JPH02423A - キトサン−コラーゲン複合体の細胞培養用基質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分！〕 本発明は、新規な８ＩＩ２Ｉ培養用基質に関し、詳しく
は動物細胞または植物細胞などの生物細胞の細胞培養を
行なうときに、細胞が付着し、増殖する細胞培養用基質
に関する。

本発明の細胞培養用基質は、動植物細胞の細胞培養に利
用することができる。

〔技術の背景および従来技術の説明１ 本明細書における「細胞培養用基質」は、細胞培養にお
いて、細胞が付着し、細胞培養用基質に付着した細胞が
増殖する培養基の材料であって、細胞培養における細胞
の支持物質ということができる培養基の材料である。

キトサンは、エビやカニの甲Ｎ票動物の殻に含まれるキ
チンを濃アルカリにより脱アセチル化して得られる多着
類であって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ
−グルコサミンからなるが、キトサンにおけるＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンの比率は、
その脱アセチル化の程度により、履々様々のものが得ら
れる。

一方、コラーゲンは、生体の結合組織の主要求分であっ
て、生体適合性が優れている物質であって、化粧品また
は医用材料として広く使用されている。またトロボコラ
ーゲンＣコラーゲン分子）をコラゲナーゼを除く蛋白加
水分解酵素で処理し、分子末端の非ヘリックス部分Ｃテ
ロペプタイド）を除去したものは、抗原性が非常に低く
、アテロコラーゲンと呼ばれる。

これまでに、細胞培養用基質として即々のものが利用さ
れている。例えば、ガラス器具、プラスチックスシャー
レ、ｇ飾デキストランビーズ、コラーゲンビーズなどを
利用することが試みられ、また単１−サンビーズをＢ胞
等菅用基質として利用することも提案されている。（特
開昭６２−５１９８２号公報） またこれまでに、Ｎ−アシルキトサンおよびコラーゲン
の複合材を生体適合性の優れたｆｉｌ（Ｉカバー材、止
血材または人工臓器などの医ＩＴＪｕＢとして利用する
ことが提案されている。Ｃ特開昭６１−２５３０６５号
公報） プラスチックスシャーレおよびキトサンビーズは、細胞
培養において、細胞の初期接着は比較的速いが、細胞の
種類によっては、細胞とのなじみが悪く、細胞の増殖が
良ｂ７に行なわれ難いことがある。またフラーゲンビ〜
ズおよびコラーゲンフィルムは、＃ｉ′ｌ＋胞とのなじ
みが良９了であっても、細胞の初期接着が遅く、ｙ％機
械的強度低く、さらに高価である。

細胞の培養基の材料に対する初期ｉ着は、マイクロキャ
リヤー法による細胞培養を行なう場合にｆｆｔ要であっ
て、接着依存性細胞においては、培養基の材料にＦＩＩ
着することな１ノに、細胞のｔ１１殖を期待することが
できず、細胞の培ＷＸの材料に対する初期ｉｓの速いこ
とが重要であり、また細胞の大Ｗ！培菅においては、細
胞の培養基の材料に対する初１ｇＩ接着の速いことが要
望されている。さらに細胞の安定的な培養の継続のため
に、細胞の培賃基の材料にλ［する初期摺着の速いこと
の他に、細胞とのなじみが良く、また充分な機械的強度
を有する安価７Ｊ細胞培菅用基質の開発が要望されてい
る。

水弁１１１１名等は、キチン、キトサンについて長年研
究を続けているが、その研究において、キトサンをコラ
ーゲンと組み合わせたキトサン−コラーゲン複合体は、
充分な機械的！ｆｆを’ｆｆ　Ｌ／　、細胞の初期接着
が速く、また細胞とのなじみが良好で、細胞の増殖も円
Ｍに行なわれることを見出し、この知見に基づいて本発
明に到達した。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の［１的は、細胞の初＋！７Ｊ接着および細胞の
増殖が良好に行なわれる１ＩｌｌＩ略培菅用基質を提供
することにあり、詳しくは機械的強度が大きく、細胞の
′１ＴＪＦＩＪ接着およびｌ［ＩＩ胞の増殖が良好に行
なわれ、動物１ｌＩＩ晦の細胞培養に好適に利用するこ
とができる細ｌ１１１ｒＦ４菅用基質を提供することに
あり、さらに詳しくは機械的強度が大きく、細胞の接着
および増殖が良好に行なわれる細胞培養用基質を余分な
コストを要することなく、安価に提供することにある。

本発明は、キトサン−コラーゲン複合体なＵ効ζ分とす
ること４ｉ−特徴とする機械的強度が大きく、ａ胞の初
期接着および増殖が良好に行なわれる細胞培養用基質ひ
ある。

本発明の細胞１′３着用基質はキトサンおよびコラーゲ
ンの酸性溶液からキトサンおよびコラーゲンを析出する
ことによって製造することができ、またキトサンの酸性
等液に、コラーゲンの存在の下に、塩基性溶液またはキ
トサンを析出しうる塩類溶液を加えて、キトサンを析出
することによって製凸することができ、さらにコラーゲ
ンの酸性ｍ液に、キトサンの存在の下に、塩基性溶液ま
たはコラーゲンを析出しうる塩類溶液を加えて、コラー
ゲンを析出することによってｖａすることができる。

本発明のキトサン−コラーゲン複合体の細胞培養用基質
の製造において、キトサンおよびコラーゲンの酸性溶液
からのキトサンおよびコラーゲンの析出は、溶液の蒸発
乾固による除去、または酸性溶解に対する塩基性溶液の
添加によるｐＨの調整によって行なうことができ、また
キト４ｊンの酸性ｍ液からキトサンを析出するときに共
存するコラーゲンは、コラーゲンの成形品を使用するこ
とができ、またコラーゲンの酸性溶液からコラーゲンを
析出するときに共存するキトサンは、キトサンの成形品
を使用することができ、さらにこれらのコラーゲンの成
形品およびキトサンの成形品は、任意の形状の成形品、
例えば、球状、棒状、管状、Ｎ膜状（フイルムスンおよ
びその他の形状の成形品を使用することができる。

本発明のキトサン−コラーゲン複合体の細胞培養用基質
の製造において、あらかじめ所望の形状に成形した基体
を調製し、その基体をキトサン−コラーゲン複合体の薄
膜で被覆して、その表面がキトサン−コラーゲン複合体
である細胞培養用基質をつくることもできる。

また本発明の細胞培養用基質の製造において、キトサン
−コラーゲン酸性溶液は、２５〜９０％（！ｆｌ）のコ
ラーゲンを含むものの使用によって細胞接着効果の高い
細胞培養用基質をつくることができ、また６０〜９ｏ９
１；（Ｍ量）のコラーゲンを含むものの使用によって細
胞増殖効果の高い細胞培養用基質をつくることができる
。

本発明の細胞培養用基質におけるキトサン−コラーゲン
複合体は、キトサンおよびコラーゲンが均質に混在する
複合体を使用することができ、またキトサンの基盤をコ
ラーゲンの薄膜で被覆した複合体またはコラーゲンの基
盤をキトサンの薄膜で被ＮＬ／た複合体を使用すること
ができる。

さらに本発明のｍ胞培養用基質におけるキトサン−コラ
ーゲン複合体は、栗曙処理をして、その機械的強度をよ
り大きいものとすることができ、栗潤処理における架橋
剤は、ジイソシアネート系のものを使用するのが好まし
い。

本発明のキトサン−コラーゲン複合体の細胞培養用基質
におけるキトサンは、キトサン、カルボキシメチルキト
サン、グリコールキトサンおよびサクシニルキトサンか
らなる群より選択されたものを使用することができるか
ら、キトサンを狭義に理解するときは、キトサンまたは
その誘導体というべきものである。

本発明の細胞培養用基質は、キトサン−コラーゲン複合
体におけるコラーゲンの使用により、動物細胞に対して
なじみ易く、またキトサンの使用により、細胞培養用基
質のａｍ的強度を向上し、さらに細胞の初期接着速度が
向上する、という利点、効果を生じると考えられる。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の細胞培養用基質におけるキトサン−コラーゲン
複合体は、キトサンおよびコラーゲンの組み合わせから
なるものであって、キトサンおよびコラーゲンが均質に
組み合わされたもの、およびキトサンおよびコラーゲン
が個別に組み合わされたものを使用することができる。

キトサンおよびコラーゲンが均質に組み合わされたキト
サン−コラーゲン複合体は、キトサンの酸性溶液および
コラーゲンの酸性溶液を混合し、その混合酸性溶液から
啓媒を蒸発することによって得ることができるが、また
その混合酸性溶液に塩基性物質のＷｇ液、たとえばアン
モニア水を加えて、キトサンおよびコラーゲンを溶液相
中に析出することによって得ることもできる。

キトサン−コラーゲン複合体の成形品を得るには、キト
サンおよびコラーゲンの混合酸性溶液を疎水性のｓａｇ
ａ、例えばトルエンに加え、撹拌して、球状のキトサン
およびコラーゲンの混合酸性ｉ＊！？ｉが疎水性の有機
溶媒相に分散した系を形成する。次いでこの系に塩基性
物質の溶液、例えばアンモニア水を茄え、撹拌して、キ
トサンおよびコラーゲンの混合酸性溶液相のキトサンお
よびコラーゲンを析出し、これをＲ水性の有機溶媒相か
ら取り出して、ビーズ状の成形品を得ることができる。

またキトサンおよびコラーゲンの混合酸性溶液を、所望
の形状のノズルから塩基性物質の溶液中に押し出して、
キトサンおよびコラーゲンを析出することによって、ノ
ズルの形状に相当する断面を有する線状または８ｍ状の
キトサン−コラーゲン複合体の成形品を得ることができ
る。

さらにキトサンおよびコラーゲンの混合酸性溶液を平底
の容器に入れ、これに塩基性物質の溶液を加え、撹拌し
て、キトサンおよびコラーゲンを析出して、キトサン−
コラーゲン複合体のＭｕのε形品を得ることもできる。

本発明のｉ胞培養用基質のキトサン−コラーゲン複合体
の成形品は、どのような形状のものであっても、これを
使用することができるが、ビーズ、系、ホロファイバー
（中空ｍ椎）、不！１１市またはフィルム状でのもので
あることが好ましく、またこれらのε形品は、あらかじ
め所望の形状に成形した基体の表面をキトサン−コラー
ゲン複合体の薄膜で被覆したものであってもよい。これ
らの基体は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド
などのプラスチックスまたはその発泡体、パーライトま
たはバーミキュライトなどの多孔質粒子、あるいは錦ま
たは林などの天然繊椎を使用することができる。

これらの基体をキトサン−コラーゲン複合体の薄膜で被
覆するには、これらの基体を本トサンーコラーゲン酸性
着液に浸漬した後、塩基性溶液の添加によりキトサン−
コラーゲン複合体を基体上に析出する方法、または容器
を形改する基体にキトサン−コラーゲン酸性？８Ｍを入
れ、蒸発乾固または塩基性溶液の添加により本トサンー
コラーゲン複合体を基体上に析出する方法のいずれの方
法であっても、それによることができる。

以上に説明したキトサン−コラーゲン複合体の扉形品の
１１９においてキトサンおよびコラーゲンの混合酸性溶
液の代わりに、キトサン７１Ｌ独の酸性溶液またはコラ
ーゲン酸性独の酸性Ｍｅを使用すると、キトサン単独の
上記と同様の形状の成形品またはコラーゲン電液の上記
と同棲の成形品を得ることができる。

このようにして得られたキトサン単独の成形品をコラー
ゲンの酸性溶液に浸漬して、キトサンは独のε形品の表
面にコラーゲンの酸性溶液を付着し、これを塩基性物質
の溶液、例えばアンモニア水に浸漬すると、キトサン単
独の成形品上にコラーゲンが析出してキトサンのε形品
がコラーゲンの７１１膜により被覆されたキトサン−コ
ラーゲン複合体のε形品を得ることができる。

またコラーゲンｉ独のε形品をキトサンの酸性そ液に浸
漬した後、これを塩基性物質のめ汐に浸漬すると、コラ
ーゲンのε形品がキトサンの薄膜により被覆されたキト
サン−コラーゲン複合体のε形品を得ることができる。

以上に述べたキトサン−コラーゲン複合体のε形品を架
１剤、例えばジイソシアネートと反応させると、キトサ
ン−コラーゲン複合体に架部反応が生起して、キトサン
−コラーゲン架１複合体のε形品を得ることができる。

キトサン−コラーゲン切Ｆａ複合体のε形品は、キトサ
ン−コラーゲン複合体のε形品よりもそのＲ械的強度が
向上する。

本発明のＩＩｌ胞培養用基質のキトサン−コラーゲン複
合体におけるキトサンは、キトサン、カルボキシメチル
キトサン、グリコールキトサンまたはサクシニルキトサ
ンを使用することができるが、これらのキ１−サン誘導
体におけるグリコールキトサンは、その置換度とかかわ
りなく、酸性溶液に熔解する。またサクシニルキトサン
およびカルボキシメチルキトサンは、そのａａ度により
酸性め液に対する醪解度が変動するから、サクシニルキ
トサンおよびカルボキシメチルキトサンは、酸性溶液に
おける醇解度の大きい低置換度のものを使用するのが好
ましい。

コラーゲンは、若い動物のフラーゲン組職を中性塩水？
８液および希酸水溶液でそれぞれ抽出して得られる中性
回置性コラーゲンまたは酸可容性コラーゲンを使用する
が、これらの抽出操作では可溶性でない不溶性コラーゲ
ンをペプシンのような蛋白質分解酵素で処理して、可溶
性とした酵素溶解コラーゲン（アテロコラーゲン）の他
に、サクシニルコラーゲンまたはメチル化コラーゲンを
使用することもできる。

本発明の細胞培養用基質のキトサン−コラーゲン複合体
におけるキトサンとコラーゲンの割合は、どのような割
合のものであっても、これを使用することができるが、
コーティング用め液の、Ｄ［＋では、コラーゲンを５〜
５０％（ｉＪｔｌｌ）の割合で含むものが好ましく、８
胞の接ηでは、コラーゲンを２５〜９０％Ｃ重量）の割
合で含むものが好ましく、また細胞の増殖では、コラー
ゲンを６０〜９０％（Ｍ　７１　）の割合で含むものが
好ましい。

本発明の細胞培養用基質のキトサン−コラーゲン複合体
における前記の架橋処理における栗嬌剤は、ヘキサメチ
レンジイソシアネートのようなジイソシアネート類、エ
ピクロルヒドリンのようなエビハロヒドリン類、グルタ
ルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、ウッドワード試薬またはＤＥＤＱを
使用することができる。また前記の架橋処理は、紫外線
を照射することによって行なうことができる。

本発明のＨ胞＠ＩＦ用基質は、動物細胞の培養に好適で
あって、インターフェロン、１１ｍｍ１＠原、ウロキナ
ーゼ、インシュリン、モノクローナル抗体およびワクチ
ンをＷａする際の細胞の大量培養用に使用することがで
きる。

以下において、実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。

実ＩＩＩＩＭ１１ （ポリマーコートシャーレの調製） ０．３％アテロコラーゲン塩酸溶液（ｐＨ：　３．Ｑ）
および０．３％キトサン酢酸溶液（ｐＨ：　４．０）を
第１表に示す割合に混合して、ポリマー混合液を調製し
、その１ａ７！をポリスチレンシャーレ（ファルコン３
００１）　　（径：３５ｍｍ、深さ：ｌＯ順）に注入し
た。１時間放置した後、ポリマー混合液を流出し、ポリ
スチレンシャーレを滅菌水で２回、およびダルベツコリ
ン酸ａ衝藤で１回リンスして、ポリマーコートシャーレ
を調製した。

第１表　ポリマー混合液のキトサンとアテロコ（細胞接
着試験） ニワトリ胚線維芽Ｅ胞を！０％牛脂児血清を含むダルベ
ツコ変法ＭＥＭ培地に２０万ｃａｌｌ　／−の濃度にｌ
！ＪＩＩＬ／、そのｌｆＥ胞懸濁液１．５−をポリマー
コートシャーレに注入し、これを炭酸ガス培養装置に入
れ、３７℃において、ＩＥｌｌｌｆｆｌに示す時間イン
キュベートした。その後、ポリマーコートシャーレのＩ
ＭＩｆｉｌ懸！ｉ液を流出し、流出した細胞懸濁液中の
ニワトリ胚ＳａＷ芽細胞数（Ｋ）をカウントし、ポリマ
ーコートシャーレに注入した細胞ｇ濁液中のニワトリ胚
ｗＡｓｉ芽細胞数（［１３との差をポリマーコートシャ
ーレに接着したニワトリ胚＊、ｍｙ細胞数として、ニワ
トリ胚ｌｌａｍ芽Ｈ胞のそれぞれのポリマーコートシャ
ーレに対する接着率Ｃ％）を次式により算出した。

接Ｉｌ率（％）　＝　（ｕ−Ｋ）　／　（ｕ）　ｘ　ｌ
ｏ。

結果は第１図に示すとおりであった。

第１因において、（−Ａ−３は試Ｂｌ−Ａ（キトサン：
１００）　、（−Ｂ−）は試８ｌ−８（キトサン／アテ
ロコラーゲン＝＝　７５　／　２５　）、（−Ｃ−）は
試Ｂｌ−Ｃ（キトサン／アテロコラーゲン＝５０　／　
５０　）、（−Ｄ−）は試＠１−Ｄ（キトサン／アテロ
コラーゲン＝＝　２５　／　７５　）、（−Ｅ−３は試
Ｂｌ−Ｅ（アテロコラーゲン＝１００）、および（−０
−）は未処瑯のポリスチレンシャーレにおける結果であ
る。

（細胞増殖試験） ニワトリ胚ｍｓ芽細胞をｌＯ％牛脂児血清を含むダルベ
ツコ変法ＨＥＭ＠ＩＩＩに、４万ｃｅｌｌ　／　１．５
−の濃度に懸濁し、その細Ｉ！２１ｇ濁液１．５−をポ
リマーコートシャーレに注入しくＩＢ細胞懸濁液中ニワ
トリ胚繊維芽細胞数二〇）、これを炭酸ガス培養装置に
入れ、３７℃において第２図に示す時間インキュベート
した。その後、ポリマーコートシャーレの細胞懸濁液を
流出し、ダルベツコリン酸緩衝液ｌ−で洗った後、その
ポリマーコートシャーレに０．１％トリプシン−ＩＯ諷
Ｍ　ＥＤＴＡ啓ｆｆ１ｍを加え、３７℃において１０分
間インキュベートした。その後、ポリマーコートの内壁
面から増殖したニワトリ胚ｍ雄芽細胞を剥離し、ダルベ
ツコリン酸緩衝液１ｔｎ１を加えてリンスし、その液中
のニワトリ胚繊維芽細胞数（Ｍ）をカウントし、次式に
よりポリマーコートシャーレに接着したニワトリ胚磁雄
芽細胞の増殖率ｃ％）を算出した。

増殖率　（％）＝（呵）／　　（Ｕ）　　ｘ　ｔｏ。

結果は第２図に示すとおりであった。

第２図において、（−Ａ−）、（−８−１、（−Ｃ−）
　、（−Ｄ−）、（−Ｅ−）および（−０−）は第１図
と同じである。

（考　察） 第１図によると、キトサンおよびキトサン−アテロコラ
ーゲン複合体でコートしたシャーレに対してニワトリ胚
繊維芽細胞は、未処理およびアテロコラーゲンでコート
したシャーレよりも、よく接着することがわかる。

第２図によると、キトサン−アテロコラーゲン複合体、
およびアテロコラーゲンでコートしたシャーレにおいて
、ニワトリ胚繊維芽細胞は、未処理およびキトサンをコ
ートしたシャーレよりも、大きい増殖率を示すことがわ
かる。

実施例　２ （グリコールキトサンーアテロフラーゲン架曙複合体の
薄膜の調製） １％アテロコラーゲン塩塩溶溶液ｐＨ：　３．０）１０
０重ｆ１部および１％グリフールキトサン酢酸溶液（ｐ
Ｈ：　４．０）　　１００ｆｆｉｆｆｉ部を混合して、
グーリコールキトサン−アテロコラーゲン混合溶液を調
製し、その１６セをポリスチレンシャーレ（フアシヨン
＋０２９）　　（径：１００ｍｍ、深さ：１５ｍｇ）に
入れ、風乾してポリスチレンシャーレの内底面にグリコ
ールキトサン−アテロコラーゲン複合体の薄膜層を杉皮
した。このグリフールキトサン−アテロコラーゲン複合
体の薄膜層をポリスチレンシャーレから剥魔し、メタノ
ール−アンモニア（４：Ｉ）溶液に浸漬して脱酸した後
、メタノールで充分に洗浄し、このグリフールキトサン
−アテロコラーゲン複合体の薄膜を２％のへキサメチレ
ンジイソシアネートを含むメタノールに浸漬し、２時間
架鴫反応を行なわせた。このグリコールキトサン−アテ
ロコラーゲン架１複合体の薄膜をメタノールで充分に洗
浄した後、充分に水洗して、グリコールキトサン−アテ
ロコラーゲンの架曙複合体の薄膜を調製した。

（細胞接着試験） 前記のグリコールキトサン−アテロコラーゲンの架喝複
合体の薄膜をポリスチレンシャーレ（フアシヨン３００
２）　　（径＝６０朋、深さ：１５＋＋ｇ）に敷き、そ
の薄膜の上にガラスリング（外径：４５關、内径：２５
１１ｊ、高さ：５ＩＩｊ＋）を置イテ、（−７７）中に
ニワトリ＃５繊維芽ＩＢ胞をｌθ％牛脂児血清を含むダ
ルベツコ変法ＨＥＭ＠ｉ１１に、２０万ｃａｌｌ／ｉの
１度に懸濁した紹胞懸濁液０．７５−を注入し、このポ
リスチレンシャーレを炭酸ガス培譬装置に入れ、３７℃
において第３図に示す時間インキュベートした。上ａＦ
Ｆｌを取り出し、上澄液のニワトリ胚ｍ錐芽ｌｉ［！胞
数（Ｋ）をカウントし、ポリスチレンシャーレに注入し
た細胞懸１１ｉｉ液中のニワトリ胚ｍ１ｍ芽８１ａ数（
Ｕ）　とのｍ　（Ｕ−Ｋ）’Ｅ−グＩＪ：１−ルキトサ
ンーアテロフラーゲンのｚｎｍ合体のＮＩ膜に接着した
ニワトリ胚繊椎芽ａｍ数として、その接着率（％）を次
式により算出した。

接ｔＪ　（％）　＝　（ｕ−Ｋ）　／　（ｔｌ）　ｘ　
ｔｏ。

１％アテロコラーゲン塩酸溶Ｈ（ｐＨ：　３．０）を使
用し、１％グリコールキトサン酢＃溶液（ｐＨ：　４．
０）を使用することなく、前記と同様にして、アテロコ
ラーゲンの栗橋体の薄膜を調製し、このアテロコラーゲ
ンの架１体の薄膜を使用し、上記と同様にして、ニワト
リ旺繊碓芽細胞の接着率ｃ％）を算出した。

さらにグリコールキトサン−アテロコラーゲンの架曙複
合体の薄膜を使用することなく、ポリスチレンシャーレ
（フアシヨン３００２　）に、［接ガラスリング（外径
：４５ｓ＋ｍ、内径：２５１１１１．高さ：５ｊＬ１１
）を置き、上記と同様にして、ニワトリ胚繊維芽細胞の
接着率（％）を算出した。

これらの結果は第３図に示すとおりであった。

万３図において、　（−〇−）はグリコールキトサン−
アテロコラーゲンの架曙複合体の薄膜、（−Ｘ−）はア
テロコラーゲンの架１体のＷｌ膜、そして（−Δ−）は
ポリスチレンシャーレ（フアシヨン３００２　）におけ
るニワトリ胚繊維芽細胞の接着率を示す。

（細胞増殖試験） 前記のグリコールキトサンーアテロコラーゲンの架橋複
合体の薄膜をポリスチレンシャーレ（ファルトコン３０
０２ン　ζ径：　６０　ｊｌＪＩ、　深さ：１５ＩＩｇ
）番こ敷き、その薄膜の上にガラスリング（外径：４５
朋、内径：２５１１１１．高さ：５＋＋ｘ）を置いて、
その中にニワトリ胚繊維芽細胞を１０％牛脂児血清を含
むダルベツコ変法ＭＥＮ培地に２万ｃｅｌｌ　／　０．
７５−の濃度に懸濁した細胞懸濁液０．７５−を注入し
くポリスチレンシャーレに注入した細胞懸ｍＷ中のニワ
トリ胚ｍ雄芽Ｊｉ１１胞数：Ｕ）、このポリスチレンシ
ャーレを炭酸ガス培養装置に入れ、３７℃において第４
図に示す時間インキュベートした。

上澄液を取り出した後のポリスチレンシャーレのグリコ
ールキトサン−アテロコラーゲンの架橋複合体の薄膜を
ダルベツコリン酸緩衝液１ｄで洗浄した後、０．１９６
トリブシンー１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ洛液１耐液１え、３
７”Ｃにおいて１０分間インキュベートした。その後、
グリコールキトサン−アテロコラーゲンの架橋複合体の
薄膜から増殖したニワトリ胚ｍａ芽ｍ胞を剥原し、ダル
ベツコリン酸緩衝液で洗浄し、その洗浄液中のニワトリ
胚議維芽細胞数（Ｍ）をカウントし、次式によりグリコ
ールキトサン−アテロコラーゲンの架橋複合体の薄膜に
接着したニワトリ胚ａｍ芽細胞の増殖率Ｃ％）を算出し
た。

増Ｍ率ｃ％）　＝　（Ｍ）　／　（ｕ）　Ｘ　ｒｏ。

１％アテロコラーゲン塩＃啓液（１１Ｈ：　３．０）を
使用し、１％グリコールキトサン酢酸溶液（１）Ｈ：　
４．０）を使用することなく、前記と同様にして、アテ
ロコラーゲンの架橋体の薄膜を調製し、このアテロコラ
ーゲンの薄膜を使用し、上記と同様にして、ニワトリ胚
繊維芽細胞の増殖率（％ンを算出した。

さらにグリコールキトサンーアテロフラーゲンの架橋体
の薄膜を使用することなく、ポリスチレンシャーレ（メ
チルコン３００２　）に直接ガラスリング（外径：４５
ｘＩｍ、内径：２５ｍ１１＋、高さ：５朋）を置き、上
記と同様にして、ニワトリ胚ｍ錐芽細胞の増Ｎ率（％）
を算出した。

これらの結果は第４図に示すとおりであった。

第４図において、（−０−）はグリコールキトサン−ア
テロコラーゲンの架橋複合体の薄膜、（−Ｘ−）はアテ
ロコラーゲンの架橋体の薄膜、モしてＣ−△−）はポリ
スチレンシャーレ（メチルコン３００２　）におけるニ
ワトリ胚繊維芽細胞の増Ｎ率を示す。

（考　察） Ｗ、３図および第４図によると、グリコールキトサン−
アテロコラーゲンの架橋複合体およびアテロコラーゲン
の架橋体は、これらを使用しないものに比べて憂れた細
胞接着率および１ｉＩＩ胞増殖率を示すことがわかる。

実施例　３ （カルボキシメチルキトサン−アテロコラーゲンの架橋
複合体の薄膜のＴＩＩＷＪ） １％アテロコラーゲン塩酸溶液（ｐＨ：　３．０）１０
０！ｆｉｔ部を１％カルボキシメチルキトサン（カルボ
キシメチル基の置換度：Ｏ，１５）酢酸啓液（ｐＨ：　
４．５）　　２００重量部を混合し、その混合液１６ａ
１１をポリスチレンシャーレ（メチルコン１０２９　）
（径：　１００朋、深さ：１５ｕ）に注入し、静置した
まま風乾して、ポリスチレンシャーレにカルボキシメチ
ルキトサン−アテロコラーゲン複合体の薄膜層を形成し
た。このカルボキシメチルキトサン−アテロコラーゲン
複合体の薄膜をポリスチレンシャーレから剥雇し、この
薄膜をアンモニアガス雰囲気に２時間次ｙ１した後、充
分に水洗し、この薄膜を１％カルボジイミド水溶液に３
０６Ｃにおいて、−夜浸漬して、反応させ、充分に水洗
し、カルボキシメチルキトサン−アテロコラーゲンの架
橋複合体の薄膜を調製した。

（細胞接着試験） 実施例２の細胞接着試験におけるグリコールキトサン−
アテロコラーゲンの架橋複合体の薄膜の代わりに、上記
のカルボキシメチルキトサン−アテロコラーゲンの架橋
複合体の薄膜を使用し、実施例２と同様にして、ＮＩ胞
接着試験を行なった。

結果は第５図に示すとおりであった。

第５図において、（−〇−）はカルボキシメチルキトサ
ン−アテロコラーゲンの架橋複合体の薄膜、（−Ｘ−）
はアテロコラーゲンの架橋体の薄膜、そして（−Δ−）
はポリスチレンシャーレ（メチルコン３００２　）にお
けるニワトリ旺繊唯芽旧、抱の接着＋を示す。

（細胞増殖試験） 実施例２の細胞増殖試験におけるグリコールキトサン−
アテロコラーゲンの架ｍ復合体の薄膜の代わりに、上記
のカルボキシメチルキトサン−アテロコラーゲンの架橋
複合体の薄膜を使用し、実施例２と同様にして、ＭＩ胞
増殖試験を行なった。

結果は第６図に示すとおりであった。

第６図において、（−０−）はカルボキシメチルキトサ
ン−アテロコラーゲンの栗［［き体の薄膜、（−Ｘ−）
はアテロコラーゲンの架部体の薄膜、モして（−△−）
はポリスチレンシャーレ（メチルコン３００２　）にお
けるニワトリ胚線維芽ｍ胞の増殖Ｉを示す。

（考　Ｗ） 第５図および第６図によると、カルボキシメチルキトサ
ン−アテロコラーゲンの架Ｆｓ複合体はアテロコラーゲ
ンの果１体と同様に優れた細胞！！Ｐ＃：Ｘおよび細胞
増殖率を示１ノ、カルボキシメチルキトサン−アテロコ
ラーゲンの架１複合体は優れた細胞培養用基質であるこ
とがわかる。

実施＠　４ Ｃサクシニルキトサン−アテロコラーゲン架部複合体ビ
ーズの調製） ３％アテロコラーゲン塩酸溶液５０−を３％サクシニル
キトサン（サクシニル化ｇ：０．２）酢酸む液１５０ぜ
をｕｆｔし、サクシニルキトサン−アテロコラーゲン混
合溶解を調製した。

Ｉｌ！容ヒーカーにトルエン４００　ｙｄ、およびクロ
ロホルム＋１０−を入れ、その混合溶媒にスパン２０を
加えて、０．１％（ｍＩ２１）　ノａＭｔ７）７．ハン
２０　ヲ含む混合溶媒を調製し、この混合溶媒に、先に
調製したサクシニル−アテロコラーゲン混合ｍ液＋５０
−を生部し、激しく撹拌して混合６媒相中に、球状のサ
クシニルキトサン−アテロコラーゲン混合溶液相を形成
し、撹拌しながら、アンモニア水を住加して、サクシニ
ルキトサン−アテロコラーゲン複合体を析出し、サクシ
ニルキトサン−アテロコラーゲン複合体ビーズを形成し
た後、ビーカーから混合溶媒を傾斜分離し、サクシニル
キトサン−アテロコラーゲン複合体ビーズを、メタノー
ルで充分に洗浄した。このサクシニルキトサン−アテロ
コラーゲン複合体ビーズを１％カルボジイミド水溶液５
００−に入れ、撹拌してサクシニルキトサン−アテロコ
ラーゲン複合体ビーズを液中に分散し、３０℃において
一夜撹拌して、サクシニルキトサン−アテロコラーゲン
栗曙複合体ビーズを形成し、このサクシニルキトサン−
アテロコラーゲン栗曙複合体ビーズを液から取り出した
後、充分に水洗し、４８〜１００メツシュ画分を分級し
て、サクシニルキトサン−アテロコラーゲン栗１複合体
ビーズを調製した。

（細＠接着および細胞増殖試験） マウス皮膚由来のｗ４雄芽細胞（Ｌｌｌｌｌｌｌｌ）を
ｌＯ％生胎児血清を含むＭＥＮ　Ｆ地に懸濁した細胞懸
閤液に、と記のサクシニルキトサン−アテロコラーゲン
栗ＦＩＪｔａ合体ビーズを入れ、これを炭酸ガス培讐装
置ｌに入れ、５日間３７℃においてインキュベートシた
。サクシニルキトサン−アテロコラーゲン架１複合体ビ
ーズの表面は増殖した細胞に時々おおわれていた。

実施＠　５ （キトサン−アテロコラーゲン複合体ホロファイバーの
調製） ２％アテロコラーゲン塩酸溶Ｅｌ　（ｐＨ：　３．０）
５０ｇを２％キトサン酢酸名液（ｐｕ　：　４．０）　
　５０ｙと混合して、キトサン−アテロコラーゲン混合
ｍ液を調製し、このキトサンーアテロフラーゲン混合Ｇ
液を、吐出口の外部内径７１．５ｍｓ、円節外径：Ｑ、
７ｇｍの環状ノズルから、３５％塩化ナトリウム水溶液
浴に、４ｍ／分の速度で押し出し、ホロファイバーを形
成した。この押し出しにおいて、環状ノズルの内筒から
３５％塩化ナトリウム水溶液を吐出して内部液とした。

凝固したホロファイバー（中−！２！糸）には３０Ｗ紫
外線ランプを２０−の正零において照射し、さらに５％
塩化す１〜リウムを含む０．１％炭酸ナトリウム水溶液
に５分間浸漬し、次いで水洗槽において流水により１０
分間水洗した後、毛細管の一端から空気を吹き込みなが
ら４０℃において乾燥して、キトサン−アテロコラーゲ
ン複合体ホロファイバーを調製した。

（細胞接着および細胞増殖試験） 上記のキトサン−アテロコラーゲン複合体ホロファイバ
ーを使用し、実施例４と同様にして、細胞接着および細
胞増殖試験を行なった。その試験において、キトサン−
アテロコラーゲン複合体ホロファイバーは、同様に増殖
したマウス皮膚由来のＩＩＪＩ！芽細胞に略々おおわれ
ていた。

実施例　６ （キトサンコートコラーゲンビーズの調製）市販のコラ
ーゲンビーズ（高研セルゲンミクロスフエア）３０−を
０．３％キトサン溶液１００１１ｉに入れ、ゆっくり撹
拌して分散した後、コラーゲンビーズを濾別し、このコ
ラーゲンビーズを５％アンモニア水溶液に入れて、キト
サンをコラーゲンビーズ表面に析出させた。このコラー
ゲンビーズを水洗し、さらにメタノールで洗浄した後、
このキトサンの付着したコラーゲンビーズを２％ヘキサ
メチレンジイソシアネート啓液液浸漬し、２０℃におい
て２時間反応させ、ビーズを濾別し、メタノールおよび
水で順次洗浄してキトサンコートコラーゲンビーズを調
製した。

（細胞接着および細胞増殖試験） 上記のキトサンコートコラーゲンビーズを使用し、実施
例４と同様にして、マウス皮膚由来の繊維芽細胞の細胞
接着および細胞増殖試験を行なった。

その試験において、キトサンコートコラーゲンビーズは
、増殖したマウス皮膚由来の繊維芽細胞に略々おおわれ
ていた。

実施例　７ （アテロコラーゲンコートキトサンビーズの調製）ｌＩ
！容ビーカーにトルエン４００−およびクロロホルム＋
１０−を入れ、その混合溶媒にスパン２０を加えて０．
１％（！Ｉｉ）の濃度のスパン２０を含む混合溶媒を調
製し、この混合溶媒に３％キトサン酢酸溶液１５０−を
生部し、激しく撹拌して混合溶媒相に球状のキトサン洛
液相を形成し、撹拌しながうアンモニア水を生部し、キ
トサンを析出してキトサンビーズを形成した後、ビーカ
ーから混合Ｃ媒を傾斜分離し、キトサンビーズをメタノ
ールで充分に洗浄した。

３０〇−容ビーカーに、０，３％アテロコラーゲン塩塩
酸液液ｐＨ：　３．０）　　＋００−を入れ、これに上
記で得たキトサンビーズ３０−を加え、ゆっくり撹拌し
て分散した後、キトサンビーズを濾別し、このキトサン
ビーズを５％アンモニア水に入れて、アテロコラーゲン
をキトサンビーズの表面に析出させた。アテロコラーゲ
ンが析出したキトサンビーズを水洗し、メタノールで充
分に洗浄した後、アテロコラーゲンが析出したキトサン
ビーズを２％へキサメチレンジイソシアネートメタノー
ル溶液に浸漬し、２時間架謂反応を行なわせ、このビー
ズをメタノールで充分に洗浄し、アテロコラーゲンコー
トキトサンビーズを得た。

Ｃ細胞接着および細胞増殖試験） 上記のアテロコラーゲンコートキトサンビーズを使用し
、実施例６と同様にして、マウス皮膚由来の繊維芽細胞
（Ｌ細胞）の細胞接着および細胞増殖試験を行なった。

その試験において、アテロコラーゲンコートキトサンビ
ーズは、増殖したマウス皮膚由来のａｍ芽細胞によりお
おわれていた。

実施例　８ （キトサン−アテロコラーゲン複合体の薄膜の調製） １％（Ｖ／Ｖ　）アテロコラーゲン塩酸液液（ｐＨ：３
．０）および１％（−ｔ／Ｖ　）キトサン酢酸溶液〔酢
酸濃度＝１％（ｖ／Ｖ））を第２表に示す割合に混合し
て、キトサン−アテロコラーゲン混合溶液を調製し、そ
の２−をポリスチレンシャーレ（メチルコン３００１）
　　（径＝３５ｆｉ、深さ：１０ｍ）に注入した。この
ポリスチレンシャーレを自然乾燥して、その内面にキト
サン−アテロコラーゲン複合体の薄膜を底面に形成した
後、このキトサン−アテロコラーゲン複合体の薄膜に１
Ｏｃ１ｎの互層をおいて、３０Ｗ紫外線ランプを照射し
て、キトサン−アテロコラーゲン複合体を架槁し、さら
にボリスチレンシャーレをアンモニア雰囲気中に２０分
間放履した。

このポリスチレンシャーレをＭ留水で２回洗浄し、さら
にダルベツコリン酸緩衝液で１回洗浄して、キトサン−
アテロコラーゲン架間複合体の薄膜を底面に形成したポ
リスチレンシャーレを調製した。

舅２表　キトサン−アテロコラーゲン混合溶鍛のキトサ
ンとアテロコラーゲンのＭ＠ 比 （Ｒ試験着試験） 実施例１におけるポリマーコートシャーレの代りに、前
記のキトサン−アテロコラーゲンＷｌｌ複き体の８Ｍを
底面に形成したポリスチレンシャーレを使用し、実施例
１と同様にして、＃１１１胞接着試験を行なった。

結果は第７図に示すとおりであった。

第７図において、　（−０−３は試Ｂ８−Ａ（キトサン
／アテロコラーゲン＝３０　／　７０　）、Ｃ−・−）
は試８ｇ−８（キトサン／アテロコラーゲン：　２０　
／　８０　）、　（−Δ−）は試′Ｂ８−Ｃ（キトサン
／アテロコラーゲン：＝ｌＯ／９０）、（−ロー）は試
料８−Ｄ　Ｃアテロコラーゲン−１００）、モして（−
璽−）は未処理のポリスチレンシャーレ（メチルコン３
００１）　　（対間）におけるニワトリ胚ｍ椎芽則胞の
慶着弔である。

（細胞増殖試験） 実施例１におけるポリマーコートシャーレの代りに、前
記のキトサン−アテロコラーゲンｚｍ？１［合体の薄膜
を底面に形成したポリスチレンシャーレを使用し、実施
＠１と同様にして、細胞増殖試験を行なった。

結果は第８図に示すとおりであった。

第８図において、（−〇−）、（−・−）、（−△−）
、（−ロー）および（−層一）は、第７図と同様に、ニ
ワトリ旺ｍ錐芽細胞の増Ｎ率である。

（考　察） 第７図によると、キトサンーアテロフラーゲン架ｍ複合
体（キトサン／アテロコラーゲン＝３０　／　７０．２
０　／　８０および１０　／　９０　）は、ニワトリ旺
ｍ維芽１ｆｌＩ胞を、アテロコラーゲンおよび未処理の
ポリスチレンシャーレよりもよく接着することがわかる
。

第８図によると、キトサン−アテロコラーゲン栗１度合
体（キトサン／アテロコラーゲン＝２０　／　８０およ
び１０　／　９０　）は、ニワトリ胚ｌ１ｌｌ堆芽剖唯
を、アテロコラーゲンおよび未処理のポリスチレンシャ
ーレと同様に増殖し、またキトサン−アテロコラーゲン
架間複合体（キトサン／アテロコラーゲン＝：　３０　
／　７０　）よりも、よく増殖することがわかる。

〔ｙＩ！ＩＢＡの効果〕

細胞の？７１期ｉ着および細胞の増殖が良好で、さらに
充分なお械的強度をｑするから、動物細胞の大ｆｆｉ培
養に利用することができる。

また塩基性物質の溶液の添加により簡単に析出するから
、その製造が容易である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の細胞！ｆ１ｍｌ試験の結果を示す図
表、第２図は実施例１の細胞増殖試験の結果を示す図表
、第３図は実施例２の細胞ＩＭＩｉ試験の結果を示す図
表、第４図は実施例２の細胞増Ｎ試験の結果を示す図表
、第５図は実施例３の細胞摺着試験の結果を示す図表、
第６図は実施例３の細胞増殖試験の結果を示す図表、第
７図は実施例８の細胞接着試験の結果を示す図表、そし
て第８図は実Ｎ例８の細胞増殖試験の結果を示す図表で
ある。 出願人　日本バイオケミカルズ株式会社代理人　弁理士
　　津　１）　　沼 第１図 第 第 図 茗 図 第 図 恩響曹密命さ ２ｇ−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）キトサン−コラーゲン複合体を有効成分とするこ
   とを特徴とする細胞培養用基質。（２）キトサンの酸性
   溶液に、コラーゲンの存在の下に、塩基性溶液を加え、
   キトサンを析出して、キトサン−コラーゲン複合体を形
   成することを特徴とするキトサン−コラーゲン複合体の
   細胞培養用基質の製造法。 （３）コラーゲンの酸性溶液に、キトサンの存在の下に
   塩基性溶液を加え、コラーゲンを析出して、キトサン−
   コラーゲン複合体を形成することを特徴とするキトサン
   −コラーゲン複合体の細胞培養用基質の製造法。