JPS6251981A - 鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のクロ−ン化及び発現 - Google Patents
鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のクロ−ン化及び発現Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［産業上の利用分野］
本発明は鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエン
シス毒素遺伝子のクローン化及び発現に関する。 ［先行技術及び問題点コ 胞子形成微生物のバシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、 Ｂｔ）は
、最もよく知られた昆虫毒素をつくる。この毒素は、δ
−エンドトキシンと指定された蛋白質である。これはａ
ｔの胞子形成細胞によって合成される。感受性のある昆
虫の幼虫が毒素の結晶型を摂取すると、毒素は昆虫の腸
液プロテアーゼにより生物学的活性のある部分に転化さ
れる。主要標的は昆虫の腸上皮細胞であっで、これが急
激に破壊される。 Ｂｔ毒素の活性は非常に高く、感受
性のある幼虫を殺すのにナノグラム単位の量しか必要で
ないことか経験かられかっている。 ８ｔの報告された活性範囲は、農林業で大きな問題とな
っている昆虫である鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏρｕｔｅｒａ
）の範囲内の昆虫橿を包含する。活性範囲はまた双し類
（［１ｉｐｔｅｒａ）の昆虫も包含する。これには蚊と
ブヨ（ｂｌａｃｋｆｌｙ）の幾つかの種が含まれる。コ
ーチ・ティー・エル（Ｃｏｕｃｈ、 Ｔ、Ｌ、）（１９
８０年）「バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・
イスラエレンシスの蚊病源性Ｊ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ２２巻６１−６７頁：ビーグル・シー・シー（
Ｂｅｅｇｌｅ、 Ｃ，Ｃ，）（１９７８年）「農業生態
系における昆虫性細菌の利用ｊ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ １ｎｄｕ−ｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏ３ｙ ２０巻９７−１０４頁を参照のこと。 クリーブ（Ｋｒｅｉｇ）ら（Ｚ、 ａｎｇ、 Ｅｎｔ、
（１９８３年）９６巻５００−５０８頁）はパンラス・
スリンキニンシス・バラエティ”テネアリオニス（Ｂ、
ｔｈｒｉｎ３ｉｅｎｓｉｓｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ）と名付けられたＢｔ分離体について記述して
いるが、これは鞘翅目の２種類の甲虫に対して活性があ
ると言われている。これらはコロラド・ポテト・ビート
ルのレブチノタルサ・デセムリネアータ（Ｌｅｐｔｉｎ
ｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）７と７ゲラ
スチカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ）で
ある。このような活性をもつと報告された既知のＢｔ分
離体はこれだけである。すでに確認されたＢｔ菌昧はす
べて、いも虫（鱗翅類）やハエの幼虫（双翅類）に対し
て活性をもつものであった。 クリーブらのｅｔ分離体は、本発明の新規なりｔ遺伝子
源として使用される８を分離体との並行比較のため人手
できない、従っで、クリーブらのＢｔ分離体か公衆の手
に入らない以上、クリーブらの公告は合衆国法の下で法
的に有効な特許法の弁解ではない。 ［問題点を解決する手段］ 鞘翅目の甲虫に有毒な毒素遺伝子のクローン化及び発現
が明らかにされ、特許請求されている。 クローン化された遺伝子でつくられる毒素は、鞘翅目の
甲虫に対して活性があるが、トリコブルシア・二（Ｔｒ
ｉｃｈｏρ１ｕｓｉａ旧）、スボトプテラ・エクシグア
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、又はネツタ
イシマ蚊（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｉｔｉ）に対しては活性
がない。鞘翅目に含まれるものとしで、農業上大きな損
害をもたらす種々のディアブロチイカ（Ｄｉａｂｒｏｔ
ｉｃａ）＋！（ハムシ科Ｃｈｒｙｓｏｍｅ ｌ １ｄａ
ｅ）がある。例えば、ディー・ウンデシムブンクタータ
（［１，ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔ−ａｔａ）（西部班
点つリハムシ）、ディー・ロンギコーニス（Ｄ、 Ｉｏ
Ｂｉｃｏｒｎｉｓ）（ノーザンーコーンールートワーム
）、ディｍ−バージテラ（［）、 ｖｉｒｇｉｔｅｒａ
）（ウェスタン・コーン・ルートワーム）、及びディー
・ウンデシムブンクタータ・ハワーデイ（Ｄ。 ｕｎｄｅｃｉ＋ｎｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）
（サザン・コーン赤ルートワーム）がある。 ｒＭ−７Ｊて指定される本発明の青紫遺伝子給源として
使用されるハシラス−スリンキニンシス分離体は、独特
のパラ胞子体く結晶）をもつ点て異例である。これは位
相差顕微鏡下に外観が暗色で、平らな角型の外形を呈す
る。 現在バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ（Ｂ
、ｔ、ｓｄ）として知られるバシラス・スリンギエンシ
ス門づの二次培養基は、１９８５年２月２７日、合衆国
イリノイ州ビオリア、合衆国ａ務省、北部研究所の永久
保存施設に寄託された。培養基は、保存施設からＮＲＲ
Ｌ ８−１５９３９の寄託番号を指定された。 この寄託物は、これを開示した特許の授与により一般に
人手できる。寄託物はまた、本出願又はその後代の対応
出願がなされている国の外国特許法での要求に応して人
手できる。しかし、寄託物が人手できるからといっで、
政府決定によって授与される特許権を侵害してまで、本
発明の実施権を構成するものではないことを了解された
い。 バシラスースリンギエンシス菌株サンディエゴ、ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５９３９はこの技術の標準的な培地及び醗酵
手法を使用して培養できる。醗酵周間の完了後、この技
術に周知の手段により、まずＢｔ胞子と結晶を醗酵液か
ら分離することによっで、細菌を収穫できる。細胞から
のＤＮＡ （染色体とプラスミド）を標準手順によって
単層し、この技術で周知の手順によって精製できる。例
えば、このような標準手順はマニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、分子りａ−ン化（１９８２年）、コールド
スプリングハーバ−研究所、に明らかにされている。 精製ＤＮＡを次に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化
させることができる。 次にＢ、ｔ、ｓｄ ＤＮＡのシーンバンクを構築するこ
とがてきる。本発明では、上記のように得られる精製Ｂ
、ｔ、Ｓｄ ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ旧
で消化させ、周知の人手できるブラスミＦｐＢＲ３２２
のＲａｍ１位査ヘクローン化した。 Ｂ、ｔ、ｓｄのＤＮＡのシーンバンクが構築されたら、
次にこのシーンバンクを選別するためにＤ Ｎ Ａプロ
ーブを構築する必要がある。この臨床的ＤＮＡプローブ
の構築は、Ｂ、ｔ、ｓｄ培養基からＭ−７毒素結晶を単
離することによって開始された。 回収された門・７毒素結晶を標準手順によって精製し、
次にトリプシンで消化させるとペプチド断片がつくられ
る。これらのトリプシン性の断片の幾つかのもののアミ
ノ酸配夕１１は標準手順によって決定された。続いで、
ある配列の選択後、プローブを既知手段により化学的に
合成した。生ずるプローブに標識を付け、この技術で知
られた手順によって交雑（ハイブリダイゼーション）さ
せた。 その結果、陽性クローン、すなわち構築された１０−ブ
へ交雑したものが検出された。 陽性クローンの代表を、標準手順によって開発されたう
さぎの抗門づ結晶抗血清を使用してウェスタン・プロッ
トにかけた。Ｍ−７毒素のクローン化と発現は、陽性ク
ローン及びＭ−７毒素結晶に対する抗体で陽性反応が見
られた時に、成功の確認が得られた。 代表的な陽性クローンから単離された組替えプラスミド
は、Ｂａｎ旧位置へ挿入された５、８ ｋｂ ＤＮＡ断
片をもつことがわかった。この５．８ ｋｂ ＤＮＡ断
片は、Ｂａｍ旧によって代表的陽性クローン（ｐＣ）Ｉ
−８３）から切断、精製され、次に既知の人手できるブ
ラスミｔ”ｐＲ０１６１４のＢａｎ旧位置へ二次クロー
ン化された（Ｊ、 Ｂａｃｔ、［１９８２年］１５０巻
６０頁；合衆国特許第４ 、３７４ 、２００号）。プ
ラスミドｐＲ０１６１４は、下記の住所の北部研究所か
ら人手でき、その寄託番号はＮＲＲＬ Ｂ−１２１２７
である。プラスミドはｐＢＲ３２２から誘導され、特異
なＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ旧、５ａ１１．及びＰｖｕ■
制限位置をもつ。Ｐｓｔｌ挿入物はカルへニジリン抵抗
遺伝子と緑Ｉｌｌ菌（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）複
製系を包含している。シュードモナス・フルオレッセン
スはこの構築されたシャトルベクターによって形質転換
され、Ｍ−７毒素の発現はウェスタン・プロットでの確
認により証明された。 プラスミドｐＣＨ −８３、又は５．８ ｋｂの断片挿
入物をもつプラスミドρＲＯＩ６＋４は、周知の手順、
例えば透明溶菌液−密度勾配平衡手順を使用しで、細菌
宿主から回収できる。所望によりＢａｍ−旧での消化に
より、５．８ ｋｂ断片をｐＲ０１６１４から切り取り
、別の宿主への形質転換のため異なるベクターへクロー
ン化できる。これらの手順はいずれも当業者に周知であ
る。 大腸菌宿主中のブラスミ）’ｐ＋−１１−８３は、６１
６０４イリノイ州ビオリア、北部研究センター、培養基
保存研究／ＩＩ’Ｓ酵研究所、ＡＲ５特許保存施設に寄
託された。寄託物は、同施設の手で少なくとも３０年間
、永久保存施設内に保存される。寄託は１９８５年７月
１８日に行なわれ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９８１の寄託番
号を付された。二次培養基は、寄託物を明らかにした特
許の授与により、一般に入手できる。寄託物はまた、本
出願又はその後代の対応出願がなされている国の外国特
許法での要求に応して人手できる。しかし、寄託物が人
手できるからといっで、政府決定によって授与される特
許権を侵害してまで、本発明の実施権を構成するもので
はないことを了解されたい。 本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物宿主中に導入で
きる。毒素遺伝子（Ｍ−７）の発現の結果、直接又は１
接的に殺虫剤が細胞内に生産され、維持される。適当な
宿主、例えばンユートモナスの場合、鞘翅目の甲虫が生
色する場所に微生物を施用すると、これらは増殖し、感
受性のある甲虫に摂取される。その結果、望んでいない
甲虫が防除される。その代りに、毒素ト１−７遺伝子の
宿主となった微生物を、細胞内につくられる毒素の活性
を持続させるような条件下に処理できる。次に処理１胞
を目標害虫の環境に施用できる。生ずる生成物は、Ｍ−
７毒素の毒性を保持している。 Ｍ−７毒素遺伝子を適当なベクター経由で微生物宿主に
導入し、宿主を生きた状態で環境に施用する場合、ある
宿主微生物を使用することが必須である。選択されるの
は、対象となる一つ以上の作物の「植物領域」（＝フィ
トスフェア）（葉面＝フィロプレイン、葉周辺＝フィロ
スフェア、根周辺：リゾスフェア、及び／又は眼表面＝
リゾプレイン）を占めることがわかっている微生物宿主
である。これらの微生物は、特定環境（作物と他の昆虫
の生、白、環境）で野性型微生物と順調に競合でき、ポ
リペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現
をもたらし、また望ましくは環境上の劣化や不活性化か
らの殺虫剤の改良された保護を提供するようなものが選
択される。 広範囲の重要作物の葉面や種周辺に生息する微生物は、
多数知られている。これらの微生物は細菌、藻類、及び
カビを包含する。特に興味ある微生物は次のようなもの
である。細菌では、厘毛でシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅ−ｒｗｉｎｉａ）、
セラティア（Ｓｅｒｒａｔ、ｉａ）、キサントモナス（
Ｘａｎｔｈｏ＋＊ｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ Ｉ
１ｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アットバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃ−ｔｅｒ）、
リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及び
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ）。カビ、
特に酵母では、厘毛てサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコツカス（Ｃｒソｐｔ、ｏｃ
ｏｃｃｕｓ）、クルイヘロミセス（にｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒ（１−ｂｏｒ
ｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ）、及びアウレオバラジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄ
ｉｕｍ）。特に興味あるのは、次のような植物領域細菌
種である。ンユートモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇ−ａｅ）、シュードモナス・
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター
９キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕ
ｍ）、アグロバクテリウム会ツメファシェンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｎ＋ｅｆａ−ｃｉｅｎｓ）
、ロートシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キ
サントモナス◆カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ｃａＩｌｌｐｅｓｔｒｉｓ）。 リゾビウム・メリオチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉ
ｏｔｉ）、アルカリゲネス−Ｘントロフス（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ ｅｎｔ−ｒｏｐｈｕｓ）、及びアットバ
クター・ヴインランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖ
ｉｎｌａｎｄｉｉ）。また、興味ある植物領域の酵母種
は次のものである。ロートトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニス（Ｒ。 ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ，マリナ（Ｒ，ｍａｒｉｎａ）
、Ｒ，アラランチフカ（Ｒ，ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、
クリプトコツカス・アルビヅス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ，ジフルエンス（Ｃ，ｄｉ
ｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｃ，ラウレンチイ（Ｃ，１ａｕｒｅ
ｎｔｉｉ）、サツカロミセスΦロゼイ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（
Ｓ、 ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ、セレヴイシア
エ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス
拳ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅ
ｕｓ）、Ｓ、オトルス（Ｓ、 ｏｄｏｒｕｓ）、クルイ
ヴエロミセス・ヴエロナエ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｖｅｒｏｎａｅ）、及びアウレオバラジウム・ポル
ランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｏｌｌｕｌａ
ｎｓ）。 有色素微生物が特に興味がある。 遺伝子の安定な維持と表現を可能にするような条件下に
、毒素を表現するＭ−７遺伝子を微生物宿主中に導入す
るには、多様な方法が広く利用てきる。例えば、毒素遺
伝子の表現のため転写及び翻訳の調節信号を包含するＤ
ＮＡ構築物を提供できる。 また、糾み込みが起こるように、調節制御下の毒素遺伝
子と、宿主生物中の配列と相同なりＮＡ配列とを提供で
きる。及び／又は、絹み込み又は安定な維持が起こるよ
うに、宿主中で機能的な複製系を提供できる。 転写開始信号はプロモーターと転写開始スタート位置を
包含する。ある場合には、毒素の調節的な発現を提供す
るのが望ましい。その場合、毒素の発現は環境への放出
後にのみ生ずることになる。 これはオペレーターで、又は微生物の物理的ないし化学
的環境の変化により誘導可能なアクチヘーターやエンハ
ンサ−への領域結合で達成できる。 例えば、感温性調節領域を使用すると、生物は毒素の発
現なしに実験室で生育てきるが、環境への放出により発
現が始まる。他の手法は毒素の発現を抑制するような特
定的な栄養培地を実験室で使用し、環境中の栄養培地で
毒素の発現が可能になる。翻訳開始には、リボゾームの
結合位置と翻訳開始コドンが存在する。 伝令の表現を強化するには活性オペレ−ターを使用する
か、又は伝令ＲＮＡの安定性を強化するような配列を使
用するなと、種々の操作を利用できる。イニシェーショ
ン領域と翻訳終了領域は、停止コードン、ターミネータ
−領域、及び任、會付加的にポリアデニル化信号を包含
する。 転写方向、すなわちコーディングないしセンス配列の５
′から３″への方向で、構築物は転写調節域があればこ
れと、調節域がプロモーターの５′又は３′のいずれか
でありうる場合はプロモーター、リボゾーム結合位置、
イニシェーションコドン、イニシェーションコドンと同
フェイズのオーブンリーディングフレームをもつ構造遺
伝子、停止コドン、もしあればポリアデニル化信号配列
、及びターミネーション領域を包含する。２本鎖として
のこの配列は、それ自体、微生物宿主の形質転換のため
に使用できるが、通常は、マーカーに関係するＤＮＡ配
列に含まれており、その場合第二のＤＮＡ配列は毒素発
現１ｌＩｌ築物に加わるか、又はＤＮＡの宿主への導入
中に、別個のＤＮＡ断片として毒素発現構築物と一緒に
てきる。 マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選択に用
いる構造遺伝子のことである。マーカーは、通常、選択
的な利点を提供するもので、例えば、抗生物質や重金属
抵抗性なとの殺生物抵抗性、栄養要求宿主に原栄養性を
与えるような相補性などを提供する。変更宿主が選択で
きるだけでなく、畑で競合できるように、相補性を使用
するのが好ましい。構築物の開発ならびに宿主変更のた
め、一つ以上のマーカーを使用できる。畑での他の野性
型微生物に対する競合的な利点を提供することによっで
、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート化剤、
例えば担鉄細胞を発現する遺伝子を、毒素発現用の構造
遺伝子と共に宿主に導入できる。こうしで、担鉄細胞の
強化された発現により、毒素生産宿主に競合的な利点が
得られ、宿主が野性型微生物と効果的に競合し、保護し
ようとする植物の環境に生態的地位を安定に占めること
ができる。 機能的な複製系が存在しない場合、構築物は宿主中の配
列と相同な、少なくとも５０ ｂｐ、好ましくは少なく
とも約＋００ ｌａｐ、及び通常的１ｏｏｏ ｂｐまで
の配列をも包含する。こうすると、正当な組替えの確率
が強化されるため、遺伝子が宿主中に組み込まれ、宿主
によって安定に維持される。毒素遺伝子が、相補性を提
供する遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子と近接して
いることが望ましい。 従っで、毒素遺伝子が失われるような場合は、生ずる生
物は相補性の遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子も失
う可能性があり、このため旭偏の構築物を保持している
遺伝子と環境中で競合できなくなる。 細菌、バクテリオファージ、シアノ細菌、藻類、カビ等
のような広範囲の微生物宿主から、多数の転写調節域が
入手できる。種々の転写調節域は、ｔｒｐ遺伝子、ｌａ
ｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左右プロモーター、Ｔ
ａｃプロモーター、宿主中で機能的な場合、毒素遺伝子
と関連した天然に生ずるプロモーターを包含する。例と
しで、合衆国特許第４．３３２，８９８号、第４．３４
２，８３２号、及び第４，３５６，２７０号を参８イの
こと。終了域は、転写開始域と通常関連した終了域か、
又は二つの領域が宿主中で両立し機能的である限り、異
なる転写開始域と関連する終了域でもよい。 安定なエピゾームの維持又は組み込みを望んでいる場合
は、宿主中で機能的な複製系をもつプラスミドが使用さ
れよう。複製系は、染色体、宿主又は別の宿主中に通常
存在するエピソーム要素、又は宿主中で安定なウィルス
からの複製系から誘導される。プラスミドは、ρＢＲ３
２２、ρＡＣＶＣ＋８４、Ｒ５Ｆ！０１０、ｐＲ０１６
１４等多数が利用できる。例としで、オルソン（Ｏｌｓ
ｏｎ）ら（１９８２年） Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｄ
ａｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年） Ｇｅｎｅ １６
巻２３７頁、及び合衆国特許第４．３５６．２７０号、
第４，３６２，８１７号、及び第４，３７１．６２５号
を参照のこと。 Ｍ−７遺伝子は、開始域の調節制御下に置かれるように
、転写・翻訳開始域と転写・翻訳終了域との間に導入で
きる。この構築物はプラスミド中に含まれるものであっ
で、プラスミドは少なくとも一つの複製系を包含するが
、プラスミド開発中のクローン化に一つの複製系を使用
し、最終宿主中ての機能化に第二の複製系が必要な場合
は、一つ以上の複製系を包含できる。更に、すてに述べ
た一つ以上のマーカーが存在しろる。葡み込みを望んで
いる場合は、プラスミドが宿主ゲノムと相同の配列を包
含するのが望ましい。 形質転換体は、慣用方法に従って単離できる。 通常、選択的手法を使用し、望んでいる生物を未変更生
物から選び出し、存在していれば、これを移し替える。 次に形質転換体の殺虫活性を試験できる。 好ましい宿主、特に植物領域（フィトスフェア）中のも
のは、宿主中で毒素の環境的安定性を強めるようなある
特性をもっていよう。保護的性質は、低水準の蛋白分解
的劣化、厚い細胞壁、色素保有等を包含する。宿主向け
に興味ある他の性質は、葉親和性、対嘩乳類毒性の欠如
、摂取害虫への誘引力、取扱いと保存の容易さ、畑での
増殖速度、競合性等を包含する。 畑施用においては、形質転換体菌株は、害虫から１呆護
しようとする植物の根周辺や葉面のような、害虫の自然
な生息環境に施用されよう。形質転換体菌株は、Ｍ−７
毒素を生産しつつ、その自然な生息環境中で生育し、Ｍ
−７毒素は幼虫又は成虫に吸収及び／又は摂取されるか
、卵に有毒な効果をもってあろう、微生物の持続性が植
生の長期保護をもたらすが、時とき投与を繰り返す必要
がかもしれない。生物は、噴霧、浸漬、地中への注入、
種子被覆、苗木被覆又は噴霧等によって施用できる。 畑への投与の場合、生物濃度は、一般にｍｌ当り細胞数
で１０６ないし１０１０個、ヘクタール当り施用容量は
一般に約０．１オンスないし２ ｌｂ以上であろう。 植物部分に投与される場合、生物濃度は通常、Ｃｍ２当
り細胞数で１０３ないし１０６個であろう。 目標害虫の環境に死菌を施用する時に細胞中の毒素の活
性を持続させるために殺虫剤含有細胞を処理する場合は
、適当な宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれかを
包含するが、通常、哺乳類のような高等生物に有毒な物
質を生産しないものに限定される。しかし、毒素が不安
定であったり、施用水準が哺乳類宿主への毒性の可能性
を避けられるほと十分に低い場合は、高等生物に有毒な
物質をつくる生物も使用できる。宿主としで、特に興味
あるものは、原核生物と、カビのような低級真核生物で
ある。グラム陽性及びグラム陽性双方の原核生物の例は
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニ
ア（１：ｒｙｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）
、サルモネラ（Ｓａｌｎ＋ｏｎｅｌ Ｉａ）及びプロテ
ウス（ｐｒｏｔｅｕｓ）のような腸内細菌科（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ） ：バシラス科（Ｂａ
ｃｉ ｌ １ａｃｅａｅ） ；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｎ＋）のようなりゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａ
ｃｅａｅ） ：発光細菌（ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉ＋
ｎｎ）、ザイモモナス（ＺｙｒＲｏｍｏｎａｓ）、セラ
チア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｌ
ｌｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デスルホビ
ブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏ−ｖｉｂｒｉｏ）、スピリルム
（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）のようならせん歯科（Ｓｐｉｒ
ｉｌｌａｃｅａｅ） ：乳酸かん歯科（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃ ｉ ｌ −Ｉａｃｅａｅ） ：シュートモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）やアセトバクター（Ａｃｅｔｏ
ｂａｃ−ｔｅｒ）のようなシュートモナス科（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｄａｃｅ−ａｅ） ：アソトバクター科（
Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、及びニトロバク
ター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）である。 真核生物ではサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）とシゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）のような酵母を含めた、藻菌類（Ｐ
ｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）と子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）のようなカビ類（ｆｕｎｇｉ）：及びロード
トルラ（Ｒｈｏ−ｄｏｔｏｒｕｌａ）、アウレオバラジ
ウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ−ｄｉｕｌ！１）、スポロボ
ロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）等のような
担子菌類（Ｂａｓｉｃｌｉｏｍｙｃｅｔｅｓ＞酵母があ
る。 生産を目的として宿主細胞を選択する際に特に興味ある
性質は、宿主へのＭ−７遺伝子導入の容易さ、表現系の
人手性、表現効率、宿主中における殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セル用に興味ある性質は厚い細胞壁、色素保有、及び細
胞内包装又は封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉親
和性；対哨乳頚毒性の欠如；摂取害虫への誘引力；毒素
へ損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。 他の考慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、
保存安定性等がある。 特に興味ある宿主生物は、ＣＩ −Ｆ’ ）ルラ種、ア
ウレオバラジウム種、サツカロミセス種、及びスポロボ
ロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウィ
ニア種及びフラボバクテリウム種のような葉面性の生物
；又はエシェリキア種、ラクトバシラス種、バシラス種
等の他の生物を包含する。特定的な生物は緑ＶＡ菌、シ
ュードモナス・フルオレッセンス、サツカロミセス・セ
レヒシアエ、バシラス・スリンギエンシス、大腸菌、枯
草菌等を包含する。 細胞は通常、無傷であり、殺菌時に胞子型よりは実質的
に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用できる。 細胞増殖を種々の方法で抑制できるが、但しその手法が
殺虫剤の性状に悪影響したり、殺虫剤を保護する際に細
胞能力を消したりしてはならない。 方法としては、物理的処理や化学的処理、細胞の物理的
性状を変える、又は細胞の物理的性質を無傷で残すなど
がある。 宿主細胞を不活性化する種々の方法は、通常５０℃ない
し７０℃の加熱；凍結；Ｕｖ照射；凍結乾燥；毒素、例
えば抗生物質；フェノール類；アニリド類、例えはカル
バニリドとサリチルアニリド；ヒドロキシュリア；第４
級類；アルコール類；抗菌染料； ＥＤＴＡ及びアミジ
ン類；ハロゲン化剤、例えば塩素化剤、臭素化剤又はヨ
ウ素化剤のような非特異的有機及び無機化学物質；アル
デヒド類、例えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデ
ヒド；オソンやエチレンオキシドのような有毒ガス；過
酸化物；ブソラレン類；乾燥剤等。これらを個々に、又
は組合わせて使用できる。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿
主細胞の性質、架橋剤による細胞壁の固定及び保存のよ
うな細胞構造の変更の性質などによって変わる。 細胞には、概して強化された構造的安定性があり、これ
が畑での環境劣化抵抗性を強化している。 殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制するように不活性化
方法を選択すべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋
白質を東橋するから、プロ型ポリペプチド’Ｈ虫剤の加
工を抑制できる。不活性化又は殺菌方法は毒素の生体利
用効率又は生物活性の少なくとも実質部分を保持する。 Ｍ−７殺虫剤遺伝子を含有する細胞宿主は、Ｄ Ｎ Ａ
構築物が選択的利点もつ場合、任意好都合な栄養培地で
生育てき選択培地を与えるので、細胞の全部又は実質的
に全部がＭ−７遺伝子を保持する。次にこれらの細胞を
慣用方法に従って取り入れることができる。その代りに
、取り入れる前の細胞を固定することもてきる。 毒素を含有する宿主生物の処理方法は、幾つかの役割を
果たすものとなっている。第一に、処理は構造的一体化
を強めて（る。第二に、蛋白分解性の劣化に対する感受
性を減らすように毒素を変更し、かつ又は細胞中に天然
に存在するプロテアーゼの蛋白分解活性を低下させるこ
とによっで、処理は毒素の強化された蛋白分解安定性を
提供できる。細胞な簾偏の段階で変更するのが好ましく
、また毒素蛋白質の実質的なＳ′積があった時も変更す
るのが好ましい。これらの変更は、広範囲の化学的反応
性をもつ化学試薬を使用するなと、種々の方法で達成で
きる。約−１０ないし６０°Ｃの範囲の温度で、かきま
ぜを加えで、又は加えずに、化学試薬を含有する液体試
薬媒体と無傷の細胞を一緒にする０反応時間は経験的に
決定でき、試薬及び反応条件により大幅に変わる。細胞
濃度は約１０２から１０１０の範囲にある。 化学試薬として特に興味あるものは、ハロゲン化剤、特
に原子番号＋７−８０のハロゲン類である。 更に詳しくは、温和な条件下で、望んでいる結果を達成
するのに十分な時間に、ヨウ素を使用できる。他の適当
な手法としては、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒ
ドのようなアルデヒド類での処理；塩化ゼフィランと塩
化セチルビリゾニウムのような抗感染剤；イソプロパツ
ールとエタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤
やヘリ−固定剤のような種々の組織学的固定剤［フマソ
ン（ｔｌｕｍａｓｏｎ）、グレッチェンΦエル（Ｇｒｅ
ｔｃｈｅｒ＋＋ Ｌ、）、Ａｎｉｍａｌ Ｔｉ５ｓｕｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （動物組織技法）、ダブリュ
ー・エッチ・フリーマン社、１９６７年、を参照のこと
］ ；又は目標害虫環境へ細胞を施用する時に細胞中に
生産される毒素の活性を持続させる物理的処理（加熱）
と化学的薬剤との組合わせがある。 ヨウ素でのハロゲン化には、温度は一般に約Ｏないし５
０℃の範囲にあるが、反応は室温で都合よ〈実施できる
。酸性の水性媒体、特に約０．５〜５Ｍの範囲のカルボ
ン酸水溶液中における０、５ないし５％の三ヨウ素化物
又はヨウ素を使用してヨウ素化を行なうのが好都合であ
る。酢酸を都合よく使用できるが、概して約１−４個の
炭素原子の他のカルボン酸も使用できる。反応時間は、
一般に１分未満から約２４時間、通常的１−６時間の範
囲であろう。 ジチオナイト、チオ１Ｉｉｔ酸ナトリウムのような還元
剤や、畑での最終使用に適合した他の還元剤との反応に
より、任意の残留ヨウ素を除去できる。更に、変更した
細胞を、当業者に周知のように、全反応媒体を除去する
ための洗浄や、乾燥型での単離、典型的な粘着剤、展着
剤、及び農業用に一般に利用される助剤での処方といっ
た処理に、なおもかけることができる。 特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬である。 この目的には、幾つかの試薬が知られている。その処理
によっで、殺虫剤の安定性が強化される。すなわち、畑
条件下に殺虫剤の持続性ないし残留活性が強化されなけ
ればならない。こうしで、未処理細胞の殺虫活性が消滅
するような条件下に、処理細胞の活性は１〜３倍長い期
間にわたって持続する。 細胞を種々の方法で処方できる。無８１（オ科（フィロ
珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）や植物材料（とう
もろこし芯粉末、もみ殻、くるみ殻等）のような種々の
不活性材料と混合することによっで、これらを水和剤、
粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は、展着／粘着
助剤、安定化剤、その他の殺虫添加剤、又は表面活性剤
を包含しうる。 液体処方剤は、水性基盤でも非水性でもよく、フオーム
、ゲル、懸濁液、乳化出来る濃縮物等として使用できる
。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤、又は重
合体を包含しうる。 殺虫剤濃度は、特定処方剤の性質、特に処方剤が濃厚液
か直接使用のものかによって大１幅に変わる。殺虫剤は
少なくとも１重量％、及び１００重量％でも存在しうる
。乾燥処方剤は約１−９５重量％の殺虫剤をもつが、液
体処方剤は液相中に概して１−６０重量％の固形分をも
っている。概して処方剤は、ｍｇ当り約１０２ないし約
１０４個の細胞をもつ。これらの処方剤は、ヘクタール
当り約５０ｍｇ（ｉｌｌ１体又は固体）ないしＩ ｋ、
ｇ以上の率で投与される。 処方剤を害虫環境へ、例えば植物、土壌又は水へ、噴霧
、散布、散水等によって施用できる。 以下は、最良の態様を含めた本発明の実施手順を示す実
施例である。これらの実施例は、限定的に考えられては
ならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、
溶媒混合物の割合はすべて容量による。 実施例１ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエ
ゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、の培養バシラス・スリ
ンギエンシス菌株サンディエゴＮＲＲＬ Ｂ−１５９３
９の二次培養基又は出発培養基を使用しで、しＢブロス
として知られる次の培地に摂取できる。 トリプトン １０ ｇ 酵母エキス ５ｇ ＮａＣｌ ５ ｇ ５Ｎ ＮａＯＨ０，６ｍｌ 水 １０００ ｉｔ標
準的な微生物学的手法などによっで、上の培地を接種前
に滅菌し、無菌手順を用いて接種を行なう。Ｍ−７″ｍ
胞を３０℃で３−４日生育させる。 詳細な手順は以下のとおりである。 無菌のＰＷＹＥ培地（水１リットル中ペプトン５．０！
、酵母エキス０．１！、 ＮａＣｌ Ｏ，５＄、ｐＨ７
，５に調整）を含有する一連の１５０ ｍｌ三角フラス
コに、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、
ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９をベトリ皿培養基から接種す
る。フラスコを回転振どう機（２０Ｏｒｐｍ）上、３０
℃で一夜培養する。この出発培養基から、その７．５１
を用いて２リツトルフラスコ中のＬＢブロス３００１に
接種する。 しＢブロスのフラスコを出発培養基と同じ条件下に培養
するが、４日後に取り入れる。 上の手順は、この技術で周知の手順により、大醗酵容器
まで容易に規模拡大できる。 上の醗酵で得られるＢｔ胞子及び結晶を、この技術で周
知の手順により単離できる。しばしは使用される手順は
、取り入れた醗酵液を分離手法、η１１えば遠心分離に
かけることである゛。 実施例２ Ｍ−７毒素遺伝子のクローン化及び発現全
体のＤＮＡ （染色体ＤＮＡとプラスミド）を実施例１
のＭ−７細胞から単離し、標準手順によって精製した。 生ずる精！！ ＤＮＡを、供給者の指示を用いて制限エ
ンドヌクレアーゼＲａｍｌで消化させた。消化されたＤ
ＮＡを周知のプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１位量
にクローン化すると、Ｍ−７ＤＮＡのシーンバンクが得
られた。このクローン化手順を、周知の標準的な手順に
従って行なった。 シーンバンクを選別するためのＤＮＡプローブは、次の
ように得られた。Ｎ’／ＳＭ培地（トリプトン１０３、
ＮａＣｌ ５３．酵母エキス５ ｇ、 ＭｇＳＯ４，７
１（２０２ｇ、水１０００ ｍｌ、ｐＨ７，５）中３０
℃で一夜生育させた培養基から、Ｍ−７結晶を単離した
。精製した結晶を８Ｍ尿素、０．１Ｍグリシン、ｐＨ８
，２に溶解し、室温で一夜、トリプシンで消化させた。 生ずるペプチド断片をＣ４逆相多孔カラム上で、アセト
ニトリル中０．１χトリフルオロ酢酸中の９１羞溶液Ａ
（０，１＄）リフルオロ酢酸水溶液）から４０χ溶液
Ａまでの１８０分勾配によって分離した。幾つかのトリ
プシン断片のアミノ酸配列が得られ、３２の１剰性をも
つ長さ１７塩基の混合プローブの合成に６アミノ酸の配
列を選んだ。 ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでプ
ローブに末端標識を付け、Ｍ−７ジーンバンク用に構築
された組替えプラスミドを含有する細菌集落に交雑させ
た。集落のフィルターは、ハナハン（ｌ（ａｎａｈａｎ
）及びメセルソン（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）（１９８０年）
Ｇｅｎｅ１０巻６３−６巻真３従ってつくられた。陽
性集落は、オートラジオグラフィによって確認された。 七つの陽性クローンく代表としてｐＣＨ−８３）から単
離された組替えプラスミドは、ＢａｍＨ１位量に挿入さ
れた５、８ ｋｂ （キロ塩基対）のＤＮＡ断片をもつ
ことがわかった。 ｐｃｔ−８３のウェスタン・プロット［バーネット・ダ
ブリュー・エヌ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、 Ｗ、Ｎ、）［１
９８１年］Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｌ１２巻１９５頁］は、うざぎ抗Ｍ−
７結晶抗血清を用いで、−夜培養基の５０５−ＰＡＧＥ
で行なった。 約８６キロダルトンの蛋白質が確認された。従っで、ク
ローンρＣＨ−８３は、Ｍ−７からの結晶蛋白質による
血清学的身元証明のある蛋白質に対するコードをもつ阿
りＤＮＡ断片を含有している。組替え蛋白質は、所定の
プラスミド構築で転写及び／又は間訳の停止信号が人手
てきないため、溶解化された門−７結晶からの毒素より
大きいこともありうる。 Ｂ、ｔ、ｓｄ毒素遺伝子を暗号化したヌクレオチド配列
を表Ａに示す。演えき的に導かれたアミノ酸配列を表Ｂ
に示す。 この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列はＤＮ
Ａのヌクレオチド配列によって決まる。遺伝暗号の１剰
性のため、すなわち蛋白質をつくるために用いられるア
ミノ酸のほとんどに対しで、一つ以上の暗号化ヌクレオ
チドトリブレット（コードン）を使用できるため、ある
特定のアミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列が暗号
化できる。 このため、遺伝暗号を次のように表わすことができる。 フェニルアラニン（Ｐｈｅ） ＴＴにロイシン（Ｌ
ｅｕ） ＸＴＹイソロイシン（ｌｌｅ）
ＡＴＭメチオニン（Ｎｅ ｔ） Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｌ） ＧＴＬセリン（
Ｓｅｒ） ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ）
ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）
ＡＣＬアラニン（Ａｌａ） ＧＣＬチロシ
ン（Ｔｙｒ） ＴＡＫヒスチジン（Ｈｉｓ
） ＣＡＫグルタミン（Ｇｌｎ）
ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ） ＡＡＫリジ
ン（Ｌｙｓ） ＡＡＪアスパラギン酸（
Ａｓｐ） ＧＡＫグルタミン酸（Ｇｌｕ）
ＧＡＪシスティン（Ｃｙｓ） ＴＧＫト
リプトファン（Ｔｒρ） ＴＧＧアルギニン（Ａ
ｒｇ） ＷＧＺグリシン（Ｇｌｙ）
ＧＧＬ終了信号 ＴＡＪ かぎ：各３文字のデオキシヌクレオチドトリブレットは
、左に５”−末端、右に３′−末端をもつｎ＋ＲＮＡの
トリヌクレオチドに対応している。本明、＊Ｖに記載の
ＤＮＡ配列は、いずれもｍＲＮＡの配列に対応する配列
のＤＮＡ鎖のものであっで、但しウラシルにはチミンが
置き変わる。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成す
るプリン又はピリミジン塩基を表わしている。 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝ニブアニン Ｔ＝チミン ＹがＡ又はＧの場合、Ｘ＝Ｔ又はＣ ＹがＣ又はＴの場合、Ｘ＝Ｃ ＸがＣの場合、Ｙ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ ＸがＴの場合、Ｙ＝Ａ又はＧ ＺがＡ又はＧの場合、Ｗ＝Ｃ又はＡ ＺがＣ又はＴの場合、Ｗ＝Ｃ ＷがＣの場合、２＝、へ、Ｇ、Ｃ又はＴＷがＡの場合、
Ｚ＝Ａ又はＧ ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの場合、ＱＲ＝ＴＣ但しＳがＴ又
はＣの場合、ＱＲ＝ＡＧ Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 以上は、Ｍ−７毒素又は他の有用な蛋白質の新規なアミ
ノ酸配列が、蛋白質の同しアミノ酸配列を暗号化した同
等なヌクレオチド配列によってつくられることを示す。 従って本発明は、このような同等なヌクレオチド配列を
包含している。更に、アミノ酸配列を変更しても蛋白質
の二次構造が変化しないならば、確認された構造と機能
の蛋白質をこのような変更によって構築できることがわ
かった［カイザー・イー・ティー（にａｉｓｅｒ、 Ｅ
、Ｔ、）及びケズディ・エフ・ジエイ（Ｋｅｚｄｙ、
Ｆ、Ｊ、）［１９８４年］ ５ｃｉｅｎｃｅ ２２３巻
２４９−２５５頁］。このように本発明は、蛋白質の二
次構造を変更しないか、又は構造が変更される場合でも
生物活性が同程度に保持されるような、本明細書に記載
のアミノ酸配列の突然変異物を包含している。 実施例３ クローンｐＣＨ−８３によるＭ−７毒素蛋白
質の生産 ｐｃｔ−８３培養基２０リツトル（アンピシリン７０μ
ｇ／ｌを含有するし一ブロス）を和酵容器中で生育させ
、０Ｄ６００＝３．３５で取り入れた。細胞ベレットを
水洗し、リゾチーム２ ｇ、 Ｉ ｍＭ ＰＭＳＦ（弗
化フェニルメチルスルホニル） 、Ｉ ｍＭ ＴＰＣに
（ｌ−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチル
ケトン）及びＤＮａｓｅ １５００μｇを含有するグリ
シン緩衝液（０，１Ｍグリシン、トリス塩基によりｐｌ
８．０） ５００ ｍｌに再懸濁し、室温で３０分培
養した。次にｐＨをＮａＯＨて１０に上げ、ビードビー
タ−（バイオスペック・プロダクツ社、オクラホマ州パ
ードルスピル）により、氷上で３０秒の打撃を５分間隔
で４回与えて細胞を破裂させた。 次に抽出液を１０，０００ ｘＧて３０分遠心分離した
。 実施例４ クローンｐＣＨ−８３でつくられるＭ−７毒
素蛋白質の単離及び精製 アフィニティークロマトグラフィ［クアトレカサ・ビー
（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａ、 Ｐ、）及びアンフィンセ
ン・シー・ビー（Ａｎｆｉｎｓｅｎ、 Ｃ，Ｏ，）［１
９７１年］ Ｍｅｔｈ。 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２巻［ダブリュー・ビー・ジ
ャコピー編、アカデミツクブレス社、ニューヨークコを
用いで、ｐＣＨ−８３からの蛋白質を次のように精製し
た。クアトレカサ及びアンフィンセンの記述のとおりに
、臭化シアンでセファロースを活性化した。 活性化したセファロースにうさぎ抗Ｍ−７結晶血清を添
加し、たえずかきまぜながら室温で一夜培養した。アフ
ィニティー樹脂を１ｚエタノールアミン、３Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ９，２でτ先い、７欠に０．０２＄ナトリウム
アジドを含有するＴＢＳ （０，０２Ｍ ）リス−ＭＣ
Ｉ、０．０７ＭＮａＣｌ、ｐＨ７，５）で洗った。ｌ
ｍＭ ＥＤＴＡ （エチレンジアミン四酢酸） 、ｌ
ｍＭ ＰＭＳＦ、 １ ｍＭ ＴＰＣに、及び０．０２
＄ナトリウムアジドを含有するｐＨＩｏ（）リス塩基で
）の０．団グリシン中でカラムを平衡化した。上のよう
に調製した大腸菌抽出液をカラムに装填し、４℃で６４
時間再循環させた。抽出液を団ＮａＣｌ及びＯ，１Ｍグ
リシン−トリス（ｐＨ１０）てカラムから洗い、結合Ｍ
−７毒素を３Ｍ過塩素酸ナトリウム、０．１Ｍグリシン
−トリス（ｐＨ１０）てカラムから除去した。次にＭ−
７毒素を水に対して透析しＪｖ？Ｊしたくマイクロプロ
Ｄ：コン、ピアース・ケミカル社、イリノイ州ロックフ
ォート）。 植生を保護するため、精製されたＭ−７毒素を、出没す
る鞘翅目の甲虫に感受性のある植生に投与（施用）でき
る。この技術で周知の適当な被覆剤を用いで、Ｍ−７毒
素を環境的に安定化させるのが有利である。 実施例５ シュードモナス・フルオレッセンスへのＭ−
７毒素遺伝子の二次クローン化及び発現 Ｍ−７毒素遺伝子をもつ５．８ ｋｂ ＤＮＡ断片を１
ラスミドρＣＨ−８３からＢａｎ＋旧で切り取り、精製
し、プラスミドｐＲ０１６１４のＢａｍＨ１位置へ二次
クローン化した。 シュードモナス・フルオレッセンスをこのプラスミドで
形質転換した。組み替えシュードモナス細胞によるＭ−
７毒素の発現は、ウェスタン・プロットでの確認によっ
て証明された。 実施例６ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエ
ゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、の胞子及び結晶の試験 上に記述されたとおりに得られるバシラス・スリンギエ
ンシス菌株サンディエゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、
の胞子と結晶を種々の昆虫に対して試験した。試験され
た昆虫種と結果の要約は、第１表に一覧されている。 Ｄ、ウンデシムブンクタータ（西部基点ウリハムシ、Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ ５ｐｏｔｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｂ
ｅｅｔｌｅ、ＷＳＣＢ）の活性についての試験に使用さ
れる方法は、噴Ｍ搭装置内でレタス葉のディスクへ胞子
／結晶懸濁液を噴霧することからなる。くこの昆虫種の
幼虫はレタス葉で生育する。）層流フード内で噴霧液を
乾燥し、容器内の湿ったろ紙上に萱いた。ＷＳＣＢの幼
虫１０匹を加え、容器を２５℃、１４時間の光同期で培
養した。新しく処理したディスクを必要に応して加えた
。食物接種の抑制が認められ、５日と７日に死亡率を記
録した。２回の生物検定の結果を第２表に示す。 ピラルタ・ルテオラ（Ｐｙｒｒｈａｌｔａ １ｕｔｅｏ
ｌａ、ニレハムシ）に対するＭ−７毒素の活性を試験す
るために、Ｍ−７結晶から溶解化された蛋白質をニレの
葉に施用した。次に乾燥した葉を容器内の湿った砂の上
に置いた。Ｐ、ルテオラ幼虫５〜１０匹を加え、容器を
室温で培養した。３日と５日に死亡率を記録した。葉表
面のＣｌｍ２当り毒素＋２０ ｎｇのＬＣ５０をこれら
の検定から計算した。 表Ａ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴの毒素遺
伝子を暗号化したヌクレオチド配列表Ｂ バシラス・スリンギエンシス菌株サン ディエゴの演えき的に導かれたアミノ酸配列
シス毒素遺伝子のクローン化及び発現に関する。 ［先行技術及び問題点コ 胞子形成微生物のバシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、 Ｂｔ）は
、最もよく知られた昆虫毒素をつくる。この毒素は、δ
−エンドトキシンと指定された蛋白質である。これはａ
ｔの胞子形成細胞によって合成される。感受性のある昆
虫の幼虫が毒素の結晶型を摂取すると、毒素は昆虫の腸
液プロテアーゼにより生物学的活性のある部分に転化さ
れる。主要標的は昆虫の腸上皮細胞であっで、これが急
激に破壊される。 Ｂｔ毒素の活性は非常に高く、感受
性のある幼虫を殺すのにナノグラム単位の量しか必要で
ないことか経験かられかっている。 ８ｔの報告された活性範囲は、農林業で大きな問題とな
っている昆虫である鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏρｕｔｅｒａ
）の範囲内の昆虫橿を包含する。活性範囲はまた双し類
（［１ｉｐｔｅｒａ）の昆虫も包含する。これには蚊と
ブヨ（ｂｌａｃｋｆｌｙ）の幾つかの種が含まれる。コ
ーチ・ティー・エル（Ｃｏｕｃｈ、 Ｔ、Ｌ、）（１９
８０年）「バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・
イスラエレンシスの蚊病源性Ｊ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ２２巻６１−６７頁：ビーグル・シー・シー（
Ｂｅｅｇｌｅ、 Ｃ，Ｃ，）（１９７８年）「農業生態
系における昆虫性細菌の利用ｊ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ １ｎｄｕ−ｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏ３ｙ ２０巻９７−１０４頁を参照のこと。 クリーブ（Ｋｒｅｉｇ）ら（Ｚ、 ａｎｇ、 Ｅｎｔ、
（１９８３年）９６巻５００−５０８頁）はパンラス・
スリンキニンシス・バラエティ”テネアリオニス（Ｂ、
ｔｈｒｉｎ３ｉｅｎｓｉｓｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ）と名付けられたＢｔ分離体について記述して
いるが、これは鞘翅目の２種類の甲虫に対して活性があ
ると言われている。これらはコロラド・ポテト・ビート
ルのレブチノタルサ・デセムリネアータ（Ｌｅｐｔｉｎ
ｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）７と７ゲラ
スチカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ）で
ある。このような活性をもつと報告された既知のＢｔ分
離体はこれだけである。すでに確認されたＢｔ菌昧はす
べて、いも虫（鱗翅類）やハエの幼虫（双翅類）に対し
て活性をもつものであった。 クリーブらのｅｔ分離体は、本発明の新規なりｔ遺伝子
源として使用される８を分離体との並行比較のため人手
できない、従っで、クリーブらのＢｔ分離体か公衆の手
に入らない以上、クリーブらの公告は合衆国法の下で法
的に有効な特許法の弁解ではない。 ［問題点を解決する手段］ 鞘翅目の甲虫に有毒な毒素遺伝子のクローン化及び発現
が明らかにされ、特許請求されている。 クローン化された遺伝子でつくられる毒素は、鞘翅目の
甲虫に対して活性があるが、トリコブルシア・二（Ｔｒ
ｉｃｈｏρ１ｕｓｉａ旧）、スボトプテラ・エクシグア
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、又はネツタ
イシマ蚊（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｉｔｉ）に対しては活性
がない。鞘翅目に含まれるものとしで、農業上大きな損
害をもたらす種々のディアブロチイカ（Ｄｉａｂｒｏｔ
ｉｃａ）＋！（ハムシ科Ｃｈｒｙｓｏｍｅ ｌ １ｄａ
ｅ）がある。例えば、ディー・ウンデシムブンクタータ
（［１，ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔ−ａｔａ）（西部班
点つリハムシ）、ディー・ロンギコーニス（Ｄ、 Ｉｏ
Ｂｉｃｏｒｎｉｓ）（ノーザンーコーンールートワーム
）、ディｍ−バージテラ（［）、 ｖｉｒｇｉｔｅｒａ
）（ウェスタン・コーン・ルートワーム）、及びディー
・ウンデシムブンクタータ・ハワーデイ（Ｄ。 ｕｎｄｅｃｉ＋ｎｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）
（サザン・コーン赤ルートワーム）がある。 ｒＭ−７Ｊて指定される本発明の青紫遺伝子給源として
使用されるハシラス−スリンキニンシス分離体は、独特
のパラ胞子体く結晶）をもつ点て異例である。これは位
相差顕微鏡下に外観が暗色で、平らな角型の外形を呈す
る。 現在バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ（Ｂ
、ｔ、ｓｄ）として知られるバシラス・スリンギエンシ
ス門づの二次培養基は、１９８５年２月２７日、合衆国
イリノイ州ビオリア、合衆国ａ務省、北部研究所の永久
保存施設に寄託された。培養基は、保存施設からＮＲＲ
Ｌ ８−１５９３９の寄託番号を指定された。 この寄託物は、これを開示した特許の授与により一般に
人手できる。寄託物はまた、本出願又はその後代の対応
出願がなされている国の外国特許法での要求に応して人
手できる。しかし、寄託物が人手できるからといっで、
政府決定によって授与される特許権を侵害してまで、本
発明の実施権を構成するものではないことを了解された
い。 バシラスースリンギエンシス菌株サンディエゴ、ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５９３９はこの技術の標準的な培地及び醗酵
手法を使用して培養できる。醗酵周間の完了後、この技
術に周知の手段により、まずＢｔ胞子と結晶を醗酵液か
ら分離することによっで、細菌を収穫できる。細胞から
のＤＮＡ （染色体とプラスミド）を標準手順によって
単層し、この技術で周知の手順によって精製できる。例
えば、このような標準手順はマニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、分子りａ−ン化（１９８２年）、コールド
スプリングハーバ−研究所、に明らかにされている。 精製ＤＮＡを次に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化
させることができる。 次にＢ、ｔ、ｓｄ ＤＮＡのシーンバンクを構築するこ
とがてきる。本発明では、上記のように得られる精製Ｂ
、ｔ、Ｓｄ ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ旧
で消化させ、周知の人手できるブラスミＦｐＢＲ３２２
のＲａｍ１位査ヘクローン化した。 Ｂ、ｔ、ｓｄのＤＮＡのシーンバンクが構築されたら、
次にこのシーンバンクを選別するためにＤ Ｎ Ａプロ
ーブを構築する必要がある。この臨床的ＤＮＡプローブ
の構築は、Ｂ、ｔ、ｓｄ培養基からＭ−７毒素結晶を単
離することによって開始された。 回収された門・７毒素結晶を標準手順によって精製し、
次にトリプシンで消化させるとペプチド断片がつくられ
る。これらのトリプシン性の断片の幾つかのもののアミ
ノ酸配夕１１は標準手順によって決定された。続いで、
ある配列の選択後、プローブを既知手段により化学的に
合成した。生ずるプローブに標識を付け、この技術で知
られた手順によって交雑（ハイブリダイゼーション）さ
せた。 その結果、陽性クローン、すなわち構築された１０−ブ
へ交雑したものが検出された。 陽性クローンの代表を、標準手順によって開発されたう
さぎの抗門づ結晶抗血清を使用してウェスタン・プロッ
トにかけた。Ｍ−７毒素のクローン化と発現は、陽性ク
ローン及びＭ−７毒素結晶に対する抗体で陽性反応が見
られた時に、成功の確認が得られた。 代表的な陽性クローンから単離された組替えプラスミド
は、Ｂａｎ旧位置へ挿入された５、８ ｋｂ ＤＮＡ断
片をもつことがわかった。この５．８ ｋｂ ＤＮＡ断
片は、Ｂａｍ旧によって代表的陽性クローン（ｐＣ）Ｉ
−８３）から切断、精製され、次に既知の人手できるブ
ラスミｔ”ｐＲ０１６１４のＢａｎ旧位置へ二次クロー
ン化された（Ｊ、 Ｂａｃｔ、［１９８２年］１５０巻
６０頁；合衆国特許第４ 、３７４ 、２００号）。プ
ラスミドｐＲ０１６１４は、下記の住所の北部研究所か
ら人手でき、その寄託番号はＮＲＲＬ Ｂ−１２１２７
である。プラスミドはｐＢＲ３２２から誘導され、特異
なＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ旧、５ａ１１．及びＰｖｕ■
制限位置をもつ。Ｐｓｔｌ挿入物はカルへニジリン抵抗
遺伝子と緑Ｉｌｌ菌（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）複
製系を包含している。シュードモナス・フルオレッセン
スはこの構築されたシャトルベクターによって形質転換
され、Ｍ−７毒素の発現はウェスタン・プロットでの確
認により証明された。 プラスミドｐＣＨ −８３、又は５．８ ｋｂの断片挿
入物をもつプラスミドρＲＯＩ６＋４は、周知の手順、
例えば透明溶菌液−密度勾配平衡手順を使用しで、細菌
宿主から回収できる。所望によりＢａｍ−旧での消化に
より、５．８ ｋｂ断片をｐＲ０１６１４から切り取り
、別の宿主への形質転換のため異なるベクターへクロー
ン化できる。これらの手順はいずれも当業者に周知であ
る。 大腸菌宿主中のブラスミ）’ｐ＋−１１−８３は、６１
６０４イリノイ州ビオリア、北部研究センター、培養基
保存研究／ＩＩ’Ｓ酵研究所、ＡＲ５特許保存施設に寄
託された。寄託物は、同施設の手で少なくとも３０年間
、永久保存施設内に保存される。寄託は１９８５年７月
１８日に行なわれ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９８１の寄託番
号を付された。二次培養基は、寄託物を明らかにした特
許の授与により、一般に入手できる。寄託物はまた、本
出願又はその後代の対応出願がなされている国の外国特
許法での要求に応して人手できる。しかし、寄託物が人
手できるからといっで、政府決定によって授与される特
許権を侵害してまで、本発明の実施権を構成するもので
はないことを了解されたい。 本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物宿主中に導入で
きる。毒素遺伝子（Ｍ−７）の発現の結果、直接又は１
接的に殺虫剤が細胞内に生産され、維持される。適当な
宿主、例えばンユートモナスの場合、鞘翅目の甲虫が生
色する場所に微生物を施用すると、これらは増殖し、感
受性のある甲虫に摂取される。その結果、望んでいない
甲虫が防除される。その代りに、毒素ト１−７遺伝子の
宿主となった微生物を、細胞内につくられる毒素の活性
を持続させるような条件下に処理できる。次に処理１胞
を目標害虫の環境に施用できる。生ずる生成物は、Ｍ−
７毒素の毒性を保持している。 Ｍ−７毒素遺伝子を適当なベクター経由で微生物宿主に
導入し、宿主を生きた状態で環境に施用する場合、ある
宿主微生物を使用することが必須である。選択されるの
は、対象となる一つ以上の作物の「植物領域」（＝フィ
トスフェア）（葉面＝フィロプレイン、葉周辺＝フィロ
スフェア、根周辺：リゾスフェア、及び／又は眼表面＝
リゾプレイン）を占めることがわかっている微生物宿主
である。これらの微生物は、特定環境（作物と他の昆虫
の生、白、環境）で野性型微生物と順調に競合でき、ポ
リペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現
をもたらし、また望ましくは環境上の劣化や不活性化か
らの殺虫剤の改良された保護を提供するようなものが選
択される。 広範囲の重要作物の葉面や種周辺に生息する微生物は、
多数知られている。これらの微生物は細菌、藻類、及び
カビを包含する。特に興味ある微生物は次のようなもの
である。細菌では、厘毛でシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅ−ｒｗｉｎｉａ）、
セラティア（Ｓｅｒｒａｔ、ｉａ）、キサントモナス（
Ｘａｎｔｈｏ＋＊ｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ Ｉ
１ｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アットバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃ−ｔｅｒ）、
リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及び
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ）。カビ、
特に酵母では、厘毛てサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコツカス（Ｃｒソｐｔ、ｏｃ
ｏｃｃｕｓ）、クルイヘロミセス（にｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒ（１−ｂｏｒ
ｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ）、及びアウレオバラジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄ
ｉｕｍ）。特に興味あるのは、次のような植物領域細菌
種である。ンユートモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇ−ａｅ）、シュードモナス・
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター
９キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕ
ｍ）、アグロバクテリウム会ツメファシェンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｎ＋ｅｆａ−ｃｉｅｎｓ）
、ロートシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キ
サントモナス◆カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ｃａＩｌｌｐｅｓｔｒｉｓ）。 リゾビウム・メリオチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉ
ｏｔｉ）、アルカリゲネス−Ｘントロフス（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ ｅｎｔ−ｒｏｐｈｕｓ）、及びアットバ
クター・ヴインランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖ
ｉｎｌａｎｄｉｉ）。また、興味ある植物領域の酵母種
は次のものである。ロートトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニス（Ｒ。 ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ，マリナ（Ｒ，ｍａｒｉｎａ）
、Ｒ，アラランチフカ（Ｒ，ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、
クリプトコツカス・アルビヅス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ，ジフルエンス（Ｃ，ｄｉ
ｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｃ，ラウレンチイ（Ｃ，１ａｕｒｅ
ｎｔｉｉ）、サツカロミセスΦロゼイ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（
Ｓ、 ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ、セレヴイシア
エ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス
拳ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅ
ｕｓ）、Ｓ、オトルス（Ｓ、 ｏｄｏｒｕｓ）、クルイ
ヴエロミセス・ヴエロナエ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｖｅｒｏｎａｅ）、及びアウレオバラジウム・ポル
ランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｏｌｌｕｌａ
ｎｓ）。 有色素微生物が特に興味がある。 遺伝子の安定な維持と表現を可能にするような条件下に
、毒素を表現するＭ−７遺伝子を微生物宿主中に導入す
るには、多様な方法が広く利用てきる。例えば、毒素遺
伝子の表現のため転写及び翻訳の調節信号を包含するＤ
ＮＡ構築物を提供できる。 また、糾み込みが起こるように、調節制御下の毒素遺伝
子と、宿主生物中の配列と相同なりＮＡ配列とを提供で
きる。及び／又は、絹み込み又は安定な維持が起こるよ
うに、宿主中で機能的な複製系を提供できる。 転写開始信号はプロモーターと転写開始スタート位置を
包含する。ある場合には、毒素の調節的な発現を提供す
るのが望ましい。その場合、毒素の発現は環境への放出
後にのみ生ずることになる。 これはオペレーターで、又は微生物の物理的ないし化学
的環境の変化により誘導可能なアクチヘーターやエンハ
ンサ−への領域結合で達成できる。 例えば、感温性調節領域を使用すると、生物は毒素の発
現なしに実験室で生育てきるが、環境への放出により発
現が始まる。他の手法は毒素の発現を抑制するような特
定的な栄養培地を実験室で使用し、環境中の栄養培地で
毒素の発現が可能になる。翻訳開始には、リボゾームの
結合位置と翻訳開始コドンが存在する。 伝令の表現を強化するには活性オペレ−ターを使用する
か、又は伝令ＲＮＡの安定性を強化するような配列を使
用するなと、種々の操作を利用できる。イニシェーショ
ン領域と翻訳終了領域は、停止コードン、ターミネータ
−領域、及び任、會付加的にポリアデニル化信号を包含
する。 転写方向、すなわちコーディングないしセンス配列の５
′から３″への方向で、構築物は転写調節域があればこ
れと、調節域がプロモーターの５′又は３′のいずれか
でありうる場合はプロモーター、リボゾーム結合位置、
イニシェーションコドン、イニシェーションコドンと同
フェイズのオーブンリーディングフレームをもつ構造遺
伝子、停止コドン、もしあればポリアデニル化信号配列
、及びターミネーション領域を包含する。２本鎖として
のこの配列は、それ自体、微生物宿主の形質転換のため
に使用できるが、通常は、マーカーに関係するＤＮＡ配
列に含まれており、その場合第二のＤＮＡ配列は毒素発
現１ｌＩｌ築物に加わるか、又はＤＮＡの宿主への導入
中に、別個のＤＮＡ断片として毒素発現構築物と一緒に
てきる。 マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選択に用
いる構造遺伝子のことである。マーカーは、通常、選択
的な利点を提供するもので、例えば、抗生物質や重金属
抵抗性なとの殺生物抵抗性、栄養要求宿主に原栄養性を
与えるような相補性などを提供する。変更宿主が選択で
きるだけでなく、畑で競合できるように、相補性を使用
するのが好ましい。構築物の開発ならびに宿主変更のた
め、一つ以上のマーカーを使用できる。畑での他の野性
型微生物に対する競合的な利点を提供することによっで
、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート化剤、
例えば担鉄細胞を発現する遺伝子を、毒素発現用の構造
遺伝子と共に宿主に導入できる。こうしで、担鉄細胞の
強化された発現により、毒素生産宿主に競合的な利点が
得られ、宿主が野性型微生物と効果的に競合し、保護し
ようとする植物の環境に生態的地位を安定に占めること
ができる。 機能的な複製系が存在しない場合、構築物は宿主中の配
列と相同な、少なくとも５０ ｂｐ、好ましくは少なく
とも約＋００ ｌａｐ、及び通常的１ｏｏｏ ｂｐまで
の配列をも包含する。こうすると、正当な組替えの確率
が強化されるため、遺伝子が宿主中に組み込まれ、宿主
によって安定に維持される。毒素遺伝子が、相補性を提
供する遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子と近接して
いることが望ましい。 従っで、毒素遺伝子が失われるような場合は、生ずる生
物は相補性の遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子も失
う可能性があり、このため旭偏の構築物を保持している
遺伝子と環境中で競合できなくなる。 細菌、バクテリオファージ、シアノ細菌、藻類、カビ等
のような広範囲の微生物宿主から、多数の転写調節域が
入手できる。種々の転写調節域は、ｔｒｐ遺伝子、ｌａ
ｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左右プロモーター、Ｔ
ａｃプロモーター、宿主中で機能的な場合、毒素遺伝子
と関連した天然に生ずるプロモーターを包含する。例と
しで、合衆国特許第４．３３２，８９８号、第４．３４
２，８３２号、及び第４，３５６，２７０号を参８イの
こと。終了域は、転写開始域と通常関連した終了域か、
又は二つの領域が宿主中で両立し機能的である限り、異
なる転写開始域と関連する終了域でもよい。 安定なエピゾームの維持又は組み込みを望んでいる場合
は、宿主中で機能的な複製系をもつプラスミドが使用さ
れよう。複製系は、染色体、宿主又は別の宿主中に通常
存在するエピソーム要素、又は宿主中で安定なウィルス
からの複製系から誘導される。プラスミドは、ρＢＲ３
２２、ρＡＣＶＣ＋８４、Ｒ５Ｆ！０１０、ｐＲ０１６
１４等多数が利用できる。例としで、オルソン（Ｏｌｓ
ｏｎ）ら（１９８２年） Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｄ
ａｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年） Ｇｅｎｅ １６
巻２３７頁、及び合衆国特許第４．３５６．２７０号、
第４，３６２，８１７号、及び第４，３７１．６２５号
を参照のこと。 Ｍ−７遺伝子は、開始域の調節制御下に置かれるように
、転写・翻訳開始域と転写・翻訳終了域との間に導入で
きる。この構築物はプラスミド中に含まれるものであっ
で、プラスミドは少なくとも一つの複製系を包含するが
、プラスミド開発中のクローン化に一つの複製系を使用
し、最終宿主中ての機能化に第二の複製系が必要な場合
は、一つ以上の複製系を包含できる。更に、すてに述べ
た一つ以上のマーカーが存在しろる。葡み込みを望んで
いる場合は、プラスミドが宿主ゲノムと相同の配列を包
含するのが望ましい。 形質転換体は、慣用方法に従って単離できる。 通常、選択的手法を使用し、望んでいる生物を未変更生
物から選び出し、存在していれば、これを移し替える。 次に形質転換体の殺虫活性を試験できる。 好ましい宿主、特に植物領域（フィトスフェア）中のも
のは、宿主中で毒素の環境的安定性を強めるようなある
特性をもっていよう。保護的性質は、低水準の蛋白分解
的劣化、厚い細胞壁、色素保有等を包含する。宿主向け
に興味ある他の性質は、葉親和性、対嘩乳類毒性の欠如
、摂取害虫への誘引力、取扱いと保存の容易さ、畑での
増殖速度、競合性等を包含する。 畑施用においては、形質転換体菌株は、害虫から１呆護
しようとする植物の根周辺や葉面のような、害虫の自然
な生息環境に施用されよう。形質転換体菌株は、Ｍ−７
毒素を生産しつつ、その自然な生息環境中で生育し、Ｍ
−７毒素は幼虫又は成虫に吸収及び／又は摂取されるか
、卵に有毒な効果をもってあろう、微生物の持続性が植
生の長期保護をもたらすが、時とき投与を繰り返す必要
がかもしれない。生物は、噴霧、浸漬、地中への注入、
種子被覆、苗木被覆又は噴霧等によって施用できる。 畑への投与の場合、生物濃度は、一般にｍｌ当り細胞数
で１０６ないし１０１０個、ヘクタール当り施用容量は
一般に約０．１オンスないし２ ｌｂ以上であろう。 植物部分に投与される場合、生物濃度は通常、Ｃｍ２当
り細胞数で１０３ないし１０６個であろう。 目標害虫の環境に死菌を施用する時に細胞中の毒素の活
性を持続させるために殺虫剤含有細胞を処理する場合は
、適当な宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれかを
包含するが、通常、哺乳類のような高等生物に有毒な物
質を生産しないものに限定される。しかし、毒素が不安
定であったり、施用水準が哺乳類宿主への毒性の可能性
を避けられるほと十分に低い場合は、高等生物に有毒な
物質をつくる生物も使用できる。宿主としで、特に興味
あるものは、原核生物と、カビのような低級真核生物で
ある。グラム陽性及びグラム陽性双方の原核生物の例は
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニ
ア（１：ｒｙｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）
、サルモネラ（Ｓａｌｎ＋ｏｎｅｌ Ｉａ）及びプロテ
ウス（ｐｒｏｔｅｕｓ）のような腸内細菌科（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ） ：バシラス科（Ｂａ
ｃｉ ｌ １ａｃｅａｅ） ；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｎ＋）のようなりゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａ
ｃｅａｅ） ：発光細菌（ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉ＋
ｎｎ）、ザイモモナス（ＺｙｒＲｏｍｏｎａｓ）、セラ
チア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｌ
ｌｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デスルホビ
ブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏ−ｖｉｂｒｉｏ）、スピリルム
（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）のようならせん歯科（Ｓｐｉｒ
ｉｌｌａｃｅａｅ） ：乳酸かん歯科（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃ ｉ ｌ −Ｉａｃｅａｅ） ：シュートモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）やアセトバクター（Ａｃｅｔｏ
ｂａｃ−ｔｅｒ）のようなシュートモナス科（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｄａｃｅ−ａｅ） ：アソトバクター科（
Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、及びニトロバク
ター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）である。 真核生物ではサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）とシゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）のような酵母を含めた、藻菌類（Ｐ
ｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）と子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）のようなカビ類（ｆｕｎｇｉ）：及びロード
トルラ（Ｒｈｏ−ｄｏｔｏｒｕｌａ）、アウレオバラジ
ウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ−ｄｉｕｌ！１）、スポロボ
ロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）等のような
担子菌類（Ｂａｓｉｃｌｉｏｍｙｃｅｔｅｓ＞酵母があ
る。 生産を目的として宿主細胞を選択する際に特に興味ある
性質は、宿主へのＭ−７遺伝子導入の容易さ、表現系の
人手性、表現効率、宿主中における殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セル用に興味ある性質は厚い細胞壁、色素保有、及び細
胞内包装又は封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉親
和性；対哨乳頚毒性の欠如；摂取害虫への誘引力；毒素
へ損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。 他の考慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、
保存安定性等がある。 特に興味ある宿主生物は、ＣＩ −Ｆ’ ）ルラ種、ア
ウレオバラジウム種、サツカロミセス種、及びスポロボ
ロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウィ
ニア種及びフラボバクテリウム種のような葉面性の生物
；又はエシェリキア種、ラクトバシラス種、バシラス種
等の他の生物を包含する。特定的な生物は緑ＶＡ菌、シ
ュードモナス・フルオレッセンス、サツカロミセス・セ
レヒシアエ、バシラス・スリンギエンシス、大腸菌、枯
草菌等を包含する。 細胞は通常、無傷であり、殺菌時に胞子型よりは実質的
に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用できる。 細胞増殖を種々の方法で抑制できるが、但しその手法が
殺虫剤の性状に悪影響したり、殺虫剤を保護する際に細
胞能力を消したりしてはならない。 方法としては、物理的処理や化学的処理、細胞の物理的
性状を変える、又は細胞の物理的性質を無傷で残すなど
がある。 宿主細胞を不活性化する種々の方法は、通常５０℃ない
し７０℃の加熱；凍結；Ｕｖ照射；凍結乾燥；毒素、例
えば抗生物質；フェノール類；アニリド類、例えはカル
バニリドとサリチルアニリド；ヒドロキシュリア；第４
級類；アルコール類；抗菌染料； ＥＤＴＡ及びアミジ
ン類；ハロゲン化剤、例えば塩素化剤、臭素化剤又はヨ
ウ素化剤のような非特異的有機及び無機化学物質；アル
デヒド類、例えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデ
ヒド；オソンやエチレンオキシドのような有毒ガス；過
酸化物；ブソラレン類；乾燥剤等。これらを個々に、又
は組合わせて使用できる。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿
主細胞の性質、架橋剤による細胞壁の固定及び保存のよ
うな細胞構造の変更の性質などによって変わる。 細胞には、概して強化された構造的安定性があり、これ
が畑での環境劣化抵抗性を強化している。 殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制するように不活性化
方法を選択すべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋
白質を東橋するから、プロ型ポリペプチド’Ｈ虫剤の加
工を抑制できる。不活性化又は殺菌方法は毒素の生体利
用効率又は生物活性の少なくとも実質部分を保持する。 Ｍ−７殺虫剤遺伝子を含有する細胞宿主は、Ｄ Ｎ Ａ
構築物が選択的利点もつ場合、任意好都合な栄養培地で
生育てき選択培地を与えるので、細胞の全部又は実質的
に全部がＭ−７遺伝子を保持する。次にこれらの細胞を
慣用方法に従って取り入れることができる。その代りに
、取り入れる前の細胞を固定することもてきる。 毒素を含有する宿主生物の処理方法は、幾つかの役割を
果たすものとなっている。第一に、処理は構造的一体化
を強めて（る。第二に、蛋白分解性の劣化に対する感受
性を減らすように毒素を変更し、かつ又は細胞中に天然
に存在するプロテアーゼの蛋白分解活性を低下させるこ
とによっで、処理は毒素の強化された蛋白分解安定性を
提供できる。細胞な簾偏の段階で変更するのが好ましく
、また毒素蛋白質の実質的なＳ′積があった時も変更す
るのが好ましい。これらの変更は、広範囲の化学的反応
性をもつ化学試薬を使用するなと、種々の方法で達成で
きる。約−１０ないし６０°Ｃの範囲の温度で、かきま
ぜを加えで、又は加えずに、化学試薬を含有する液体試
薬媒体と無傷の細胞を一緒にする０反応時間は経験的に
決定でき、試薬及び反応条件により大幅に変わる。細胞
濃度は約１０２から１０１０の範囲にある。 化学試薬として特に興味あるものは、ハロゲン化剤、特
に原子番号＋７−８０のハロゲン類である。 更に詳しくは、温和な条件下で、望んでいる結果を達成
するのに十分な時間に、ヨウ素を使用できる。他の適当
な手法としては、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒ
ドのようなアルデヒド類での処理；塩化ゼフィランと塩
化セチルビリゾニウムのような抗感染剤；イソプロパツ
ールとエタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤
やヘリ−固定剤のような種々の組織学的固定剤［フマソ
ン（ｔｌｕｍａｓｏｎ）、グレッチェンΦエル（Ｇｒｅ
ｔｃｈｅｒ＋＋ Ｌ、）、Ａｎｉｍａｌ Ｔｉ５ｓｕｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （動物組織技法）、ダブリュ
ー・エッチ・フリーマン社、１９６７年、を参照のこと
］ ；又は目標害虫環境へ細胞を施用する時に細胞中に
生産される毒素の活性を持続させる物理的処理（加熱）
と化学的薬剤との組合わせがある。 ヨウ素でのハロゲン化には、温度は一般に約Ｏないし５
０℃の範囲にあるが、反応は室温で都合よ〈実施できる
。酸性の水性媒体、特に約０．５〜５Ｍの範囲のカルボ
ン酸水溶液中における０、５ないし５％の三ヨウ素化物
又はヨウ素を使用してヨウ素化を行なうのが好都合であ
る。酢酸を都合よく使用できるが、概して約１−４個の
炭素原子の他のカルボン酸も使用できる。反応時間は、
一般に１分未満から約２４時間、通常的１−６時間の範
囲であろう。 ジチオナイト、チオ１Ｉｉｔ酸ナトリウムのような還元
剤や、畑での最終使用に適合した他の還元剤との反応に
より、任意の残留ヨウ素を除去できる。更に、変更した
細胞を、当業者に周知のように、全反応媒体を除去する
ための洗浄や、乾燥型での単離、典型的な粘着剤、展着
剤、及び農業用に一般に利用される助剤での処方といっ
た処理に、なおもかけることができる。 特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬である。 この目的には、幾つかの試薬が知られている。その処理
によっで、殺虫剤の安定性が強化される。すなわち、畑
条件下に殺虫剤の持続性ないし残留活性が強化されなけ
ればならない。こうしで、未処理細胞の殺虫活性が消滅
するような条件下に、処理細胞の活性は１〜３倍長い期
間にわたって持続する。 細胞を種々の方法で処方できる。無８１（オ科（フィロ
珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）や植物材料（とう
もろこし芯粉末、もみ殻、くるみ殻等）のような種々の
不活性材料と混合することによっで、これらを水和剤、
粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は、展着／粘着
助剤、安定化剤、その他の殺虫添加剤、又は表面活性剤
を包含しうる。 液体処方剤は、水性基盤でも非水性でもよく、フオーム
、ゲル、懸濁液、乳化出来る濃縮物等として使用できる
。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤、又は重
合体を包含しうる。 殺虫剤濃度は、特定処方剤の性質、特に処方剤が濃厚液
か直接使用のものかによって大１幅に変わる。殺虫剤は
少なくとも１重量％、及び１００重量％でも存在しうる
。乾燥処方剤は約１−９５重量％の殺虫剤をもつが、液
体処方剤は液相中に概して１−６０重量％の固形分をも
っている。概して処方剤は、ｍｇ当り約１０２ないし約
１０４個の細胞をもつ。これらの処方剤は、ヘクタール
当り約５０ｍｇ（ｉｌｌ１体又は固体）ないしＩ ｋ、
ｇ以上の率で投与される。 処方剤を害虫環境へ、例えば植物、土壌又は水へ、噴霧
、散布、散水等によって施用できる。 以下は、最良の態様を含めた本発明の実施手順を示す実
施例である。これらの実施例は、限定的に考えられては
ならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、
溶媒混合物の割合はすべて容量による。 実施例１ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエ
ゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、の培養バシラス・スリ
ンギエンシス菌株サンディエゴＮＲＲＬ Ｂ−１５９３
９の二次培養基又は出発培養基を使用しで、しＢブロス
として知られる次の培地に摂取できる。 トリプトン １０ ｇ 酵母エキス ５ｇ ＮａＣｌ ５ ｇ ５Ｎ ＮａＯＨ０，６ｍｌ 水 １０００ ｉｔ標
準的な微生物学的手法などによっで、上の培地を接種前
に滅菌し、無菌手順を用いて接種を行なう。Ｍ−７″ｍ
胞を３０℃で３−４日生育させる。 詳細な手順は以下のとおりである。 無菌のＰＷＹＥ培地（水１リットル中ペプトン５．０！
、酵母エキス０．１！、 ＮａＣｌ Ｏ，５＄、ｐＨ７
，５に調整）を含有する一連の１５０ ｍｌ三角フラス
コに、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、
ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９をベトリ皿培養基から接種す
る。フラスコを回転振どう機（２０Ｏｒｐｍ）上、３０
℃で一夜培養する。この出発培養基から、その７．５１
を用いて２リツトルフラスコ中のＬＢブロス３００１に
接種する。 しＢブロスのフラスコを出発培養基と同じ条件下に培養
するが、４日後に取り入れる。 上の手順は、この技術で周知の手順により、大醗酵容器
まで容易に規模拡大できる。 上の醗酵で得られるＢｔ胞子及び結晶を、この技術で周
知の手順により単離できる。しばしは使用される手順は
、取り入れた醗酵液を分離手法、η１１えば遠心分離に
かけることである゛。 実施例２ Ｍ−７毒素遺伝子のクローン化及び発現全
体のＤＮＡ （染色体ＤＮＡとプラスミド）を実施例１
のＭ−７細胞から単離し、標準手順によって精製した。 生ずる精！！ ＤＮＡを、供給者の指示を用いて制限エ
ンドヌクレアーゼＲａｍｌで消化させた。消化されたＤ
ＮＡを周知のプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１位量
にクローン化すると、Ｍ−７ＤＮＡのシーンバンクが得
られた。このクローン化手順を、周知の標準的な手順に
従って行なった。 シーンバンクを選別するためのＤＮＡプローブは、次の
ように得られた。Ｎ’／ＳＭ培地（トリプトン１０３、
ＮａＣｌ ５３．酵母エキス５ ｇ、 ＭｇＳＯ４，７
１（２０２ｇ、水１０００ ｍｌ、ｐＨ７，５）中３０
℃で一夜生育させた培養基から、Ｍ−７結晶を単離した
。精製した結晶を８Ｍ尿素、０．１Ｍグリシン、ｐＨ８
，２に溶解し、室温で一夜、トリプシンで消化させた。 生ずるペプチド断片をＣ４逆相多孔カラム上で、アセト
ニトリル中０．１χトリフルオロ酢酸中の９１羞溶液Ａ
（０，１＄）リフルオロ酢酸水溶液）から４０χ溶液
Ａまでの１８０分勾配によって分離した。幾つかのトリ
プシン断片のアミノ酸配列が得られ、３２の１剰性をも
つ長さ１７塩基の混合プローブの合成に６アミノ酸の配
列を選んだ。 ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでプ
ローブに末端標識を付け、Ｍ−７ジーンバンク用に構築
された組替えプラスミドを含有する細菌集落に交雑させ
た。集落のフィルターは、ハナハン（ｌ（ａｎａｈａｎ
）及びメセルソン（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）（１９８０年）
Ｇｅｎｅ１０巻６３−６巻真３従ってつくられた。陽
性集落は、オートラジオグラフィによって確認された。 七つの陽性クローンく代表としてｐＣＨ−８３）から単
離された組替えプラスミドは、ＢａｍＨ１位量に挿入さ
れた５、８ ｋｂ （キロ塩基対）のＤＮＡ断片をもつ
ことがわかった。 ｐｃｔ−８３のウェスタン・プロット［バーネット・ダ
ブリュー・エヌ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、 Ｗ、Ｎ、）［１
９８１年］Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｌ１２巻１９５頁］は、うざぎ抗Ｍ−
７結晶抗血清を用いで、−夜培養基の５０５−ＰＡＧＥ
で行なった。 約８６キロダルトンの蛋白質が確認された。従っで、ク
ローンρＣＨ−８３は、Ｍ−７からの結晶蛋白質による
血清学的身元証明のある蛋白質に対するコードをもつ阿
りＤＮＡ断片を含有している。組替え蛋白質は、所定の
プラスミド構築で転写及び／又は間訳の停止信号が人手
てきないため、溶解化された門−７結晶からの毒素より
大きいこともありうる。 Ｂ、ｔ、ｓｄ毒素遺伝子を暗号化したヌクレオチド配列
を表Ａに示す。演えき的に導かれたアミノ酸配列を表Ｂ
に示す。 この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列はＤＮ
Ａのヌクレオチド配列によって決まる。遺伝暗号の１剰
性のため、すなわち蛋白質をつくるために用いられるア
ミノ酸のほとんどに対しで、一つ以上の暗号化ヌクレオ
チドトリブレット（コードン）を使用できるため、ある
特定のアミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列が暗号
化できる。 このため、遺伝暗号を次のように表わすことができる。 フェニルアラニン（Ｐｈｅ） ＴＴにロイシン（Ｌ
ｅｕ） ＸＴＹイソロイシン（ｌｌｅ）
ＡＴＭメチオニン（Ｎｅ ｔ） Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｌ） ＧＴＬセリン（
Ｓｅｒ） ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ）
ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）
ＡＣＬアラニン（Ａｌａ） ＧＣＬチロシ
ン（Ｔｙｒ） ＴＡＫヒスチジン（Ｈｉｓ
） ＣＡＫグルタミン（Ｇｌｎ）
ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ） ＡＡＫリジ
ン（Ｌｙｓ） ＡＡＪアスパラギン酸（
Ａｓｐ） ＧＡＫグルタミン酸（Ｇｌｕ）
ＧＡＪシスティン（Ｃｙｓ） ＴＧＫト
リプトファン（Ｔｒρ） ＴＧＧアルギニン（Ａ
ｒｇ） ＷＧＺグリシン（Ｇｌｙ）
ＧＧＬ終了信号 ＴＡＪ かぎ：各３文字のデオキシヌクレオチドトリブレットは
、左に５”−末端、右に３′−末端をもつｎ＋ＲＮＡの
トリヌクレオチドに対応している。本明、＊Ｖに記載の
ＤＮＡ配列は、いずれもｍＲＮＡの配列に対応する配列
のＤＮＡ鎖のものであっで、但しウラシルにはチミンが
置き変わる。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成す
るプリン又はピリミジン塩基を表わしている。 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝ニブアニン Ｔ＝チミン ＹがＡ又はＧの場合、Ｘ＝Ｔ又はＣ ＹがＣ又はＴの場合、Ｘ＝Ｃ ＸがＣの場合、Ｙ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ ＸがＴの場合、Ｙ＝Ａ又はＧ ＺがＡ又はＧの場合、Ｗ＝Ｃ又はＡ ＺがＣ又はＴの場合、Ｗ＝Ｃ ＷがＣの場合、２＝、へ、Ｇ、Ｃ又はＴＷがＡの場合、
Ｚ＝Ａ又はＧ ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの場合、ＱＲ＝ＴＣ但しＳがＴ又
はＣの場合、ＱＲ＝ＡＧ Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 以上は、Ｍ−７毒素又は他の有用な蛋白質の新規なアミ
ノ酸配列が、蛋白質の同しアミノ酸配列を暗号化した同
等なヌクレオチド配列によってつくられることを示す。 従って本発明は、このような同等なヌクレオチド配列を
包含している。更に、アミノ酸配列を変更しても蛋白質
の二次構造が変化しないならば、確認された構造と機能
の蛋白質をこのような変更によって構築できることがわ
かった［カイザー・イー・ティー（にａｉｓｅｒ、 Ｅ
、Ｔ、）及びケズディ・エフ・ジエイ（Ｋｅｚｄｙ、
Ｆ、Ｊ、）［１９８４年］ ５ｃｉｅｎｃｅ ２２３巻
２４９−２５５頁］。このように本発明は、蛋白質の二
次構造を変更しないか、又は構造が変更される場合でも
生物活性が同程度に保持されるような、本明細書に記載
のアミノ酸配列の突然変異物を包含している。 実施例３ クローンｐＣＨ−８３によるＭ−７毒素蛋白
質の生産 ｐｃｔ−８３培養基２０リツトル（アンピシリン７０μ
ｇ／ｌを含有するし一ブロス）を和酵容器中で生育させ
、０Ｄ６００＝３．３５で取り入れた。細胞ベレットを
水洗し、リゾチーム２ ｇ、 Ｉ ｍＭ ＰＭＳＦ（弗
化フェニルメチルスルホニル） 、Ｉ ｍＭ ＴＰＣに
（ｌ−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチル
ケトン）及びＤＮａｓｅ １５００μｇを含有するグリ
シン緩衝液（０，１Ｍグリシン、トリス塩基によりｐｌ
８．０） ５００ ｍｌに再懸濁し、室温で３０分培
養した。次にｐＨをＮａＯＨて１０に上げ、ビードビー
タ−（バイオスペック・プロダクツ社、オクラホマ州パ
ードルスピル）により、氷上で３０秒の打撃を５分間隔
で４回与えて細胞を破裂させた。 次に抽出液を１０，０００ ｘＧて３０分遠心分離した
。 実施例４ クローンｐＣＨ−８３でつくられるＭ−７毒
素蛋白質の単離及び精製 アフィニティークロマトグラフィ［クアトレカサ・ビー
（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａ、 Ｐ、）及びアンフィンセ
ン・シー・ビー（Ａｎｆｉｎｓｅｎ、 Ｃ，Ｏ，）［１
９７１年］ Ｍｅｔｈ。 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２巻［ダブリュー・ビー・ジ
ャコピー編、アカデミツクブレス社、ニューヨークコを
用いで、ｐＣＨ−８３からの蛋白質を次のように精製し
た。クアトレカサ及びアンフィンセンの記述のとおりに
、臭化シアンでセファロースを活性化した。 活性化したセファロースにうさぎ抗Ｍ−７結晶血清を添
加し、たえずかきまぜながら室温で一夜培養した。アフ
ィニティー樹脂を１ｚエタノールアミン、３Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ９，２でτ先い、７欠に０．０２＄ナトリウム
アジドを含有するＴＢＳ （０，０２Ｍ ）リス−ＭＣ
Ｉ、０．０７ＭＮａＣｌ、ｐＨ７，５）で洗った。ｌ
ｍＭ ＥＤＴＡ （エチレンジアミン四酢酸） 、ｌ
ｍＭ ＰＭＳＦ、 １ ｍＭ ＴＰＣに、及び０．０２
＄ナトリウムアジドを含有するｐＨＩｏ（）リス塩基で
）の０．団グリシン中でカラムを平衡化した。上のよう
に調製した大腸菌抽出液をカラムに装填し、４℃で６４
時間再循環させた。抽出液を団ＮａＣｌ及びＯ，１Ｍグ
リシン−トリス（ｐＨ１０）てカラムから洗い、結合Ｍ
−７毒素を３Ｍ過塩素酸ナトリウム、０．１Ｍグリシン
−トリス（ｐＨ１０）てカラムから除去した。次にＭ−
７毒素を水に対して透析しＪｖ？Ｊしたくマイクロプロ
Ｄ：コン、ピアース・ケミカル社、イリノイ州ロックフ
ォート）。 植生を保護するため、精製されたＭ−７毒素を、出没す
る鞘翅目の甲虫に感受性のある植生に投与（施用）でき
る。この技術で周知の適当な被覆剤を用いで、Ｍ−７毒
素を環境的に安定化させるのが有利である。 実施例５ シュードモナス・フルオレッセンスへのＭ−
７毒素遺伝子の二次クローン化及び発現 Ｍ−７毒素遺伝子をもつ５．８ ｋｂ ＤＮＡ断片を１
ラスミドρＣＨ−８３からＢａｎ＋旧で切り取り、精製
し、プラスミドｐＲ０１６１４のＢａｍＨ１位置へ二次
クローン化した。 シュードモナス・フルオレッセンスをこのプラスミドで
形質転換した。組み替えシュードモナス細胞によるＭ−
７毒素の発現は、ウェスタン・プロットでの確認によっ
て証明された。 実施例６ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエ
ゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、の胞子及び結晶の試験 上に記述されたとおりに得られるバシラス・スリンギエ
ンシス菌株サンディエゴ、ＮＲＲＬ Ｂ−１５９３９、
の胞子と結晶を種々の昆虫に対して試験した。試験され
た昆虫種と結果の要約は、第１表に一覧されている。 Ｄ、ウンデシムブンクタータ（西部基点ウリハムシ、Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ ５ｐｏｔｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｂ
ｅｅｔｌｅ、ＷＳＣＢ）の活性についての試験に使用さ
れる方法は、噴Ｍ搭装置内でレタス葉のディスクへ胞子
／結晶懸濁液を噴霧することからなる。くこの昆虫種の
幼虫はレタス葉で生育する。）層流フード内で噴霧液を
乾燥し、容器内の湿ったろ紙上に萱いた。ＷＳＣＢの幼
虫１０匹を加え、容器を２５℃、１４時間の光同期で培
養した。新しく処理したディスクを必要に応して加えた
。食物接種の抑制が認められ、５日と７日に死亡率を記
録した。２回の生物検定の結果を第２表に示す。 ピラルタ・ルテオラ（Ｐｙｒｒｈａｌｔａ １ｕｔｅｏ
ｌａ、ニレハムシ）に対するＭ−７毒素の活性を試験す
るために、Ｍ−７結晶から溶解化された蛋白質をニレの
葉に施用した。次に乾燥した葉を容器内の湿った砂の上
に置いた。Ｐ、ルテオラ幼虫５〜１０匹を加え、容器を
室温で培養した。３日と５日に死亡率を記録した。葉表
面のＣｌｍ２当り毒素＋２０ ｎｇのＬＣ５０をこれら
の検定から計算した。 表Ａ バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴの毒素遺
伝子を暗号化したヌクレオチド配列表Ｂ バシラス・スリンギエンシス菌株サン ディエゴの演えき的に導かれたアミノ酸配列
第１表
バシラス・スリンギエンシス菌株サン
ディエゴに対する昆虫の感受性評価
昆虫 試験段階 活性
鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｙａ）
ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）ジアブロチカ
・ウンデシムブンクタータ種 成虫 、幼虫
＋（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃ
ｔａ−ｔａ）−船名 ： 西部斑点ウリハムシ（ｌＪｅ
ｓｔｅｒｎ ５ｐｏｔｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒｂ
ｅｅｔｌｅ） ビラハタ−ルテオラ種（Ｐｙｒｒｈａｌ ｔａ
成虫 、幼虫 ＋＋＋＋１ｕｔｅｏｌａ）−船
名 二 二しハムシ（８１ｍｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ
） ハルチカ・トムｌビシ士種（Ｈａｌｔｉｃａ
成虫、幼虫 ＋＋＋ｔｏｍｂａｃ ｉ ｎａ）
−船名二−ゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌ １ｏｎｉｄ
ａｅ）オチオリンクス・スルカブス種（Ｏｔｉｏｒｈｙ
ｎｃ 幼虫 ＋＋−ｈｕｓ ５ｕ
ｌｃａｔｕｓ）−船名 ： クロフードウソーウムン（
Ｂｌａｃｋ ｖｉｎｅ ｗｅｅｖｉｌ）コナムシ科
（Ｔ ｅ ｎ ｅ ｂ ｒ ｉ ｏ ｎ ｉ ｄ ａ
ｅ ）テネフーリオ・モリトル種（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｍｏｌ 幼虫 ＋＋−１ｔｏｒ）−
船名 二 Ｎイロコナムシ（Ｙｅｌｌｏｗ ｌｌｅａ
ｌｗｏｒｌｌ）トリ本゛リウ訃カスタネウム種（Ｔｒｉ
ｂｏｌ ｉｕｍ 成虫 、幼虫ｃａｓｔａｎｅｕｍ
）−船名 ： コクヌストシトー４（Ｒｅｄ ｆｌｏ
ｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）−工 ＋ （Ｄｅｒｍｅｓｔｉ
ｄａｅ）ダ−メスチダエ科種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ
幼虫ｌｌｅｇａｔｏａ＋ａ）−船名二一 プチニダエ科 （Ｐｔｉｎｉｄａｅ） キビウムプシロイデス種（Ｇｉｂｂｉｕｍ
成虫 −ｐｓｙｌ １ｏｉｄｅｓ）−船名二− 双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ） カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ） アエテ゛ス・アエギプチ種（Ａｅｄｅｓ
幼虫 −ａｅｇｙｐｔｉ）−船名 ：
ネフタインマカ（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｍｏｓｑ
ｕｉｔｏ）■翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｕｔｅｒａ） ヤガ科（ＮｏｃＴｕｉｄａｅ） ス参〇トー７８テラーＩ４シクー１種（Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅ 幼虫 −−ｒａ ｅｘｉｇｕａ）
−船名 二 ヒ゛−トコトウムシ（Ｂｅｅｔ ａｒｍ
ｙｗｏｒｌＷ） トリ］フ０ルシト二種（Ｔｒ ｉ ｃｈｏｐ ｌ ＩＪ
ｓ ｉ ａ 幼虫 −ｎｉ）−船名
＝ 髪ヤヘ゛ツシャクトリムシ（Ｃａｂｂａｇｅ ｌ
ｏｏｐｅｒ） 第２表 接種後７日目の第二齢ジアブロチ方・ウンデシムブンク
タータＵ、に対するバシラス・スリンギエンシスＭ−７
の２生物検定の結果Ｒｅｐ、当り消費 された葉ディ
・ウンデシムブンクタータ種 成虫 、幼虫
＋（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃ
ｔａ−ｔａ）−船名 ： 西部斑点ウリハムシ（ｌＪｅ
ｓｔｅｒｎ ５ｐｏｔｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒｂ
ｅｅｔｌｅ） ビラハタ−ルテオラ種（Ｐｙｒｒｈａｌ ｔａ
成虫 、幼虫 ＋＋＋＋１ｕｔｅｏｌａ）−船
名 二 二しハムシ（８１ｍｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ
） ハルチカ・トムｌビシ士種（Ｈａｌｔｉｃａ
成虫、幼虫 ＋＋＋ｔｏｍｂａｃ ｉ ｎａ）
−船名二−ゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌ １ｏｎｉｄ
ａｅ）オチオリンクス・スルカブス種（Ｏｔｉｏｒｈｙ
ｎｃ 幼虫 ＋＋−ｈｕｓ ５ｕ
ｌｃａｔｕｓ）−船名 ： クロフードウソーウムン（
Ｂｌａｃｋ ｖｉｎｅ ｗｅｅｖｉｌ）コナムシ科
（Ｔ ｅ ｎ ｅ ｂ ｒ ｉ ｏ ｎ ｉ ｄ ａ
ｅ ）テネフーリオ・モリトル種（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｍｏｌ 幼虫 ＋＋−１ｔｏｒ）−
船名 二 Ｎイロコナムシ（Ｙｅｌｌｏｗ ｌｌｅａ
ｌｗｏｒｌｌ）トリ本゛リウ訃カスタネウム種（Ｔｒｉ
ｂｏｌ ｉｕｍ 成虫 、幼虫ｃａｓｔａｎｅｕｍ
）−船名 ： コクヌストシトー４（Ｒｅｄ ｆｌｏ
ｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）−工 ＋ （Ｄｅｒｍｅｓｔｉ
ｄａｅ）ダ−メスチダエ科種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ
幼虫ｌｌｅｇａｔｏａ＋ａ）−船名二一 プチニダエ科 （Ｐｔｉｎｉｄａｅ） キビウムプシロイデス種（Ｇｉｂｂｉｕｍ
成虫 −ｐｓｙｌ １ｏｉｄｅｓ）−船名二− 双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ） カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ） アエテ゛ス・アエギプチ種（Ａｅｄｅｓ
幼虫 −ａｅｇｙｐｔｉ）−船名 ：
ネフタインマカ（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｍｏｓｑ
ｕｉｔｏ）■翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｕｔｅｒａ） ヤガ科（ＮｏｃＴｕｉｄａｅ） ス参〇トー７８テラーＩ４シクー１種（Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅ 幼虫 −−ｒａ ｅｘｉｇｕａ）
−船名 二 ヒ゛−トコトウムシ（Ｂｅｅｔ ａｒｍ
ｙｗｏｒｌＷ） トリ］フ０ルシト二種（Ｔｒ ｉ ｃｈｏｐ ｌ ＩＪ
ｓ ｉ ａ 幼虫 −ｎｉ）−船名
＝ 髪ヤヘ゛ツシャクトリムシ（Ｃａｂｂａｇｅ ｌ
ｏｏｐｅｒ） 第２表 接種後７日目の第二齢ジアブロチ方・ウンデシムブンク
タータＵ、に対するバシラス・スリンギエンシスＭ−７
の２生物検定の結果Ｒｅｐ、当り消費 された葉ディ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、鞘翅目の甲虫に有毒なポリペプチド毒素を発現させ
るために形質転換させた細菌株であって、バシラス・ス
リンギエンシス菌株サンディエゴの結晶蛋白質の免疫学
的性状をもつもの。この結晶は、更に位相差顕微鏡下に
暗色で、平らな角型の外観をした独特なバラ胞子体をも
ち、かつ次のアミノ酸配列をもつことを特徴としている
。 【アミノ酸配列があります】 ２、ＮＲＲＬＢ−１５９８１の確認特性をもつ特許請求
の範囲第１項による菌株の、大腸菌／ｐＣＨ−Ｂ３。 ３、Ｍ−７毒素遺伝子をもつ５．８ｋｂＤＮＡ断片を含
んだプラスミドｐＲ０１６１４で形質転換させた、特許
請求の範囲第１項による菌株シュードモナス・フルオレ
ッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ）。 ４、細菌宿主種の中で複製できる雑種組替えプラスミド
であって、以下のヌクレオチド配列をもつ表現可能な非
相同ＤＮＡを含むプラスミド。 【ヌクレオチド配列があります】 又は翻訳される領域が同じアミノ酸配列を暗号化してい
る場合の塩基を含有する同等のヌクレオチド配列を含む
もの。このＤＮＡは、鞘翅目の甲虫に有毒で、バシラス
・スリンギエンシス菌株サンディエゴの結晶蛋白質の免
疫学的性状をもつ毒素を暗号化したものであり、この結
晶は更に位相差顕微鏡下に暗色で、平らな角型の外観を
した独特のパラ胞子体をもち、かつ次のアミノ酸配列を
もつことを特徴としている。 【アミノ酸配列があります】 ５、特許請求の範囲第４項によるプラスミドである、プ
ラスミドｐＣＨ−Ｂ３。 ６、変更が、鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギ
エンシス菌株サンディエゴの毒素遺伝子をもつ５．８ｋ
ｂＤＮＡ断片の、プラスミドｐＲ０１６１４のＢａｍＨ
ｌ位置への挿入を含むものである、特許請求の範囲第４
項による変更プラスミドｐＲ０１６１４。 ７、微生物がこの微生物中で表現される鞘翅目の甲虫に
有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素を暗号化した遺
伝子を含有し、この毒素が鞘翅目の甲虫に対して殺虫性
があり、害虫が正常に餌を食べる過程でこの微生物を摂
取する時に成長抑制水準が摂取されるような水準で、毒
素が微生物中に維持される場合の、植物領域を占有でき
る生きた微生物。 ８、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾ
トバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア
（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）
、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ−ｌａ）、リゾビウ
ム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス
（Ｍｅ−ｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）、アセトバクタ
ー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の種である、特許請求の範囲第
７項による微生物。 ９、微生物が色素保有性で葉面（フィロプレイン）に付
着したものである特許請求の範囲第８項による微生物。 １０、毒素がバシラス・スリンギエンシス菌株サンディ
エゴの蛋白質性パラ胞子結晶毒素である、特許請求の範
囲第７項による微生物。 １１、微生物がこの微生物中で表現される鞘翅目の甲虫
に有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子を含み
、この遺伝子がバシラス・スリンギエンシス菌株サンデ
ィエゴのパラ胞子結晶毒素の少なくとも有毒な断片を暗
号化したものであって、害虫が正常に餌を食べる過程で
この微生物を摂取する時に成長抑制水準が摂取されるよ
うに、この毒素が殺生物水準で微生物中に維持される場
合の、植物領域中で繁殖できる生きたシュードモナド（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）微生物。 １２、シュードモナドがシュードモナス・フルオレッセ
ンスである、特許請求の範囲第１１項によるシュードモ
ナド微生物。 １３、特許請求の範囲第７項による微生物を植物環境に
投与することを含む、鞘翅目の甲虫から植物を保護する
方法。 １４、投与が根部（リゾスフェア）に対してなされる、
特許請求の範囲第１３項による方法。 １５、投与が葉面（フィロプレイン）に対してなされる
、特許請求の範囲第１３項による方法。 １６、特許請求の範囲第１１項による微生物を植物環境
に投与することを含む、鞘翅目の甲虫から植物を保護す
る方法。 １７、毒素がバシラス・スリンギエンシス菌株サンディ
エゴのパラ胞子結晶毒素の少なくとも殺虫断片である、
特許請求の範囲第１６項による方法。 １８、特許請求の範囲第７項による微生物を植物部分に
施用することを含む、鞘翅目の甲虫から植物を保護する
方法。 １９、植物部分が種子である、特許請求の範囲第１８項
による方法。 ２０、毒素がバシラス・スリンギエンシス菌株サンディ
エゴのパラ胞子結晶毒素の少なくとも殺生物断片である
、特許請求の範囲第１８項による方法。 ２１、目標害虫環境に施用されると持続的な殺虫活性を
もった殺虫剤含有の実質的に無傷の死んだ細胞と不活性
担体とを含む殺虫組成物であって、この殺虫剤が鞘翅目
の甲虫に有毒なポリペプチドで細胞内のものであり、細
胞中におけるバシラス・スリンギエンシス菌株サンディ
エゴ毒素遺伝子の発現の結果としてつくられる場合の組
成物。 ２２、死んだ細胞がプロテアーゼ不活性化又は細胞壁強
化条件下に、殺虫活性を保持しながら殺菌せしめられる
、特許請求の範囲第２１項による殺虫組成物。 ２３、細胞が原核生物又は低級真核生物である、特許請
求の範囲第２１項による殺虫組成物。 ２４、原核細胞が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅ−ａｅ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅ
ａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、
らせん菌科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸かん菌
科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、シュードモ
ナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾト
バクター科（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、及
びニトロバクター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃ−ｔｅｒａｃｅ
ａｅ）からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２３
項による殺虫組成物。 ２５、低級真核細胞が藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び担子
菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙ−ｃｅｔｅｓ）からなる群か
ら選ばれる、特許請求の範囲第２３項による殺虫組成物
。 ２６、細胞が色素保有の細菌、酵母又はカビである、特
許請求の範囲第２１項による殺虫組成物。 ２７、殺虫剤を含有する実質的に無傷の死んだ単細胞微
生物の細胞と不活性担体とを含む殺虫剤組成物であって
、この殺虫剤が鞘翅目の甲虫に対して有毒なポリペプチ
ドであり、細胞内のもので、細胞中のバシラス・スリン
ギエンシス菌株サンディエゴ毒素遺伝子の発現の結果と
してつくられ、かつこの細胞が細胞壁の架橋のため強化
された構造安定性をもつ場合の殺虫剤組成物。 ２８、単細胞微生物がシュードモナスである、特許請求
の範囲第２７項による殺虫剤組成物。 ２９、死んだ細胞がホルマリンを用いて殺菌させたもの
である、特許請求の範囲第２７項による殺虫剤組成物。 ３０、死んだ細胞がヨウ素を用いて殺菌させたものであ
る、特許請求の範囲第２７項による殺虫剤組成物。 ３１、殺虫剤を含有する実質的に無傷の死んだ単細胞微
生物と不活性担体とを含む殺虫剤組成物の有効量を植物
に施用することを含み、この殺虫剤が細胞内のもので、
細胞中において、鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリ
ンギエンシス毒素遺伝子の発現結果としてつくられ、か
つ目標害虫環境下に組成物を施用する時に殺虫活性を持
続させるような条件下に微生物を殺菌したものである、
鞘翅目の甲虫から植物を保護する方法。 ３２、微生物が原核生物又は低級真核生物である、特許
請求の範囲第３１項による方法。 ３３、原核微生物が腸内細菌科、バシラス科、リゾビウ
ム科、らせん菌科、乳酸かん菌科、シュードモナス科、
アゾトバクター科、及びニトロバクター科からなる群か
ら選ばれる、特許請求の範囲第３２項による方法。 ３４、低級真核微生物が藻菌類、子のう菌類及び担子菌
類からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第３２項に
よる方法。 ３５、細胞が色素保有の細菌、酵母又はカビである、特
許請求の範囲第３１項による方法。 ３６、実質的に無傷の死んだ単細胞微生物が、殺虫活性
を保持しながらプロテアーゼを不活性化する組成物で殺
菌させたものである、特許請求の範囲第３５項による方
法。 ３７、実質的に無傷の死んだ単細胞微生物が、ホルマリ
ンを用いて殺菌させたものである、特許請求の範囲第３
６項による方法。 ３８、実質的に無傷の死んだ単細胞微生物が、ヨウ素を
用いて殺菌させたものである、特許請求の範囲第３６項
による方法。 ３９、毒素が鞘翅目の甲虫に有毒なポリペプチドを暗号
化した、鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエン
シス毒素遺伝子発現の結果であり、細胞が目標害虫環境
に施用される時に酵素を不活性化し殺虫活性を持続させ
るような条件下に細胞が殺菌される、細胞内毒素を含有
する実質的に無傷の死んだ単細胞微生物細胞。 ４０、微生物がシュードモナスで、毒素がバシラス・ス
リンギエンシス菌株サンディエゴ毒素である、特許請求
の範囲第３９項による細胞。 ４１、細胞がホルマリンを用いて殺菌され、毒素が活性
型である、特許請求の範囲第４０項によるシュードモナ
ス細胞。 ４２、細胞がヨウ素を使用して殺菌される、特許請求の
範囲第４０項によるシュードモナス細胞。 ４３、以下を含有する実質的に無傷の死んだ単細胞微生
物細胞。（１）鞘翅目の甲虫に対して有毒であり、この
微生物中で発現可能で、かつＭ−７毒素を暗号化したバ
シラス・スリンギエンシス毒素遺伝子で、この単細胞微
生物の同じ属以外の給源からのもの。（２）この遺伝子
の発現生成物。細胞は、目標害虫環境に施用される時に
し殺虫活性を持続させるような条件下に殺菌されるもの
。 ４４、微生物が細菌である、特許請求の範囲第４３項に
よる単細胞微生物。 ４５、細菌がシュードモナスである、特許請求の範囲第
４４項による単細胞微生物。 ４６、殺虫剤が実質的に無傷の死んだ単細胞微生物中に
封入された、鞘翅目の甲虫に対して有毒なポリペプチド
である場合の殺虫剤組成物の製法であって、鞘翅目の甲
虫に有毒で微生物中において発現可能なバシラス・スリ
ンギエンシス毒素遺伝子を単細胞微生物中に導入し、Ｍ
−７毒素を発現させながら微生物細胞数を増加させるた
めに微生物を生育させ、かつ上記細胞が鞘翅目甲虫環境
に施用される時に殺虫活性を持続させるような条件下に
微生物を殺菌することを含む方法。 ４７、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴの
結晶蛋白質の免疫性状をもった、鞘翅目の甲虫に対して
有毒なポリペプチド毒素の製法であって、このポリペプ
チド毒素を暗号化した遺伝子を異種宿主微生物中にクロ
ーン化し、この異種宿主微生物によって発現されたポリ
ペプチド毒素を単離精製することを含む方法。 ４８、異種宿主微生物が大腸菌である、特許請求の範囲
第４７項による方法。 ４９、ポリペプチド毒素の単離精製がアフィニティー（
親和）カラムを用いて実施される、特許請求の範囲第４
７項による方法。 ５０、Ｍ−７と指定されるポリペプチド毒素の環境的に
安定な製剤を植物環境に投与することを含む、鞘翅目の
甲虫から植物を保護する方法。 ５１、殺虫活性のある毒素を暗号化した以下のようなＤ
ＮＡ。 【ＤＮＡ配列があります】 及び次のアミノ酸配列をもつ分子を暗号化した同等なヌ
クレオチド配列。 【ヌクレオチド配列があります】 ５２、殺虫活性をもち、以下のアミノ酸配列をもつ蛋白
質毒素。 【アミノ酸配列があります】 及び蛋白質の二次構造を変更しない突然変異種、又は構
造を変更する場合は、生物活性をある程度保持している
もの。 ５３、以下のヌクレオチド配列、又は翻訳領域が同しア
ミノ酸配列を暗号化しているような塩基類を含有する同
等なヌクレオチド配列、の全部又は一部をもつＤＮＡを
含む組替えＤＮＡ運搬ベクター。 【ヌクレオチド配列があります】 ５４、原核微生物に運搬され、その中で複製される、特
許請求の範囲第５３項のＤＮＡ運搬ベクター。 ５５、原核微生物が大腸菌Ｋ−１２誘導菌である、特許
請求の範囲第５４項のＤＮＡ運搬ベクター。 ５６、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が以下のもの、すなわち 【ＤＮＡ配列があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第７項による生きた微生物。 ５７、毒素が以下のアミノ酸配列をもつ、特許請求の範
囲第１０項による微生物。 【アミノ酸配列があります】 ５８、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が次のもの：すなわち 【ＤＮＡ配列があります】 及び次のアミノ酸配列：すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第１１項による生きたシュード
モナド微生物。 ５９、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ毒
素遺伝子のＤＮＡが以下のもの、すなわち【ＤＮＡ配列
があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第２１項による殺虫剤組成物。 ６０、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ毒
素遺伝子のＤＮＡが以下のもの、すなわち【ＤＮＡ配列
があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第２７項による殺虫剤組成物。 ６１、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が以下のもの、すなわち 【ＤＮＡ配列があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第３１項による方法。 ６２、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が以下のもの、すなわち 【ＤＶＡ配列があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第３９項による微生物細胞。 ６３、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が以下のもの、すなわち 【ＤＮＡ配列があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第４３項による微生物細胞。 ６４、バシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のＤＮＡ
が以下のもの、すなわち 【ＤＮＡ配列があります】 及び以下のアミノ酸配列、すなわち 【アミノ酸配列があります】 をもつ分子を暗号化した同等なヌクレオチド配列のもの
である、特許請求の範囲第４６項による方法。 ６５、Ｍ−７と指定されたポリペプチド毒素が以下のア
ミノ酸配列をもつ、特許請求の範囲第５０項による方法
。 【アミノ酸配列があります】
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