JPS6251983A

JPS6251983A - ヒト／ヒト・ハイブリド−マ培養用無血清培地

Info

Publication number: JPS6251983A
Application number: JP60192145A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Hagiwara; 秀昭萩原; Hideo Yuasa; 湯浅　英雄
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-09-02
Filing date: 1985-09-02
Publication date: 1987-03-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒト／ヒト・ハイブリドーマの培養に有用な無
血清培地に関し、たとえば細胞増殖機構の解明、抗体の
生産機構の解明、更には抗体その他の有用物質の生物工
業的製造などの如きバイオ・チクノロシイ分野に於て、
従来必須であった血清や血清アルブミン成分の利用に随
伴するこれら血清成分中の多種多様々混在異種因子によ
る不都合な影響から解放されて、ヒト／ヒト・ハイブリ
ドーマの生育・増殖・抗体生産などに利用するのに高度
に適したヒト／ヒト・ハイツリドーマ培養用無血清培地
に関する。

更に詳しくは、本発明は、（ｌ）動物細胞培養基礎培地
、（２）インシュリン及びトランスフェリンより成る群
からえらばれた成長因子の少なくとも一種、（３）エタ
ノールアミン、（４）メルカプトエタノール及び（５）
亜セレン酸塩を含有してなる動物細胞培養完全培地であ
って、アミノ酸成分として、約１００゜ｒａｙ／ｌ−完
全培地を超え、約４５００岬／！一完全培地以下の高濃
度量のＬ−アルギニンを含有することを特徴とするヒト
／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清培地に関する。

従来、多数の動物細胞培養基礎培地（血清や血清アルブ
ミン成分の如き血清成分を含有しない培地）が知られて
おシ、約５０種類に及ぶ基礎培地が市場で入手可能であ
る。そして、動物細胞の培養に際しては、細胞の実用に
供し得る生育、増殖能を維持するために、これら基礎培
地に例えば仔牛血清、ヒト血清などの如き血清や血清か
ら分離された血清アルブミンやその複合体力どの血清成
分を、たとえば約５〜約１０％（ｖｏＬ／ｖｏｌ−培−
地）程度配合して完全培地となして使用するのが普通で
あ′る。

一方、血清は挟体脂質、高密度リボ脂質（ＨＤＬ）、低
密度リポ脂質（ＬＤＬ）などの挟体因子を含肩し、これ
らの不都合な異種因子の混入を回避することができない
。更に血清アルブミンやその複合体の場合にも精製が煩
雑である上に、注意深い精製を行っても、血清由来の不
都合な異種因子の混入を完全に回避することは至難であ
る。このために、例えば前述したような生理化学的機構
の解明に際して障害となり、又、例えば診断、予防、治
療などの医薬用途に有用なバイオ製品の製造に際して、
不都合な異種因子の混入から解放された高純度の有用物
質を容易な操作をもって且つ高品質で製造することがで
きなくなる等々の技術的トラブルを生ずる。

このようなトラブルを回避するために、血清の添加を必
要としない所Ｗ４′″無血清培地”の開発も種々試みら
れてきた。しかしながら、ヒト／ヒト・ハイツリドーマ
培養に際して実用に供し得る無血清培地であって、更に
血清アルブミンやその複合体の如き血清成分由来の異種
因子含有成分の配合をも必要としない真正のヒト／ヒト
・ノ・イブリドーマ培養用無血清培地は、従来、全く知
られていない。

例えば、ジャーナル・オプ・イミュノロジカル・メソッ
ド（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｔｒｒｍｔＬｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈ−ｏｄｓ〕、３９ｔ３６９−３７５
（１９８０）には、マウス／マウス・ハイプリドーマの
細胞培養に際して、基礎培地ＲＰＭＩ−１６４０もしく
はＭＥＭにインシュリン及びトランスフェリンを配合し
た無血清／無血清アルブミン培地を使用したことが記載
され、又、プロシーデングス・ナショナル・アカデミイ
・オツ・サイエンスＵ、Ｓ、Ａ（ｐｒｏｃ、ＮａｔＬ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　）　、ユｊ。

１１５８−１１６２（１９８２）には、マウス／マウス
・ハイツリドーマの細胞培養において、上記と同様な基
礎培地にインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸
ナトリウム及びエタノールアミンを配合した無血清／無
血清アルブミン培地を使用したことが記載されている。

しかしながら、本発明者等の検討によれば、このような
無血清／無血清アルブミン培地はマウス／マウス・ハイ
プリドーマの細胞培養に利用可能であっても、ヒト／ヒ
ト・ハイブリドーマの細胞培養に転用すると実用に供し
得る生育、増殖能を維持させることはできないことがわ
かった。

更に、特開昭５８−６３３８５号には、無血清又は低血
清の状態で培養細胞を増殖させるための培地について提
案されている。そして、この提案には、そのような具体
的な実例は全く示されていないが、人間のハイプリドー
マ細胞ラインの無血清培養にも使用できると記載されて
いる。

しかしながら、この提案の無血清又は低血清の状態下で
培養細胞を増殖させるための培地においては、アラキド
ン酸、オレイン酸、リノール酸、ノルミチン酸、ステア
リン酸、リルン酸及び・ンルミトレイン酸よシなる群か
ら選択された少くとも１種の脂肪酸と１：０．５から１
：５の範囲のモル比で複合させた、約１００〜１０００
μ？／コの牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）の配合が必須
である。血清から分離された血清アルブミンは血清に比
して挟体因子は減少はしているものの、なお無視し得な
い挟体異種因子を含有することは避けられない。従って
、これら異種因子による不都合な影響から依然として解
放され得ない。

本発明者等は、無血清であるのは勿論のこと、このよう
な血清アルブミン成分も必要としないで且つ実用に供し
得るヒト／ヒト・ノ・イブリドーマの生育、増殖が順調
且つ円滑に行われ、実用性ある抗体生産能をも示し得る
ような真正の無血清培地を提供すべく研究を行ってきた
。

その結果、従来普通に用いられてきたアミノ酸濃度を超
える可成りの高濃度量でアミノ酸成分、とくには特定の
高濃度範囲量のＬ−アルギニンをアミノ酸成分の少なく
とも一種として含有せしめることによって、全く意外な
ことにも、無血清／無血清アルブミン培地であって且つ
ヒト／ヒト・ハイブリドーマの生育、増殖、更には抗体
生産能を保持でき、斯くて血清及び／又は血清アルブミ
ンの使用に由来する挟体因子による不都合な影響から解
放されたヒト／ヒト・ノ・イブリドーマ培養用の真正の
無血清完全培地が提供できることを発見した。

本発明者等の研究によれば、（１）動物細胞培養基礎培
地、（２）インシュリン及びトランスフェリンより成る
群からえらばれた成長因子の少なくとも−Ｎ、（３１エ
タノールアミン、（４）メルカグトエタノール及び（５
）亜セレン酸塩を含有してなる動物細胞培養完全培地で
あって、アミノ酸成分として、約１０００■／ｌ−完全
培地を超え、約４５００Ｑｌ／ｌ−完全培地以下の高濃
度量のＬ−アルギニンを含有せしめた培地は、血清及び
血清アルブミン成分無配合であるにも拘わらず、上記高
濃度量のＬ−アルギニンを含有せしめることによって、
血清及び血清アルブミン成分配合培地に匹敵するヒト／
ヒト・ハイブリドーマの生育、増殖を順調且つ円滑に行
わせることを可能とし且つ該血清及び血清アルブミン成
分配合培地に匹敵する或いは明らかに高い実用性ある抗
体生産能の発揮を可能とするという、全く予想外の事実
を発見した。

アミノ酸量が高く、必須アミノ酸は加えうる最大濃度ま
で添加されていることの公知な基礎培地であるＬ−１５
培地（Ｌ　−１５ＭｅｄｉｌＬｆｒＬ）（Ｌａ１ｂｏｖ
ｉｔｚ、　Ａ、、　Ａｍａｒ、／、　Ｈｙｇ、　７３　
。

１７３（１９６３））においてさえ、Ｌ−アルギニン（
遊離塩基）濃度は５００■／ｌ−培地でああることがら
みて、本発明に特定された高濃度量のＬ−アルギニン含
有培地が、血清及び血清アルブミン成分無配合であるに
も拘わらず、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの生育、増殖
に完全培地として機能し、前述した挟体因子に由来する
トラブルを伴うことなしに、血清及び血清アルブミン成
分配合の完全培地に匹敵する或はより優れた性能を発揮
することは、全く意外な結果であった。

本発明者等の研究によれば、後に第１図について説明す
るように、前記（１）〜（５）成分及び高濃度量のＬ−
アルギニン含有の本発明培地は、血清及び血清アルブミ
ン成分無配合であるにも拘わらず、血清もしくは血清ア
ルブミン成分配合で普通量のＬ−アルギニン含有の培地
に匹敵する或は明らかに優れたヒト／ヒト・ハイブリド
ーマの生育、増殖能力及び抗体生産能力を示し、Ｌ−ア
ルギニン濃度が低すぎても高すぎても、これら能力が低
減してしまうことがわかった。更に又、後に第２図に示
すように、上記本発明培地を使用して、抗体生産能に実
質的な低下を伴うことなしに長期間にわたって継代培養
可能であることがわかった。斯くて、本発明者等の研究
によれば、血清及び血清アルブミン使用におけるような
異種因子による不都合な影響から完全に解放され得るヒ
ト／ヒト・ハイブリドーマ培養用の真正な無血清完全培
地が提供できることがわかった。

従って、本発明の目的はヒト／ヒト・ハイブリドーマ培
養用無血清培地を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清培地
は、（１）動物細胞培養基礎培地、（２）インシュリン
及びトランスフェリンより成る群からえらばれた成長因
子の少なくとも一種、（３）エタノールアミン、（４）
メルカグトエタノール及び（５）亜セレン酸塩を含有し
てなる動物細胞培養完全培地であって、アミノ酸成分と
して、約１０００１１１ｖ／ｊ’一完全培地を超え、約
４５００■／ｌ−完全培地の高＊度量のＬ−アルギニン
を含有し、血清及び血清アルブミン成分を配合する必要
がない。

該（１）動物細胞培養基礎培地は種々知られており、公
知文献（例えば、「細胞培養マニュアル」、第３版、１
９８４年７月２０日講談社サイエンティフィック発行）
に従って調製でき、その多くのものけまた市場で入手可
能であシ本発明で利用することができる。

このよう々基礎培地の例としては、下記の如き公知の基
礎培地及びその公知改質培地を例示することができる。

ＢＭＥ培地（Ｂａ５ａｌ　ｂｈｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ　
）（イーｆＡ／　−ｘイチ、サイエンス（Ｅａｇｌｅ、
　Ｈ，、５ｃｉｅｎ−ｃ、ｅ）＋１２２：５０１　（１
９５５）；イー１”　ル。

エイチオジャーナル　オツ　エクスペリメンタルメデイ
スン（Ｅａｇｌｅ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｅｚｐ、　Ｍａｄ、
　）　。

１０２．３７（１９５５）及び１０２，５９５（１９５
５）；イーグル・エイチ、ゾヤーナルオプ　バイオロン
カル　ケミストリー（Ｅａｇｌｔｔ。

Ｈ，、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈ＃ｍ、）　　＋　　
２　１４　　ｔ　　８３９（１９５５）　；イーグル・
エイチ、エトアール。

サイｘ：ｙス（Ｅａｇｌｅ、　Ｈ，、５ｃｉｅｎｃｅ　
）　、　１２３　。

８４５（１９５６）；ハンクス・ソエイ・エイチ。

ワランス・アール・イー、プロシーディング　オプ　ザ
　ソサイエテイー　フォー　イクスペリメンタル　バイ
オロゾー　アンド　メデイスン（Ｈａｎｋｓ、１．Ｈ，
、Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒ，Ｅ、、ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｚｐ、　Ｅｉｏｌ、　Ｍｅｄ）　　、　７１
　　、１９６　（１９４９）；ヤマネ・アイ、プロシー
ディング　オプザ　ンサイエテイー　フォー　イクスペ
リメンタル　バイオロゾー　アンド　メデイスン（Ｙａ
ｍａｎｅ　。

／、、　ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｚｐ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｍａｄ　）　＋　１２７　＋３３５　（１９６８）；
モートン・エイチ・ソエイ。

インビトｏ　（Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｈ，／、、　Ｉｎ　Ｖ
ゼｔｒｏ）。

６．８９（１９７０）；イーグル・エイチ、ｆロシーデ
イング　オプ　ザ　ンサイエテイー　フォー　イクスペ
リメンタル　バイオロゾー　アンドメデイスン（Ｅａｇ
ｌｅ、　Ｈ，、ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｒ；ｐ。

Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ）、８９．　３６２（１９５５）；等
〕、ＨＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｓｒｎ　Ｅｓ５ｅｎｔ　ｉ
ａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　）〔例えば、イーグル・エイチオ
サイエンス（Ｅａｇｌｅ。

Ｈ，、Ｓｃｉｔｔｎｃｇ）　　、　１３０　＋　　４３
２　（１９５９）　；ストーカ−・エム、マッグ　７ア
ーソン・アイ。

バイロロソー（５ｔｏｋｅｒ、　ｋｆ、、　Ｍａｃｐｈ
ｅｒｔｔｏｎ、　１．。

Ｖｉｒｏｌｏｙｔｔ）、１４，３５９（１９６１）；マ
ツクファーンン・アイ、ストーカ−・エム、パイロロソ
ー（Ｍａｃｐｈｔｒｓｏｎ、　１．、５ｔｏｋｅｒ、　
Ｍ、。

Ｖｉｒｏｌｏｒｎ）　　＋　１６　、１４７　（１９６
２）　　；ストーカ−・エム、マッグファーノン・アイ
、ネイチャー　（５ｔｏｋｅｒ、　ｌＫ、、　Ｍａｃｐ
ｈｅｒｓｏｎ、　１．　、　Ｎａｔｕ−ｒｅ、２０３．
１３５５　（１９６４）；　　ダルベツコ−・アール、
フリーマン・ノー、パイロロソー（Ｄｗｌｂｅｃｃｏ、
　Ｒ，、Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｇ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
）。

８．３９６（１９５９）ｉスミス・ヅエイ・ディーラエ
ト　アール、パイｏｏノー（Ｓｙ＋ｚｚｔｈ＋　７゜Ｄ
、、　ａｔ　ａｔｌＶｉｒｏｌｏｇｙ）　＋　１２　＋
　１８５（１９６０）、スタンナーズ・シー・ピー、エ
トアール、ネイチャー　ニュー　バイオロゾ−（５ｔａ
ｎｎｅｒｓ、　Ｃ，ｐ、、　ｅｔ　ａＬ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　ＮｅｗＢｉｏｔｏｇｙ）ｓ　２３０１５２　（１
９７１＞　：　　スタンナーズ・シー・ビー、スチュア
ート・シー、パーソナル　コミュニケーション（Ｓｔα
ｎｎｅｒｓ。

Ｃ，ｐ、、　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｃ，、ｐｅτ５ｏｎａ
ｌ　Ｃｏｒｗｎｕｎｉｃα−ｔｉｏ九、（１９７２）ｉ
等〕、　１９９培地〔モーガン・ソエイ・エフ、エト　
アール、ジャーナルオプ　キャンサー　インステイチュ
ート（Ｍｏｒｇａｎ。

Ｊ、Ｆ、、ａｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｈａｔ、Ｃａｎｃｅｒ
　　Ｉｎ５ｔ　）。

１６．５５７（１９５５）ｉモートン・エイチ・−７ｘ
イ、インビトｏ　（Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｈ，Ｊ、、　Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ　）　、　６　、８９　（１９７０）　；等
〕、Ｌ−１５培地（Ｌ　−１５Ｍｅｄｉｕｍ　（リーホ
ヒツツ。

エイ、アメリカ７　（Ｌｇｉｂｖｉｔｚ、　Ａ、、　Ａ
ｍｅｒ、　Ｊ。

Ｈ１／Ｑ＞・、７８．１７３　（１９６３）ｉ等〕、ハ
ム培地（Ｈａｍ’ｓ　ＭｅｄｉＳｍ）　［：　　ハム・
アール−ノー。

イクスペリメンタル　セル　リサーチ（Ｈａｍ、Ｒ。

Ｃ，’、、Ｅ：ｔｐ、ＣｅｔｔｌＲｅｓ）　、２９，５
１５（１９６３）；ハム・アール・ノー、グロシーデイ
ングオプ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイエンス　
オプ　ザ　ユナイテツド　ステート　オプアメリカ（Ｈ
ａｍ、　７？、　Ｇ、、　ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃ
ａｄ。

５ｃｉ）、５３，２８８（１９６５）；等〕、マツコイ
５．ｉ培ｍｃノイマン・アール・イー、マツコイ・テイ
ニ・ニー、プロシーディング　オプ　エクスペリメンタ
ル　バイオロゾー　アンド　メデイスン（Ｎｅｕｍａｎ
、　Ｒ，Ｅ、　、　ＪｆｃＣｏｙ、　Ｔ、　Ａ、　。

ｐｒｏｃ、　Ｅｚｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ　）　＋　
９８　＋　３０３（１９５Ｂ）ｉマツコイ・ティー・エ
イ、エトアール、プロシーゲイング　オプ　エクスベリ
メンタル　　パイオロソー　アンド　メデイスン（Ｍｃ
Ｃｏｙ、　Ｔ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｔ、、　ｐｒｏｃ、
　Ｅｚｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍ’ｄ）　、１００＋　１１５（１９５９）Ｈノー・テ
ィー・シー、ケロッグ・ティー・ニス、（Ｈｓｘ。

Ｔ、　Ｃ，、Ｋｅｌｌｏｇｇ、　Ｄ、　Ｓ、、　／、　
Ｎａｔ、　ＣａｆＬＣｅｒＩｎｓｔ、、２５，２２１　
（１９６０）；等〕、ＲＰ　ＭＩ培地（Ｒｐ　Ｍ　Ｉ　
　Ｍｇｄｉｕｔｎ　）　（ム−７−ノー・イー、エト　
アール、ソエイ・ニー・エム。

ｘ　−（Ｍｏｏｒｅ、　Ｇ、　Ｅ、、　ｅｔ　ｃ！、、
　７．　Ａ、　Ｍ、　Ａ、）１９９．５１９（１９６７
）ｉムーブ・ノー・イー。

エト　アール、ツヤ−ナル　オプ　ナショナル　キャン
サー　インステイチュート（Ｍｏｏｒｓ　、　Ｇ、　Ｅ
、　。

ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｈａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ
５ｔ　）　　＋　　３６　＋４０５（１９６６）ｉ等〕
、ウィリアムスＥ培地（Ｗｉ　ｌ　Ｌ　ｉａｍｓ　’　
Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ　）　（ウィリアムス・ノー・エム、
ワイスバーガー・イー・ケイ、ワイスバーガー・ジエイ
・エイチオエクスベリメンタルセル　　リサーチ（Ｗｉ
　ｌ　ｌ　ｉａｍｓ　、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｖｌｅ　ｉ
ｓｂｕ−ｒｇｔｔｒ、　　Ｅ、　　Ｋ、、　　Ｗｇｉｓ
ｂｒｙｇｅｒ、　　Ｊ、　　Ｈ，、Ｅｚｐ。

Ｃｅ１１．　Ｒｅ５）　　、　６９　、　１０６〜１１
２　（１９７１）；等〕。

これら＋１）動物細胞培養基礎培地は、複数種を適当な
割合で配合して利用することもできる。

更に、本発明においては、上述の如き（１）動物細胞培
養基礎培地のほかに、（２）インシュリン及びトランス
フェリンより成る群からえらばれた成長因子の少なくと
も一徨、＋３１エタノールアミン、（４）メルカプトエ
タノール及び（５）亜セレン酸塩たとえば亜セレン酸ナ
トリウム塩やカリウム塩を含有する。

これら（２）〜（５）成分の配合量は適宜に選択変更で
き、たとえば培養目的や培養するヒト／ヒト・ノ・イブ
リドーマなどによって、実験的に容易に好ましい配合量
を選択設定できるが例えば、約２〜約５０■／ｌ−完全
培地の（２）成分、約１０−８モル−約１０゛４モル／
Ｅ−完全培地の（３）成分、約１０−８モル−約１０−
４モル／ｌ−培地の（４）成”１１分及び約１０　　、ヤ〜約、。−Ｙ、ヤ／ｌ−完全培地
の（５）成分の如き配合量を例示することができる。

本発明のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清培地
は、アミノ酸成分として、約１０００■／ｌ−完全培地
を超え、約４５００■／ｌ−完全培地以下、好ましくは
約１１００〜約４０００ｍｌ１／ｌ−培地の高濃度量の
Ｌ−アルギニンを含有する。Ｌ−アルギニンは遊離塩基
の形、酸塩たとえば塩酸塩の形及びこれらの混合物の形
のいづれの形態でも利用できる。なお、本発明において
、上記Ｌ−フルギニンのｍｙ／ｌ−完全培地で示した濃
度は、遊離塩基の形で表わした濃度を意味する。

又、該濃度は、（１）動物細胞培養基礎培地に含有され
るＬ−アルギニン及び／又はその酸塩と更に配合された
追加量のそれらの合計に基づく濃度である。前述したよ
うに、（ｉ）基礎培地として、とくにアミノ酸成分が多
い点で特殊なＬ−１５培地においても高々５００ｗ／ｌ
のＬ−アルギニンを含有するにとどまり、一般には、約
２００■／ｌ程度までである。

本発明のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清培地
は、上述のように、アミノ酸成分として、約１０００岬
７を一完全培地を超え、約４５００■／ｌ−完全培地以
下という高濃度量のＬ−アルギニンを含有することによ
って、血清及び血清アルブミン成分配合の必要なしに、
ヒト／ヒト・ハイブリドーマの高い生育、増殖能を示し
且つ高い抗体生産能を示す。本発明のヒト／ヒト・ハイ
ブリドーマ培養用無血清培地は、（１）〜（５）成分及
び上記高濃度量のＬ−アルギニンの他に、所望により、
それ自体公知の任意のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養
培地用の他成分を含有することができる。

このような成分の例としては、それ自体公知の他の培地
用アミノ酸類、ビタミンもしくはミネラル類、・核酸誘
導体類、糖類、補酵素類、脂肪酸類などを挙げることが
できる。

又、本発明のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清
培地を利用して培養できるヒト／ヒト・ハイブリドーマ
には、とくべつな制約はなく、例えば、特開昭５８−２
０１９９４号、特開昭５９−１３５８９８号、特開昭５
９−１３７４９７号などに開示された方法で得ることの
できるヒト／ヒト・ハイブリドーマの培養に利用するこ
とができる。このようなヒト／ヒト・ハイブリドーマの
例としては、ヒト／ヒトハイプリドーマＣＬＮ／５ＵＺ
Ｈ５〔微工研寄託受託拒否通知番号、５７微寄文菌６３
７号；ヒト／ヒト・ハイブリドーマＣＬＮＥ５、ＡＴＣ
ＣＨＢ８２０６　〕、ヒト／ヒトハイプリドーマＣＬＮ
／５ＵＺＩ１１１　Ｃ微工研寄託受託拒否通知番号、５
７微寄文第６３８号；ヒト／ヒトハイツリドーマＣＬＮ
Ｉ１１１、ＡＴＣＣＨＢＢ５０７〕を例示できる。更に
、本発明培地を用いて、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの
培養を有利に実施できるが、ヒト／ヒト・ハイブリドー
マ以外のハイプリドーマの培養にも利用することができ
るし、また、培養の実施に際して、必要ではないが、血
清や血清アルブミンを所望により適宜添加して使用して
も差支えない。

本発明のヒト／ヒト・ハイブリドーマ培養用無血清培地
は、（１）動物細胞培養基礎培地、（２）インシュリン
及びトランスフェリンより成る群からえらばれた成長因
子の少なくとも一種、（３）エタノールアミン、（４）
メルカプトエタノール、（５）亜セレン酸塩及び約１０
０ＣＩＷ１ｙ／ｌ−完全培地を超え約４５００η／ｌ−
完全培地以下の量のＬ−アルギニンを含有する剤形であ
ってもよいし、それらの適宜な組み合わせからなり、使
用時に配合して使用する剤形であっても差支えない。

以下、実施例によシ、本発明のヒト／ヒト・ハイブリド
ーマ培養用無血清培地の調製及び該培地を用いたヒト／
ヒト・ハイブリドーマ培養例について更に詳しく例示す
る。勿論、本発明はこれら例示に限定されるものではな
い。

動物細胞培養基礎培地として、公知のＲＰＭＩ−１６４
０、ダルベツコＭＥＮ（Ｄ　　ＭＥＮ）及びハムＦ　−
１２（Ｈａｍ’ｓ　　Ｆ　−１２）を使用した。

なお、これら公知基礎培地が含有するＬ−アルギニンの
量は下記のとおり。

上記公知の動物細胞培養基礎培地ＲＰＭＩ−１６４０、
Ｄ　　ＭＥＮ及びＨａｍ’ｓ　Ｆ　−１２を、２：１：
１の割合で混合し、滅菌蒸留水を加えて１１となし、さ
らに、炭酸水素ナトリウム２２１９岬を加えてよく攪拌
する（混合基礎培地）。しかル後、インシュリン１０ｗ
ｊ／Ｊ、トランスフェリン１０■／’ＩＮ　エタノール
アミン１０−　Ｍ、亜セレン酸ナトリウムＩＭ’Ｍ、メ
ルカプトエタノール１０−”Ｍ及びＬ−アルギニンの適
量（本発明要件を充足しない量及び充足する量）を加え
、１Ｎ塩散で７）Ｈｌ−７，２に調整して、無血清培地
を調製した。更に、Ｌ−アルギニンを加えない対照培地
、混合基礎培地に仔牛の血清を加えた対照培地を調製し
た。調製した対照培地、比較培地及び本発明培地は、以
下のとおり。

（対照）培地風１上記混合基礎培地（基礎培地由来のＬ−アルギニンが１
６１■／Ｊ）＋５％仔牛血清。

（対照）培地風２上記混合基礎培地（基礎培地由来のＬ−アルギニンが１
６１■／ｌ）。

（対照）培地Ｎｏ、３上記混合基礎培地（基礎培地由来のＬ−アルギニンが１
６１η／ｌ）十上記インシュリン、トランスフェリン、
エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメルカプ
トエタノール。

（比較）培地Ｎｌ１４上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミ／、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カプトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて６６１　町／Ａ’　）。

（本発明）培地Ｎｏ、５上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カプトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて１１６１”！９／ｌ）。

（本発明）培地隘６上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カゾトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて１６６１ｍ？／ｌ）。

（本発明）培地Ｎ１１Ｌ７上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カプトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて３１６１ｑ／ｌ）。

（比較）培地Ｎ［Ｌ８上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カプトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて５１６１〜／ｊ）。

（比較）培地Ｎ１１９上記混合基礎培地＋上記インシュリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム及びメル
カプトエタノール＋Ｌ−アルギニン（基礎培地由来のＬ
−アルギニンを含めて１６２６１ｍｇ／ｌ）。

ヒト／ヒト・ハイブリドーマＣＬＮＩ１１’１（ＡＴＣ
ＣＨＢ８３０７；微工研寄託受託拒否通知番号−５７微
を文第６３８号）を、前記混合基礎培地に１０％の仔牛
血清を加えた培地で増殖させておき、低速度の遠心操作
によって細胞を回収する。回収した細胞に上記培地Ｎａ
　７の完全無血清培地を加え、細胞塊をよくほぐした後
、低速度の遠心操作によって細胞を回収する。この無血
清培地による洗滌操作を２回くりかえして回収したＣＬ
Ｎ　Ｈ１１細胞を、上記培地嵐１〜嵐９の夫夫に、培地
Ｉｒｎｔ中に５Ｘ１０’細胞数となるように加え、３７
℃、５９７；Ｃ’Ｏｔの環境下で６日間培養を行った。

６日間培養後の細胞数（生細胞数を血球計算計で測定）
及び培地中に生産された抗体（ＣＬＮ−ＩＱＧ）の濃度
（酵素抗体法によシ測定）を実測し、その結果を１線グ
ラフで添付第１図に示した。

第１図において図中白棒線が細胞数（細胞数／−）を示
し、黒枠線が抗体濃度（ＣＬＮ−１ｔ）Ｇμ２／−）を
示す。培地陽、１（血清含有培地）と培地ＮＩＩＬ５〜
隘７（本発明無血清培地）との結果を対比して明らかな
とおり、細胞数は力清含有培地の場合には及ばないにし
ても充分に良好な儒殖結果を示す一方、抗体生産量にお
いては、血清含有培地の場合に比して明らかに増大する
という意外な結果が得られることがわかる。このことは
また、単位細胞当りの抗体生産量が格段に向上すること
を意味し、全く予想外のことであった。そして、この卓
越した作用効果は他の比較培地Ｎｃｔ４．Ｎｎ８゜歯９
に比較して、培地隘５〜宛７（本発明無血清培地）にお
いて顕著な且つ特異的な効果であることがわかる。

実施例２基礎培地由来のＬ−アルギニンを含めて、Ｌ−アルギニ
ンの量が２ｏａＯｗ／ｌ！となるようにしたほかは、実
施例１と同様に行って、本発明無血清培地を調製した。

この培地１−当り、実施例１と同様にして上記本発明無
血清培地で洗浄したＣＬＮ　Ｈ１１細胞を、上記無血清
培地１−轟り１×１０ｓ細胞となるように移植し、３７
℃、５％ＣＯ７の環境下で６日間培養した。次いで、同
様な新しい無血清培地に、上記第１世代培養物から分離
した細胞を無血清培地１ｒｎｌ当りｌＸ１０’細胞とな
るように移植し、同様の条件で第２世代培養を行なう。

このようにして第８世代にわたって継代培養を繰り返し
た結果を添付第２図に示した。

第２図において、本発明の無血清培地によれば、細胞増
殖能の低下及び抗体生妾能の飛下を伴うことなしに長期
間にわたって継代培養が可能であり、実施例１に示した
予想外且つ驚くべき効果が、本発明無血清培地を用いて
継代培養によっても達成できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

添付第１図は実施例１の結果を示すグラフであり、添付
第２図は実施例２の結果を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１、（１）動物細胞培養基礎培地、（２）インシュリン
及びトランスフェリンより成る群からえらばれた成長因
子の少なくとも一種、（３）エタノールアミン、（４）
メルカプトエタノール及び（５）亜セレン酸塩を含有し
てなる動物細胞培養完全培地であつて、アミノ酸成分と
して約１０００ｍｇ／ｌ−完全培地を超え、約４５００
ｍｇ／ｌ−完全培地以下の高濃度量のＬ−アルギニンを
含有することを特徴とするヒト／ヒト・ハイブリドーマ
培養用無血清培地。２、該Ｌ−アルギニン濃度が１１００ｍｇ〜４０００ｍ
ｇ／ｌ−完全培地であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の無血清培地。