JPH025873A - 新規なハイブリッドバシラス・スリンギエンシス遺伝子、プラスミド、及び形質転換されたシユードモナス・フルオレッセンス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なハイプリットバシラス・スリンギエンシ
ス遺伝子、プラスミド、及び形質転換されたシュードモ
ナス・フルオレッセンスに間する。

［従来の技術］ 晶も広く使用されろ微生物殺虫剤は細菌のバシラス・ス
リンキニンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｌ＋ｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ）に由来している。この細菌薬剤は、葉を食
べる広範囲（７）イも虫ヤマメコカネ（Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ　ｂｅｅｔｌｅｓ）、蚊の防除に使用される。バシラ
ス・スリンギエンシスは、感受性のある昆虫ホストに摂
取されると有毒なタンパク性バラ胞子や結晶をつくる。

例えば、バシラス・スリンギエンシス拳バラエティ・力
−スタキ１１０−１（Ｂ、ｔｌ＋ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ＋１Ｄ−１）は、デル
タ毒素と呼ばれる結晶をつくるが、これは幾つかの鱗鉗
目昆虫の幼虫に有毒である。

大１１ｊＪ　蘭（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）におけるこのｎ、
ｔ、結晶タンパク遺１云子のクローニング及び発現は、
公表文献［シュネフ・エッチ・イー（Ｓｃｈｎｅｐｆ、
１１．Ｅ、）及びホワイトリ−・エッチ・アール（Ｗｈ
ｉｔｅｌｙ、　Ｈ，Ｒ，）（１９８１年）。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎ＝ｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
Ｓ’Ａ　７８巻２８９３−２８９７頁］中に記述されて
いる。合衆国特許第４，４４８，８８５号と第４，４６
７．０３０号は、大＠菌でのＢ、ｔ、結晶タンパクの発
現を明らかにしている。合衆国特許第４，４６７．０３
６号で、Ｂ、スリンギエンシス・バラエティ・力−スタ
キ［１−１は、イリノイ州ビオリアの周知のＮＲＲＬ培
養基保存施設から人手できることが明らかにされている
。そこでのその呼出し番号はＮＲＲＬ　Ｂ−３７９２で
ある。Ｂ、スリンギエンシス・バラエティ・カースタキ
ｌＩＤ−７３もＮＲＲＬから入手できる。その呼出し番
号−はＮＲＲＬ　Ｂ−４４８８である。

［発明が解決しようとする課題］ Ｕ’ｄｌ目昆虫に有毒な所現なハイブリッド毒素遺伝子
が明らかにされ、特許請求されている。この毒素遺賑子
はアラスミ１ζベクターを経由して、シュードモナス・
フルオレッセンスホストに形質転換された。

特定的には、本発明はＢ、スリンギエンシス・バラエテ
ィ・カースタキ菌株ＨＤ−７３毒素遺伝子の一部と、８
．スリンギエンシス・バラエティ・スリンギエンシス萌
株ベルリナー１７１５（ＤＮＡ　５巻３０５−３１４頁
、１９８６年）からの毒素遺伝子の一部とを含めてなる
ＩＩＴ現なハイブリッドデルタ内毒素１遺伝子を含めて
なる。このハイブリッド遺伝子をシュードモナス・フル
オレッセンスホストの形質転換のために使用した。Ｐ、
フルオレッセンスホストは、鱗翅目昆虫に対して活性の
ある殺虫剤として使用できる。

更に特定的には、本発明ば鱗翅目昆虫に対して活性をも
つ新規なタンパクをコードした新規なハイブリット毒素
遺伝子（口ＮＡ）に間する。第１表は新規な毒素をコー
ドしたＤＮＡを明らかにしている。

第２表は新規なハイブリッド毒素のアミノ酸配列を明ら
かにしている。第３表は第１．２表を合成したものであ
る。

［課題を解決する手段］ 本発明の￥Ｒ現なハイブリッド毒素遺伝子は、Ｂ。

スリンギエンシス・バラエティ・カースタキ菌株１１０
・７３毒素遺１云子の一部と、Ｂ、スリンギエンシス拳
バラエティ・スリンギエンシス菌株ベルリナー＋７１５
の毒素遺伝子の一部とを含めてなる。一般にＢ、ｔ、に
、ＨＤ−７３遺伝子部分は、初めに（１）既知大ｉｌＩ
菌プラスミドｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡ切片、及び
（２）ハイアリッＦ’Ｔａｃプロモータを表わす［ｌＮ
Ａ切片に結合された。次にベルリナー毒素遺伝子の３′
部分を加え、続いて既知プラスミドｐＲＯＩ６目からの
、シュードモナス中で複製する能力を付与するＤＮＡ切
片を加えた。

生ずるハイブリット遺伝子はｐＭ３．１３０−７と名付
けられたプラスミドに含まれた。このプラスミドを用い
てシュードモナス・フルオレッセンス微生物を形質転換
させると、ＭＲ４２０という形質転換された菌株を生し
た。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入で
きろ。毒素遺伝子のｔ＠現は、直接又は間接に殺虫剤の
細胞内生産と医持をもたらす。適当なホスト、例えばシ
ュードモナスの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生１１　ｆ
ｉｔに施用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される
。その結果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わ
りに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられ
る毒素の活性を持続させるような条件下に処理できる。

次に処理細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成
物はＢ、ｔ、毒素の毒性を保持している。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子は適当なベクターを経て微生物ホス
トへ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ
施用されろ場合に、あるホストｍ生物を使用することが
必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要作物の「
植物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根面）
を占有することが知られたものを選択する。・これらの
微生物は、特定環境（作物及びＩｌｌ！の昆虫生息地）
中で野性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポ
リペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発
現を提供し、環境的劣化と不活性化からの改良された保
護を殺虫剤に提供するものが望ましい。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領域
（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が知
られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを包
含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（
Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
クレブシェラ（ＫＩｅｌ＋５ｉｅｌ　Ｉａ）、キサント
モナス（Ｘ　ａｎｔｈｏｍｏｎａｓｕ）、ストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒ１
＋１ｚｏｂｉｕ慣）、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄ
ｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス（Ｍｅ
ｔｈｙｌ。

ｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃ　ｉ　ｌ
　１ｕｓ）、アセトバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、リ
ューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）及びアル
カリゲネス（Ａ　Ｉ　ｃａＩｉｇｅｎｅｓ）属の細菌；
カビ類、特にＷ＃母、例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃ
ｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコツカス（＋：ｒｙｐ
ｔｏｃＯｃｃｕｓ）、クルイベロミセス（にｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏ
ｌｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｔ＋ｏｄｏｔｏｒ
旧ａ）、及びオーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ
ｄｉｕｎ＋）属なとの微生物である。特に重要なものは
、シュードモナスやシリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス拳フルオレッ
センス、セラティア・マルセスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ　＊ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター・キシリ
ヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）、ア
グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒ＋＋ｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ＋５ｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロード
シュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕ
＋Ｉｏｍｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサント
モナス６カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　　
ｃａＩＩｌｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム・メリオチ（
ＲＩ＋１ｚｏｂｉ＋１＋ｓ　ｍｅｌｉｏｔｉ）、アルカ
リゲネス番エントロフス（ＡＩｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅ
ｎｔｒｏｐｈｕｓ）、及びアゾトバクタ−・ヴインラン
ディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）
のような植物領域の細菌種：及びロー１−トルう・ルア
ラ（Ｒ１＋ｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、Ｒ。

グルチニス（Ｒ，ｇｌｕｔｉ旧ｓ）、Ｒ，マリーナ（Ｒ
，ｍａｒｉｎａ）、Ｒ，オーランティ７カ（Ｒ，ａｕｒ
ａｎｔｉａｃａ）、クリブトコツカス−フルビダス（Ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ目＋ｉ＋１ｕｓ）、Ｃ，ジ
フルエンス（ｉ：、　ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、イ１．ロ
ーレンティ（Ｃ，Ｉａｕｒｅｎｔ、■）、サツカロミセ
ス命ロゼイ（Ｓ、ｒ。

５ｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（Ｓ、　ｐｒｅｔｏｒ
ｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ。

セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボ
ロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　
ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ、オドルス（Ｓ、　ａｄｏｒｎｓ）
、クルイベロミセス・ヴエローナエ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及びオーレオバシシウム
・ポルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ＋ｌ１ｕＩＩｌｐｏ
ｌｌｕｌａｎｓ）のような植物領域の酵母種である。特
に重要なのは有邑素微生物である。

遺伝子の安定な賑持と発現を可能とするような条件下に
、毒素を発現させるｒ＜、ｔ、遺伝子を微生物ホストに
導入するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺伝
子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制ｆａｊ下の毒
素遺１云子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の
配列と相同のＤＮＡ配列、また組込みや安定な維持が起
こるための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだＤ
ＮＡｔｌｌ造体をｌｌ造品ことができろ。

転写開始１８号はプロモータと転写開始出発１ｙ置を包
含しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提１！壓
して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるように
するのが望ましいこともある。これはオペレータ、又は
アクチベータやエンハンサに結合する領域、によって達
成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化
によって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使
用すると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、
環境へ放出されると発現が始まる。池の手法は、実験室
で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一
方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使
用できる。転写開始には、リポソーム結合位置と開始コ
ドンが存在しよう。

メツセンジャーＲＮＡの安定性を強化する配列を開用す
ると共に、特に活性プロモータを使用してメツセンジャ
ーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。間
・始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び任
意にポリアデニル化信号を包含しよう。

転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の５
′から３′への方向で、構造体は転写調節領域（これが
ある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの５′
又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、開
始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもった
構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列（使
用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本鎖とし
てのこの配列はそれ自体微生物ホストの転写に使用でき
るが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴っており、
この第二のＤＮＡ配列はホストへのＤＮＡ導入中に毒素
発現構造体に結合させることができる。

マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定を
行なうための構造遺伝子のことである。

マーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば
抗生物質や重金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素
要求ホストに原栄養性を与える相補性を提供する。変更
されたホストが選定されるだけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカーを使
用できる。

野外で他の野性型微生物に対する競合的利点を提供する
ことによって、生物を更に変更できる。例えば、金属キ
レ−１・剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、
毒素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。

この方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産
ホストに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微
生物と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を
占めるようになる。

機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも５０塩基対（ｂ　ｐ）、好ま
しくは少なくとも約ｔｏｏ　ｂｐ及び通常的ｔ、ｏｏ。

ｂｐまでの配列を包含しよう。こうすると合法的な組換
えの可能性が強化されるため、遺伝子はホストへ組込ま
れ、ホストによって安定に保持される。

毒素遺１云子が相補性を提供する遺伝子並びに競合的利
点を提供する遺伝子に近接しているのが望ましい。従っ
て、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補性遺
伝子及びｌ又は競合的利点を提供する遺伝子も失う可能
性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺伝子
とは環境中で競合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、
カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転写調
節領域が人手できる。種々の転写調節領域はｔｒｐｉｌ
ｌ伝子、ｌａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右
プロモータ、Ｔａｃプロモータ、及びホスト中で機能的
な場合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータ
を包含する。例として合衆国特許第４，３３２．８９８
号、第４．３４２，８３２号、及び第４．３５０，２７
０号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開始領域と
関連する終結領域か、又は異なる転写開始領域（二つの
領域がホスト内で適合的でｔａｔ能的である限りにおい
て）でありうる。

安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、ホ
スト中で機能的な？ＪＩａ系をもったプラスミド゛が使
用されよう。複製系は染色体、ホスト又は別のホスト内
に通常存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定な
ウィルスの１！製系から誘導される。ｐ　ＩＩＲ３２２
、ｐＡｃＹｃ１８４、ＲＳＦＩＯＩＯ１ｐＲ旧１４等の
ような多数のプラスミドが人手できる。例として、オル
リン（Ｄｌｓｏｎ）ら、（１９８２年）　Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ。

１５０巻ＧＯ６り頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｔｌ
ａｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年）　Ｇｅｎｅ　ｌ（
３巻２３７頁、並びに合衆国特許第４．３５＋３，２７
０号、第４，３６２．８１７号、及び第４，３７１゜６
２５号を参照のこと。

８．ｔ、遺１云子は開始領域の調節制御下にあるように
、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入で
きる。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミド
は少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包
含でき、その場合−つの複製系はプラスミドの開発中に
クローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホスト
での機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以
上のマーカーが存在できる。紺込みを望む場合は、プラ
スミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい
。

形質転換体は、通常、未変更生物や運ｆｌｉｔ生物が存
在する時は、それらに対して所望生物を選定できるよう
に、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる
。次に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

殺虫剤含有、ｗｍを処理して処理細胞を目標害虫環境に
施用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに適し
たホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通
常、は乳類のような高等動物に有毒な物質を生じない細
胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、Ｉｌ＋Ｉｉ
乳類ボスト・＼の゛毒性の可能性を回避するの゛に十分
な低い施用水準である場合には、高等生物に有毒な物質
をつくる生物も使用できる。ホストとじて、特に興味あ
るものは、原核生物と、カビのような低級真核生物であ
る。

グラム陰性・陽性双方の原核生物の例は、エシェリキア
（Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｂｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｎびプロテウス（Ｐ　ｒ　ｎ
　Ｌ　Ｉ！　ＩＪ　Ｓ　）のよらな腸内細閏科（Ｅｎｔ
ｅｒ。

ａｃｔ、ｅｒｉａｃｅａｅ）　：バシラス科（Ｂａｃｉ
　１ｌａｃｅａｅ）　：リソビウム（Ｒ１＋ｉｚｏ旧１
１ｍ）のようなりゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂａｃｅａｅ
）：発光細菌、シモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、セ
ラテ４７　（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａ　
ｅ　ｒ　ｏ　１Ｔｌｏ　ｎ　ａ　ｓ　）、ビブリオ（Ｖ
　ｉ　ｂ　ｒ　ｉ　（１）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓ
ｕｌｆｏｖｉｂ　ｒ　ｉ　ｏ　）、スピリルム（Ｓｐｉ
　ｒｉ　ｌ　ｌｕｍ）のようならせん菌科；乳酸かん百
科；シュー）・モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及び
アセトバクター（ＡｃｅｔｏＬ＋ａｃｔｅｒ）のような
シュードモナス科；アゾトバクタ−科及びニトロバクタ
−科を包含する。真核生物には藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ）と子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）
のようなカビ力、１％　ｔ）、コレはサツカロミセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とシゾサツカロミセス（
Ｓｃｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のような
酵母、ロートトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ　１ｍ）、オ
ーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ス
ポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）のよ
うな担子菌ｘｉ　（Ｂａｓ　ｉｄ　ｉ。

ｍｙｃｅｔｅｓ）酵母を包含する。

生産目的のためにホスト細胞を選択する上で特に重要外
特性は、Ｂｔｔ、遺伝子のホストへの導入の容易さ、発
現系の人手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定性、
及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカ
プセルとして使用するのに＠要な特性は厚い細唸壁、色
素形成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形成の
ような殺虫剤保護性：葉親和性；対咄乳類毒性の欠如；
害虫に摂散させるための誘引力；毒素に横書を与えない
殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処
方と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。

特に重要なホスト生物は、ロートトル９種、オーレオバ
シジウム種、サツカロミセス種、文ボロボロミセス種の
ような酵母；シュードモナス種、エルウィニア挿、及び
フラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；又
はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の他の生物
を包含する。

特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓ
ｅｕ＋ｆｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ）＜１ｎｏｓａ）、シ
ュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ）、サツカロミセス６セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｔ：ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉＳｉａｅ）、バシラ
ス・スリンギエンシス、大腸菌、枯草菌（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉＳ）を包含ずろ。

細胞は通常、Ｉ！！濡であって、処理時に胞子型よりも
実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。

微生物ｍｖｆｊｉ、例えばＢ、ｔ、毒素遺伝子を含有す
る微生物の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか
、叉は毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化
学的又は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手
段の絹合わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、
特に原子番号１７−８０のハロゲンである。もつと特定
的には、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成す
るのに十分な時間に使用できる。他の適当な手法は、ホ
ルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒ
ド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのよう
な抗感染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのよ
うなアルコール類；ブアン固定剤とヘリ−固定剤［フマ
リン（ｌｌｕｌｌａｓｏｎ）、グレッチェン・エル（Ｇ
ｒｅｔｃｈｅｎ、　Ｌ、）　ｒ動物組織手法」ダブリニ
ー・エッチ・フリーマン社、１９６７年、を参照］のよ
うな種々の１１　ａｔ　ｆ−的固定剤等での処理；又は
ホスト動物に細胞を投与する時に細胞中につくられる毒
素の活性を保存し、持続させるような物理的処理（加熱
）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理的手段
の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長放射線、凍
結、ＵＶｐＦ！射、凍結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するような
、強化された構造安定性をもつであろう。

殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えばホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制できる。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少な
くとも実質量の生物学的利用率又は生物活性を保持する
。

Ｂ、ｔ、殺虫剤遺伝子を含有する細′胞ホストは任意慣
用の栄養培地で生育できるが、Ｄ　Ｎ　Ａ構造体は選択
的利点を提供するため、細胞の全電叉は実質的全敏が０
　、１．　、遺伝子を保持するように選択培地となる。

次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り入れる。その
代わりに、細胞を取り入れる前に処理することもてきる
。

＋１　、　ｔ、　、細胞を種々の方法で処方できる。こ
れらを無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸
塩等）又は植物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ般、
クルミ殻等）と混合することにより、水和剤、粒剤又は
粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安定剤、
そのＩＩＩＩ殺虫助剤、又は表面活性剤を包含できる。

液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フオー
ム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できろ。成分は流
動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含で
きる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使用
されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少なくと
もｌ１ｌＥＩｌで存在し、１００重＠χでありうる。乾
燥処方剤は約１−９５！ｌｔＸの殺虫剤をもつが、液体
処方剤は一般に約１−６０重＠χの固体を）α相中にも
つであろう。処方剤は概してＩＩＩｇ当たり約１０２な
いし約１０’飼の細胞をもつであろう。これらの処方剤
はへクタール当たり約５０　ｍｇ（液体又は乾燥）ない
しｌ　ｌａｇ以トの率で投与されよう。

処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水に
噴霧、散布、散水等によって施用できる。

以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した
実施例である。これらの実施例は限定的に考えられては
ならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、
溶媒混合物割合はすべて容量による。

実施例１　新規なハイブリッド毒素遺伝子の構築とシュ
ードモナス・フルオレッセンス への形質転喚 出発ＡＴＧ（すなわち出発メチオニン）からＨｉｎｄｍ
位置までの毒素ニーＦＤＮＡの全部を包含するＢ、スリ
ンギエンシス・バラエティ参カースタキＨＤ−７３遺伝
子の一部を、ＴａｃてプロモートされたプラスミドρＫ
Ｋ２２３−３（ファーマシア）へ挿入した。　ｐＫに２
２３−３中のリポソーム結合位置からすぐ下流でこの遺
伝子のプラント融合体をつくることで、これを行なった
。これでプラスミドｐＫＫ２ができた。プラスミドｐに
に２を１ｌｉｎｄｌＩＩで完全に消化させると、毒素遺
伝子の最終の３１末端が開裂した。クレノフ断片を用い
て、■１旧１■のオーバーハングにデオキシヌクレオチ
ドを詰めて、これをプラントにした６次に新しいプラン
ト１ａ置にＰｓｔ　［リンカ−を付加し、続いてＰｓｔ
　Ｉで消化させ、ＤＮＡリガーゼでプラスミドを閉じた
。次にベルリナー毒素配列（ＤＮＡ　５巻３０５−３１
４頁、１９８６年）の３′部分をＳａｃ　ＩないしＰｓ
ｔ　Ｉ断片として変更ｐＫＫ２／Ｓａｃ　［＋　Ｐｓｔ
　１ヘクローン化し、ρＫＫ７３８Ｂ−９と呼ばれる斬
しいプラスミド中に組換え毒素遺°伝子をつくった。こ
の遺伝子は、（３′方向で）Ｓａｃ　Ｉ　４ｎ　ａを越
えた全配列については、ベルリナー起源のものである。

次に、ｐにに７３８Ｂ−９をＰｓｔｌで完全に消化させ
ると、新しいキメラ毒素遺伝子の最終３′末端で開裂し
、細菌のアルカリ性フォスファターゼでこれを処理した
。プラスミドルＲ旧旧４からのＰｓｔ　Ｉ口ＮＡ断片は
、シュードモナス中で複製する能力を与えろもので、こ
れをｐＫＫ７３８Ｂ−９／ＰＳｔ　Ｉ　’へフタ−へ挿
入するとブラスミ！・１団２．＋０７−１が得られた。

プラスミドｐＭ２，１０７−１を制限酵素ＴＴＨ１１１
１で完全に消化させ、問いた位置のオーバーハングをク
レノフ断片プラスデオキシヌクレオチド処理によってプ
ラントにし、Ｂａｍｎ＋／ＩＩにｌ／ンカーをｔ：ｒけ
、Ｂａｍ旧で（ｎ１ヒさせ、再結合、形質転換し、選定
すると、無用の部分的テトラサイクリン耐性遺伝子（ｐ
ＫＫ２２３−３に由来）を失ったプラスミドが見つかっ
た。これでプラスミド１）Ｍ３，１２３−１が得られた
。プラスミドｐＭ３．１２３−１を制限酵素Ｐｖｕｌて
開裂し、Ｂａ１３１で短時間消化させ、クレノフ断片及
びデオキシヌクレオシド三燐酸処理によってプラントに
し、ｐＢＲ３２２からの同じくブラント化されたテトラ
サイクリン耐性遺伝子（地図上の位置ＥｃｏＲＩ及びＡ
ｖａ　ｌ　）のクローン化にベクターとして使用した。

テトラサイクリン耐性コロニーの選定は、ｐＨ３，１３
０−７と呼ばれる所望のプラスミドを生じた。次に、標
準手１１１１を用いて、このプラスミドをシュードモナ
ス・フルオレッセンスへ形質転換した。生ずる形質転換
菌株はＭＲ４２０と呼ばれる。

玉のクローニング手１１１ａを、他に注意がなければ標
準手１１１１１を使用して行なった。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法はこの技術で周知である。これらの手１１１
ａはすべて、マニアチス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、
　Ｔ、）、フリッシュ・イー−エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ、
　Ｅ。

Ｆ、）及びサムブロック・ジエイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
　ｊ、）（１９８２年）、「分子クローニング：実験マ
ニュアル」（コールド令スプリングφハーバー研突所、
ニューヨーク州）に記述されている。このように、微生
物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化を行ない
、［ｌＮＡ断片を電気泳動にかけ、プラスミドのテーリ
ングとアニーリングを行ない、ＤＮＡを挿入、再結合し
、細胞を形質転趨し、プラスミドＤＮＡを：ＪＪ製し、
タンパクを電気泳動にかけ、ＤＮＡの配列を決定するの
は、遺伝子工学の当業者の技術範囲にある。

本明細書で明らかにされている制限酵素は、ベセスダ研
究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）及びニューイ
ングランド・バイオラフ（マサチューセッツ州ビバリー
）から購入できろ。酵素は、供給側から提供されろ指示
に従って使用される。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有するプラスミドｐＭ３，１３
０−７は、形質転換されたホスト微生物から周知の櫟準
手順を用いて除去できる。例えば、Ｐ、フルオレッセン
ス（９Ｍ３．１３０−７）を透明溶菌液のイソピクニッ
ク密度勾配手１１１ａ等にかけて９Ｍ３．１３０−７を
回収することができる。

Ｐ、フルオレッセンス（９Ｍ３．１３０−７）の二次培
養基は、合衆国０１６０４イリノイ州ビオリア、ノース
・ユニバーシティ◆ストリート１８１５、地域研究セン
ター、農業研究サービス特許培養基保存施設（ＮＲＲＬ
）の永久保存施設に１９８８年２月２２日寄託された。

培養基は、受託施設により、呼出し番号ＮＲＲＬ　Ｂ−
１８３３２を与えられた。この寄託物、は、これを明ら
かにした特許の授与に伴って一般に利用できる。また、
本米国出願又はその子孫の対応特許出願が提出されてい
る国々の米国以外の外国特許法で要求されるならば、寄
託物は人手できる。しかし、寄託物が人手できるからと
いって、行政行為によって付与された特許権を損わしめ
て本発明の実施する権利を構成するものではないことを
理解すべきである。

更に、本培養基寄託物は、ブダペストｍ生物寄託条約の
規定に１にって保存され、一般の人々に人手可能とされ
ろ。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつとんな場合も、寄託期日か
ら少なくとも３０年間か、又は培養基を開示して発行さ
れる特許の権利行使可能な曲間中、これらの寄託物は、
生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあ
らゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合には
、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである。

本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべての
制限は、これらを開示した特許の１１与に際して永久に
取り除かれる。

実施例２　毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコー
ドした新規な遺伝子は、７グａバクター・ツメファシェ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）からのＴｉプラスミドを使用して、植物細胞へ挿入で
・きる。次に植物細胞を植物へ再生させる［ザンブリス
キーと−（ＺａＩＩｌｌ＋ｒｙｓｋｉ、　Ｐ、）、ショ
ース・エッチ（、Ｉ＋＞ｏｓ、　Ｉｌ、）、ジエンテロ
・シー（ｔ；ｅｎｔ、ｅｌｌ＋＋、　Ｃ，）、Ｊ−マン
ス、ジェイ（Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、）、パン・モンタ
キュー・エム（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕｅ、　Ｍ、）、
及びシェル・ジェイ（Ｓｃ＋＋ｅ１１．．１．）（１９
８３年）Ｃｅｌｌ　　３２巻＋０３３−１０４３頁］。

この点て、特に有用なベクターはｐＥＮＤ４にである［
クリ−・エッチ争ジェイ（Ｋｌｅｅ、　Ｈ，Ｊ、）、ヤ
ノフスキー・エム・エフ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｍ、Ｆ
、）及びネスター・イー・ダブリュー（Ｎｅｓｔｅｒ、
　Ｅ、讐、　）　（１９８５年）８ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　３巻Ｂ５７−６４２頁］。このプラスミドは
、植物細胞と細菌中で複製でき、パラセンジャー遺伝子
に対して複数のクローニング位置をもっている。例えば
毒素遺伝子はｐＥＮ０４にのＢａｍＨＩへ挿入され、大
腸菌中で増鼎し、適当な植物細胞へ形質転喚される。

実施Ｐｉｌ＋　３　　新規なハイブリッドＢ、スリンギ
エンシス遺伝子のバクロウィルスへのクロー ニング 本発明の新規なハイブリッド遺伝子を、オートグラフ７
・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆ
ｏｒ−ｎｉｃａ）核ポリへトロシスウィルス（ＡｃＮＰ
Ｖ）のようなバクロウィルスへクローン化できる。ｐＵ
Ｃ８のような市販のクローニンクｌ＼クターにクローン
化されたＡｃＮＰ〜′ゲノムを含有するプラスミドを構
築できる。ＡｃＮＰＶゲノムを変更し、ポリヘトリン遺
伝子のコード領域が除かれて、パラセンジャー遺伝子の
特異なりローエング位置がポリへドリンブロモータの真
後ろに置かれるようにする。このようなベクターの例は
、ペノックら［ベノックφジー・デイ−（Ｐｅｎｎｏｃ
ｋ、　ｔ；、口、）、シューメーカー・シー（ＳＩ＋ｏ
ｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，）及びミラｍ−エル・ケイ（Ｍｉ
ｌｌｅｒ。

Ｌ、に、）（１９８４年）Ｍｏ１．　ｌ：ｅｌｆ　Ｒｉ
ｏｔ、　４巻−３９９−４０６頁］に記述されたｐ　（
ｒ　Ｐ　−Ｒｎ　８７４、及びスミスら［スミス・ジー
φイー（Ｓｍｉ會、ｌ＋、Ｇ、Ｅ、）、サマーズ・エム
・デイ−（Ｓｕｍ…ｅ言・ｓ　、　Ｍ　、　１１　、　
）及びフレーザーφエム・ジェイ（Ｉ　ｒ＋　＋＋　：
（年）Ｍ＋＋１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　：３巻２＋
５６−２１６５頁］に記述された＋ＩＡ　Ｉ’、’　３
８０である。本鑓明のＰＦＩ［なタンパク毒素をコード
した遺１云子は、コード領域から上流及び下流の適当な
領域で、Ｂａｎ＋ｔｌｌ’／ンカーによって変更でき、
Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖベクター類の一つのもののパラセン
ジャー位置に挿入できろ。

すでに明らかにされたように、Ｂ、ｔ、毒素遺伝子をコ
ードしたヌクレオチド配列を第１表に示す。

１１Ｎ定されたアミノ酸配列を第２表に示す。

この技術で１４λｌのように、タンパクのアミノ酸配り
１１は、Ｄ　Ｎ　Ａのヌクレオチ１ζ配列によって決定
される。遺伝暗号の１剰性のため、すなわちタンパクを
つくるのに使用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ
以上の暗号化ヌクレオ子トドリブレット（コドン）を使
用できるため、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌク
レオチド配列がコードできる。このため、遺伝暗号を次
のように描くことができる。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴＫロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（ｌｌｅ）
　　　　　ＡＴＭメチオニン（Ｎｅｔ）　　　　　　Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｌ）　　　　　　　　ＧＴＬセリン（
Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ）
　　　　　　　Ｃ（Ｌスレオニン（Ｔｈｒ）　　　　　
　ＡＣＬアラニン（Ａｌａ）　　　　　　　　ＧＣＬチ
ロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　ＴＡにヒスチジン（ｌ
ｌｉｓ）　　　　　　ＣＡにグルタミン（Ｇｌｎ）　　
　　　　　ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ）　　　　　　
ＡＡＫリジン（Ｌｙｓ）　　　　　　　　　ＡＡ、１ア
スパラギン酸（ＡＳＩ３）　　　　ＧＡＫり）Ｌ、　９
　ミンｉ！ｉ＊　（Ｇｌｌｌ）　　　　　ＧＡｊシスチ
イン（（ｙｓ）　　　　　　　ＴＧＫトリプトファン（
Ｔｒｌｌ）　　　　Ｔｌ’；Ｇアルギニン（Ａｒｇ）　
　　　　　讐６Ｚグリシン（ｊ；Ｉ　ｙ）　　　　　　
　　Ｇ　ｌ；　Ｌ終結イ８号　　　　　　　　　ＴＡＪ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に５゛末端、右側に３゛末端をもつ伝令ＲＮＡのト
リヌクレオチドに対応する。本明細書に記数のＤＮＡは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｎ＋ＲＮＡ
の配列に対応する配列の［）ＮＡ鎖のものである。文字
はデオキシヌクレオチド配列を形成するプリン文はピリ
ミジン塩基を示す。

Ａ＝アデニエ ン；＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＶｈＳｋまたは６の場合は、χ＝Ｔ叉はＣ０ＶがＣまた
はＴの場合は、×＝Ｃ６ ＸがＣの場合は、Ｙ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。

×がＴの場合は、Ｖ＝Ａ叉はＧ。

ＺがＡ叉はＧの場合は、す＝Ｃ叉はＡ。

ＺがＣ叉はＴの場合は、−二（シ。

νがＣの場合は、Ｚ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。

すがＡの場合は、Ｚ＝Ａ叉はり；。

ＳがＡ、　Ｇ、　Ｃ叉はＴの場合は、０Ｒ＝ＴＣ，又は
その代わりに９がＴ又はＣの場合は、ＱＲ＝ＡＧ。

、１＝八又は（： に＝Ｔ又は（： Ｌ＝Ａ、　　Ｔ、　Ｃ又はＣ。

Ｍ＝Ａ、　Ｃ叉はＴ。

Ｆ記は、［（、Ｌ　、毒素の新規なアミノ酸配列が、こ
のタンパクの同しアミノ酸配列をコードシた同等なヌク
レオチド配列によって調製できることを示す。ｊだって
、本発明はこのような同等なヌクレオチド配置りを包含
する。更に、アミノ酸配ケ１の変更がタンパクの二次構
造を変更しないならば、確認された構造及び機能のタン
パクが、このような変更によって構築できることが示さ
れた［カイザー・イー・ティー（にａｉｓｅｒ、　Ｅ、
Ｔ、）及びケズディ・エフ・ジエイ（Ｋｅｚｄｙ、　Ｆ
、ｊ、）（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３巻２４
Ｌ２５５頁］。このように、本発明はタンパクの二次構
造を変更しないような本明細書に記載のアミノ酸配列の
変異体、又は構造が変更される場合、生物活性がある程
度保持されるような変異体を包含する。

１５（ｌ　１ １６二１ １５１０　　　　　　−１５二Ｑ ＣＧＡＡＧＡＡＣＴＴ　　Ｃ＾ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡ
ＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＩ：１ＡＣ
ＧＧＡＡ　　ＧＡＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣ
Ｇ　　ＧＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴ　　
ＴＴＡＣＧＴＴＡＡＩ：ｉ１″５ｉ：５０　　　　　　
　１５４０　　　　　　　１″５′５（＋　　　　　　
　　１５６０ＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＴＡ
Ａ　　ＡＴＡＴＴＡＣＴＧＣ＾ＣＣ＾ＴＴ＾Ｔ口＾ＴＣ
ＧＣＴＡＣＧＣＴ ＴＣＡＧＧＧＧ八八丁 ＧＡＣへへＴＡＧＩ３丁 ＴＧＣＴＣＡＴＧＴＣ １日（〕１ １９二１ １９日１ １日１０ ＣＧＡＡＴＴＧＡＡＴ ＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧ ＡＣＧＧＡＴＴＡＴＣ ＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡ ＣＧＧＡＡＴＴＴＡＣ １日二〇 ＴＴＧＴＴＣＣＧＧＣ ＴＧＡＡＴＧＡＧＣＴ ＡＴＡＴＴＧＡＴＣＡ ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴ ＴＴＣＡＡＧＡＴＣ口 １日３゜ ＡＧＡＡＧＴＡＡＣＣ ＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴ ＡＧＴＡＴＣＣ＾ＡＴ ＧＴＣＣＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡＣＴＴＴＡＧＡ ２１（＋１　　ＡＩＥＡＧＩ３ＡＡＧＴＡ　ＣＧＧＡＴ
ＡＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧ＾二１６１　　ＡＣＧＣ
ＴＡＴＴＩＥＧ　ＧＴ＾ＣＣＴＴＴＩＥ＾　Ｔ１３＾Ｇ
ＴＧＣＴ＾Ｔ１日４０ １日５０ ＴＴＡＧＴＴ１３ＡＧＴ　　ＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡｒＩ
ＴＣＡＡＡＣＡＴ１３　　ＣＧＡＡＧロＧＡＣＴ６ＧＧ
ＡＴＣＡＡ丁Ａ　　ＧＡＣＡ＾ＣＴ＾Ｇ＾１日６０ ＴＧＡＡＴＴＴＴＧＴ ＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧ ＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧ ：１６０ ２４１０　　　　　　２４２０　　　　　　２４：ＪＯ
２４４０２４５ｉ０　　　　　　　：！４６０二４０１
　口ＡＴＴＴＣＴＣＣＴ　　ＴＩＥＧＡＣＡＴＴＧＡ　
　ＴＩ：１ＴＴＩＥＧ＾ＴＧＴ　　＾Ｃ＾Ｇ＾ＣＴＴ＾
＾　＾ＴＧ＾ＧＧ＾ＣＴＴ　　＾ＧＧＴＩ：ｉＴ＾ＴＧ
Ｇ２４６１　　ＧＴＧＡＴＡＴＴＣＡ　　ＡＩＥＡＴＴ
ＡＡＧＡＣＧＣ＾＾Ｇ＾ＴＧＧＣ二６４１ ＴＣＴＧＴＡＧＡＴＧ　　ＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴ　　Ａ
ＡＡＣＴＣＴＣＡＡ　　ＴＡＴＧ＾Ｔ＾Ｇ＾ＴＴ＾ＣＡ
Ａ６ＣＧＧ＾　Ｔ＾Ｃ０＾＾Ｃ八ＴＣ２７：５０ 二８：１ ＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴ　　ＣＣＣＴＡＴＡＴＧＡＴＧＣ
ＧＡ１３ＡＡＡＴ １３ＴＣＣＴＴＧＴ丁Ｇ 丁ＴＣＣＧＩ：ｉＡＡ丁Ｇ　　ＧｆＥＡ＾ＧＣ＾Ｇ＾＾
ＧＴ１３ＴＣＡＣＡＡＧ　　ＡＡＧ丁ＴＣＧ丁ＧＴ　　
ＣＴＧＴＣロＧＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧ＾ ＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡ　　ＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡらＡＴ
ＴＡＴＡＣＴＧ　　Ｃｒ３＾ＣＴＣＡＡＧＡ　　ＡＧＡ
＾Ｔ＾ＴＧ＾ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴ　　ＡＴｒ３ＣＡ
ＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡ ：５＝　”）　　　　　　　３３５ｉ’Ｊ　　　　　　
　−Ｉ　：”　５亀：）ＴＡＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣ
ＡＧＣＴＩ：ｉＧ　　ＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧ丁
Ａ７１３ＧＡ　　ＴＴＧＡＧＡＴＣＧＧ　　ＡＩＥＡＡ
ＡＣＧＩ：１ＡＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧ　　ＣＧＴＧＧ
ＡＡＴＴＡ　　ＣＴ丁ＣＴＴＡＴＧＧ　　ＡＧＩＥＡＡ
申第２ ｉ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｒ
ｏ　Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　ＡｓｐＭ６　　Ｌｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｆ’ｒｏ　　１３Ｌｕ　Ｖａｌ　　
Ｇｌｕ　　Ｖａｌ５　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｒ＋　　巳ｈｅ＝　　Ｉｌ
ｅ　　Ａｓｎ　　６１ｎ　　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ　　ＧＬ
ｕ　　ＧＬｖＡＩａ　　Ｉｌｅ　　Ｆ’ｒｏ　　Ｌｅｕ
　　Ｆ’ｈａ　　Ａｌａ　　’ｖ／ａｌＳｓｒ　　Ｖａ
ｌ　　丁ｙ１’　　Ｖａｌ　　ｆ３１ｒ＋　　Ａｌａ　
　Ａｈａ＾ｒ９ ＧＬｕ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｌａｕ　　Ｔｌｙ （）ａｌ ３１ｙ Ｌａｕ Ａｒｇ Ａｓｐ １ａ Ｔｈｒ’ Ｇ　１　’／ Ｐｒ口 Ｇｌｖ Ｖａｌ ｌｖｌｅｔ　　Ｇｌｖ Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ Ｐｈｅ　　Ａｓｎ Ｔｈｒ　　ＧＩＬＪ Ｔｙｒ　　Ａｒｇ ５ｎ Ｖａ、Ｉ １ｅ Ｐｈ＝ ｙｓ Ａｌａ Ｔン°Ｆ１ Ｇｌｖ Ａｌａ ！Ｅｅｒ ＾１ａ ｒａ Ｔす［・ Ｇｌｖ ＩＩａｌ、Ｆ’ｒｏ　　Ｆ’ｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｎ
　　Ａｓｎ　　Ａｃ＝ｎ　　Ｖａｌ）−１ｉｓ　　Ａｒ
ｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　　ｌ−１ｉｓ　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ
　　Ｍｅｔ５７１　？ｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｆ
’ｒ。

５日６　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ６０
１　　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｆ’ｈｅＦｈｅ　　
Ａｓｎ　　Ｆ’ｈｅ Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ｆ’ｒｏ　　Ａｌａ Ｇｌｎ ｌＥｌｙ Ａｓｎ Ｆ’ｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ ｅｔ ｌ５ Ｔｈｒ％ １ｅ Ｅ１ｎ ｌＥｌｙ　Ｇｌｙ ｓｐ ７′５１ Ｌｅｕ Ｉｓ ｌＥｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ ｉｓ Ｇｌｙ ｙｒ Ｌｅｕ ｉｓ ｙｒ ５ｎ ｒＰ Ｓｅｔ” Ｉ９ １ａ Ｐｒ口 ｉｓ Ｇｌｕ ｙｓ Ｌｅｕ ｉｓ ｓｐ ｉｓ Ｓｅｒ Ｆ’ｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ｓｐ １ｅ ｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ ｖｓ 扁ｒｇ １ｃｍ Ｆ’ｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｆ’ｈｅ Ｓｅｒ Ｌミし ノロ、１ ＋Ｅ１ｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ｅｔ Ｇｌｕ ｌｕ 第３表 １’１ｓｓｔ　　ＡＳｐ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｒ
ｏ　ＡＳｎ　　ＩＩｓ　＾ｑｎ　　ＧｌｕＡＴＧ　　Ｇ
ＡＴ　　ＡＡＣＡＡＴ’　ＣＯＧ　　ＡＡＣＡＴＣＡＡ
Ｔ　　ＧＡＡ＝５ Ｊ０ ＴＣＧ　　ＣＴＡ　　ＡＣＧ　　ＣＡＡ　　ＴＴＴ　　
ＣＴＴ　　ＴＴＩ３　ＡＧＴ　　ＩＥＡＡ１：５０ １山〕 ＣＴＴ　　ＡＣＡ　　ＡＣＣＧＣＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣ
Ｔ　　ＣＴＴ　　ＴＴＴ　　ＧＣＡ　　ＧＴＴ　　ＣＡ
Ａ　　ＡＡＴ　　ＴＡＴ　　Ｃ，−Ａ　　ＧＴＴ　−Ｃ
ＣＴ　　ＣＴＴ　　Ｔ丁Ａ　　ＴＣＡ　　ＧＴＡＣＡＴ
　　ＡＧＧ　　ＧＧＴ　　ＴＡＴ　　ＴＡ＋　　ＴＡＴ
　　ＴＧＧ　　ＴＣＡ　　ＧＧＧ　　ＣＡＴ　　ＣＡＡ
３：５０ コ３５ ３？Ｊ３ ３６Ｃ〕 ゴ７０ ３日５ ＩＥＧＡ　　ＡＣＣＴＣＣＴＣＡ　　ＡＡＴ　　ＴＴＧ
　　ＣＣＡ　　ＴＣＣＧＣＴ、ＧＴＡＧＡＴ　　ＧＡＡ
　　ＡＴＡ　　ＣＣＧ　　ＣＣＡ　　ＣＡＧ　　ＡＡＴ
　　ＡＡＣＡＡＣＧＴＧ４：５ ４６５　　　　　　　　　　　　　　　　４７ＱｒＥｌ
ｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　ＩＩｓ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｆ’ｒｏ　　！５ｅｒ　　Ｓｅｒ　　ＧｉｎＧＡ
Ａ　　ＴＴＴ　　ＡＡＴ　　ＡＡＴ　　ＡＴＡ　　ＡＴ
Ｔ　　ＣＣＴ　　丁ＣＡ　　ＴＣＡ　　ＣＡＡ　　ＡＴ
Ｔ　　ＡＣＡ　　ＣＡＡ　　ＡＨＡ　　Ｃ口＋　　ＴＥ
Ａ　　ＡＣＡ　　＾＾Ａ　　ＴＣＴ　　ＡＣＴ４Ｅｉ！ ｑ５ ｆｆ、Ｈン 一〇５ ５二５ ５ｉ１Ｑ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５１５
　　　　　　　　　　　　　　　　　５二１）Ｌｅｕ　
　Ａｒ”９　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ
　　Ａｌａ　　Ｆ’ｒｏ　　Ｌ＝ｕ’　５ｅ−ｒＴＴＡ
　　ＡＩＥＡ　　ＧＴＡ　　ＡＡＴ　　ＡＴＴ　　ＡＣ
Ｔ　ＧＣＡ　　ＣＣＡ　　ＴＴＡ　　ＴＣＡ５ｉ！０　
　　　　　　　　　　　　　　５３！　　　　　　　　
　　　　　　　　５４１）Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ
　　Ａｓｎ　　Ｌｓｖ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｈｉｓ
　　Ｔｈｒ　　５＝ｒＴＣＴ　　ＡＣＣＡＣＡ　　ＡＡ
Ｔ　　ＴＴＡ　　ＣＡＡ　　ＴＴＣＣＡＴ　　μＣＡ　
　ＴＣＡ５５Ｃ〕 ５６（〕 ３日５　　　　　　　　　　　　　　　５９０Ｓｅｒ　
　Ｓａｒ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　
　５ｔｅｒ　　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａ１丁ＣＡ　　ＡＧ
Ｔ　　ＧＴＡ　　ＴＴＴ　　ＡｃＧ　　ＴＴＡ　　ＡＧ
Ｔ　　ＧＣＴ　　ＣＡＴ　　ＧＴＣ５９＝ ６０Ｃ） ６１′５ ６２’５　　　　　　　　　　　　　　　　　６コ０　
　　　　　　　　　　　　　　　　６３５　　　　　　
　　　　　　　　　　６４１）Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ
　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　
Ｅｉｅｒ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ＾ｓｐ　ＶａｌＣＡＡ　ＡＡＧ　
ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　Ｇ＾１３　ＣＴＧ　　ＴＴＴ
　ＡＣＴ　ＴＣＴ　　ＴＣＣ＾＾Ｔ　ＣＡＡ　＾ＴＣＧ
ＩＥＧ　ＴＴ＾ＡＡＡ　ＡＣ＾　ＧＡＴ　ＧＴＧ６４′
５ ６日５ ７：ｗ５ ４ｇ５ ７日５ ８０！５ 日２′５ 日４５ ８６″５ ８日５ ９０′５ ７：５５ ７′５１） ７７′５ ７日０ 日１５ ８二Ｃ） ８ゴ０ ８３？５ Ｓａ 日７１） 日ε（１ ９７０９７５９日０ ｕａｌ　　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ
　ＡＳｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　！Ｅａｒ３丁Ａ　
　ＳＡＴ　　ＧＴＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＣＡＡ　
　ＡＡＣＡ＾ＣＣへＣＣＧＴ　　ＴＣＧｉｌ）７ｅＪ １０９＝ ＧＩＥＡ　　ＡＬＡ　　ＴＴＣＡＴ口　１ｊｌｌｊ　　
ｂＭＬ＋　　ｆＡＩｐＬ＋　　＋ｊｌｌコ　＋３Ｍ１−
４Ｌｃａｕ　　Ｍｅ’ｔ　　Ｇし」　ＧＬｕＣＴＴ　　
ＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ１〇二〇 １り８１：＋ １１０１ン 　ｌ　４Ｑ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第２表に示すアミノ酸配列のバシラス・スリンギエ
   ンシス（Ｂ．ｔ．）毒素をコードしたＤＮＡ。 ２、第１表に示すヌクレオチド配列をもった、特許請求
   の範囲第１項によるＤＮＡ。 ３、第１表に示すヌクレオチド配列をもち、該配列が停
   止コドンで終了する、特許請求の範囲第１項によるＤＮ
   Ａ。 ４、第２表に示すアミノ酸配列をもち、かつ鱗翅目に対
   して活性のある毒素、又はタンパクの二次構造を変更し
   ないか、又は構造が変更される場合生物活性がある程度
   保持されるような、その変異体。 ５、第２表に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオチ
   ド配列の全部又は一部をもったＤＮＡを含めてなる組換
   えＤＮＡ運搬ベクター。 ６、原核生物又は真核生物ホストへ移され、その中で複
   製される、特許請求の範囲第５項によるＤＮＡ運搬ベク
   ター。 ７、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素を
   発現させるために形質転換される細菌ホスト。 ８、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素が
   コードされている場合のＢ．ｔ．毒素遺伝子を含有する
   プラスミドベクターで形質転換させた特許請求の範囲第
   ７項によるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
   ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。 ９、特許請求の範囲第８項によるシュードモナス・フル
   オレッセンスであるＮＲＲＬ　Ｂ−１８３３２の確認特
   性をもったシュードモナス・フルオレッセンス（ｐＭ３
   、１３０−７）。 １０、シユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ア
   ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニ
   ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、リゾビウ
   ム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒ
   ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフイリウス
   （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウ
   ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（
   Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（Ａｌｃ
   ａｌｉｇｅｎｅｓ）の種である、特許請求の範囲第７項
   による微生物。 １１、微生物が有色素で葉面接着性である、特許請求の
   範囲第１０項による微生物。 １２、特許請求の範囲第１０項による微生物を鱗翅目昆
   虫に、又は該昆虫の環境に投与することを含めてなる、
   鱗翅目昆虫類の防除法。 １３、投与が根の周辺に対してである、特許請求の範囲
   第１２項による方法。 １４、投与が葉面に対してである、特許請求の範囲第１
   ３項による方法。 １５、投与が水に対してである、特許請求の範囲第１２
   項による方法。 １６、目標害虫環境に施用されたとき持続的な殺虫活性
   をもった実質的に無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を含
   めてなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅目昆虫
   に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、第２表に示す
   アミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素を発現できる形質転
   換された微生物の発現の結果としてつくられる場合の殺
   虫剤組成物。 １７、環境中で殺虫活性を持続させるために処理細胞が
   化学的又は物理的手段によって処理される、特許請求の
   範囲第１６項による殺虫剤組成物。 １８、細胞が原核生物又は低級真核生物である、特許請
   求の範囲第１７項による殺虫剤組成物。 １９、原核生物細胞が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
   ｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃ
   ｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｈｉａｃｅａｅ）
   、らせん科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸杆菌科
   （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、シュードモナ
   ス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾトバ
   クター科（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及びニ
   トロバクター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）
   からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１８項によ
   る殺虫剤組成物。 ２０、低級真核生物細胞が藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅ
   ｔｅｓ）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、及
   び担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）からなる
   群から選ばれる、特許請求の範囲第１８項による殺虫剤
   組成物。 ２１、細胞が有色素細菌、酵母又はカビである、特許請
   求の範囲第１６項による殺虫剤組成物。 ２２、第２表に示すアミノ酸配列のポリペプチド毒素を
   コードした、鱗翅目昆虫に有毒なバシラス・スリンギエ
   ンシス毒素遺伝子の発現結果である細胞内毒素を含有す
   る処理された実質的に無傷の単細胞微生物であって、細
   胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活性を持続させる
   ような条件下に細胞が処理される場合の微生物。 ２３、環境中で殺虫活性を持続させるために細胞が化学
   的又は物理的手段によって処理される、特許請求の範囲
   第２２項による殺虫剤組成物。 ２４、微生物がシュードモナスであり、毒素が第２表に
   示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素である、特許請
   求の範囲第２２項による細胞。 ２５、細胞がヨウ素で処理される、特許請求の範囲第２
   ４項によるシュードモナス細胞。２６、シュードモナス
   ・フルオレッセンスである、特許請求の範囲第２２項に
   よる細胞。２７、シュードモナス・フルオレッセンス（
   ｐＭ３、１３０−７）である、特許請求の範囲第２６項
   による細胞。 ２８、ｐＭ２，１０７−１、ｐＭ３，１２３−１、及び
   ｐＭ３，１３０−７からなる群から選ばれるプラスミド
   。 ２９、特許請求の範囲第２８項によるプラスミドｐＭ３
   ，１３０−７。