合しトついで前述の如き途○分離する。上澄み液を注
意深く捨て、ベレットを５机のＰＢＳに再浮遊させる。
約１び分後に浮遊液に再度遠心作用を加え〜再度上澄み
液を捨てる。Ｅ ビーズ表面の標識付き抗体の相対的ケ
ィ光を測定し「 この値を対数一対数方眼紙で抗原濃度
（仏夕）に対してプｑツトする。 特定態様に関する以下の実施例は「架橋ポリァクリルア
ミドビーズにカップリングされるウサギ抗一人１ｇＧ（
Ｒ隣日をＧ）について本発明を例示するものである。 実施例 １ １タサンプルのターボリマーミクロピーズ（直径１０ミ
クロン禾満）を「 凶ＭＮａＯＨ（１８時間，４０℃）
で処理して加水分解した。 ビーズをＨＣそで中和し、Ｄ１（脱イオン）比○で６度
洗った。上記加水分解ビーズの５００の９サンプルを１
００の‘の０．０側Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ６．３
）に浮遊させた。２地のウサギ抗一人１ｇＧ血清ｉｇＧ
分直〔マイルズ（Ｍｉｌｅｓ），ロット地１４，コード
Ｍ．腿一１５５〕は１％蛋白溶液中に２。 ９の夕〆の‘の抗体を含んでし・た。 反応混合物のｐＨを６．３に調整した。１３０の９のＥ
ＤＡＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を加え、ｐＨをｔ希酸又は希
塩基の添加により１時間？ ６．３に維持した。 ４℃で燈拝しながら一夜反応を進行させた。 ビーズを〜１００私のＰ茂で２度、９ＭのグァニジンＨ
Ｃ〆を含むｉｏｏの【の０．０１Ｍホスフェート緩衝液
（ｐＨ？−５）で３度、１００机‘のＰＢＳで２度以上
洗った。４ゆで３時間経過後にビーズを１００私の０．
００９Ｍホスフヱート緩衝液（ｐＨ？。 ５）で２度洗い、ついでＱ．ｏｉ％のナトリウムアジド
を含む５０叫の最後の緩衝液に浮遊させト貯蔵した（最
終濃度、１０の９ビーズノ柵）。 実施例 ２ 抗原過剰分析 実施例１の２００〆そ（２級）のＲＱＨＩｇＧビーズを
も−列に並べられた１．物上工ツベンドルフ遼心管内の
１２００仏〆のＰＢＳに加えた。 ュツベンドルフ遠心分離機３．２００ノ３０型で最高速
度（〜１２０００多）で１分間遠心作用を加えることに
よりビーズをべレツト化した。１０仏ｕのＦＩＴＣ標識
付き人１ｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ），様々な希釈度の正常人
血清、及び全量を１．５柵にするに足る量のＰ斑を各サ
ンプルに加えた。 反応は「渦型ミキサーでビ一ズを再浮遊させることによ
り開始された。３科分後に前述の如くビーズに遠心作用
を加え、上澄み液を捨てた。 １。 ５の‘のＰＢＳに再浮遊させも前述の如く遠心作用を加
えることによりビーズを洗った。 再度上澄み液を注ぎ出した。この方法をもう一度くり返
し〜ビーズを５楓の０。００９のトリスＨＣ夕（ｐＨ８
．５）に再浮遊させた。 ビーズのケィ光をト励起光に対してはフィルター４７Ｂ
を使い照射光（ｅｍｉｓｓｉｏｎｌｉ述｛）に対しては
フィルター２ＡＩ２を使ってターナーフィルター（Ｔｕ
ｍｅてＦｉＭ【）ケィ光光度計で測定した。未処理ビー
ズの〜２級浮遊液を含む管のケィ光を、各試験サンプル
のケィ光から減じた。 ついで試験サンプルのケィ光を対照ビーズ（Ａｂビーズ
十ケィ光抗原ふ血清を加えず）のケィ光で割りも第官図
に示される如く対数−ロジット（ｌｏｇｏｇｉｔ）方眼
紙で抗原濃度（燐）に対してプロツトした。実施例 ３ サンドイッチ分析 以下の成分をェッベンドルフ遠心管内で混合し、室温で
１細時間培養した。 ２００仏そのＲＱ印ｇＧビーズ（実施例１）；１％のＢ
ＳＡを含む１２００〃そのＰ斑；及び１００ムその正常
人血清希釈液。 ヱツベンドルフ３２００／３０型で最大速度（〜１２０
００夕）で１分間遠心作用を加えてビーズを底に沈め、
デカンテーションして上澄み液を捨てた。 １．畝‘のＰＢＳに再浮遊させ、前述の如く遠心作用を
加えてビーズを洗った。 デカンテーションして上澄み液を捨て、１％のＢＳＡを
含むｉ泌のＰ既にビーズを再浮遊させた。１０〃そのＦ
ＩＴＣ抱合ＲＱＨＩｇＧ〔マイルズ（Ｍｉｌｅｓ），ロ
ット船．１９ コード地．弘一１６９〕をビーズに加え
、室温で反応させた。 ３び分後にビーズに遠心作用を加え「前述の如くＰ聡で
２度洗った。 ビーズを５の乙の０．００８ＭトリスＨＣぞ，ｐＨ８，
ら に再浮遊させた。ビーズのケィ光を、励起光に対し
ては４７３フィルターを使い、照射光に対しては２ＡＩ
２フィルターを使ってターナーフイルター（Ｔｕｍｅｒ
Ｆｉｌにｒ）ケィ光光度計で測定した。試験サンプルの
ケイ光からプランクサンプル血清に曝露されず、しかし
ケイ光抗体と反応されたビーズを含むサンプルのケイ光
を減じたものを第２図に示される如く対数一対数方眼紙
で１ｇＧ濃度（ムタ）に対してプロットした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２における、 馨鯵芋…孝三Ｅ男手壬業と抗原濃度との関係を示すグラ
フである。 第２図は、実施例３における、試験サンプルのケイ光か
ら対照サンプルのケィ光を減じたものと抗原濃度との関
係を示すグラフである。 Ｆ９Ｇ−１ 円６胸麓

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 改良免疫ケイ光分析法において、サイズが約０．１
   〜１０ミクロンである複数の水不溶性親水性高分子粒子
   を提供し； これに、測定対象である未知免疫系反応体
   と免疫学的に関連のある免疫系反応体を共有結合させ；
   該未知物と免疫学的に関連のある適量のケイ光標識付
   き免疫系反応体を提供し； 水溶液中の該粒子を、該未
   知物の濃度に比例した量の該標識付き免疫系反応体と免
   疫学的に結合させ； 該粒子を該水溶液から分離し；そ
   して、 該粒子の水浮遊液のケイ光をケイ光光度計で測
   定して、該未知免疫系反応体の濃度を測定できる情報を
   得る；ことからなる分析法。