JPS6255104B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、混合液中に存在する蛋白の定量分析
技術、特に試料の量が微量である場合における定
量分析方法に関するものである。

近年、健康及び疾病に関して蛋白の果たす役割
に関する知識が急速に発展するに及び血清、脊髄
液、細胞抽出液等の液の蛋白を迅速かつ比較的経
済的に定量測定する必要性が一般に高まつてい
る。

このような液中の蛋白は、特定の蛋白に対して
特異的な抗体によつて起こる各蛋白の沈降を利用
した免疫化学的方法によつて同定（定性分析）さ
れることが多い。このような特定の抗体は生体中
に異種蛋白（抗原）が侵入して刺激することによ
つて産生される。抗血清は、このような既知の抗
体の混合物である。ある蛋白試料を生体外で、こ
のような抗血清と反応させ、その結果得られる沈
降の存否を観察すると、試料の中にある蛋白の種
類についての有力な手がかりをつかむことができ
る。

このような免疫化学的方法を利用して蛋白の定
量分析を行なう方法としては、抗体または抗原の
一方の試薬を有するゲルの表面に他方の試薬を接
触せしめ、形成された沈澱に基づく散乱光を検知
する方法（特開昭50−107123）が知られている
が、この方法によつて得られる定量分析のための
パラメータは一つの測定点におけるゲル中の沈澱
濃度に相応する値であるから、ゲル中の拡散速度
に大きく影響されるため不正確であるとともに、
単一成分のものにしか適用できないという欠点が
ある。

したがつて、このような免疫化学的方法は蛋白
の分析においては一般的に定性的手段と考えられ
ており、定量分析に有効な具体的方法は見い出さ
れていない。

本発明の目的は、信頼性及び再現性の高い免疫
化学的方法による蛋白の定量分析方法を提供する
ことである。

また本発明の他の目的は、上記目的に加えてさ
らに多種の蛋白を含む試料の各蛋白の定量分析方
法を提供することである。

本発明は、特定の蛋白に対して特異的な抗体を
含む抗体源と抗原試料とで免疫拡散を行つて、抗
原試料中の蛋白濃度を測定する方法である。即
ち、蛋白と抗体は初めにこれらの反応物質を含ん
でいない支持媒体中で相互に拡散し、接触反応を
起こして有限長さを持つ細長い沈降ゾーンを少な
くとも一個形成し、これを定量的に測定するため
にそのゾーンの内外にわたつて分布している二次
元配列の各位置を光学的に走査し、各位置におけ
る沈降物濃度に相当する電気信号を発生させ、上
記蛋白濃度に特有な変化を表わす細長い沈降ゾー
ンに沿つたゾーン両端間の距離に関するパラメー
タを、その信号から電気的に誘導する。そして、
その結果を、一方で既知量の上記蛋白を含んでい
る対照抗原溶液について、試料の場合と同様な免
疫拡散を行つて得られた対照ゾーンから求めたパ
ラメータ対照値と比較する方法である。

上記の実施結果及びその結果に関する計算は、
必要に応じてマニユアルに行うこともできるし、
また光学的及び電気的走査装置を用いて、半自動
でデータを求めることもできる。また必要なデー
タ処理は、適当な容量の汎用コンピユータによつ
て全自動で行うこともできる。

本発明者らは、蛋白及び抗体を相互に拡散させ
て形成した有限長さの細長い沈降ゾーンの両端間
の距離が、蛋白の定量測定のための有効なパラメ
ータを有していることを見い出し、本発明に至つ
たもので、このパラメータは、細長い沈降ゾーン
の内外に分布した二次元配列のそれぞれの位置に
おいて測定した複数の電気的信号から導出され
る。細長い沈降ゾーンは標準的には対称形として
現われるので、その対称軸または沈降ゾーンの曲
率に基づいてその沈降ゾーンの端部位置を計算に
より補正したり補完することができる。

前述した本発明において、最初の抗原の混合物
中に多種の蛋白を含む場合は、初めに、各種蛋白
間の特性の相異に比例して、上記抗体源と相互に
拡散する方向とは直交する方向に移動させること
によつて一部を分画しておく。このような選択的
移動は、例えば、簡単な拡散や、電気泳動、或い
は、クロマトグラフイのような更に複雑な方法に
よつても行なうことができるが、その後の免疫拡
散によつて形成される沈降ゾーンは、いずれの方
法で分画された場合にも、基本的に変らない。例
えば電気泳動の場合、異なつた蛋白間の泳動易動
度の差によつて各蛋白は電界方向に沿つて、易動
度の差に応じて移動分布する。このような初期分
画を行つた後に、蛋白は異つた方向に移動して抗
血清と接触し、一般にはアガールやアガローズの
ような適当な支持媒体中で相互拡散を行うことに
よつてその結果基本的な直線的分布を形成する。
各蛋白の沈降ゾーンは一般に完全に分離し、明ら
かに弁別される。

異つた蛋白、あるいはまた抗体の拡散易動度に
は、元来、このような沈降ゾーンをはつきり弁別
するのに足るだけの充分な差がある。ゾーンのオ
ーバラツプは一部に限られているから、ゾーンの
エンドポイントは、はつきりと弁別することがで
きる。また、隣り合う沈降ゾーンが重なり合つて
も、沈降ゾーンの対称性を利用してその対称軸ま
たは沈降ゾーンの曲率に基づいて重なり合つた方
の端部位置を計算により求めることができる。

前記従来技術のように一つの測定点における散
乱光あるいは光強度を定量パラメータとする場合
には、蛋白の密度及び経時的な拡散の程度は測定
結果に重大な影響を及ぼし、これを補正する他の
パラメータを見い出すことは困難であるが、本発
明による定量法では、沈降ゾーンの形状的因子を
パラメータとしているので、相互拡散の前に分画
処理としてのこのような選択移動を行なうことが
できるのである。

免疫拡散を行うために抗原と抗体を穴の中に入
れて、抗原と抗体が相互に移動する速度を高める
ために電気免疫拡散のような方法で電場をかけた
場合でも、その結果形成される沈降ゾーンは電界
をかけなかつた場合と同じ基本形を保つている。
またもし、免疫電気泳動において免疫拡散のステ
ツプが、適当な電場によつて加速された場合も、
上記と同様である。従つて、本明細書における免
疫拡散なる語は、加速電場を伴う場合と、伴わな
い場合の双方を意味している。

以下、本発明の実施例を、添付図面を参照して
説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。

免疫電気泳動は定性法として良く知られてお
り、それを行うために多種の装置が発表されてい
るがいずれも大同小異である。本発明において
は、電気泳動と、それに続く拡散と免疫反応は、
通常、光学的に透明な板の上に乗せられた数分の
１ミリメータから数ミリメータの厚さの単層ゲル
の中で行なわれる。支持媒体としては今日一般に
用いられている、pH約8.6でイオン強度が約0.1の
バルビタール緩衝液で飽和されたアガローズが用
いられる。そして試料は、ゲル層に切り込まれた
穴とか、ゲル層をキヤリアに乗せる時にモールド
して作られた穴の中に入れられる。

第１図にはプレート２０が図示してあり、その
上に電気泳動の方向と平行に延びる軸２５に沿つ
た抗体溝２４と、その両側に等間隔が配置された
円形の抗原穴２１と２２がある。穴の配置によつ
て、２種の別個の溶液又は同種の溶液の２つの試
料は、各プレートの上で同じ抗体溶液に向つて同
時に移動する。各プレートの上で２つの抗原穴の
外側に更に２つの抗体溝を追加し、更にその外側
に２つの抗原穴を追加して、プレートの容量を倍
加させてもよい。同様にして、パターンのオーバ
ーラツプを防ぐために、穴２１と２２から電気泳
動の方向に沿つて充分に離れた所に、抗原穴を追
加してもよい。

第１図Ａの陰影部２６と２８は、穴２１と２２
の中に入れられて矢印２３の方向に一定時間電気
泳動を行つた後の一対の同種の試料中にある４種
の蛋白ａ，ｂ，ｃ及びｄの代表的な分布を近似的
に示したものである。通常、すべての蛋白は、液
体媒質中中では同じ方向に移動するが、溶媒自体
が純電荷を運ぶ性質を持つているため、結果とし
てゲルの流れやゲルに対して電気浸透を引き起
す。従つて蛋白は穴に対して両方向に移動する。

電気泳動が終ると、溝２４に抗体が入れられ、
第１図Ａのａ，ｂ，ｃ及びｄの蛋白とそれに対応
する抗体との相互拡散によつて沈降ゾーンが形成
される。第１図のＢ，Ｃ，Ｄは、代表的なゾーン
出現の各段階を示している。

関係のない抗原の沈降アークは、それぞれの抗
体と反応して別個に形成されるが、充分に接近し
てくると第１図Ｄのように交差し、免疫化学的に
関係のある沈降アーク同志は連続した反応線とし
て融合する。第１図Ｃ及びＤにおける沈降ゾーン
ｄ′は、第１図Ａにおける領域ｄが、実は２つの別
個の蛋白を含んでおり、同じ電気泳動易動度を持
つている２つの蛋白であつても、別個の沈降ゾー
ンを形成する事実を例示している。ゾーンｄと
ｄ′は、２つの異つた蛋白が穴２１に入れられて、
初期の電気泳動のステツプを経ないで免疫拡散を
適用されたと考えることもできる。夫々のゾーン
エンドがはつきり分れている理由は、各蛋白或い
は抗体の拡散率が異つているためである。いずれ
の場合にも、このような各ゾーンは以下に述べる
方法を用いると別々に分析することができる。

本発明によると、免疫電気泳動による沈降ゾー
ンを、直接定量的に測定することができる。この
ような測定によつてプレート上で目的とする蛋白
の各沈降ゾーンの特定の特徴的な物理的な配置を
決めることができるし、それとともに光学的方法
によつて光強度の測定を行うこともできる。いず
れの方法に対しても、時間的要素が加えられてお
り、これが観測データの重要な要素となつてい
る。しかし、インキユベーシヨンを平衡に達する
まで行つて、安定したゾーンの形成を待つのであ
れば、このような時間を測定しても無意味であ
る。

プレート２０の上での位置測定は、例えば低倍
率の顕微鏡で行うことができる。第２図に図示さ
れているように、光源ランプ３６と黒のベルベツ
トのような吸光性の暗視野３４を持つ光源箱３０
の可変開口部３２の上にプレート２０が置いてあ
る。顕微鏡４０には対物レンズ４１、接眼レンズ
４２及び焦点面に照準用の十字線４３がついてい
る。光源箱３０の上にはダブルスライド機構４５
が載置されており、詳細に図示してないがねじに
よる駆動装置４６と正確な目盛が施されていて、
その上に乗せられている顕微鏡の位置を２つの座
標軸に対して正確に読み取ることができるように
なつている。この図では分り易くするために１つ
の座標軸についてのみ示してある。通常は第１図
Ａに示されているように、ｘ軸を電気泳動の方
向、つまり抗体溝と平行に定め、座標軸の原点を
軸２５の上か、その近くに定めると便利である。

光の濃淡の測定のために、顕微鏡には斜めにな
つている光束分割用のハーフミラー４８が設けて
あり、光の一部を接眼部に送り、他の部分でダイ
ヤフラム５２の上で実像を結ばせている。ダイヤ
フラム５２は、プレート２０の上で十字線４３に
一致している範囲からの光のみを、感光トランス
ジユーサ５０に送る。トランスジユーサ５０は増
幅回路５４とメータ５６に電気的に接続されてい
る。メータ５６の代りに直接眼で見てマニユアル
に記録してもよいし指令信号に応じて、自動的に
光の強弱を記録するようなプリント回路やＡＤ変
換器を接続させてもよい。第２図においては、例
えば暗視野照明の代りに、直接照明とか、ゾーン
からの反射光を直接測定できるような上からの照
明等、種々の変更が可能である。完全な自動測定
を行うための方法及び装置の実施例を以下に説明
する。

第３図はゾーンが出現した際に、本発明によつ
てゾーンの位置測定を行うために、定められた沈
降ゾーンのある特徴を図示したものである。ｙ＝
ｙにおける水平の線６１は免疫電気泳動スライド
の抗体溝の端である。座標（Xe、Ye）及び
（Xf、Yf）における点Ｅ及びＦは展延するゾーン
６０の左及び右のエンドポイントである。

ゾーンエンドポイントＥ及びＦの他に、各ゾー
ンの中で何個所かの中間点を測定する方がよい。
第３図において座標（Xg、Yg）における１点Ｇ
はこのような点の例である。

ゾーンはｙ方向にある幅を持っているので、Ｇ
のような各中間点のｙ座標は、抗体溝に最も近い
前縁６３、ゾーンの後縁６５、或いはゾーンの中
で、光の強度の最も強い部分も含めて、１個所或
いはそれ以上の点６４を定めると便利である。

インキユベーシヨン時間の経過に伴つて、ゾー
ンが出現すると、点Ｅ，Ｆ及びＧの絶対及び相対
位置が変化する。時間の関数として、第４図に例
示されているXeとXfの値は蛋白濃度と相関して
おり、この座標の差（Xf−Xe）、即ち特定の測定
時間における沈降ゾーンの長さＬを同じ時間で既
知の濃度の蛋白によつて得られた対照値と比較す
ることによつて、直接蛋白濃度を測定することが
できる。しかし、このような測定結果からパラメ
ータとして有効であると考えられる１つか或いは
それ以上の関数を誘導して、上記パラメータを補
正することにより、更に信頼性の高い正確な結果
を得るようにしてもよい。

第４図が表わすデータとして、第５図にインキ
ユベーシヨン時間に対するこのパラメータの変化
を示してある。

第４図及び第５図において、実線は実際の実験
から求めた値をプロツトしたものである。これら
の図にはまた、実線を時間の少ない方向に向つて
延長（外挿）した値が示されている。この延長は
破線で示してある。第４図で延長線が交わる点６
６はゾーンの長さが０であつた点を表わしてい
る。第５図の延長（外挿）線は点６７で時間軸と
交わり、同様にToを求めることができる。この
ような延長（外挿）によつて沈降ゾーンの初出現
時間を実際的に正確に求めることができ、この初
出現時間を沈降ゾーン長Ｌを求めるための時間的
基準にすることもできる。

分析される試料について、パラメータを求める
ための実験値が得られると、これらの値は、各蛋
白の標準値を適当に組合せた値と比較される。こ
れらの標準値は既知量の目的の蛋白を含む一連の
溶液を用いて、測定と同じ条件下で作られたもの
である。このような標準値の組合せを得るため
に、このような標準蛋白溶液を用いて標準操作を
行い、各プレートの対応する点で、インキユベー
シヨンの進行につれて、引続いて測定を行う。標
準操作は、すべての条件をできるだけその標準が
適用されるべき測定操作と同じ状態で行うことが
望ましい。事実、対照値は、各測定操作に対して
個々に対応する独特なものであることが望まし
い。しかし日常の測定において前回の測定で対照
曲線の勾配が既知であるような場合には、１回の
標準操作で充分なこともある。

希望するパラメータの標準値は、各濃度につい
て、このような標準操作を数回行つて導出され
る。こうして測定されたパラメータの標準値は、
従つて、濃度と時間の双方の関数であると考えら
れる。

標準曲線を作ることは、より間接的である。こ
れらの値は、測定が行なわれた時間に関係してい
るので、対照標準は時間の範囲をカバーするよう
に作らなければならない。すべての濃度に対して
同時にデータを測ることは困難である。従つて各
測定値は測定の時間に関連を持たせて、各蛋白濃
度の最終的な標準値を時間の関数として別々の曲
線にプロツトする。

第６図はこのようなグループの代表例であつ
て、３つの濃度に対するパラメータの標準値が時
間軸に対してプロツトされている。第６図には、
任意の時間t₁，t₂及びt₃で垂直な線が引いてあ
る。これらのＬの各値は濃度の関数の別々の曲線
として再プロツトすることができる。その結果得
られた一組の曲線の組合せは、それぞれの時間に
対して、蛋白濃度の関数としてのＬを示してい
る。この組合せは第７図に示されており、実験値
を比較する差には第６図の時間に対するプロツト
よりは、便利である。

本発明の他の特徴は、正確度を改善することに
あり特に測定しようとする試料中の目的の蛋白の
一種又はそれ以上の濃度が比較的低い場合に有効
である。そのような場合には試料溶液にそのよう
な蛋白の既知量を整数比でいくつか補足すること
が望ましい。そして、その溶液と既知量の蛋白を
含む標準とを並行して測定操作を行うのである。
夫々の溶液に対して所要のパラメータを求めるた
めの値が必要であれば、時間に対して上に述べた
補間によりすべての時間について求めることがで
きる。正規の標準について得られたパラメータ値
Ｐを第８図のカーブ８０に示すように通常の方法
で蛋白濃度に対してプロツトする。同様にもとの
抗原試料及び既知量の蛋白を加えた一部に対する
Ｐの値を各点ｈ，ｉ，ｊ及びｋに対して、あたか
もその溶液が追加された蛋白だけしか含んでいな
かつたようにプロツトされる。従つて、もとの試
料に対する値ｈは、濃度が０の位置にプロツトさ
れる。これらの点を通つて曲線８１が引かれる。
このデータの処理例では、もとの試料の蛋白濃度
は数種の方法で計算することができ、いずれも基
本的には同じ値を与えてくれるはずである。こう
して希望する数種の方法を用いて計算し、結果の
平均を採ればよい。

まず、ｈから水平に延長して曲線８０とｈ'で交
わる直線はＣｈで示されている値の濃度を示す。
これは先に述べた一般の比較法に相当する。更に
同様にして、ｉ，ｊ及びｋから、直線８０に交わ
るように引いた延長線は、ｉ→ｉ'，ｊ→ｊ'及びｋ
→ｋ'の直線の長さに応じて濃度を与えてくれ、そ
れらの長さは、論理的にはすべて同じである。も
しｈにおけるＰの値が何らかの理由、例えば観察
したゾーンが不明瞭なために不確実である場合に
は、４つのすべての間隔の平均によつて、信頼で
きる値を得ることできる。

もう１つの方法は、ｈにおける測定の不正確を
改善できるばかりでなく、もとの試料中の蛋白の
濃度が、測定可能な沈降線を形成するのに必要な
限界値以下であるような場合にも、値を求めるこ
とができるという利点を持つている。後者の場
合、曲線８１の上の蛋白は得られた点ｉ，ｊ及び
ｋを結んで得られ、更にＰ軸の方に延長（外挿）
され、ｈにおけるＰを決める。このように曲線８
１を延長する際に曲線８０はガイドとして役に立
つ。例えば第８図の曲線８０は、それが点ｉ，ｊ
及びｋを表わすようになるまで全体として左に移
動させたものである。こうして移動させた曲線８
０とＰ軸との交点は点ｈの値を与え、それから濃
度Ｃｈを求めることができる。また曲線８１を横
軸の負側−Ｃｈまで延長すると、濃度値Ｃｈに合致
する濃度を直接読み取ることができる。

上に述べた補足された標準線８１による方法
は、実験用及び対照用として、同じ溶液が使える
という大きな利点を持つている。特にその試料が
特定の病気の患者の人血清である場合には、この
利点によつて標準線を延長することによるいかな
る小さな誤差も解消することができる。種々の量
の蛋白を補足した試料の数を増やすことによつ
て、第８図に示してある３点のみならず、数個所
で測定を行うことによつて、この外挿の信頼性は
ほとんど無制限に向上させることができ、含まれ
る測定誤差についての正しい認識を得ることがで
きる。

本発明はまた、抗原試料中のある種の蛋白の異
常を自動的に検出することができる。例えば正常
及び異常ガンマグロブリンは両者の間で、通常、
免疫拡散及び電気泳動易動度の範囲に僅かの差を
持つていて、しかも同じ抗体と反応し、異常な沈
降ゾーンを形成して一般にゾーンの長さに沿つて
非対称に分布する沈降を形成する。このような異
常性は、細長い沈降ゾーンの非対称性とがその他
の値の異常性を観察することによつて異常が発生
していることを知ることができる。そしてこの異
常性は、もしＸのある値において数個の独立した
測定が行われ、また測定誤差を計算した結果が統
計的に顕著な変化を示したら異常の存在が示され
たことになる。

異常蛋白の存在に対して、鋭敏に応答するその
他のパラメータは、ゾーンの軸方向の曲率であ
る。異常の存在によつて、ゾーンの長さ方向に沿
つた曲率は、異常に且つ非対称に変化する傾向が
あり一方全体としての曲率は正常以下になる傾向
がある。

２つ或いはそれ以上のパラメータの特異な関数
から成る多価パラメータを用いると更に有利であ
る。例えばゾーンの長さＬと光強度パラメータの
合計は、測定誤差を適当に考慮に入れると、個々
の成分を１つずつ使用するよりは信頼性の高い結
果を与えてくれるような新しいパラメータにな
る。

その他に２つのパラメータの導関数もパラメー
タとして有利であり、一方は蛋白濃度の増加に伴
つて増加し、一方は低下する。こうしてこれらの
パラメータの商とか、差を用いると、それらを
個々に用いるよりも、濃度に対して鋭い依存性を
持つパラメータを得ることができる。

ゾーンの初出現時間Toは、蛋白濃度に対して
逆の関係を持つている例であり、特にこのような
商を求める際に利用できる。ｘ軸の任意の希望す
る値Xgにおける抗体溝とゾーンとの距離もま
た、蛋白濃度と逆の関係を持つており、このよう
な商もパラメータとして用いられる。一般的に
は、濃度に直接依存するパラメータを、濃度に逆
依存するパラメータで割算しその結果の多価パラ
メータが、濃度に対して逆依存でなく、直接依存
となるようにする方がよい。

未知の試料について、実測によつて定められた
多価パラメータに対して比較のために適した対照
値は、既に述べたように、各成分のパラメータの
対照値から導出することができる。

既知の如く、位置及び光強度の測定やパラメー
タの誘導は、直接観察やマニユアルな方法で行う
ことができるが、本発明の特徴として、これらの
操作は特に一部又は全体を自動化するのに適して
いるということである。

本発明に必要な測定を行うについて、特に便利
で有効な方法は、スライドを光学的に走査する方
法であつて、テレビカメラのように、電荷結合型
走査装置又は、それと同等な方法で走査範囲の２
次元の組合せの見かけ上の光強度を表わすような
ビデオ信号を得る方法である。各エレメントの信
号は一般にデジタル変換され、プレート上の位置
に対応するｘ及びｙ座標、或いは測定時間と共に
電気的に記憶される。このような位置全体の信号
の組合せ又は、特定の位置の信号は、その後のデ
ータ処理に際して、呼び出すことができる。また
スライド上の像のいかなる部分でもＣＲＴ又はそ
れに相当するような方法で、走査中又はその後を
問わず表示することができる。走査や映像の記
憶、再生や像の特定の点をデジタル信号として抽
出するシステムは、エレクトロニクス技術では既
知の方法であり、この要求に合うような形で購入
することができる。

第９図は、このような装置の一例を図示するも
ので、テレビカメラ９０はレンズ９１によつてカ
メラの感光面、モニタＣＲＴ９２、走査コントロ
ール装置９４及び汎用コンピユータ１００にプレ
ート２０の像を結ばせる。レンズ９１の調整によ
つてプレート２０は任意の倍率で像を作ることが
できる。プレートの任意の位置を中心にもつてく
るためには、例えば第２図の光源箱３０のような
照明付の支持台の上でプレートの位置を変えたり
カメラ回路で従来の電子的なバイアス制御を行つ
てもよい。

特に、もし走査装置としてモニターＣＲＴに同
期した走査機構を用いることができるならば、ス
クリーン上での両座標軸方向の動きが連続的に等
しいような細かいステツプで機構を駆動すること
ができる。像は面積要素に分割され、例えばｘと
ｙ座標によつて識別される。マニユアル又は半自
動操作のために、モニター表示器には通常カーソ
ルがついており、電子的に作られた輝点が、各走
査毎にスクリーン上で面積要素からビデオ信号が
抽出されている位置を示す。オペレータのために
マニユアルでコントロールできるスイツチがあ
り、目で見ながらカーソルを自由に動かすことが
できる。装置はまた、デジタルなコマンドアドレ
スによるｘ及びｙ座標の値に応じて、カーソルを
直接希望の点に合わせることもできる。このよう
な信号はマニユアルでも、又は汎用コンピユータ
によるプログラムからでも得ることができる。

第９図に例示されるようにカウンタ１０２はク
ロツク１０３からのパルスを計数し、分岐線１０
４に連続的にｘ座標を表わすデジタル信号を与え
る。回路１０６はライン１０７にその信号に応じ
てｘ座標の最小単位毎のアナログのステツプ状電
圧を発生させる。分割回路１０８はｘ軸方向のビ
ームの走査計数を行ない分岐線１０９に各掃引毎
にｙ座標を表わすデジタル信号を与える。回路１
１０はこの計数に応じて、ｙ座標の最小単位毎の
アナログのステツプ状電圧を、ライン１１１に送
り出す。ライン１０７と１１１のステツプ電圧
は、カメラ９０とＣＲＴ９２のｘ及びｙ方向の走
査を制御し、両者の同期状態を保つ。カメラ９０
からのビデオ信号は、ライン１１２を経てモニタ
ーＣＲＴ９２に送られ、スクリーン面でプレート
２０の光強度の変化を再現する。

選択回路１１８は通常Ｘ及びＹカウンタから成
つており、１１９で示される操作桿を手動で動か
すと、１個又は何個かのパルスを計数して上下に
カウンタアツプ又はカウンタダウンする。その結
果のデジタル信号は測定対象となつている場所の
ｘ及びｙ座標を表わし、レジスタ１１７に記憶さ
れる。比較回路１１４は、レジスタ１１７からの
特定の測定対象位置の座標とライン１０４と１０
９から走査ビームのｘ及びｙ座標を常に比較す
る。走査スポツトが記憶されていた位置（アドレ
ス）に来ると、通常各走査について１回ずつ、比
較回路１１４からスイツチング回路１２０に動作
信号が送られる。こうしてレジスタ１２５はその
ライン１２３にスライド上の特定された測定点を
走査した時の光強度に相当するデジタル信号を受
ける。回路１１４からの動作信号はカーソルコン
トロール回路１２６にも送られ、ビデオ信号に光
強度変調パルスを重畳して、１２７で示されるよ
うに、モニタースクリーン上で選択された点を識
別させる。

レジスタ１２５はまたライン１１５と１１６か
らｘ及びｙ座標信号を受け、また時間回路１２８
によつて作られた連続的な時間信号を受ける。こ
れらの信号は全てレジシタ１２５に蓄えられ、ラ
イン１２９からのマニユアルコントロール、又は
ライン１３０からのコンピユータコントロールに
よる読取り信号に応じコンピユータ１００に送ら
れる。

コンピユータ１００は測定点を個々に識別し、
またどのようなプログラムの要求にも応じてプレ
ート２０のスポツトの入力情報を受け入れる。こ
のような測定方法は、回路的には選択回路１１
８、レジスタ１１７及び比較回路１１４と似てお
り、選択回路１１８は測定点の動きの方向を選択
的に指示したり、必要な位置のデジタルアレスを
指示する電気信号に従つて動作する。このような
装置を２つ作るよりも、第９図に示すように、ス
イツチ１３３がマニユアルからオートマチツクの
方に切替えられると、操作桿１１９は切り離され
て、選択回路１１８は分岐線１３２を経てコンピ
ユータ１００によつてコントロールされる。コン
ピユータ１００によるこのようなコントロールを
するために、既に述べたようにコンピユータ１０
０には位置や光強度の測定や、一般のパラメータ
誘導のプログラムが組み込まれている。

ゾーンを自動的に走査するために、プレートは
インキユベーシヨンチヤンバから適当に照明され
て、正確に定められた走査位置に移される方がよ
い。特に光学走査装置が電荷結合装置のように軽
量でコンパクトな場合には、例えば免疫拡散や免
疫電気泳動のプレートが並んでいる上で２次元方
向に動くことのできるプラツトホーム上に走査装
置を取付ける方が望ましい。このようにすると、
走査装置を用いて抗原や抗体を穴や溝に入れる目
的にも使用することができる。その目的でデジタ
ル信号でコントロールできるピペツトが走査装置
から少し外れたところに取付けてある。走査装置
からのビデオ信号は、コンピユータに送られ、コ
ンピユータは個々の穴の形を識別したり、自動読
取りによる識別ができるようにプログラムされて
いる。走査装置のピペツトを取付けたプラツトホ
ームがコンピユータコントロールによつてプレー
トの上を動き、走査軸が、ある定められた抗原穴
の上に正しく来た時に停止することができる。そ
れらのプラツトホームは、ピペツトが丁度穴の上
に来るように定められたある距離だけ移動し、一
定量の試料が正しく穴の中に注入される。

こうして各操作毎に適当にピペツトを洗いなが
ら全ての穴の中に抗原溶液が注入されると、電気
泳動が始まる。同様にして電気泳動が終つた後
で、或いは電気泳動を行わない場合には抗原穴に
抗原を入れた直後に、この装置によつて抗体溝に
抗体が入れられる。一定時間の拡散の後に同じ走
査装置が、プレートの組合せの上に沈降ゾーンの
上を動いて走査を行う。

走査装置の走査能力はまた、穴に試料を注入す
る前にも発揮される。コンピユータは抗原穴を抗
体溝の相対位置を測定するようにプログラムされ
ており、プレートの中で穴や溝の相対位置や寸法
の正しくないものを記憶している。そして規格か
ら大きく外れたものは、試料注入の段階で排除さ
れ、規格から僅かにずれたものについては、最終
的にパラメータを誘導する段階で、自動的に補正
される。

最初のゾーンの走査過程は、ゾーンの形成が予
想される区域の上で特定のｘの値と、一定の間隔
で移動するｙの値によつて、連続的に測定される
アドレスからのビデオ信号を得るために、コンピ
ユータによつてコントロールされる段階である。
レジスタ１２５から受け入れたビデオ光強度値
は、各測定点毎にｘ、ｙ及びｔがデータとして記
憶される。このような各々のｙ走査が終ると、ｘ
座標は一定間隔だけ移動し、同様にｙ走査が行な
われて結果が記録され、目的の全区域をカバーす
るまでこれをくり返す。測定された各光強度値は
通常前回に測定され、記憶された値と比較され
る。もし測定された光強度がバツクグラウンド領
域の閾値以上であれば沈降ゾーンの存在を示すよ
うに定められている。また各々のｙ走査について
も、ゾーンを横切る時の最高強度が定められ記憶
されていて、等間隔なｘの値に対する一連のｙの
値から、ゾーンの軸が確定される。各ゾーンのエ
ンドポイントはｘの各方向において、光強度の最
高点（ピーク）が認められるようなｘの最端値に
よつて認識される。更に精密な位置測定が必要な
場合にはエンドポイント付近の一定区域で、ｘ、
ｙの間隔を更に細かくして走査するようプログラ
ムされる。

このように位置し、記録された実際の沈降ゾー
ンに対して記録されたデータに直接数学的な処理
を施し、ゾーンエンドのｘ値を引き算するとパラ
メータＬになる。その他のパラメータは要求に応
じて適当な計算によつて求められる。

上記の測定は、１つ又はそれ以上の未知の試料
とそれに関する上記のいくつかの標準溶液を含
み、未知の試料についての判定が完全にできるよ
うなプレートの１セツトについて単位測定として
行うのが望ましい。このようなプレートのセツト
の各走査の後にコンピユータは、沈降ゾーンが見
つかつた各蛋白の濃度を導出する。もしも既に述
べたように、多数の標準測定が含まれている場合
は、考えられる測定濃度は各々計算された濃度値
について求められる。コンピユータによつてこの
ような計算を行うことは既知である。試料の中に
各蛋白の濃度から、いくつかの独立した測定を行
うことができる。一般には異なつたいくつかのパ
ラメータを参考にして予想される誤差に従つて重
みづけをして平均を求める。

もし、その平均値に対する誤差の計算値が、測
定中の試料に対して一定の範囲内に収まれば、そ
れ以上他の測定を行う必要はない。コンピユータ
はそれによつて一般のプリントアウトが最終結果
の記録をしたりプログラムに必要なできるだけ多
くのオリジナルデータの収集を行う。例えば、解
析を依頼した医師がすべてのデータを磁気テープ
などに入れて将来の参考のために要求することも
できる。また免疫拡散を行つたプレートの写真
を、モニターＣＲＴを通して、又は直接にでも撮
ることができる。通常、蛋白の濃度が高くない場
合には、１サイクルの走査で、対象とする蛋白の
濃度を決めるのは良くない。ある時間、即ち数分
から１時間或いはそれ以上の時間、インキュベー
シヨンを追加した後、上記の走査をくり返し、測
定用のプレートと、それに対応する標準用プレー
トが走査される。コンピユータは通常前回の走査
ではゾーンがなかつた所に現われる新しいゾーン
を探したり、また前回に沈降ゾーンが見つかつて
記録されている区域を走査し、前回の記録からゾ
ーンの動きや拡大の程度を探索するようにプログ
ラムされている。こうして、コンピユータは走査
の度毎にデータ処理を続ける。

時には別個の蛋白による２つの沈降ゾーンが極
めて接近し、正常に沈降が形成されたものが最後
に交差することがある。免疫電気泳動によつて作
られたゾーンでは、このようなゾーンの交差を予
測するようにプログラムされており、いつ交差が
起るかを予測して、種々のパラメータを誘導する
過程で適当な補正を行う。

測定中の蛋白が交差するような種類のものであ
れば、第１図Ｂのように各プレートがゾーン出現
の早期で、また交差が起る前に走査される。そし
てゾーンの軸とエンドポイントは確実に定位され
る。コンピユータは正規の各走査の一部として
も、実際の交差をチエツクできるようにプログラ
ムされている。例えば、各ゾーンの軸の測定点の
（ｘ、ｙ）座標を、隣りのゾーンのそれらと比較
することによつて、交差を示す特定の閾値での座
標の一致を求める。走査にはすべて、交差の可能
性のチエツクも含まれている。例えばコンピユー
タはすべてのエンドポイントを実測値以上に延長
し、隣りのゾーンの延長されたエンドポイントと
比較する。このような軸の延長は各エンドポイン
ト付近で軸の勾配方向へ、リニアに延長するとい
う簡単な方法をとつている。または、観察された
ゾーン軸を、放物線、又は他の曲線に一致させて
正しく延長するようにしてもよい。

ゾーンの交差は、また、ゾーンの軸の勾配の変
化率を計算することによつても検出できる。或い
は、ゾーンに沿つた一連の点によつて軸の曲率半
径を計算して検出することもできる。これらの関
数のなめらかな普通の変化から何ら躍び離れた値
が出ればゾーンは２つか或いはそれ以上の交差区
域を含むことを示す。

実際の交差がゾーンの半分に及ぶ時でも、交差
区域内のゾーン端部の位置を、交差していない残
り半分で観測したゾーン端部の位置を対称形と仮
定して導出することによつて、充分に正確な補正
を行うことができる。このような免疫電気泳動に
よるゾーンの２点間の対応は、抗体溝に最も近い
点Xgを中心として、その両側にｘの等しい値の
間隔の所で求められ、また直接免疫拡散を行つた
ゾーンに対しては、ゾーン軸の両側について、ｙ
の等しい値の間隔の所で求められる。交差してい
る区域内にある軸は、外挿によつて定位される。

必要に応じて更に正確な補正の方法も可能であ
る。例えば、コンピユータはゾーンの交差してい
ない半分側において選ばれた対称な点において測
定結果を調整し、ゾーンの非対称性を考慮に入れ
るようにプログラムしてある。非対称性が検知さ
れると、例えば交差する以前に観察された２点と
比較して、これらの値の間の比を求めて補正係数
とすることもできる。

その他の補正の例としては、実際に交差してい
る区域で実測された光強度値が、一部は一方のゾ
ーンによるものであり、他の一部は他のゾーンに
よるものであることを考慮に入れて補正する方法
である。コンピユータは交差区域での光強度値を
適当な値に分割するようプログラムされている。
適当な分割比を決めるためには、既に述べたよう
に、交差区域と対称な部分の夫々の値を比較すれ
ばよく、この際上述の調整は行つても、行わなく
ともよい。

可能であれば、交差区域の補正には２つかそれ
以上の別々の計算をあてはめ、その結果を平均し
て誤差を決定することが望ましい。しかし、元来
は交差の区域はゾーン全体に比べると小さな一部
にすぎない。従つて、交差の区域内で正しい値を
近似する場合の誤差は、受容できる程度のもので
あり、最終結果に大きい影響を与える程度のもの
でない。

当業者には既に述べた方法の多くの特徴は、本
発明の範囲内で種々の等価的な代替技術で実現さ
せることができることが了解されよう。

例えば、インキユベーシヨン時間について連続
的測定定を行う必要のないようなパラメータ値
は、インキユベーシヨンが平衡に達したあとで求
めることができる。このような測定はゾーンの構
成がスタテイツクで安定しており、測定を行う時
間が重大な要素でないという利点を持つている。

更にインキユベーシヨンのどの時期においても
沈降ゾーンの測定は特定の光で行うことができ
る。この方法は精密な時間測定を必要としないの
で、通常、反応が平衡に達した後において便利で
ある。

以上要するに生理学的な液体中の個々の蛋白の
濃度の真の定量的測定を行うために、免疫拡散
法、免疫電気泳動及びアナログ的手段を用いて測
定を行う方法及び装置を説明した。ここに述べた
方法を実際に使用する際には、蛋白濃度の５％又
はそれ以下の精度で測定されることが実証され
た。本発明はこのようにして広い範囲にわたつて
実験又は診断のための測定技術を提供するもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫電気泳動のプレートの図であつ
て、第１図のＡは電気泳動後の代表的な各種蛋白
の分布を示し、第１図のＢ，Ｃ，Ｄはその後の拡
散と免疫沈降反応の各段階を示している。第２図
は、スライドを測定するための装置の縦断面図で
ある。第３図は、本発明に関して、沈降ゾーンの
特性を例示する図である。第４図はゾーンエンド
ポイントと時間との代表的な関係を示すグラフで
ある。第５図はゾーン長と、時間との代表的な関
係を示すグラフである。第６図及び第７図はゾー
ン長に対する時間と蛋白濃度の代表的な関係を示
すグラフである。第８図は、未知の蛋白の既知の
蛋白を追加することによつて蛋白濃度値を誘導す
る例を示すグラフである。第９図は、本発明にお
ける電子走査装置の実施例のブロツクダイヤグラ
ムである。 ２０…プレート、２１，２２…抗原穴、２４…
抗体溝、９０，９１，９２…光学的手段、９４…
制御手段。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白を含有する抗原試料と、該抗原試料中の
   蛋白に特異的な抗体を含有する抗体源とを免疫拡
   散させて該抗原試料中の蛋白濃度を定量測定する
   方法であって、 上記蛋白及び抗体を、当初これら反応物質がい
   ずれも存在しない支持媒体の領域を通じ反応しな
   がら拡散し合うようになして、少なくとも一つの
   有限長さの細長い沈降ゾーンを形成させること
   と、 光学的手段により上記沈降ゾーンを走査して一
   部が該沈降ゾーン内に分布し一部が該沈降ゾーン
   の外に分布した二次元の配列のそれぞれの位置に
   おける沈降濃度に応答して複数の電気的信号を発
   生させることと、 上記蛋白濃度に特有な変化を表わす上記細長い
   沈降ゾーンに沿つたゾーン両端間の距離に関する
   パラメータ値を複数の上記電気的信号から電気的
   に導出することと、 上記抗原試料中の上記蛋白濃度を定量測定する
   指標を得るために、それぞれ既知の濃度の上記蛋
   白を含有する複数の対照抗原溶液の等価的な免疫
   拡散により生成された対照沈降ゾーンから導出さ
   れた基準パラメータ値と上記パラメータ値と比較
   すること を含むことを特徴とする蛋白の定量分析方法。 ２ 沈降ゾーンを走査する前記段階が、該沈降ゾ
   ーンと交差する複数の走査経路と、該沈降ゾーン
   の各端部を超えた複数の走査経路とを含み、該走
   査が相互に離間された平行な走査経路に沿つて前
   記沈降ゾーンと交差して行われ、さらに前記パラ
   メータの値を導出する段階が、それぞれの沈降ゾ
   ーン端部に隣接した走査経路を選択して前記複数
   の電気的信号を比較し、前記選択された走査経路
   の相互の距離を測定することからなる特許請求の
   範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 ３ 前記複数の電気的信号に応答して前記沈降ゾ
   ーンを表わす映像を陰極線管のスクリーン面に発
   生させることを含む特許請求の範囲第１項に記載
   の蛋白の定量分析方法。 ４ パラメータ信号を導出する前記段階が、蛋白
   濃度の増加につれて増大する第１の信号を導出す
   ること、蛋白濃度の増加につれて減少する第２の
   信号を導出すること、並びに前記第１及第２の信
   号の示差的な組合せを表わす第３の信号を組合わ
   されたパラメータ信号として導出することを含む
   特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 ５ 前記組合わされたパラメータ信号が前記第１
   の信号と第２の信号との比を表わすものである特
   許請求の範囲第４項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 ６ 前記配列が、前記沈降ゾーン内の一方の側
   と、他の沈降ゾーンと重なり合う領域内とに少な
   くともそれぞれ一つの位置を含んでおり、複数の
   電気的信号を発生する沈降ゾーンの前記走査段階
   が、前記他の沈降ゾーンと重なり合う第１のゾー
   ンの他方の側にありかつ重なり合つていない領域
   にある第２の位置における電気的信号を発生さ
   せ、さらに前記第１の位置の前記電気的信号を導
   出するために前記第２の位置信号を用いることか
   らなる特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量
   分析方法。 ７ 前記抗原試料の各部分が、各試料部分の前記
   免疫拡散に先立つて前記蛋白の異なつた既知量を
   添加することにより高濃度化されており、また、
   前記走査段階、パラメータ値の導出段階及び対照
   パラメータ値と求められたパラメータ値とを比較
   する段階が、試料部分毎に形成された沈降ゾーン
   に対して行なわれることを含む特許請求の範囲第
   １項に記載の蛋白の定量分析方法。 ８ 前記抗原試料の各部分が、該各試料部分の免
   疫拡散に先立つて異なつた既知量の前記蛋白を添
   加することによつて高濃度化され、各試料部分の
   得られた沈降ゾーンを、前記走査段階、パラメー
   タ値の導出段階、さらに添加した蛋白濃度に対し
   て各試料部分に関する前記得られたパラメータ値
   を効果的にプロツトする段階並びにもとの試料中
   の前記蛋白濃度の値を前記得られたカーブの外挿
   によつて求める段階で処理する特許請求の範囲第
   １項に記載の蛋白の定量分析方法。 ９ 前記沈降ゾーンの走査段階に先立つて前記沈
   降ゾーンを染料で染色する段階を含む特許請求の
   範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １０ 前記複数の電気的信号から、前記蛋白のあ
   る種の異常性の存在に応じて前記第１のパラメー
   タと特性的に異なるゾーンの第２のパラメータの
   相当値を電子的に送出する段階、及び前記第１の
   パラメータの値と前記第２のパラメータの値とを
   比較して前記異常性の存在を検出する段階を含む
   特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 １１ 蛋白を含有する抗原試料と、該抗原試料中
   の蛋白に特異的な抗体を含有する抗体源とを免疫
   拡散させて該抗原試料中の蛋白濃度を定量測定す
   る方法であつて、 上記免疫拡散に先立ち、上記抗原試料を、上記
   抗体源と相互に拡散する方法とは直交する方向に
   選択的な蛋白の移動を行なわせることと、 上記蛋白及び抗体を、当初これら反応物質がい
   ずれも存在しない支持媒体の領域を通じ反応しな
   がら拡散し合うようになして、少なくとも一つの
   有限長さの細長い沈降ゾーンを形成させること
   と、 光学的手段により上記沈降ゾーンを走査して一
   部が該沈降ゾーン内に分布し一部が該沈降ゾーン
   の外に分布した二次元の配列のそれぞれの位置に
   おける沈降濃度に応答して複数の電気的信号を発
   生させることと、 上記蛋白濃度に特有な変化を表わす上記細長い
   沈降ゾーンに沿つたゾーン両端間の距離に関する
   パラメータ値を複数の上記電気的信号から電子的
   に導出することと、 上記抗原試料中の上記蛋白濃度を定量測定する
   指標を得るために、それぞれ既知の濃度の上記蛋
   白を含有する複数の対照抗原溶液の等価的な免疫
   拡散により生成された対照沈降ゾーンから導出さ
   れた基準パラメータ値と上記パラメータ値と比較
   すること 含むことを特徴とする蛋白の定量分析方法。 １２ 沈降ゾーンを走査する前記段階が、該沈降
   ゾーンと交差する複数の走査経路と、該沈降ゾー
   ンの各端部を超えた複数の走査経路とを含み、該
   走査が相互に離間された平行な走査経路に沿つて
   前記沈降ゾーンと交差して行われ、さらに前記パ
   ラメータの値を導出する段階が、それぞれの沈降
   ゾーン端部に隣接した走査経路を選択して前記複
   数の電気的信号を比較し、前記選択された走査経
   路の相互の距離を測定することからなる特許請求
   の範囲第１１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １３ 前記複数の電気的信号に応答して前記沈降
   ゾーンを表わす映像を陰極線管のスクリーン面に
   発生させることを含む特許請求の範囲第１１項に
   記載の蛋白の定量分析方法。 １４ パラメータ信号を導出する前記段階が、蛋
   白濃度の増加につれて増大する第１の信号を導出
   すること、蛋白濃度の増加につれて減少する第２
   の信号を導出すること、並びに前記第１及び第２
   の信号を示差的な組合せを表わす第３の信号を組
   合わされたパラメータ信号として導出することを
   含む特許請求の範囲第１１項に記載の蛋白の定量
   分析方法。 １５ 前記組合わされたパラメータ信号が前記第
   １の信号と第２の信号との比を表わすものである
   特許請求の範囲第１４項に記載の蛋白の定量分析
   方法。 １６ 前記配列が、前記沈降ゾーン内の一方の側
   と、他の沈降ゾーンと重なり合う領域内とに少な
   くともそれぞれ一つの位置を含んでおり、複数の
   電気的信号を発生する沈降ゾーンの前記走査段階
   が、前記他の沈降ゾーンと重なり合う第１のゾー
   ンの他方の側にありかつ重なり合つていない領域
   にある第２の位置における電気的信号を発生さ
   せ、さらに前記第１の位置の前記電気的信号を導
   出するために前記第２の位置信号を用いることか
   らなる特許請求の範囲第１１項に記載の蛋白の定
   量分析方法。 １７ 前記抗原試料の各部分が、各試料部分の前
   記免疫拡散に先立つて前記蛋白の異なつた既知量
   を添加することにより高濃度化されており、ま
   た、前記走査段階、パラメータ値の導出段階及び
   対照パラメータ値と求められたパラメータ値とを
   比較する段階が、試料部分毎に形成された沈降ゾ
   ーンに対して行なわれることを含む特許請求の範
   囲第１１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １８ 前記抗原試料の各部分が、該各試料部分の
   免疫拡散に先立つて異なつた既知量の前記蛋白を
   添加することによつて高濃度化され、各試料部分
   の得られた沈降ゾーンを、前記走査段階、パラメ
   ータ値の導出段階、さらに添加した蛋白濃度に対
   して各試料部分に関する前記得られたパラメータ
   値を効果的にプロツトする段階並びにもとの試料
   中の前記蛋白濃度の値を前記得られたカーブの外
   挿によつて求める段階で処理する特許請求の範囲
   第１１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １９ 前記沈降ゾーンの走査段階に先立つて前記
   沈降ゾーンを染料で染色する段階を含む特許請求
   の範囲第１１項に記載の蛋白の定量分析方法。 ２０ 前記複数の電気的信号から、前記蛋白のあ
   る種の異常性の存在に応じて前記第１のパラメー
   タと特性的に異なるゾーンの第２のパラメータの
   相当値を電子的に送出する段階、及び前記第１の
   パラメータの値と前記第２のパラメータの値とを
   比較して前記異常性の存在を検出する段階を含む
   特許請求の範囲第１１項に記載の蛋白の定量分析
   方法。