JPS6251982A - 細胞培養用基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野１ 本光明は、安全性、生体適合性１機械的強度に優れた新
規な細胞培養用基質に関するものである。 ［従来の技術１ １Ｉ胞培養用基質としては古くからガラス器具が用いら
れている。それ以外としては、化学的エツチング又は放
電加工をして濡れ特性を変化させたプラスチックスシャ
ーレ、デキストランの架橋物に電荷を導入したマイクロ
キャリヤー、各種合成高分子に電荷を導入したマイクロ
キャリＡ７−及び化学修飾させたコラーゲングル等が挙
げられる。 これらの基質は何れも表面の濡れ特性、含水率。 イオン性相互作用やミクロドメイン構造等の物理化学的
パラメーターを変化させたり、生化学的に特有な結合反
応を用いて見出されたものである。 しかし、プラスチックスシャーレ等の材料では高圧蒸気
殺菌に耐えることが出来ず、又、デキストラン架橋物、
コラーゲンゲル等は機械的強度が低い欠点がある。 又、合成高分子を用いたマイクロキャリヤーの製造には
高度の技術を必要とし、この人工基質は生体との馴染み
の点で劣っている。 従って、高圧然気滅菌に耐え、材料自体の溶出物等にＩ
Ｉｌ胞毒のない強度的にも優れた基質の要望が高いのが
現状である。キトサン成形物を細胞培養用基質に応用す
る考えは従来全くなかった。 【発明が解決しようとする問題点】 本発明は上述した従来から知られている細胞培養基質の
諸欠点を解決するものである。 キトサンは天然の海老、蟹等の甲殻類に含まれているキ
チンの脱アセチル化によって得られる物質であり、それ
自体が生体由来であるので細胞毒性が低く生体への馴染
みも良好で、合成高分子物質に見られる如き有毒な残存
モノマーも含まれていないので安全性も極めて高い。又
、キトサンは適当な結晶構造を有するために機械的強度
も高く、高圧蒸気滅菌に対する耐性も高く、キトサンは
分子構造中にアミノ基を有しているため荷電の導入。 化学修飾による抗血栓性の付与、更には酵素や蛋白の固
定化の様な生化学的処理も容易である性質がある。 従って、本発明者等はキトサンの上記諸特徴に注目して
本発明をなしたものであって、本発明により合成高分子
にない優れた安全性、生体適合性を有するキトサンを用
いて、他の生体由来による人工基質にない別械的強度の
高い新規な細胞培養用基質を得たものである。

【問題点を解決するための手段】

本発明の細胞培養用基質は、キトサンを原料として、こ
れを酸性水溶液中に溶解し、塩基性溶液中で膜状、繊維
状１球状体等に成形し、場合によっては成形されたキト
サンを架橋処理することにより得られる。 使用するキトサンは特に限定はされないが、平均分子量
が１００００〜２３００００の低分子量キトサンを用い
ることが好ましい。キトサンは、酢酸、ジクロル酢酸、
蟻酸等の単独、若しくは混合物の水溶液に溶解する。キ
トサン酸性水溶液の濃度は取扱いに適した範囲で任意に
選択出来、咳キトサン酸性水溶液は水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム。 炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチレン
ジアミン等のアルカリ性物質を含む塩基性水溶液中で凝
固せしめる。塩基性水溶液には、メタノール、エタノー
ル等の極性を有するアルコール類を加えて使用すること
もできる。 本発明によるａ胞培養用基質は、膜状、繊維状。 球状体等任意の形状とすることができる。膜状とする場
合はキトサン酸性水溶液を固体上に塗布後塩基性水溶液
中に浸漬させる、膜状に塩基性溶液中に押出し成形する
等の方法がとられ、又、繊維状２球状とする場合は、キ
トサン酸性水溶液を吐出口より圧下刃に塩基性水溶液よ
りなる凝固浴中に連続的に又は一定量ずつそれぞれ供給
、凝固せしめることによって得られる。 上記のようにして得られたキトサン成形物は、必要に応
じ、有機ジイソシアネ−１・化合物、エピハロヒドリン
、グルタールアルデヒドや有機ハライドで架橋処理を行
う。架橋処理を行うことによって、キトサン成形物は機
械的強度が増加し取扱いに便利なものとなる。 有機ジイソシアネート化合物を用いて架橋反応を行う場
合は、極性溶媒中で反応を行う。極性溶媒としては、メ
タノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のア
ルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン
類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の
アミド類が使用できる。又、有機ジイソシアネート化合
物としては、例えば４，４′−ジフェニルメタンジイソ
シアネート、１，４−フェニレンジイソシアネート、２
，４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシ
アネー１−１１．４−シクロヘキサンジイソシアネート
、４，４′−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート
、キシリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシ
アネート、ヘキサメチレンジイソシアネー１へ等が挙げ
られる。 本発明による細胞培養用基質は、インターフェロン、腫
瘍抗原、ウロキナーゼ、インシュリン。 モノクローナル抗体等を分離、粘製する際の細胞大量培
養用の基質としてのみならず細胞を生着させ、生体本来
の能力を生かした人工臓器として注目されているハイブ
リッド型人工臓器としても応用できる。 【実　施　例１ 次に実施例を埜げて、本発明を説明する。 実施例における１ｆｌ胞懸濁液、培養及び計数方法は次
の通りである。 （１）培養液としてイーグル最少必須培地に１０％ウシ
胎児血清を加えたものを用いた。 （２）細胞としてはマウス結合組織由来繊維芽細胞であ
る１９２９．アフリカミドリザル腎臓由来繊維芽細胞で
あるＶｅｒｏを用いた。 （３）　（１）の培養液に１．０ｘｉＯｃｅｌｌｓ／ｄ
になるようにの（２）の各細胞を懸濁させた。 （４）各シャーレに細胞懸濁液５艷を分注し３７℃、０
０２５％雰囲気下で１．２．４日培養後の＠胞数をそれ
ぞれ計測した。 （５）計数方法は浮Ｍ細胞（生着せｆ浮遊している細胞
）と培養液をＷ４酸緩衝液で除去し、生着細胞を１・υ
プシンーＥＤＴＡ溶液処理で剥離し、しかる後該液を７
００’ｒｐｎ、　６分間遠心分雌し、トリプシン−ＥＤ
Ｔへ溶液等を除去後、沈澱したｍ胞を′ＩＡ酸緩衝液２
ｒＩＩ！中に懸濁し、血球計点盤により計測した。 ◇実施例１ 分子ｆｉ　２０００００又は４３０００で脱アセチル化
度８０と９５％のキトサンの０．５％酢酸水溶液２雇を
それぞれ直径６０．のガラスシャーレ底面に均一に注加
し、５％アンモニア水で中和凝固させ膜状に形成させ、
純水で水洗した後潟洗し、４０℃で乾燥させ膜とし試料
番号１〜４とした。これらの膜を１２１℃で２０分間高
圧蒸気滅菌し、無菌下で′ＩＡＰ１緩衝液で洗浄し＠養
基質とし、ＩＩ胞Ｌ９２９を培養した。１，２゜４日後
の結果を第１表に示す。従来から使用されているガラス
シャーレを培養基質として使用した比較例１の結果と比
較して従来使用されているものと同様のＩＩＩ胞数が認
められた。 以下余白 ◇実施例２ 分子ｆｆｉ　２０００００で脱アセチル化度８０％と９
５％のキトサンを０．５％酢酸水溶液とし、この２威を
それぞれ直径θＯ顛のガラスシャーレの底面に均一に注
入し、５％アンモニア水で中和し成膜して純水で水洗後
潟洗し４０℃で乾燥した。このシャーレ上の膜に対し５
％エビクロロヒドリンのエタノール溶液を１ＯＮ１注加
し４０℃で４時間静置し、エタノールで３回洗浄後純水
で水洗をし更に８０℃で湯洗を１時間行い、１２１℃で
２０分間高圧蒸気滅菌し、無菌下で燐ｌ！！緩衝液で洗
浄し試料番号５，６の培養用基質を得た。又、分子量２
０００００と４３０００で脱アセチル化度９５％のキト
サンを用いて上述の如くシャーレ上に膜を作り、２．５
％グルタールアルデヒドの純水溶液１０ｄを注加し、室
温で２時間静置し、純水で水洗し８０℃の湯で１時間湯
洗を行い、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌し、無菌下
でｙＩ４酸緩衝液で洗浄し試料番号７，８の培養用基質
を得た。又、分子１２０００００で脱アセチル化度８０
％と９５％のキトサンを用いて上述の如くシャーレ上に
膜を作り、５％のへキサメチレンジイソシアネー１−（
ＨＯＴ）のジメチルフォルムアミド溶液１０ｄを注加し
室温で１．５時間静置しジメチルホルムアミドで３回洗
浄後純水で洗浄後８０℃の湯水で３０分間渇沈金行い、
１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌し無菌下で′！ｆ４酸
緩衝液で洗浄し、試料番号９，１０の培養用基質を得た
。 又、分子Φ４３０００と２０００００で脱アセチル化度
９５％のキトサンを用いて上述の如くシャーレ上に膜を
作り、１％の４，４′ジフエニルメタンジイソシアネー
ト（８０１）のジメチルホルムアミド溶液１〇−を注加
し室温で１時間静置し、ジメチルホルムアミドで３回洗
浄後純水で水洗し、８０℃の渇水で３０分間潟洗した。 これを１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌し無菌下でｖＡ
酸緩衝液で洗浄し、試料番＠１１゜１２の＠養用基質を
得た。 又、分子量４３０００と２０００００で脱アセチル化度
９５％のキトサンを用いて上述の如くシャーレ上に膜を
作り、５％塩化シアヌルのジメチルホルムアミド溶液１
０戒を注加し、８０℃で２時間静置しジメチルホルムア
ミドで３回洗浄後、純水で水洗して８０℃の渇水で１時
間湯洗を行い、１２１℃で２０分間高圧然気滅菌し、無
菌下で燐酸緩衝液で洗浄して試料番号１３．１４の培養
用基質を得た。 これら試料番号５から試料番号１４について、これら基
質に対し、１１１１胞［９２９を培養した。１，２゜４
日後のａ胞数を従来から使用されているガラスシャーレ
を培養基質として使用した比較例２と共に第２表に示す
。本発明による培養基質は、架橋反応させることにより
強度が増加して取去いが容易であると共に、培養基質と
しての性能も侵れたものであった。 以下余白 又、分子量２０００００で脱アセチル化度９５％の上記
試料番号８及び１２に用いた＠養用基貿を使用し、試料
番号１５．１６として細胞Ｖｅｒｏを＠養した結果をガ
ラスシャーレを培養基質とした比較例３の細胞数と共に
第３表に示す。架橋反応を行ったキトサン培養基質は、
細胞Ｌ９２９の場合と同様に優れた培！Ｉ基質としての
性能を示した。 以下余白 ◇実施例３ 平均分子ｆｆｉ　４２０００で脱アセチル化度８０％の
キトサンの５％酢酸水溶液を、１０％Ｎａ０１ｌ、　３
０％ＣＩ＋叶と水からなるＦＡ基注性水溶液中ノズル孔
径０．２４闇のノズルよりＮ２圧力２　Ｋ９　／　ｃ−
で落下させ球状に成形した後、この球状物を洗液が中性
になる迄水洗し、粒度が４２〜８０メツシユの球状基質
を得た。 この球状物１００−を取り出し、ジメチルホルムアミド
置換を４回行った後、１０％４．４′シフにルメタンジ
イソシアネート（１４ＤＴ）　１００　ｄを注加し室温
で１時間攪拌した。その後ジメチルホルムアミドで３回
＠換後水洗し８０℃湯水で１時間湯洗し、燐酸Ｍ耐液で
＠換後１２１℃で２０分間高圧熱気滅菌し、無菌下で燐
酸緩衝液で洗浄し、試料番号１７の培養用基質を得た。 又、別に球状物１００ｄに対し２．５％グルタールアル
デヒド１００ｄを注加し、室温で２時間攪拌後純水で水
洗し８０℃渇水で１時間湯洗した。これを燐Ｂ緩衝液で
置換後１２１℃で２０分間高圧熱気滅菌し、無菌下でｆ
ｉ酸緩衝液で洗浄し試料番号１８の培養用基質とした。 これら試料番号１７．１８の塩ｍ基質をシャーレに所定
Ｐ入れて細胞Ｌ９２９を培養した。該培養の結果を比較
例４として市販のｊ８養基７ｑ　（Ｃ１／１ＯｄｅＸ　
ｔｙｐｅＩＩ　、スウェーデンＰｈａｒｍａｃ　ｉａ社
：裂）を用いた結果と共に第４表に示した。これらの結
果から、Ｊ氷状体のキトサン基質も優れたＪ８養基質と
しての性能を有することが判明した。 以下余白 【発明の効果１ 本発明の細胞培養用基質は、上記実施例の記載から明ら
かなように高圧蒸気滅菌が可能であり、又、成形後のキ
トサン培養基質を架橋処理した場合は、機械的強度が増
加し、取扱いに便利なものとすることができる。本発明
による細胞培養用基質は、従来用いられている基質と全
く同様の１１１８１１培養についての優れた性能を有し
、本発明によって、細胞の増殖２機械的強度、高圧蒸気
滅菌耐性及び低毒性等に於いて極めて有用にして安全な
基質が提供されるものである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサンを酸性水溶液に溶解し、これを塩基性溶
   液中で成形してなる細胞培養用基質。
2. （２）成形後、架橋処理をしてなる特許請求の範囲第１
   項に記載の細胞培養用基質。
3. （３）該架橋処理を行う架橋剤が、有機ジイソシアネー
   ト、エピハロヒドリン、グルタールアルデヒド及び有機
   ハライドの何れかである特許請求の範囲第２項に記載の
   細胞培養用基質。
4. （４）該基質の形状が、膜状、繊維状、球状物の何れか
   である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の細胞培養
   用基質。