JPS6253485B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景） この発明は、微生物由来のピリジン可溶性抽出
物に関し、この抽出物は細胞壁骨格及びトレハロ
ースジミコレートと組合わせた場合に抗腫瘍性を
有する医薬組成物及びその使用に関する。 コリネバクテリウム・パルブム
（Corynebacterium parvum）のごとき細菌が、
腫瘍増殖の阻害に寄与する成分を分離しそして特
徴を調べるための実験の対象とされてきた〔例え
ば、カントレル（Cantrell）等、Cancer
Research39、3554〜3563頁（1979年９月）、Anti
Tumor Activity and Lymphoreticular
Stimulation Properties of Fractions Isolated
from C.parvumを参照のこと〕。抗腫瘍活性とは
別に、C.パルブム（C.parvum）が脾及び肝の重
量の好ましくない増加を結果するリンパ網状系及
び胚子発生の効果的な刺激剤であることが示され
ている。出願人は、微生物のピリジン可溶性抽出
物が、従来技術の生成物が有する不所望の毒性を
伴わないで効果的な抗腫瘍性を有することを見出
した。 細胞壁骨格は、本質上、取り出された細胞壁中
に通常見出される蛋白質及び脂質の多くを有して
いる細胞壁である。これはトレハロースジミコレ
ート（P3）及び末消化の結核菌蛋白質の残留物
を含有する重合ミコル酸アラビノガラクタンムコ
ペプチドである。細胞壁骨格はM.スメグマチス
（M.smegmatis）、M.フレイ（M.phlei）、ノカル
デイア・ルブラ（Nocardia rubra）、ノカルデイ
ア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、コ
リネバクテリウム・ジフテリア
（Corynebacterium diphtheria）、コリネバクテ
リウム・パルブム（Corynebacterium
parvum）、M.カンサシー（M.kansasii）、M.ツベ
ルクロシス（M.tuberculosis）H37RV株及び
AyomaB株、及びM.ボビス（M.bovis）BCG株を
含む任意の微生物から得られるが、これらに限定
されない。 細胞壁骨格を製造するには、M.ボビスBCG株
〔バシルス・カルメツテイーグエリン（Bacillus
Calmette−Guerin）のごとき細菌をまず増殖せ
しめ、そして集菌する。こうして得た全細胞（ホ
ールセル）残渣を、細胞を破砕する細胞分画機
〔リビ・セル・フラクシヨネーター（Ribi Cell
Fractionator）ソルバル（Sorvall）、モデルRF−
１〕を通して処理し、細胞質不純物から外皮すな
わち細胞壁を分離する。こうして得た細胞壁を一
連の溶剤抽出及び酵素処理（例えばトリプシン及
び／又はキモトリプシン処理）にかけ、精製され
た細胞壁骨格を得る。 トレハロースジミコレート（TDM）は、例え
ばM.アビウム（M.avium）、M.フレイ、M.ツベ
ルクロシスH37RV株及びAyomaB株、M.ボビス
BCG、M.スメグマチス、M.カンサシー、ノカル
デイア・ルブラ、M.ボビニス（M.bovinis）及び
コリネバクテリウム・ジフテリアのごとき微生物
から得られる。 M.アビウムのごとき細菌を増殖せしめ、集菌
し、そして熱殺菌する。次に細胞を幾種類かの溶
剤で抽出し、そして活性な溶剤可溶性区分を抽出
する。この抽出物を一連の溶剤抽出によりさらに
純化し粗TDMを得る〔アズマ等、Journal of
the National Cancer Institute、第52巻、95〜
101頁（1974年）Bioloyically active components
from mycobacterial cell walls.i.isolation and
composition of cell wall skeleton and
component P₃を参照のこと〕。この記載を引用に
より明細書に組み入れる。アズマ等の記載のごと
く、粗TDMを、遠心微粒シリカゲルクロマトグ
ラフイーによりさらに精製することにより精製さ
れたTDMを得ることができる。 従つて、この発明は、微生物のピリジン可溶性
抽出物を細胞壁骨格及びトレハロースジミコレー
トと共に含んでなる医薬組成物を提供することを
目的とする。 この発明の他の目的は、微生物のピリジン可溶
性抽出物、細胞壁骨格及びトレハロースジミコレ
ートを含んで成る組成物を使用するヒト以外の温
血動物の腫瘍の治療方法を提供することである。 （発明の概要） この発明は約７〜約20重量％の蛋白質、約10〜
約16重量％の糖及び約35〜約55重量％の脂肪酸を
含んで成る微生物由来のピリジン可溶性抽出物、
細胞壁骨格（CWS）及びトレハロースジミコレ
ート（TDM）と共に含んで成る医薬組成物に関
する。この抽出物は、約12重量％ずつの蛋白質及
び糖、並びに約45重量％の脂肪酸を含有すること
が好ましい。 例えばM.ボビス（M.bovis）BCG、M.フレイ
（M.phlei）、M.スメグマチス（M.smegmatis）、
M.カンサシー（M.kansasii）、ノカルデイア・ル
ブラ（Nocardia rubra）、コリネバクテリウム・
ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）及
びコリネバクテリウム・プルブム
（Corynebacterium parvum）を含む任意の微生
物を使用してピリジン可溶性抽出物を製造するこ
とができる。コリネバクテリウム・パルブムが特
に好ましい。 微生物の全細胞、好ましくはペースト状のもの
をピリジンと混合する。こうして得た混合物を分
離することによりピリジン可溶性抽出物を含有す
る上澄区分、及びピリジン抽出残渣を得る。場合
によつては、ピリジン残渣を再度上記のようにピ
リジンを使用する分離操作にかけ、追加量の目的
抽出物を分離する。 次に、抽出物からピリジンを除去し、そして乾
燥抽出物を、蒸留水のごとき適当な液に対して透
析する。全細胞又は細胞断片汚染物が存在しない
ことを顕微鏡で確認する。こうして得た精製され
た抽出物は、次に公知の方法により凍結乾燥して
安定な生成物を得ることができる。 この発明の方法に従つて製造したピリジン可溶
性抽出物をCWS及びTDMと組合わせて、脾及び
肝の肥大の誘導を刺激することなく有効な抗腫瘍
活性を有する組成物を製造する。この組成物によ
り治療することができる癌には、動物の腫瘍、例
えばウシ扁平細胞癌、ウシ線維肉腫、ウマ類肉
腫、ウマ黒色腫、ウマ扁平細胞癌、イヌ乳房癌、
イヌ線腫、及びイヌ黒色腫、並びにヒトの腫瘍、
例えば乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、扁平細
胞癌及び卵巣腫瘍が含まれる。 この組成物は、油滴乳剤のごとき医薬として許
容される媒体中、注射により、後に詳述する条件
下で、腫瘍に直接投与するのが好ましい。 前記の組成物は、例えば凍結乾燥により安定化
せしめ、そして効力を喪失することなく再調製す
ることができる。 動物の治療の場合、１回の注射におけるピリジ
ン可溶性抽出物の量は約375〜約2500マイクログ
ラム／mlである。CWS及びTDMの量は125〜375
マイクログラム／mlである。 腫瘍に注射する生物製剤のミリリツトル数は次
の表に従つて、腫瘍の大きさにより決定する。

【表】 注射当たりの最大投与量は、ピリジン可溶性抽
出物及びCWSのそれぞれについて約40mgであ
り、TDMのそれは６mgである。治療の過程は約
２週間の間隔における６回以下の注射から成る。 油滴乳剤のごとき適当な注射媒体中のこの発明
の組成物はヒトの腫瘍に直接投与する。１回の注
射におけるピリジン可溶性抽出物の量は約200〜
5000マイクログラム、好ましくは約800〜1200マ
イクログラムであり、CWSの量は約50〜2000マ
イクログラムであり、そしてTDMの量は約50〜
1000マイクログラムである。CWS及びTDMの好
ましい単位投与量は約475〜525マイクログラムで
ある。上記の投与レベルはいずれも典型的な70Kg
の成人患者を基礎にしたものである。注射はおよ
そ１週間に１回、合計15回以下で行う。 上記のごとく、温血動物及びヒトの治療のため
の組成物は油滴乳剤の形で使用することができ
る。使用する油の量は、組成物の合計容量に対し
て約0.5〜約3.0容量％の範囲である。約0.75〜約
1.5容量％の油を使用するのが好ましい。このよ
うな油の例には、軽鉱油、スクアレン、スクアラ
ン、７−ｎ−ヘキシルオクタデカン、コノコ・ス
ーパーオイル（Conoco superoil）及びドラケオ
ール（Drakeol）6VR鉱油〔ペンレコ
（Penreco）社、バトラー（Butler）、ペンシルバ
ニア製〕が含まれる。 次に、ホモジナイズした油含有混合物を、場合
によつては混合に先立つて塩溶液中に溶解した洗
剤と混合する。洗剤の量は、組成物の合計容量に
対して約0.02〜0.25容量％、好ましくは約0.10〜
0.20容量％とする。トウイーン（Tween）−80、
アルラセル（Arlacel）（アトラス・ケミカル社
製）等の任意の一般の洗剤を使用することができ
る。 次に洗剤の添加によつて得られた混合物をホモ
ジナイズして、顕微鏡観察した場合に活性成分に
より被覆された油滴を高い比率で含む懸濁液を生
成せしめる。 次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明す
る。但しこれによりこの発明の範囲が限定される
ものではない。 例 １ コリネバクテリウム・パルブムからのピリジン
可溶性抽出物の調製 コリネバクテリウム・パルブム〔P.アクネス
（P.acnes）、4182株〕を、NIHチオグリコレート
培地中で48〜72時間、37℃にて増殖せしめ、そし
て集菌して全細胞ペーストを得た。次にこのペー
ストを500mlの蒸留水で洗浄した。90ｇ（湿重
量）の洗浄ペーストを200mlの純ピリジンと混合
し、そして４℃にて１時間1700×ｇにおいて遠心
分離した。ピリジン可溶性抽出物を上澄区分とし
て取り出した。残つた残渣を、前記と同じ条件で
追加のピリジンを用いて抽出した。ワツトマン
（Whatman）No.１紙を用いて過した後のピリ
ジン抽出物を集め、そしてブツチ・ローターベー
パー（Buchi Rotavapor）〔ブリンクマン・イン
ストルメンツ（Brinkman Instruments）ウエス
トバリー、ニユーヨーク製〕中、50℃にて溶剤を
蒸発除去した。乾燥ピリジン抽出物を、蒸留水に
対して十分に透析し、そして凍結乾燥した。得ら
れた、精製されたピリジン抽出物は約12重量％の
蛋白質、約12重量％の糖及び約45重量％の脂肪酸
を含有していた。抽出物を電子顕微鏡で観察し、
全細胞及び細胞壁断片による汚染が存在しないこ
とが見出された。ピリジン可溶性抽出物の収量は
９％（8.1ｇ）であつた。 例 ２ M.ボビスBCG株からのピリジン可溶性抽出物
の調製 M.ボビスBCG株を、サウトンス（Sautons）培
地中、37℃にて３〜４週間増殖せしめ、そして集
菌し、洗浄全細胞ペーストを得た。50ｇ（湿重
量）の洗浄ペーストを、次に例１と同様にして処
理し、７％（3.5ｇ）のピリジン可溶性抽出物を
得た。この抽出物は、15重量％の蛋白質、10重量
％の糖及び約52重量％の脂肪酸を含有していた。 例 ３ モルモツトにおける系統−10腫瘍に対する試験 直径約９mmに増殖した系統−10腫瘍を有する系
−２モルモツト６匹の腫瘍組織に直接、例１に従
つて調製したピリジン可溶性抽出物300マイクロ
グラム、並びに50マイクログラムずつの細胞壁骨
格及びトレハロースジミコレートを含有する無菌
油滴乳剤〔ドラケオール6VR鉱油（ペンシルバニ
アリフアイニング社、バトラー、ペンシルバニ
ア〕0.4mlを１回注射した。 ３箇月後に動物を検査したところ、６動物中５
動物において完全な退化が生じていた。 対照実験として、直径約９mmに増殖した系統−
10腫瘍を有する系−２モルモツト６の腫瘍組織に
直接、ピリジン抽出物又は細胞壁骨格及びトレハ
ロースジミコレートを含有しない前記の油滴乳剤
0.4mlを１回注射した。３箇月後、６個の腫瘍は
いずれも退化の徴候を示さなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 約７〜約20重量％の蛋白質、約10〜約16重量
   ％の糖、及び約35〜約55重量％の脂肪酸を含んで
   成る微生物由来のピリジン可溶性抽出物、細胞壁
   骨格及びトレハロースジミコレートのそれぞれの
   医薬として有効な量を、医薬として許容される担
   体と共に含んで成る医薬組成物。 ２ 微生物が、M.ボビス（M.bovis）BCG、M.
   フレイ（M.phlei）、M.スメグマチス（M.
   smegmatis）、M.カンサシー（M.Kansasii）、ノ
   カルデイア・ルブラ（Nocardia rubra）、コリネ
   バクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium
   diphtheriae）、又はコリネバクテリウム・パルブ
   ム（Corynebacterium parvum）であり、そして
   好ましくはコリネバクテリウム・パルブム
   （Coryne−bacterium parvum）である特許請求
   の範囲第１項記載の組成物。 ３ 抽出物がそれぞれ約12重量％の蛋白質及び
   糖、並びに約45重量％の脂肪酸を含有し、そして
   ピリジン可溶性抽出物及び細胞壁骨格の量がそれ
   ぞれ約40mg以下であり、トレハロースジミコレー
   トの量が約６mg以下であり、そして組成物が凍結
   乾燥の形又は油滴乳剤の形である特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の組成物。 ４ 油がスクアレン、軽鉱油スクアラン、７−ｎ
   −ヘキシルオクタデカン、コノコ・スーパーオイ
   ル（Conoco superoil）又はドラケオール
   （Drakeol）6VR鉱油であり、そして組成物中に、
   組成物の合計容量に対して約0.5〜3.0容量％存在
   する特許請求の範囲第３項記載の組成物。 ５ 洗剤を組成物の合計容量に対して約0.02〜
   0.25容量％含有し、ピリジン可溶性抽出物が約
   200〜5000マイクログラムであり、細胞壁骨格の
   量が約50〜2000マイクログラムであり、そしてト
   レハロースジミコレートの量が約50〜1000マイク
   ログラムである特許請求の範囲第３項記載の組成
   物。 ６ 約７〜約20重量％の蛋白質、約10〜約16重量
   ％の糖及び約35〜約55重量％の脂肪酸を含んで成
   る微生物由来のピリジン可溶性抽出物、細胞壁骨
   格及びトレハロースジミコレートのそれぞれの医
   薬として有効な量を医薬として許容される担体と
   共に含んで成る医薬組成物をヒト以外の温血動物
   の腫瘍に直接注射することを特徴とするヒト以外
   の温血動物の腫瘍の治療方法。 ７ 約375〜2500マイクログラム／mlのピリジン
   可溶性抽出物、並びにそれぞれ約125〜375マイク
   ログラム／mlの細胞壁骨格及びトレハロースジミ
   コレートを含有する組成物を腫瘍に直接注射する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 ８ 約２週間の間隔で６回以下、組成物を腫瘍に
   直接注射する特許請求の範囲第６項又は第７項記
   載の方法。 ９ 約200〜5000マイクログラム、好ましくは約
   800〜1200マイクログラムのピリジンン可溶性抽
   出物、約50〜2000マイクログラム、好ましくは約
   475〜525マイクログラムの細胞壁骨格、約50〜
   1000マイクログラム、好ましくは約475〜525マイ
   クログラムのトレハロースジミコレートを含有す
   る組成物を、約１週間の間隔で15回以下直接腫瘍
   に直接注射することを特徴とする特許請求の範囲
   第８項記載の方法。