JPS625128B2

JPS625128B2 -

Info

Publication number: JPS625128B2
Application number: JP53020402A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Suzuki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-02-25
Filing date: 1978-02-25
Publication date: 1987-02-03
Also published as: JPS54113413A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアロエより分離できる新規物質アロク
チンＡに関する。本発明者は、アロエより次の特性を有するアロ
クチンＡを分離し、この新規物質が種々の生理活
性を有しており、癌、炎症、火傷、皮膚病等の医
薬としての使用が期待できることを見出し本発明
を完成するに至つた。 (1) 分子量：1.8×10⁴ (2) 構造：蛋白と糖の比が約８対２（重量）であ
るグリコプロテイン (3) ソデイムドデシルサルフエート存在下に
おけるポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で単
一バンドを与え、これを２−メルカプトエタノ
ールによりＳ−Ｓ結合を切断した場合は二バン
ドを与える。 (4) リンパ球幼若化作用（mitogenic activity）
及びリンパ球膜流動性促進作用を有する。 (5) 赤血球及び腫瘍細胞凝集活性を有する。 (6) 血清蛋白の或る種蛋白と反応しアガロース平
板上で沈降線を形成する作用を有する。 (7) 補体第３成分活性化作用を有する。古くからアロエは、薬用植物として知られてお
り、日本薬局方にもアロエ末、アロエエキスが集
録されている。これらの主成分は低分子物質であ
り、本発明のアロクチンＡはこれら公知の低分子
物質とは異なる高分子物質、グリコプロテインで
ある。一方、植物成分コンカナバリンＡ
（ConcanavalinA）等公知のレクチン（Lectin）
のいずれとも、本発明のアロクチンＡは、分子
量、ソデイウムドデシルサルフエート（以
下、SDSという）−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動上の特性及び前記本発明のアロクチンＡの有
する生理活性の点で異なる。さらに、アロエの中
に制癌活性を有する成分があることは知られてい
るが、純粋な形で分離された例はなく、グリコプ
ロテインが分離されたこともない。本発明のアロクチンＡはユリ科のアロエ
（Aloe）属植物例えばキダチアロエ（Aloe
arborescens MILL）、ソコトラアロエ（Aloe
perryi BAKER）、キユラソウアロエ（Aloe
barbadensis MILLER）、ケープアロエ（Aloe
forox MILLER）等（本明細書中でアロエとい
う）より分離でき、またその葉、幹、根等地上
部、地下部いずれからも分離できる。その分離方
法の一実施例を次に述べる。キダチアロエ（Aloe arborescens MiLL）の
葉１Kgをよく破砕後ガーゼを用いてジユースを分
離した。10000回転30分間の遠心分離操作で夾
雑、粗大物質を沈殿除去し上清を分離した。０−
40％硫安分画に付し、沈殿物を分取し、0.05M炭
酸−重炭酸緩衝液（PH9.5）を加え、透析、脱塩
し、ついで凍結乾燥法により濃縮した。なおこのようにして得られた透析処理物（以下
AS−40という）は赤血球凝集活性を有してい
た。AS−40を炭酸−重炭酸緩衝液に溶解（PH
9.5）し、ついで1M酢酸を加えることによりPHは
4.4に調整した。遠心分離（10000回転、20分）操
作で上清液（酸性Supという）と沈殿物（酸性
Pptという）を、分離した。酸性Pptよりも酸性
Sup中により高い赤血球凝集活性が見出された。
リンパ球幼若化活性はPptにのみ認められた。酸性Pptを凍結乾燥後、0.05M燐酸緩衝液（PH
8.0）に溶解し、フアルマシア社製架橋デキスト
ランゲル、セフアデツクスＧ−200をカラム（1.5
×25cm）に詰め、同じ緩衝液で平衡にした後これ
に通液、溶出した。同一緩衝液を用い４℃、流速２ml／ｈの条件で
溶出を行ない、1.3ml単位で分取した。蛋白の溶
出曲線（A280ｍμ）を図１ａに示した。赤血球
凝集活性を斜線で表示した。V₀はボイドボリユ
ームを示す。赤血球凝集活性とリンパ球幼若化活性は、流出
開始後27.3ml〜44.2mlの分取区分であるＰ−２画
分のみ見出され、その前後の画分であるＰ−１と
Ｐ−３には該生理活性は見出されなかつた。Ｐ−
２画分が本発明のアロクチンＡを含む画分であ
る。Ｐ−１画分については再度セフアデツクスＧ−
200によるゲルクロマトグラフイーを行い更に精
製しＰ−１を得た。図１ａにおいて10.4ml〜18.2
mlの分取区分、Ｐ−１画分を濃縮し、0.05M燐酸
緩衝液（PH8.0）であらかじめ平衡化したセフア
デツクスＧ−200を1.5×25cmカラムに詰め、その
上に前記濃縮物をのせ、0.05M燐酸緩衝液（PH
8.0）で溶出した。上記同一の緩衝液で溶出し、
４℃、２ml／ｈの流速で1.3mlづつ分取した。結
果を図１ｂに示した。V₀はボイドボリユームを
示す。この画分からは何ら赤血球凝集活性は見出
されなかつた。Ｐ−２画分についても再度セフアデツクスＧ−
200によるゲルクロマトグラフイーを行い更に精
製した。図１ａにおいて分取した27.3〜44.2mlの
Ｐ−２画分をスペクトレイパーメンブレンテユー
ブ（Spectrum Medical Industries、Inc−Calf.
米国）で濃縮し（1.2mg）、あらかじめ0.05M燐酸
緩衝液（PH8.0）で平衡化したセフアデツクスＧ
−200を1.5×25cmカラムに詰め、その上に前記濃
縮物をのせ、0.05M燐酸緩衝液で溶出した。４
℃、２ml／ｈの流速で1.3mlづつ分取した。結果
を図１ｃに示した。赤血球凝集活性は斜線で表示
した。ここで精製された物質、Ｐ−２が本発明のアロ
クチンＡである。一方、酸性Supは凍結乾燥後、0.05M燐酸緩衝
液（PH8.0）４mlに溶解し、あらかじめ、0.05M
燐酸緩衝液（PH8.0）で平衡化したセフアデツク
スＧ−100（フアルマシア社製架橋デキストラ
ンゲル）を2.0×30cmカラムに詰め、その上に上
記溶液を流し、0.05M燐酸緩衝液で溶出した。溶出は同一緩衝液を用い４℃流速５ml／ｈの条
件下に行い、2.5mlづつ分取した。結果を図２に
示した。赤血球凝集活性を斜線で表示した。この凝集活
性はＳ−１画分の方にのみ見出され、Ｓ−２には
この生理活性は見出されなかつた。Ｓ−１画分は
再び同様にゲルクロマトグラフイーに付し精製し
活性物質Ｓ−１（アロクチンＢ）を得た。上記の実験より、本発明のアロクチンＡはセフ
アデツクスＧ−200によるゲルクロマトグラフイ
ーを、必要により前記生理活性を指標として、繰
返すことにより単離することができる。なお、簡便には糖又は蛋白によるアフイニテイ
ーカラムクロマトグラフイーにより、アロクチン
Ａを得ることもできる。以上の実験結果を表１に整理して示した。

【表】本発明のアロクチンＡはSDS−ポリアクリルア
ミド・ゲル電気泳動上特異性を示すことは次の実
験から理解できる。なお、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動分析は10％ゲルによるソデイウムドデシル
サルフエートを用いてウエバーとオスボーン法
（Weber、K.、and Osborn.M（1969）J.Biol.
Chem.244、4406−4412）に従つて行つた。ゲル
はクマシーブリリアンドブルー（Coomassie
brillant blue）で蛋白染色を行い、10％酢酸と10
％イソプロパノールの混合物で脱色した。 SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析実
験：Ｐ−１、Ｐ−２及びＳ−１についてSDS−ポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動分析を行つた。
0.1％SDSを含む0.1M燐酸緩衝液（PH7.2）中10％
ゲルを用いた。試料は２−メルカプトエタノール
処理したものと、処理しないものを用い、１％
SDS、10％グリセロール及び0.001％ブロムフエ
ノールを含む0.01M燐酸緩衝液（PH7.2）中で５
分間100℃に加熱した。得られたパターンを図３に示した。ａはＰ−１
を２−メルカプトエタノール処理したものと処理
しないものについて示したものであり、これは処
理、未処理同一結果を与えた。ｂはＰ−２を２−
メルカプトエタノール処理しないもの、ｃはＰ−
２を２−メルカプトエタノール処理したもの、ｄ
はＳ−１を２−メルカプトエタノール処理しない
ものを、ｅはＳ−１を２−メルカプトエタノール
処理したものを示す。図３より明白な如く、２−メルカプトエタノー
ル処理しないとＰ−１、Ｐ−２及びＳ−１は単一
バンドを与えた。一方、２−メルカプトエタノー
ル処理した場合はＰ−１は同一単一バンドを与え
るのに対し、Ｐ−２は二つの分離したバンドを与
えた。この二つのバンドに対応する物質はいずれ
もペプチドであり分子量に差があり、小さい方は
α、大きい方をβとする。Ｓ−１については２−
メルカプトエタノール処理物は、処理しない物と
同様単一バンドを与えるが、処理しないものに比
べ小さいバンド（γ）を与えた。本発明のアロクチンＡを特定する手段の一つと
しては本発明のアロクチンＡの有する他の特性を
有するものについてSDS−ポリアクリルアミド・
ゲル分析を行い、単一バンドを与え、ただし２−
メルカプトエタノール処理物について二バンドを
与えるかどうかチエツクする。前記同様のSDS−
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析実験をあ
る物質について行い、得られた結果と、この実験
と同条件下でのアロクチンＡのSDS−電気泳動分
析実験結果と比較し、同一かどうかをチエツク
し、全く同一であればその物質はアロクチンＡと
決めることができる。もちろん、ある物質につい
て前記SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
分析実験と全く同一条件で実験を行い、図３にお
けるＰ−２の結果と比べ同一であればその物質が
アロクチンＡであると決めることができる。本発明のアロクチンＡの分子量をSDS−ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動分析法による分子量
測定実験結果から求めた。分子量測定実験：２−メルカプトエタノール処理しない試料（Ｐ
−１、Ｐ−２及びＳ−１）のSDS−ポリアクリル
アミド・ゲル電動泳動分析から図４ａに示す如く
分子量既知の標準蛋白についてその分子量の対数
値と移動度の関係をプロツトし標準曲線を求め決
める。なお、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動分析実験は前記図３において記載の方法と同様
に行つた。下記標準蛋白標品（括弧内に分子量を
示す）を用い移動度と分子量の対数値の関係をプ
ロツトし図４ａに示した。チトロームＣ（12500）、キモトリプシノーゲン
Ａ（25000）、オブアルブミン（45000）、ボバイン
シーラムアルブミン（67000）。次に、Segrestらの方法（Jere P.Segrest and
Richard L.JacKson Methods in Enzymology
28、54−63、1972）に従い、各種濃度を有するゲ
ルによるSDSを用いたポリアクリルアミド・ゲル
電動泳動分析での分子量測定実験を行つた。結果
を図４ｂに示した。図４ｂにおいては次の如くで
ある。 ●−●：Ｐ−２ ○−○： α ▲−▲：Ｐ−１（β） ■−■：Ｓ−１ □−□： γ 以上の結果から分子量を下記を如く決めた。Ｄ−１：1.05×10⁴ Ｐ−２：1.8×10⁴（アロクチンＡ）Ｓ−１：2.4×10⁴（アロクチンＢ）２−メルカプトエタノール処理したＰ−２とＳ
−１のSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電動泳動
分析実験で得られる結果は、Ｐ−２については２
つのバンドに対応するα、β、及びＳ−１につい
て１つのバンドに対応するγの分子量を同様に決
めた。 α：7.5×10³ β：1.05×10⁴ γ：1.2×10⁴ サブユニツトの構造：Ｐ−１は２−メルカプトエタノール処理、未処
理関係なくSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動分析で同一単一バンドを与えた。従つて、Ｐ
−１はＳ−Ｓ結合により構成されるサブユニツト
を有しない。Ｐ−２は２−メルカプトエタノール未処理のも
ののSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電動泳動分
析では、1.8×10⁴の分子量を有する単一バンドを
与えるのに対し、２−メルカプトエタノール処理
物ではそれぞれ分子量7.5×10³と1.05×10⁴に対応
する位置に小さい方（α）と大きい方（β）のペ
プチドに対応する二つのバンドを与えた。これは
1.8×10⁴の分子量を有するＰ−２（アロクチン
Ａ）分子が一個のα−サブユニツトと一個のβ−
サブユニツトから構成していること、さらにこの
計二個のサブユニツトはＳ−Ｓ結合でアロクチン
Ａを構成していることを示す。さらに、抗血清＃513と＃533を用いたオクタロ
ニーテストの結果（図５ａ及び５ｂ参照）、Ｐ−
１とＰ−２には同じ抗原性があることがわかる。
故に、Ｐ−１は植物中ではＰ−２とは別個に単独
に存在するβ−サブユニツト鎖であると考えられ
る。２−メルカプトエタノール処理しないSDS−ポ
リアクリルアミド・ゲル電動泳動分析で、Ｓ−１
はほぼ2.4×10⁴の分子量の単一バンドを示すのに
対し、２−メルカプトエタノール処理したＳ−１
についての電気泳動分析ではほぼ1.2×10⁴の分子
量に対応する位置に単一バンドを与えた。このこ
とからほぼ2.4×10⁴の分子量を有するＳ−１分子
は二個のγ−サブユニツトからＳ−Ｓ結合で構成
され、その各々はほぼ1.2×10⁴の分子量のもので
あることがわかる。アロクチンＡ、アロクチンＢともにグリコプロ
テインであることはニンヒドリン反応が陽性であ
り、中性糖の呈色反応例えば、モリツシユ・ピア
ール反応が陽性であることから確認され、またア
ミノ酸分析においてアロクチンＡ，ＢともにＮ−
アセチルグルコサミンが証明された。定量分析結果から、Ｐ−１、Ｐ−２及びＳ−１
はそれぞれ24.9％、18.3％及び50％以上で糖を構
成していることが確かめられた。従つて本発明の
アロクチンＡは蛋白と糖の比が約８対２（重量）
であるグリコプロテインであることがわかる。次に示すアミノ酸分析実験結果より、アロクチ
ンＡは構成アミノ酸としてアスパラギン酸、グル
タミン酸等酸性アミノ酸を多量に含有しているこ
とがわかる。アミノ酸分析：Ｐ−１（β）、Ｐ−２（αβ）及びＳ−１（γ
_２）のアミノ酸組成を表２に示した。トリプトフ
アンは定量しなかつた。アスパラギン酸、グルタ
ミン酸等の酸性アミノ酸含量が大であり、メチオ
ニン及びヒスチジンの割合が低いのが特徴的であ
る。

【表】 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動から計算さ
れるβの分子量は10500である。一方、アミノ酸
分析によつて得られた分析値は表２のようであ
る。今βの最小構成アミノ酸であるメチオニンと
ヒスチジンの個数を１とすると他のアミノ酸の個
数は表２の括弧内の整数値となり、この整数値と
各アミノ酸の分子量とから計算されるβの分子量
は9392となり略々10500と一致しこのアミノ酸の
整数値及び、分子量10500は正しいといえる。同
様にしてＰ−２のSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動によつて計算される分子量18000、メチオン
を１として得られた各アミノ酸の個数とその分子
量から計算されるＰ−２の分子量は17038となり
よく一致する。このようにして得られたアミノ酸組成におい
て、α、β共に２個づゝの半シスチンを一分子内
に有している。これがＳ−Ｓ結合によつて結合
し、Ｐ−２（αβ）を作るものと理解出来る。なお、上記分析実験において、試料は真空密封
の管内で蒸留HCIを用い110℃、20時間加水分解
した。加水分解物のアミノ酸含量はスパツクマン
等の方法（Spackman、D.H.、Stein、W.H.、
and moore、S.（1958）Anal.Chem.30、1190−
1206）で日立アミノサンアナライザー（KLA−
3B）で分析計算した。システインとシスチンは
リユー等の方法（Liu、T.Y.、and Inglis A.S.、
“Methods in Enzymologry”ed、by Hirs、C.
H.W.、and TimaSkeff、S.N.、Acad、Press、
New York、New York、25、P.55、1972年）に
よるＳ−スルホシステインとして分析した。中性糖の総量はオルシノール−硫酸法
（Winzler、R.J.、“Method of Biochemical
Analysis”ed.by Glick、D.、Interscience、
New York、New York、Vol、、P.279、1956
年）により求めた。以上の実験はすべてのアミノ酸について分析し
たものでないので必ずしも正確ではないが、他の
結果と矛盾なく説明でき、この値は与えられた整
数値の10％程度の整数値をプラスマイナスする誤
差範囲内にあるものと考えられる。オークタロニーテスト：Ｐ−１、Ｐ−２及びＳ−１の同定のために二つ
の抗血清、抗血清＃513と抗血清＃533を用いてオ
ークタロニーテストを行つた。図５ａは抗血清＃513を使用したオークタロニ
ー免疫拡散ゲルのパターン図であり、中心の穴：
抗血清＃513、穴１：Ｐ−１（１mg／ml）、穴２：
Ｐ−２（１mg／ml）、穴３：Ｓ−１（１mg／ml）、
穴４：Ｓ−２（１mg／ml）である。Ｐ−１とＰ−２の沈降線は、共に互いに融合し
ている。Ｓ−１もＳ−２も沈降線は検出されなか
つた。すなわち抗血清＃513はＰ−１、Ｐ−２と
は反応するがＳ−１とは反応しない。図５ｂは抗血清＃533を使用したオークタロニ
ー免疫拡散ゲルのパターン図であり、中心の穴：
抗血清＃533、穴１：Ｐ−１（１mg／ml）、穴２：
Ｐ−２（１mg／ml）、穴３：Ｓ−１（１mg／ml）、
穴４：Ｓ−２（１mg／ml）Ｐ−１とＰ−２の沈降線は完全に融合している
が、Ｓ−１の沈降線はＰ−２のそれにスパーアウ
トしている。Ｓ−２については沈降線は検出されなかつた。
すなわち抗血清＃533はＰ−１、Ｐ−２及びＳ−
１と反応した。これらの結果からＰ−１とＰ−２は共通の抗原
性を有し、これはＳ−１のものとは異なることが
わかる。なお、一つの抗血清はAS−40に対するラビツ
トで作り、もう一つの抗血清は、アガロースゲル
平板でのAS−40と正常ラビツト血清との間で形
成された沈降線に対するラビツトで作つた。ラビ
ツトは２か月間１週間毎にほぼ１mgのAS−40の
エマルジヨンと生理食塩水でそれらを洗浄した後
の沈降線をカツトアウトするエマルジヨンとを投
与した。両方のエマルジヨンは完全フロインド
アドジユーバンド（極東製薬(株)製）を含んでい
る。得られた抗血清はそれぞれ抗−AS−40（抗
血清＃533）及び抗−PL（抗血清＃513）とし
た。なお、免疫電気泳動法はヒルシフエルドの方
法（Hirschfeld、J.（1960）Sci.Tools、７、
1825）により、又免疫拡散法はオークタロニー法
（Ouchterlony、O.（1953）Acta Path.MiCrobiol
Scand32、231−240）により実施した。本発明のアロクチンＡが赤血球凝集活性を有し
ていることは次の試験により確かめた。赤血球凝集活性試験：人、羊、ウサギ等の赤血球標品をＰ−２とＳ−
１は凝集せしめ、人のシステムにおける赤血球凝
集活性テストでＡ−Ｂ−Ｏ血液型特異性を示さな
かつた。主な実験は人赤血球を用いて行われた。
Ｐ−２、Ｐ−１は赤血球を0.1％トリプシンで処
理するとほぼ５倍にその凝集性を増大せしめた。
上記トリプシン処理人赤血球に対する最少赤血球
凝集量を表１に示してある。Ｓ−１は強い赤血球凝集活性を示し、Ｐ−２は
Ｓ−１のほぼ四分の一の赤血球凝集活性を示し
た。Ｐ−１と、Ｐ−２のサブユニツトβは赤血球
凝集活性を示さなかつた。赤血球凝集タイトレーシヨンはマイクロタイタ
ーイクイプメント（Cooke Laf.Prod.、
Virginia、米国）で２％生理食塩水の２％赤血球
サスペンジヨンを用いて実施された。0.14MNaCl
を含む0.01M燐酸緩衝液に溶かした試料（1.0
mg／ml）を段階的に倍数稀釈した。60分のインキ
ユベーシヨン後、凝集の程度は肉眼で見てわかる
程度に上昇した。タイター価をタイマー／mg蛋白
として測定した。本発明のアロクチンＡが腫瘍細胞凝集活性を有
することは下記の実験より確かめた。一定濃度のＰ−２をトリプシン処理をしたヒト
一定数（１×10⁵）赤血球に加えたときの凝集を
（＋）とした場合、肉眼的及び顕微鏡下で判定し
た各細胞の凝集価、Ｐ−２Ｓ−１ヒト赤血球〓〓 Mol＋4B 〓〓 P3HR−１〓〓 HNG−100 〓〓 NC−37 〓〓エーリツヒ腹水肝癌〓〓 AH−130 〃〓〓本発明のアロクチンＡがリンパ球幼若化作用を
有することは次の実験で確かめた。リンパ球幼若化作用：純粋な人リンパ球の調製はほぼ川口等の方法
（Kawaguchi、T.、Matsumoto、I.、and
Osawa、T.（1973）J.Biol.Chem.249、2786−
2792）によつた。人静脈血液をヘパリンで処理済みのシリンジに
入れ、ヘパライズドされた血液はグラスシリンダ
ーに移され、赤血球を底の方へ沈めた。白血球に
豊んだ血漿をとり出し、ガラス製遠沈管中次の溶
液の同量の上にのせた。 9.1ｇのフイコル（フアルマシア社製） 25mlのウログラフイン液（60％、シエーリング社
製） 125mlの２回蒸留した水 400ｇで20分間遠心分離を行つた。血清層とそのウログラフイン−フイコル層との
間にある白インターフエース層はアスピレーシヨ
ンで除去した。この層中のリンパ球の平均の割合
は98％以上であり、バイアビリテイはトリパンブ
ルーエキスクルージヨンテストにより90％と100
％の間であることがわかつた。リンパ球はその後
0.25％のボーバインシーラムアルブミンの
0.15M NaCl−5M燐酸緩衝液（PH＝７）で洗浄し
リンパ球幼若化試験のために用いた。リンパ球幼若化活性の測定法は次のように行つ
た。形態学上の試験ではギムザ染色した標本からト
ランスフオームした細胞の百分率を、試験標本当
りほぼ1000個の細胞を数えて、計算することによ
り行つた。〔³H〕チミジンのとりこみ実験では、各試験
管に１×10⁶のリンパ球を入れ〔³H〕チミジン
（2.0μＣ、ラジオケミカルセンター、英国）を加
え、更に試料（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｓ−１等）を加
え60時間インキユベートした。そして細胞を集
め、４℃の等張燐酸緩衝液（PH7.2）で３回洗滌
した。その後、1.5mlの冷却した５％TCA（トリ
クロル酢酸）次いで２mlの冷却したメタノールを
細胞ペレツトに加えた後、キヤリヤーの蛋白とし
て３％ボーバインシーラムアルブミン（BSA）
の一滴を加えた。沈殿物を“Manifold”Multiple
サンプルコレクター（Millipore）中のメンブ
ラン（CF／C2.5cm；ワツトマン社製）の上で洗
浄した。メンブランは乾燥後シンチレーシヨンバ
イアルに入れた。0.3mlのソルビライザー
（Soluene TM 100、Packard）を加えて37℃のイ
ンキユベーシヨンまたは55℃の２時間のインキユ
ベーシヨン後、５mlのシンチレーシヨン液（５ｇ
PPOと0.1ｇPOPOP／トルエン）を各バイア
ルに加えた。バイアルは４℃一夜保ち、次いでベ
ツクマンLS−200B液体シンチレーシヨンカウン
ターで計算した。人リンパ球のＰ−２及び酸性Pptを加えた培養
においては、形態学的にトランスフオームした形
体をもつ大きなリンパ球が、他の画分、Ｐ−１、
Ｓ−１及び無添加で培養した細胞の培養系と比較
して、多かつた。おおよそ1000の細胞を数えた場合、約70％のリ
ンパ球が72時間の培養後トランスフオームしてい
るのが観察された。このトランスフオームの率は
ほとんど陽性対照として使用されたPHA−Ｗと
同じであつた。供試幼若化物質の機能を〔³H〕チミジンのと
りこみ実験で示すためにリンパ球を酸性Ppt、Ｐ
−１、Ｐ−２、Ｓ−１、Ｓ−２等の標品の各量で
処理した。表１からわかるように、リンパ球幼若化活性は
酸性PptとＰ−２の両方に検出されたが、Ｐ−
１、Ｓ−１及びＳ−２には見出されなかつた。本発明のアロクチンＡがリンパ球膜流動性促進
作用を有することは次の実験より確かめた。Ｐ−２とFITC（Fluorecene.iso thiocyanate）
を結合し、次の細胞中で37℃５分 10分30分の
Incubatを行う。 patch−cap Formationを螢光顕微鏡下で観察
及び写真撮影を行つた。

【表】本発明のアロクチンＡが血清蛋白の或る種蛋白
と反応しアガロース平板上で沈降線を形成する作
用を有することは次の実験より確かめた。血清蛋白との反応性試験：アロエの粗抽出物の反応性をゲル拡散テスト
（オークタロニーテスト）により各種動物（人、
ウサギ、山羊、犬、猫、馬、豚、ラツト、胎児ラ
ツト、牛、胎児牛、へび、スツポン）の血清に対
して試験した。これら血清のうち10個の血清、及び卵黄はオー
クタロニーテスト反応陽性を示した。アロエの抽出物Ｐ−２は哺乳動物の血清のみな
らず、卵黄、魚、両性類、爬虫類の血清とも反応
した。すべての試料のなかで卵白のみが反応しな
かつた。さらにほとんどすべての血清及び卵黄について
二つ以上の沈降線が検出できた。Ｐ−１、Ｐ−２、Ｓ−１及びＳ−２について、
上記と同じ実験を行つた。図５ｃはＰ−２と免疫していない動物の血清蛋
白との免疫拡散平板による反応結果のパターン図
である。中心穴、正常ウサギ血清；穴１、Ｐ−１（１
mg／ml）；穴２、Ｐ−２（１mg／ml）；穴３、Ｓ
−１（１mg／ml）；穴４、Ｓ−２（１mg／ml）。Ｐ−２と人血清蛋白間の沈降反応を示す二つの
沈降線が観察される。すなわち、Ｐ−２のみ人血
清蛋白と反応し、二本の沈降線が検出された。どの種類の血清蛋白がＰ−２と反応するかを決
定するために人血清を用いて免疫電気泳動を行つ
た。図５ｄは人血清のα_２−マクログロブリンの免
疫電気泳動パターン図である。ベロナール緩衝液
（PH＝8.6、μ＝0.05）中で1.4％アガロースを用い
て行つた。右が陽極であり、左が陰極である。沈
降線はウサギ抗−人血清（上部）、ウサギ抗−人
α_２−マクログロブリン（下部）、及びＰ−２
（中部、矢印）に対して形成された。免疫電気泳
動パターンによるとＰ−２（矢印）に対する人血
清蛋白の沈降線の電気的移動度は完全にα_２−マ
クログロブリンのそれと一致していることがわか
る。図は上から下へ；穴１と２、人血清；溝ａウサ
ギ抗−人血清；溝ｂ、0.05M燐酸緩衝液に溶かし
たＰ−２溶液（300μｇ／ml）；溝ｃ、ウサギ抗
−α_２−マクログロブリン。すなわち、α_２−マ
クログロブリンはＰ−２と反応した血清蛋白の一
つであつた。（図５ｄ参照）。本発明のアロクチンＡが補体第三成分（C₃成
分）活性化作用を有することは次の試験により確
かめた。Ｐ−２による血清補体成分（補体第三成分、
C3）活性化試験： C3成分又はC3プロアクチベーターが活性化さ
れるとき、免疫電気泳動移動度に変化がみられ
C3成分（β1A／β1C）がβ領域へ移動する。C3
プロアクチベーターの免疫沈降線はアガロース平
板電気泳動におけるβ領域にみられ、またこれが
活性化されるとγ領域に移動する。図５ｅと５ｆはＰ−２を１時間32℃でインキユ
ベートした人血清のC3成分とC3プロアクチベー
ターの免疫電気泳動移動度を示す。図５ｅは、Ｐ−２を加えインキユベートした人
血清中のC3の免疫電気泳動のパターン図であ
る。試験方法は本実験においては右が陰極、左が
陽極とし、それ以外は図５ｄで記載したと同様の
方法で行つた。沈降反応はウサギ抗−人C3（β
1C／β1A）血清に対して行つた。記載の穴の
各々は人血清１mlと300μｇ／mlＰ−２溶液１ml
（穴１）、と0.85％生理食塩水（穴２）より成る試
料５μを含む。図５ｆはＰ−２を加えインキユベートした人血
清中のC3プロアクチベーターの免疫電気泳動の
パターン図である。図５ｅで述べたと同様の方法
で実験を行つた。沈降反応はウサギ抗−人C3プ
ロアクチベーターに対して行われた。穴１，２は
それぞれ図５ｅにおいて穴１，２において記載し
たと同じ試料を含む。Ｐ−２で前処理した人血清の場合は抗−人C3
プロアクテイベーター（ウサギ）に対する沈降線
がγ−領域に見られた。Ｐ−２で前処理しない対
照血清においては、沈降線はβ−領域にのみ見ら
れた。抗−人C3（ウサギ）に対する沈降線はα
−領域に見られた。沈降線は対照血清補体成分の
ためのβ−領域に見られた。補体系はClassical pathway又はalternative
pathwayのいずれかを経由して活性化される。そ
して、Mg⁺⁺のみがalternative pathwayに必要で
あり、一方Mg⁺⁺とCa⁺⁺の両方はclassical
pathwayにとつて必須であることは知られてい
る。Ｐ−２は補体系に関しclassical pathwyあるい
はalternative pathwayを経由して活性化される
のか次の実験により決めた。新鮮人血清0.9mlへＰ−２けんだく液（１mg／
ml）0.1mlを加えた。混合物を37℃１時間反応さ
せた後、冷却下に遠心分離（5000回転、30分間）
操作を行つた。補体活性を試験するため上清液を用いて免疫電
気泳動分析を行つた。EGTAの存在下にコンバー
トしたC3プロアクチベーターの沈降線はγ領域
に見られた一方、EDTAの存在下で実験を行つた
ものはγ領域に見られなかつた。また補体成分の
活性化は温度にも依存していた。これらの結果か
ら、Ｐ−２による補体成分の活性化はalternative
pathwayを経由して起つていることがわかる。本発明のアロクチンＡが強い制癌活性を有して
いることは実の実験により確かめた。制癌活性試験：制癌活性試験のために、約100ｇ体重のドンリ
ユーラツトを用いた。生後30〜40日のラツトへ５×10³〜２×10⁶細胞
の腹腔内移植後のAH−130細胞の癌原性を図６
に示した。すべての動物は８〜27日間で癌のため
死亡した。植継後７日経過したAH−130癌細胞、0.5ml
（５×10³個の癌細胞を含む）の腹水をラツトへ腹
腔内に移植した。癌細胞移植の前後の異つた各時
間に投与したアロエ抽出物質の癌成長に対する影
響を試験した。結果を図７に示した。ａ：ラツト酸性Pptの２mg（２mg蛋白）／ラツ
ト／日を毎日７時間腹腔内へ投与した後、５×
10³AH−130細胞を酸性Pptの最後の投与日後
７日後に移植した。ｂ：対照。ラツトには何らアロエ抽出物は投与せ
ず５×10³AH−130の細胞を移植した。図７から、酸性Pptについて制癌活性があるこ
とがわかる。さらに検討した結果Ｐ−１とＰ−２
の間ではＰ−２のみに制癌活性があることを確認
した。次に、癌細胞移植動物の生存時間に対応するＰ
−２の投与量を決定するための実験を行つた。種々の量のＰ−２を５×10³AH−130癌細胞移
植以前14〜７日の７日間毎日投与した。結果を80
日間すなわち癌で対照動物がすべて死亡後54日間
記録し、これを図８に示した。図８から、癌をも
たない生存動物数、すなわちＰ−２の制癌活性は
その投与量によつて変化する。各％値は三つの実
験からの25〜30ぴきのラツトについての平均値を
示してある。さらに７日間毎日Ｐ−２の50μｇを投与し、癌
細胞移植後120日間生存した10ぴきのラツトにつ
いて再度１×10⁵AH−130細胞を移植した実験で
は癌はすべてのラツトについて完全に退縮した。一方、JCL−1CRマウス（体重約30ｇ）雄雌各
５匹を一群として、これにザルコーマ180を腹水
型でメインテインしたものをマウスの右肩に皮下
移植（２×10⁵細胞）し固形腫瘍として実験を行
つた。ザルコーマ180移植後より毎日アロクチン
A30γ／１匹（食塩により等張としたリン酸緩衝
液、PH7.2に溶解して使用）を２週間投与したと
ころ、60日後のinhibition ratio（腫瘍阻止率）は
80％であり、また10匹中２匹で腫瘍が完全に退縮
していた。本発明のアロエ抽出物、アロクチンＡは無毒で
あるからこれにより癌を完全に退縮せしめた後特
に処置する必要がない。上記実験結果から、特にアロクチンＡの制癌活
性は癌細胞に対して直接細胞毒効果ではなく、宿
主細胞を介した反応による免疫効果であることが
理解される。

【図面の簡単な説明】

図１ａ〜ｃ及び図２はアロクチンＡの分離方法
の一実施例におけるゲルクロマトグラフイー溶出
パターン図であり、図３はアロクチンＡに関する
SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動パター
ン図であり、図４ａ，ｂはアロクチンＡに関する
分子量測定結果を示したものであり、図５ａ〜ｃ
はアロクチンＡに関するオークタロニー免疫拡散
ゲルのパターン図であり、図５ｄ〜ｆはアロクチ
ンＡに関する免疫電気泳動パターン図である。図
６〜８はアロクチンＡに関する制癌活性試験結果
を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１次の特性を有し、アロエより分離できるアロ
クチンＡ。 (1) 分子量 1.8×10⁴ (2) 構造：蛋白と糖の比が約８対２（重量）であ
るグリコプロテイン (3) ソデイウムドデシルサルフエート存在下にお
けるポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で単一
バンドを与え、これを２−メルカプトエタノー
ルによりＳ−Ｓ結合を切断した場合は二バンド
を与える。 (4) リンパ球幼若化作用及びリンパ球膜流動性促
進作用を有する。 (5) 赤血球及び腫瘍細胞凝集活性を有する。 (6) 血清蛋白の或る種蛋白と反応しアガロース平
板上で沈降線を形成する作用を有する。 (7) 補体第３成分活性化作用を有する。