JPS6248193B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血しようまたは血清よりリポ蛋白質
を選択的に除去する方法に関する。 より詳細には、本発明は次の二つの方法に関す
る。 (1) 血しようまたは血清よりリポ蛋白質を選択的
に分離する方法であつて、水に不溶で、親水性
で、水で膨潤しうるマトリツクスを包含し、該
マトリツクスには多数のスルフエート基が化学
的に結合しており、陽イオン交換体のイオン交
換容量を該スルフエート基により提供してお
り、このスルフエート基の数は交換体が0.2〜
1.1ミリ当量／ｇのスルフエート化度を有する
ようにするのに充分の数である、陽イオン交換
体を詰めたカラムに２価陽イオンを含有する血
しようまたは血清を通し、該交換体に結合した
超低密度リポ蛋白質および低密度リポ蛋白質を
血しようまたは血清から分離する工程からな
り、該マトリツクスは架橋された炭水化物、架
橋された多糖類またはそれのヒドロキシル基含
有誘導体、または自然のままのせんい状の、微
粒状の、微結晶状の、または再生された形のい
ずれかの架橋セルローズか、あるいは多数のヒ
ドロキシ低級アルキル基が化学的に結合してい
る架橋された炭水化物、架橋された多糖類また
はそれのヒドロキシル基含有誘導体、または、
自然のままのせんい状の、微粒状の、微結晶状
の、または再生された形のいずれかの架橋セル
ローズのいずれかを含むものであることを特徴
とする方法。および (2) 血しようまたは血清よりリポ蛋白質を選択的
に分離する方法であつて、水に不溶で、親水性
で、水で膨潤しうるマトリツクスを包含し、該
マトリツクスには多数のスルフエート基が化学
的に結合しており、陽イオン交換体のイオン交
換容量を該スルフエート基により提供してお
り、このスルフエート基の数は交換体が0.2〜
1.1ミリ当量／ｇのスルフエート化度を有する
ようにするのに充分の数である、陽イオン交換
体を詰めたカラムに２価陽イオンを含有する血
しようまたは血清を通し、該交換体に結合した
超低密度リポ蛋白質および低密度リポ蛋白質を
血しようまたは血清から分離し、次いで超低密
度リポ蛋白質および低密度リポ蛋白質が分離さ
れた後の残りの血しようまたは血清を、前記の
陽イオン交換体において、そのスルフエート化
度が1.1〜4.0ミリ当量／ｇの範囲である陽イオ
ン交換体を詰めたもう一つのカラムに通し、該
交換体に結合した高密度リポ蛋白質を血しよう
または血清から分離する工程からなり、該マト
リツクスは架橋された炭水化物、架橋された多
糖類またはそれのヒドロキシル基含有誘導体、
または自然のままのせんい状の、微粒状の、微
結晶状の、または再生された形のいずれかの架
橋セルローズか、あるいは多数のヒドロキシ低
級アルキル基が化学的に結合している架橋され
た炭水化物、架橋された多糖類またはそれのヒ
ドロキシル基含有誘導体、または、自然のまま
のせんい状の、微粒状の、微結晶状の、または
再生された形のいずれかの架橋セルローズのい
ずれかを含むものであることを特徴とする方
法。 ここ１世紀におよんで、血しようまたは血清中
に存在する種種の蛋白質を分画して分けること
は、研究者にとつて著しい興味の的であつた。研
究の進歩の結果、蛋白質種のうちのいくらかは、
たとえば、フイブリノーゲン、ガンマー−グロブ
リンおよびアルブミンは高度の純度をもつて産業
的に採取されうるようになつた。しかし、血しよ
うまたは血清の蛋白質のうちのひとつを分離しよ
うとする企ては、いずれも種種の技術上の問題に
よつて妨げられている。そして、共通な問題は、
少なからぬ量の脂質蛋白質の存在である。これら
は選択的に除去するのが困難であり、少なくと
も、大規模の操作においてそうである。 イオン交換体は、交換体と、交換体に結合させ
それにより液体より分離しようとする物質との間
の荷電−荷電交互作用に基づいて作用する。予想
されることとして、類似の荷電の多数の種が存在
すると、特定の種がイオン交換体により選択的に
除かれそうにない。全く予期されなかつたことと
して、我我は、イオン交換容量がスルフエート基
で与えられる陽イオン性イオン交換体は、それら
を２価陽イオンたとえばマグネシウム、カルシウ
ムおよびマンガンのような２価陽イオンを含有す
る溶液と平衡させそして同じ２価陽イオンを血清
に添加する時に、すべての他の血清蛋白質の存在
で、リポ蛋白質と選択的に結合することを見出し
た。血清に必要とされる陽イオンの濃度は、スル
フエート化されるマトリツクスの性質、スルフエ
ート化の程度、陽イオンの種類、血清のPHで変化
する。なるべくは、濃度は0.05から1.0Mまでの
範囲とし、PHは６から８までの範囲とする。適当
なパラメーターは、つぎの諸例に示す。 血しようリポ蛋白質濃度の上昇は、第１次の疾
患たとえば、糖尿病、甲状腺機能低下症、重篤な
蛋白尿症および障害性黄だんに伴う２次的現象と
あらわれる。さらに、過去四半世紀を超えるデー
タの集積は、血しようリポ蛋白質の濃度と臨床的
な冠状動脈疾患との直接的関連性を示唆してい
る。 血しよう中のリポ蛋白質は３つの主要な分画を
包含している。それらは非常に低密度（VLDL）
の分画、低密度（LDL）の分画および高密度
（HDL）の分画である。冠状動脈疾患の患者に
は、これらのうちの第２のものが高濃度に認めら
れている。本発明のこの背景についてのより完全
なレビユーは、U.S.A.John Wiley ＆ Son社
1972年刊、Gary J.Nelson編、“Blood Lipids
and Lipoprotein Quantitation Composition and
Metabolism”に見出しうる。毎年の定期的健康
診断に、このような異常を試験するための簡単な
方法は非常に望まれる。警告を受けた患者は、冠
状動脈疾患にかかる可能性を減少させるために、
望ましからぬ濃度を減少させるのに、食事の変化
のような改良の手段をとりまたは薬を飲むことを
始めうる。血液中の脂質蛋白質分画の相対濃度を
測定するためにこれまでに用いられて来た方法
は、面倒な沈殿および遠心の操作を含み、定量的
な分離は、満足という程度には及ばなかつた。た
とえば、Journal of Lipid Research 11巻、1970
年、583−595頁をみよ。 本発明の目的は、これらの欠点をいくらかでも
改良しようとするかまたは少なくとも、一般人に
有用な望ましい材料を供給しようとすることであ
る。 従つて、本発明は、広い意味で、血しようまた
は血清よりリポ蛋白質を選択的に分離する方法に
存し、つぎの段階を包含する。つまり、２価陽イ
オンを含有する血しようまたは血清と、水不溶性
で、親水性で、水膨潤性のマトリツクスを包含す
る陽イオン性イオン交換体とを合せる。ここでマ
トリツクスには多数のスルフエート基が化学的に
結合しており、交換体のイオン交換能は、このス
ルフエート基が提供する。マトリツクスは、架橋
炭化水素、架橋多糖類またはそれらのヒドロキシ
ル基含有誘導体、または自然のままの繊維状か、
微粒状か、微晶状かまたは再生された形のいずれ
かの架橋セルローズか、多数のヒドロキシ低級ア
ルキル基がそれらの炭水化物、多糖類、多糖類誘
導体またはセルローズに結合しているところの、
架橋炭水化物、架橋多糖類またはそれらのヒドロ
キシル含有誘導体、または、生来の繊維状か、微
粒状か、微晶状かまたは再生された形の架橋セル
ローズとする。ついで該交換体に結合した脂質蛋
白質を採取するかまたは脂質蛋白質の除かれた血
しようまたは血清の残留物を採取するか、または
該抽出リポ蛋白質および該血清または血しよう残
留物の双方を採取する。 イオン交換体およびそれらの製造方法は、本願
と同日に出願する日本特許願明細書No. に
記載されている。本発明の有利な具体例を記載し
て本発明をより完全に理解しうるようにする。 例 １ イオン交換体の製造 Ａ ヒドロキシプロピルセルローズの製造 粒状の再生セルローズ（20ｇ）を、冷30％
（重量／容量）の水酸化ナトリウム水溶液（30
c.c.）、２c.c.のエピクロルヒドリン（10％容量／
重量、セルローズ基準）および10c.c.のプロピレ
ンオキサイド（50％容量／重量、セルローズ基
準）と混合する。混合物は、セルローズが膨潤
を完了しすべての液体が吸収されてしまうまで
十分にかきまぜる。湿つた粉末状セルローズは
ついで容器中におき栓をしてさらにかくはんす
ることなく60℃に加熱する。２時間後反応容器
は室温に冷却し、開口し、内容物を大量（500
c.c.）の水にあける。ヒドロキシプロピルセルロ
ーズの粒子は、ブツフナーロ斗で集め、水洗
し、最終的には、メタノールによる溶媒交換で
乾燥し、ついで減圧60℃で乾燥する。生成物
（20ｇ）はデシケーター中に貯蔵し、スルフエ
ート化に備える。蒸留水中での膨潤床容量は
9.5c.c.／ｇである。 Ｂ ヒドロキシプロピルセルローズスルフエート
（Na⁺形）の調製 乾燥ヒドロキシプロピルセルローズ（１
ｇ）、ピリジン−３酸化イオウ（１ｇ）および
乾燥ピリジン（10c.c.）を、乾燥管で保護した３
角フラスコ中におき、油浴上80℃で1.5時間加
熱する。反応中フラスコは時時手で振り冷却し
て反応混合物を脱イオン水200c.c.にあける。ス
ルフエート化生成物はガラスフイルター上に集
め、脱イオン水でさらに洗う。ピリジニウム塩
をナトリウム塩に変えるには、1M塩化ナトリ
ウム中で0.1M水酸化ナトリウムで滴定し、フ
エノールフタレイン終点とする。そしてふたた
び集め、フイルター上で洗い、４℃で湿つたま
ま貯蔵する。 例 ２ 置換度の測定 スルフエート化の程度（2.37ミリ当量／ｇ）
は、スルフエート化セルローズより脱イオン水で
おきかえられたピリジニウムイオンを中和するに
用いた0.1水酸化ナトリウムの容量（31.2c.c.）よ
り、反応によるセルローズの収率100％を仮定し
て得られた値である。この値の真実性は、調製を
複数で行ない、最後に生成物の乾燥重量を測定す
ることで確かめられた。反応に使用するピリジン
３酸化イオウの量を変化することにより、イオン
交換容量を０から4.0ミリ当量／ｇに変化させう
る。 例 ３ リポ蛋白質を選択的に除去するためのイオン交
換体の使用 例1Bに記載のように製造のヒドロキシプロピ
ル再生セルローズ−８−50スルフエート（１ミリ
当量／ｇ）をイオン交換体としてカラムに詰め
る。0.01Mの重炭酸ナトリウムを含有しPH7.4に
調整した0.5Mの塩化マグネシウムの１カラム容
量で平衡させる。血清を1M塩化マグネシウムで
１対１に希釈し0.1M水酸化ナトリウムでPH7.4に
調整してカラムに通し、リポ蛋白質の２つの分
画、つまり非常に低密度のリポ蛋白質（VLDL）
および低密度のリポ蛋白質（LDL）を選択的か
つ定量的に除く。第３のリポ蛋白質分画つまり高
密度リポ蛋白質（HDL）を含む他の蛋白質はカ
ラムをそのまま通過する。カラムを平衡さすのに
最初に使用した0.5M塩化マグネシウム（PH7.4）
のさらに１カラム容量で洗い出す。カラムに結合
したリポ蛋白質（VLDLおよびLDL）は、塩化ナ
トリウム0.25Mおよびくえん酸ナトリウム0.25M
を含有し、1M塩酸でPH7.4に調整した溶液で溶出
する。（別様には、これらのリポ蛋白質は1M塩酸
ですみやかに溶出しうる）。溶出リポ蛋白質、免
疫電気泳動およびアガロース電気泳動によると、
他の血清蛋白質が混在しないことが分る。同様に
カラムをそのまま通り抜けた血清蛋白質は、免疫
電気泳動およびアガロース電気泳動でVLDLおよ
びLDL不含のことが分る。 より高度に置換されたイオン交換体たとえば３
−５ミリ当量／ｇの用いるとHDL分画もまたカ
ラムに留保される。しかし血清蛋白質の分画に面
倒をおこすのはLDLおよびVLDLであるので、こ
れはふつうは不要である。血清がイオン交換体カ
ラムを通過する流速は、リポ蛋白質が、５c.c.の血
清より15分内に除かれるようにするが、さらによ
り大きなカラムを用いて良好な流れ特性を実現し
うる。つまり、血清よりリポ蛋白質成分を選択的
に除くための従来法からはまつたく予期されなか
つたこととして、本発明のイオン交換体の使用で
は定量的にそして迅速に実施しうる。 それで、このような操作を最初に用いると、他
の血清蛋白質の分離が容易となる。たとえばIgG
を血清より調製するには、QAE−Sephadexのカ
ラムに蛋白質を吸着させIgGはそのままカラムを
通過させる（Protides of the biological
fluids；Proceeding of the 18th Colloquium、
1969、511から515頁）。しかし、カラムに通す希
釈血清の容量はカラムの容量の75％を超ええな
い。さもないと、LDLおよびVLDLもまたカラム
を通り抜けてIgGを汚染する。スルフエート化イ
オン交換体のカラムでLDLおよびVLDLを除いて
から、上記文献に示した概要によりIgGを調製す
ると、QAE−Sephadexカラムに３倍に及ぶ血清
を加えても、IgGを汚染されずに分離しうる。 例 ４ 高められたリポ蛋白質含量の試験 １夜絶食した正常の被検者から血液試料を採取
する。血清は３または４日以内に使用する。 カラムの流出液500マイクロリツトルを用い、
３c.c.のエタノール性KOH（88c.c.のエタノールに
12c.c.の50％KOH添加）と50℃で30分間反応させ
たものについてコレステロールを測定する。反応
後1.5c.c.のヘキサンおよび0.5c.c.の水を加え、1000
マイクロリツトルの有機層試料を分け蒸発乾こす
る。抽出コレステロール試料は１c.c.のLieberman
Burchard試薬（20c.c.の無水酢酸、１c.c.の硫酸、
10c.c.の酢酸）と反応させ、30分してから１c.c.のキ
ユベツト中で620nｍで光学密度を測定する。同
様な条件で標準曲線を作製する。この方法を血清
コレステロールの測定に使用する場合、50マイク
ロリツトルの血清試料で十分である。 ゲル電気泳動 ポリアクリルアミドデイスクゲル
電気泳動をつぎのように実施する。 分離用のゲルは3.75％のアクリルアミド（PH
8.9）を含有する。他方上層ゲルは2.5％のアクリ
ルアミド（Hz6.7）を含有する。試料用のゲルは
用いず、Sudan black Ｂであらかじめ染色した
試料を30％スクローズ中に加え濃縮ゲルに直接に
施す。電気泳動のあと、ゲルは、７％酢酸中１％
アミドブラツクで重ねて染色する。 この試験方法は、図面によりより完全に理解し
うるであろう。 第１図は、あとから示す例５のスルフエート化
イオン交換体より溶出される蛋白質分画（横軸は
分画番号）のコレステロール含量のプロツトであ
る。 第２図は、あとから示す例５のスルフエート化
イオン交換体より溶出される３つの蛋白質ピーク
の電気泳動パターンである。各対の右側のゲルは
蛋白質を染色し、左側のゲルでは脂質を染める。 第３図は、HDL（P₂）を含有する蛋白質のピー
クについて実施した分析用超遠心機で得られるシ
ユリーレンパターンであり、横軸はcm単位の中心
部からの距離を示す。 第４図は、あとから示す例６のスルフエート化
イオン交換体より溶出される蛋白質分画のコレス
テロール含量のプロツトである。この交換体は、
第１図のものよりスルフエート化の程度が少な
い。 第５図のａおよびｂは、イオン交換体のスルフ
エート化の程度の関数としての、イオン交換体の
HDL容量（コレステロールミリグラム／スルフ
エート化マトリツクスグラム）およびVLDL＋
LDL容量（コレステロールミリグラム／スルフ
エート化マトリツクスグラム）をプロツトしたグ
ラフである。これは例７を参照とする。 例 ５ ヒドロキシプロピルセルローズより製造の、
3.7ミリ当量／ｇのスルフエート含量のスルフエ
ート化イオン交換体をカラム（８×１cm）に詰
め、25c.c.の0.5MのMgCl₂で平衡させる。２c.c.の
ヒト血清を、MgCl₂濃度0.5Mとし、カラムに加
える。ついで25c.c.の0.5M MgCl₂で洗い、ついで
10c.c.の0.05M MgCl₂で洗う。カラムに試料を加
えると、半透明の樹脂は透明となる。これは、
VLDLおよびLDLの結合によることがあとから分
つた。結合蛋白質は60c.c.の0.1M NaClおよび60c.c.
の1M NaClを用い、直線的に濃度を増加させて
溶出する。５c.c.宛集める。500マイクロリツトル
試料を各試験管より採取し、リポ蛋白質を分析す
る手段として、コレステロール含量を測定する。
（第１図） 非結合蛋白質ピーク１（P₁）はコレステロール
を含有しない。しかし、ピーク２および３の蛋白
質はコレステロールを含有する。ピーク２ではピ
ーク３に比して蛋白質とコレステロールとのより
高い比率なのでピーク２はHDLを表わすように
みえる。ピーク１，２および３を含有する各溶液
は、0.02M Tris／HCl（PH7.7）に対して真空透
析する。Sudan black Ｂで予め染色しておいて
からアクリルアミドゲル電気泳動に処する。電気
泳動のあと、ゲルはアミドブラツクで重ねて染
め、非リポ蛋白質のバンドを検出する（第２
図）。 ピーク２の材料は、脂質染色および蛋白質染色
の両方で染まる単一バンドで、このバンドの易動
度は、HDLのそれに一致する。ピーク３は２個
の蛋白質バンドを含有する。２つとも脂質染色と
反応する。これらのバンドの易動度はLDLおよ
びVLDLのそれに相当する。ピーク１は、リポ蛋
白質成分を除いては正常の血清蛋白質を含有す
る。 ピーク２の材料を１％NaClを含有するPH7.7の
0.02M Tris／HClに対して透析し、超遠心すると
単一の対称の境界面を示す（第３図）。この境界
面のＳ_20W値（4.6S）は、HDLのそれ（4.9S）符
合する。 例 ６ 上記のようにクロマトグラフを行なうが、スル
フエート化の程度の少ない（0.5ミリ当量／グラ
ム）のイオン交換体を使用する。ひとつだけのリ
ポ蛋白質ピークがカラムに結合する。（第４図） 非結合蛋白質のピークをゲル電気泳動にかけて
みると、非リポ蛋白質に加えてHDLを含有して
いる。電気泳動からさらに、単一の結合ピークは
LDLおよびVLDLのみからなり立つことが分る。 例 ７ 例６に上記した方法にもとづいて、10c.c.の血清
を、15×１cmのカラム（0.5ミリ当量／ｇ）上で
２つの分画に分ける。非結合蛋白質（VLDLおよ
びLDL以外の血清蛋白質）はMgCl₂で洗い流され
る。結合蛋白質（LDLおよびVLDL）は1M NaCl
で溶出される。 HDLおよびLDL＋VLDLのの結合に及ぼすスル
フエート化の程度の効果を測定するために、0.1
から3.75ミリ当量／ｇの１連８個のイオン交換体
を調製する。Pasteurピペツトより作つたカラム
にSP−SEPHADEX（2.75ミリ当量／ｇ）を詰め
る。0.5MのMgCl₂で平衡させ同じレベル（カラ
ム容量1.6c.c.）とする。 上記のように製造のLDL＋VLDL試料は生理食
塩水に対して透析してついでMgCl₂を0.5M濃度
とする。過剰の（この溶液で飽和する量の約２
倍）を９個のカラムのそれぞれに施す。カラムは
20c.c.の0.5MのMgCl₂で洗い結合したLDLおよび
VLDLのすべてを除去する。結合したLDLおよび
VLDLはついで６c.c.の1MのNaClで溶出する。こ
の溶液の280nｍの光学密度でLDLおよびVLDLに
対するイオン交換体の容量で表わす。 イオン交換体を再平衡させたあとHDLおよび
血清の非リポ蛋白質分画をあわせたものを同様に
カラムに施す。つまりイオン交換体はHDLで飽
和し、結合したHDLは1MのNaClで溶出する。第
５ａ図は、HDLに対するイオン交換体の能力を
そして第５ｂ図はLDLおよびVLDLに対するイオ
ン交換体の能力を、スルフエート化の程度の関数
として表わす。１ミリ当量／ｇ以下ではHDLは
まつたく結合しないことが分る。しかし、この値
を超えると、HDLの結合はスルフエート化の程
度の増加にともなつて比例して増加する。他方
LDLおよびVLDLの結合は０から１ミリ当量／グ
ラムまでは非常にすみやかに増加し、１ミリ当
量／グラムを超えると、スルフエート化の程度に
ほとんど無関係になる。これらの結果から、上記
第１の実験で使用の樹脂（3.7ミリ当量／グラ
ム）がHDLおよびLDLおよびVLDLの双方を結合
し、他方、第２の例で使用のイオン交換体（0.5
ミリ当量／グラム）はLDLおよびVLDLを結合す
ることが分る。さらにSP−SEPHADEX（第５
図）は、これらの条件のいずれにおいても蛋白質
を結合しないことが分る。 本発明に準じて製造した、選択したスルフエー
ト化イオン交換体の容量測定の結果を表１に示
す。

【表】

【表】 ス
低密度リポ蛋白質を超遠心で除いた血清につい
てもこの方法を反復してみる。これらの条件で
は、他の血清蛋白質はいずれも結合しないので、
HDLに対するイオン交換体の容量が分る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例５のスルフエート化イオン交換体
より溶出される蛋白質分画のコレステロール含量
をプロツトしたものである。第２図は、例５のス
ルフエート化イオン交換体より溶出される３つの
蛋白質ピークの電気泳動のパターンである。各対
の右側Ｐは蛋白質について染色し、左側Ｌは脂質
について染色してある。第３図は、HDL含有蛋
白質ピーク（P₂）について分析用超遠心機による
シユリーレンパターンである。第４図は、例６の
スルフエート化イオン交換体より溶出される蛋白
質分画のコレステロール含量をプロツトしたもの
である。第５ａ図および第５ｂ図は、イオン交換
体のスルフエート化の程度の関数としての、
HDLおよびVLDL＋LDLに対するイオン交換体の
容量を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血しようまたは血清よりリポ蛋白質を選択的
   に分離する方法であつて、水に不溶で、親水性
   で、水で膨潤しうるマトリツクスを包含し、該マ
   トリツクスには多数のスルフエート基が化学的に
   結合しており、陽イオン交換体のイオン交換容量
   を該スルフエート基により提供しており、このス
   ルフエート基の数は交換体が0.2〜1.1ミリ当量／
   ｇのスルフエート化度を有するようにするのに充
   分の数である、陽イオン交換体を詰めたカラムに
   ２価陽イオンを含有する血しようまたは血清を通
   し、該交換体に結合した超低密度リポ蛋白質およ
   び低密度リポ蛋白質を血しようまたは血清から分
   離する工程からなり、該マトリツクスは架橋され
   た炭水化物、架橋された多糖類またはそれのヒド
   ロキシル基含有誘導体、または自然のままのせん
   い状の、微粒状の、微結晶状の、または再生され
   た形のいずれかの架橋セルローズか、あるいは多
   数のヒドロキシ低級アルキル基が化学的に結合し
   ている架橋された炭水化物、架橋された多糖類ま
   たはそれのヒドロキシル基含有誘導体、または、
   自然のままのせんい状の、微粒状の、微結晶状
   の、または再生された形のいずれかの架橋セルロ
   ーズのいずれかを含むものであることを特徴とす
   る方法。 ２ 血しようまたは血清よりリポ蛋白質を選択的
   に分離する方法であつて、水に不溶で、親水性
   で、水で膨潤しうるマトリツクスを包含し、該マ
   トリツクスには多数のスルフエート基が化学的に
   結合しており、陽イオン交換体のイオン交換容量
   を該スルフエート基により提供しており、このス
   ルフエート基の数は交換体が0.2〜1.1ミリ当量／
   ｇのスルフエート化度を有するようにするのに充
   分の数である、陽イオン交換体を詰めたカラムに
   ２価陽イオンを含有する血しようまたは血清を通
   し、該交換体に結合した超低密度リポ蛋白質およ
   び低密度リポ蛋白質を血しようまたは血清から分
   離し、次いで超低密度リポ蛋白質および低密度リ
   ポ蛋白質が分離された後の残りの血しようまたは
   血清を、前記の陽イオン交換体において、そのス
   ルフエート化度が1.1〜4.0ミリ当量／ｇの範囲で
   ある陽イオン交換体を詰めたもう一つのカラムに
   通し、該交換体に結合した高密度リポ蛋白質を血
   しようまたは血清から分離する工程からなり、該
   マトリツクスは架橋された炭水化物、架橋された
   多糖類またはそれのヒドロキシル基含有誘導体、
   または自然のままのせんい状の、微粒状の、微結
   晶状の、または再生された形のいずれかの架橋セ
   ルローズか、あるいは多数のヒドロキシ低級アル
   キル基が化学的に結合している架橋された炭水化
   物、架橋された多糖類またはそれのヒドロキシル
   基含有誘導体、または、自然のままのせんい状
   の、微粒状の、微結晶状の、または再生された形
   のいずれかの架橋セルローズのいずれかを含むも
   のであることを特徴とする方法。