JPS6255105B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、混合液中に存在する蛋白の定量分析
技術、特に試料の量が微量である場合における定
量分析方法に関するものである。

近年、健康及び疾病に関して蛋白の果たす役割
に関する知識が急速に発展するに及び血清、脊髄
液、細胞抽出液等の液の蛋白を迅速かつ比較的経
済的に定量測定する必要性が一般に高まつてい
る。

このような液中の蛋白は、特定の蛋白に対して
特異的な抗体によつて起こる各蛋白の沈降を利用
した免疫化学的方法によつて同定（定性分析）さ
れることが多い。このような特定の抗体は生体中
に異種蛋白（抗原）が侵入して刺激することによ
つて産生される。抗血清は、このような既知の抗
体の混合物である。ある蛋白試料を生体外で、こ
のような抗血清と反応させ、その結果得られる沈
降の存否を観察すると、試料の中にある蛋白の種
類についての有力な手がかりをつかむことができ
る。

このような免疫化学的方法を利用して蛋白の定
量分析を行なう方法としては、抗体または抗原の
一方の試薬を有するゲルの表面に他方の試薬を接
触せしめ、形成された沈澱に基づく散乱光を検知
する方法（特開昭50−107123）が知られている
が、この方法によつて得られる定量分析のための
パラメータは一つの測定点におけるゲル中の沈澱
濃度に相応する値であるから、ゲル中の拡散速度
に大きく影響されるため不正確であるとともに、
単一成分のものにしか適用できないという欠点が
ある。

したがつて、このような免疫化学的方法は蛋白
の分析においては一般的に定性的手段を考えられ
ており、定量分析に有効な具体的方法は見い出さ
れていない。

本発明の目的は、信頼性及び再現性の高い免疫
化学的方法による蛋白の定量分析方法を提供する
ことである。

また本発明の他の目的は、上記目的に加えてさ
らに多種の蛋白を含む試料の各蛋白の定量分析方
法を提供することである。

本発明の主目的は従来単なる定性的手段と考え
られていた免疫拡散法において、抗原溶液中に存
在する一種または多種の蛋白の濃度の定量値を求
めることである。

本発明は、特定の蛋白に対して特異的な抗体を
含む抗体源と抗原試料とで免疫拡散を行つて、抗
原試料中の蛋白濃度を測定する方法である。即
ち、蛋白と抗体は初めにこれらの反応物質を含ん
でいない支持媒体中で相互に拡散し、接触反応を
起こして有限長さを持つ細長い沈降ゾーンを少な
くとも一個形成し、これを定量的に測定するため
にそのゾーンの内外にわたつて分布している二次
元配列の各位置を光学的に走査し、各位置におけ
る沈降物濃度に相当する電気信号を発生させ、上
記蛋白濃度に特有な変化を表わす上記沈降ゾーン
の初出現時間に関するパラメータを、その信号か
ら電気的に誘導する。そして、その結果を、一方
で既知量の上記蛋白を含んでいる対照抗原溶液に
ついて、試料の場合と同様な免疫拡散を行って得
られた対照ゾーンから求めたパラメータ対照値と
比較する方法である。

上記の実験結果及びその結果に関する計算は、
必要に応じてマニユアルに行うこともできるし、
また光学的及び電気的走査装置を用いて、半自動
でデータを求めることもできる。また必要なデー
タ処理は、適当な容量の汎用コンピユータによつ
て全自動で行うこともできる。

本発明者らは、蛋白及び抗体を相互に拡散させ
て形成した有限長さの細長い沈降ゾーンの初出現
時間、即ち、拡散を開始してから沈降ゾーンが出
現するまでの時間が、蛋白の定量測定のための有
効なパラメータを有していることを見い出し、本
発明に至つたもので、このパラメータは、細長い
沈降ゾーンの内外に分布した二次元配列のそれぞ
れの位置において測定した複数の電気的信号から
導出された各種のパラメータ、例えば沈降ゾーン
の両端間の距離、光強度の総計値等から導出する
ことができる。沈降ゾーンの形状的因子を含んだ
これらの予備的パラメータは、蛋白の濃度に相関
しており、また、時間の関数である。したがつ
て、沈降ゾーンの初出現時間を直接測定できない
場合には、これらの予備的パラメータの値を０点
に延長（外挿）することにより初出現時間を求め
ることができる。本発明においては、相互免疫拡
散により有限長さの細長い沈降ゾーンを形成する
が、このことは蛋白の定量分析を行なう上で重要
な意味を持つ。即ち、この細長い沈降ゾーンは標
準的には対称形として現われるので、上記予備的
パラメータを導出する際にその対称性を利用し
て、各種の補正が可能となるからである。

前述した本発明において、最初の抗原の混合物
中に多種の蛋白を含む場合には、初めに、各種蛋
白間の特性の相異に比例して、上記抗体源と相互
に拡散する方向とは直交する方向に移動させるこ
とによつて一部を分画しておく。このような選択
的移動は、例えば、簡単な拡散や、電気泳動、或
いは、クロマトグラフイのような更に複雑な方法
によつても行なうことができるが、その後の免疫
拡散によつて形成される沈降ゾーンは、いずれの
方法で分画された場合にも、基本的に変らない。
例えば電気泳動の場合、異なつた蛋白間の泳動易
動度の差によつて各蛋白は電界方向に沿つて、易
動度の差に応じて移動分布する。このような初期
分画を行つた後に、蛋白は異つた方向に移動して
抗血清と接触し、一般にはアガールやアガローズ
のような適当な支持媒体中で相互拡散を行うこと
によつてその結果基本的な直線的分布を形成す
る。各蛋白の沈降ゾーンは一般に完全に分離し、
明らかに弁別される。

異つた蛋白、あるいはまた抗体の拡散易動度に
は、元来、このような沈降ゾーンをはつきり弁別
するのに足るだけの充分な差がある。ゾーンのオ
ーバラツプは一部に限られているから、ゾーンの
エンドポイントは、はつきりと弁別することがで
きる。本発明による定量法は、そのような形式の
免疫拡散に応用するのに適した方法である。

同様に、免疫拡散を行うために抗原と抗体を穴
の中に入れて、抗原と抗体が相互に移動する速度
を高めるために電気免疫拡散のような方法で電場
をかけた場合でも、その結果形成される沈降ゾー
ンは電界をかけなかつた場合と同じ基本形を保つ
ている。またもし、免疫電気泳動において免疫拡
散のステツプが、適当な電場によつて加速された
場合も、上記と同様である。従つて、本明細書に
おける免疫拡散なる語は、加速電場を伴う場合
と、伴わない場合の双方を意味している。

以下、本発明の実施例を、添付図面を参照して
説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。

免疫電気泳動は定性法として良く知られてお
り、それを行うために多種の装置が発表されてい
るがいずれも大同小異である。本発明において
は、電気泳動と、それに続く拡散と免疫反応は、
通常、光学的に透明な板の上に乗せられた数分の
１ミリメータから数ミリメータの厚さの単層ゲル
の中で行なわれる。支持媒体としては今日一般に
用いられている、pH約8.6でイオン強度が約0.1の
バルビタール緩衝液で飽和させたアガローズが用
いられる。そして試料は、ゲル層に切り込まれた
穴とか、ゲル層をキヤリアに乗せる時にモールド
して作られた穴の中に入れられる。

第１図にはプレート２０が図示してあり、その
上に電気泳動の方向と平行に延びる軸２５に沿つ
た抗体溝２４と、その両側に等間隔で配置された
円形の抗原穴２１と２２がある。穴の配置によつ
て、２種の別個の溶液又は同種の溶液の２つの試
料は、各プレートの上で同じ抗体溶液に向つて同
時に移動する。各プレートの上で２つの抗原穴の
外側に更に２つの抗体溝を追加し、更にその外側
に２つの抗原穴を追加して、プレートの容量を倍
加させてもよい。同時にして、パターンのオーバ
ーラツプを防ぐために、穴２１と２２から電気泳
動の方向に沿つて充分に離れた所に、抗原穴を追
加してもよい。

第１図Ａの陰影部２６と２８は、穴２１と２２
の中に入れられて矢印２３の方向に一定時間電気
泳動を行つた後の一対の同種の試料中にある４種
の蛋白ａ，ｂ，ｃ及びｄの代表的な分布を近似的
に示したものである。通常、すべての蛋白は、液
体媒質中では同じ方向に移動するが、溶媒自体が
純電荷を運ぶ性質を持つているため、結果として
ゲルの流れやゲルに対して電気浸透を引き起す。
従つて蛋白は穴に対して両方向に移動する。

電気泳動が終ると、溝２４に抗体が入れられ、
第１図Ａのａ，ｂ，ｃ，及びｄの蛋白とそれに対
応する抗体との相互拡散によつて沈降ゾーンが形
成される。第１図のＢ，Ｃ，Ｄは、代表的なゾー
ン出現の各段階を示している。

関係のない抗原の沈降アークは、それぞれの抗
体と反応して別個に形成されるが、充分に接近し
てくると第１図Ｄのように交差し、免疫化学的に
関係のある沈降アーク同志は連続した反応線とし
て融合する。第１図Ｃ及びＤにおける沈降ゾーン
ｄ′は、第１図Ａにおける領域ｄが、実は２つの別
個の蛋白を含んでおり、同じ電気泳動易動度を持
つている２つの蛋白であつても、別個の沈降ゾー
ンを形成する事実を例示している。ゾーンｄと
ｄ′は、２つの異つた蛋白が穴２１に入れられて、
初期の電気泳動のステツプを経ないで免疫拡散を
適用されたと考えることもできる。夫々のゾーン
エンドがはつきり分れている理由は、各蛋白或い
は抗体の拡散率が異つているためである。いずれ
の場合にも、このような各ゾーンは以下に述べる
方法を用いると別々に分析することができる。

本発明によると、免疫電気泳動による沈降ゾー
ンを、直接定量的に測定することができる。この
ような測定によつてプレート上で目的とする蛋白
の各沈降ゾーンの特定の特徴的な物理的な配置を
決めることができるし、それとともに光学的方法
によつて光強度の測定を行うこともできる。いず
れの方法に対しても、時間的要素が加えられてお
り、これが観測データの重要な要素となつてい
る。

プレート２０の上での位置測定は、例えば低倍
率の顕微鏡で行うことができる。第２図に図示さ
れているように、光源ランプ３６と黒のベルベツ
トのような吸光性の暗視野３４を持つ光源箱３０
の可変開口部３２の上にプレート２０が置いてあ
る。顕微鏡４０には対物レンズ４１、接眼レンズ
４２及び焦点面に照準用の十字線４３がついてい
る。光源箱３０の上にはダブルスライド機構４５
が載置されており、詳細に図示していないがねじ
による駆動装置４６と正確な目盛りが施されてい
て、その上に乗せられている顕微鏡の位置を２つ
の座標軸に対して正確に読み取ることができるよ
うになつている。この図では分り易くするために
１つの座標軸についてのみ示してある。通常は第
１図Ａに示されているように、ｘ軸を電気泳動の
方向、つまり抗体溝と平行に定め、座標軸の原点
を軸２５の上か、その近くに定めると便利であ
る。

光の濃淡の測定のために、顕微鏡には斜めにな
つている光束分割用のハーフミラー４８が設けて
あり、光の一部を接眼部に送り、他の部分でダイ
ヤフラム５２の上で実像を結ばせている。ダイヤ
フラム５２は、プレート２０の上で十字線４３に
一致している範囲からの光のみを、感光トランス
ジユーサ５０に送る。トランスジユーサ５０は増
幅回路５４とメータ５６に電気的に接続されてい
る。メータ５６の代りに直接眼で見てマニユアル
に記録してもよいし指令信号に応じて、自動的に
光の強弱を記録するようなプリント回路やＡＤ変
換器を接続させてもよい。第２図においては、例
えば暗視野照明の代りに、直接照明とか、ゾーン
からの反射光を直接測定できるような上からの照
明等、種々の変更が可能である。完全な自動測定
を行うための方法及び装置の実施例を以下に説明
する。

第３図はゾーンが出現した際に、本発明によつ
てゾーンの位置測定を行うために、定められた沈
降ゾーンのある特徴を図示したものである。ｙ＝
yAbにおける水平の線６１は免疫電気泳動スライ
ドの抗体溝の端である。座標Xe，Ye及びXf，Yf
における点Ｅ及びＦは展延するゾーン６０の左及
び右のエンドポイントである。

ゾーンエンドポイントＥ及びＦの他に、各ゾー
ンの中で何個所かの中間点を測定する方がよい。
第３図において座標Xg，Ygにおける１点Ｇはこ
のような点の例である。

ゾーンはｙ方向にある幅を持つているので、Ｇ
のような各中間点のｙ座標は、抗体溝に最も近い
前縁６３、ゾーンの後縁６５、或いはゾーンの中
で、光の強度の最も強い部分も含めて、１個所或
いはそれ以上の点６４を定めると便利である。

インキユベーシヨン時間の経過に伴つて、ゾー
ンが出現すると、点Ｅ，Ｆ及びＧの絶対及び相対
位置が変化する。沈降ゾーンの初出現時間T₀
は、直接観察によつて求めることは通常困難であ
り、このパラメータT₀は、時間の関数として表
わされる各種の予備的パラメータに基づいて導出
することができる。以下に説明する予備的パラメ
ータによれば、高い信頼性と再現性でパラメータ
T₀を求めることができる。時間の関数として、
第４図に例示されているXeとXfの値は蛋白濃度
と相関しており、第４図で延長線が交わる点６６
はゾーンが始めて出現した時点を表わしている。

本発明で用いられる沈降ゾーンの初出現時間に
関するパラメータを導出するための重要な予備的
パラメータの１つの座標の差（Ｘｆ−Ｘｅ）であ
り、それは特定の測定時間における沈降ゾーンの
最さＬである。第４図が表わすデータとして、第
５図にインキユベーシヨン時間に対するこのパラ
メータの変化を示してある。

第４図及び第５図において、実線は実際の実験
から求めた値をプロツトしたものである。これら
の図にはまた、実線を時間の少ない方向に向つて
延長（外挿）した値が示されている。この延長は
破線で示してある。第４図で延長線が交わる点６
６はゾーンの長さが０であつた点を表わしてい
る。第５図の延長（外挿）線は点６７で時間軸と
交わり、同様にT₀を求めることができる。この
ような延長（外挿）によつて沈降ゾーンの初出現
時間を実際的に正確に求めることができる。T₀
を定めるためのこの方法は、プレートを連続的に
常時観察する必要がないので有利な方法である。

初出現時間T₀を導出するための別の予備的パ
ラメータはゾーン内の光強度和である。単なる光
強度の読み取りだけでは、蛋白濃度を実用的に測
定することはできない。その理由は、ゾーンの形
とゾーン形成速度が変化して、ゾーンが大きくな
るにつれて、光強度が変化するからである。

一方これらの要素の変化は、適切に選ばれたい
くつかの場所において一連の光強度の読み取りを
行い、それを光強度パラメータを求めるために総
合的に処理することによつて、大幅に補償するこ
とができる。その方法は、沈降ゾーンを横切る直
線に沿つて等間隔で光強度を測ることであり、通
常ｘの特定の値においてｙ方向に行われる。この
ような一連の読み取りでは、ゾーンの両側で数個
所の光強度値を求めることが望ましい。このよう
なオフセツト値を平均して、バツクグラウンド強
度を求め、ゾーンの中における光強度値から、バ
ツクグラウンド値を差引くのに用いられる。その
結果、修正された光強度値は集計され、特定のｘ
の値においてゾーンを横切るラインに沿つた光強
度のリニアインテグラルを求めることができる。
このような直線光強度和Ixは、正規の再現可能な
方法においてインキユベーシヨン時間の増加と共
に増加し、その値はどの所定時間においても、広
い範囲の実験条件にわたつて反応する蛋白の濃度
と共に増加する傾向を持つことを見い出した。

このクロスゾーン走査によつて観察される光強
度の変化をプロツトした代表例が第９図に示され
ている。２つのカーブは以下に述べる半自動の装
置でフロツトされ、沈降ゾーンが抗体溝に最も近
い点Ｘｇにおいてｙ方向に走査されたものであ
る。第９図において、ピーク４７と７７は第１図
と同様なプレートにおいて２つの抗原穴に入れら
れたものと同じ蛋白の試料によつて抗体溝の両側
にできたゾーンによるものである。７５と７６の
２つの小さなピークは抗体溝の夫々の縁によるも
のであり、その溝から、ゾーンの特定の点までの
距離Ｄを測るのに都合の良い対照となつてい
る。。前記のように定義したパラメータIxは、本
質的には、例えば第９図のピーク７４又は７７の
下の面積に相当するものである。

第９図の２つのピーク７４と７７は人血清アル
ブミンの同じ試料によつて作られたものである。
それらは、インキユベーシヨン時間が２時間（実
線のカーブ７０）の時と、４時間（破線のカーブ
７２）の時との沈降ゾーンの成長の様子を代表的
に示している。この２組の測定の間に、ゾーンの
位置は大変安定していることがわかるが、各ピー
クの下の面積は顕著に増加している。ピーク７４
と７７のカーブは図をわかりやすくするために縦
方向に適当な距離だけずらしてあるので、、その
不一致については問題にする必要はない。

第１０図は種々の濃度の蛋白で作られたプレー
トを、同じインキユベーシヨン時間でｙ方向に走
査したものについてプロツトしてある。グラフに
よつてＡからＣに蛋白濃度が増加するにつれて、
各ピークの面積が増加し、またゾーン全体が抗体
溝の方に移動している様子が明らかに読み取れ
る。

パラメータIxが蛋白濃度の決定に極めて有用で
あることから、このような直線光強度和を数個の
ｘの値について求め、それを集計又は平均し、多
数の光強度パラメータにより求める方法によると
結果は更に向上する、その代表的な方法は直線光
強度和をＸｇ及びその両側で適当な間隔を置いて
選ばれたいくかの点について求めることである。
予め等間隔に定められた何点かの直線光強度和を
平均又は集計すると実験誤差を減らして全体とし
ての蛋白濃度測定の精度を向上させることができ
る。

その他、前述の方法において、沈降ゾーンの長
さが増加するにつれて、光強度和の計算等に含ま
れる直線光強度和の数は、プレートを走査する度
に増加する。そのための方法の一例はＸｇにおけ
る直線光強度和を定めてからＸｇの両側において
直線光強度和の値が、ある閾値以下になるまで測
定を続けることである。すべての直線光強度和の
総和は、パラメータIz（総光強度和）となり、こ
れは本質的には、沈降ゾーンを走査した時の光強
度の積分である。この近似値は機器の分解能の許
す範囲内で測定を行う度毎にｘ及びｙの変化分を
小刻みにすることによつて希望通りに向上させら
れる。Lzの幅は広い範囲の実験条件にわたつ
て、蛋白濃度の関数として、特に激しく変動す
る。その理由は濃度が増加するにつれて、ｘ、ｙ
両方の寸法が増加し、またゾーンの平均光強度も
増加する傾向を持つからである。蛋白濃度に対す
るこの強い依存性のゆえに直線光強度和の総和で
あるパラメータIzは濃度測定ための判定条件とし
て、特に効果的である。

分析される試料について、１つかそれ以上のパ
ラメータを求めるための実験値が得られると、こ
れらの値は、各蛋白の標準値を適当に組合せた値
と比較される。これらの標準値は既知量の目的の
蛋白を含む一連の溶液を用いて、測定と同じ条件
下で作られたものである。このような標準値の組
合せを得るために、このような標準蛋白溶液を用
いて標準操作を行い、各プレートの対応する点
で、インキユベーシヨンの進行につれて、引続い
て測定を行う。標準操作は、すべての条件をでき
るだけその標準が適用されるべき測定操作と同じ
状態で行うことが望ましい。事実、対照値は、各
測定操作に対して個々に対応する独特なものであ
ることが望ましい。しかし日常の測定において前
回の測定で対照曲線の勾配が既知であるような場
合には、１回の標準操作で充分なこともある。

希望するパラメータの標準値は、各濃度につい
て、このような標準操作を数回行つて導出され
る。こうして測定されたパラメータの標準値は、
従つて、濃度と時間の双方の関数であると考えら
れる。個々の直線光強度和Ixを別々に考える場合
には、全部を測定するために、ｘの値の明細が必
要になる。

パラメータとしてゾーンの初出現時間を用いる
と、標準値T₀が変数としての時間を含まないと
いう利点がある。即ち、これまでに述べた方法で
T₀を決めるには、ある特定の時間で、何回かに
わたつて測定をしなければならない。しかしこれ
らの測定によつて一旦T₀が定まつてしまうと、
各測定値は不要になつてしまう。こうして、T₀
の値は、蛋白濃度の関数としてプロツトされ、１
つの標準曲線を得ることができる。このような曲
線は第６図に図示されている。これは第４図及び
第５図に関して述べた外挿法によつて、各濃度に
ついての値を求めることによつて作られたもので
ある。第６図の曲線によつて、未知の蛋白のT₀
がわかりさえすれば濃度値を直接読み取ることが
できる。

例えば、Ｌ，Ix，Izのような予備的パラメータ
の場合、標準曲線を作ることは、より間接的にな
る。これらの値は、測定が行なわれた時間に関係
しているので、対照標準は時間の範囲をカバーす
るように作らなければならない。すべての濃度に
対して同時にデータを測ることは困難である。従
つて各測定値は測定の時間に関連を持たせて、各
蛋白濃度の最終的な標準値を時間の関数として
別々の曲線にプロツトする。

第７図及び第１１図はこのようなグループの代
表例であつて、３つの濃度に対する各パラメータ
の標準値が時間軸に対してプロツトされている。
これらの曲線を、それぞれＬ＝０、Lz＝０の方
向に延長したものがT₀の標準値を与え、それに
よつて第６図のT₀がプロツトされ、或いは第６
図と比較するためのT₀の実験値を与えることが
できる。第７図及び第１１図には、任意の時間
t₁，t₂及びt₃で垂直な線が引いてある。これらの
Ｌ，Izの各値は濃度の関数の別々の曲線として再
プロツトすることができる。その結果得られた一
組の曲線の組合せは、それぞれの時間に対して、
蛋白濃度の関数としてＬ及びIzを示している。
この組合せはそれぞれ第８図及び第１２図に示さ
れている。

本発明の他の特徴は、正確度を改善することに
あり特に測定しようとする試料中の目的の蛋白の
一種又はそれ以上の濃度が比較的低い場合に有効
である。そのような場合には試料溶液にそのよう
な蛋白の既知量を整数比でいくつか補足すること
が望ましい。そして、その溶液と既知量の蛋白を
含む標準とを並行して測定操作を行うのである。
夫々の溶液に対して所要のパラメータを求めるた
めの値が必要であれば、時間に対して上に述べた
補間によりすべての時間について求めることがで
きる。正規の標準について得られたパラメータ値
Ｐを第１３図のカーブ８０に示すように通常の方
法で蛋白濃度に対してプロツトする。同様にもと
の抗原試料及び既知量の蛋白を加えた一部に対す
るＰの値を各点ｈ，ｉ，ｊ及びｋに対して、あた
かもその溶液が追加された蛋白だけしか含んでい
なかつたようにプロツトされる。従つて、もとの
試料に対する値ｈは、濃度が０の位置にプロツト
される。これらの点を通つて曲線８１が引かれ
る。このデータの処理例では、もとの試料の蛋白
濃度は数種の方法で計算することができ、いずれ
も基本的には同じ値を与えてくれるはずである。
こうして希望する数種の方法を用いて計算し、結
果の平均を採ればよい。

まず、ｈから水平に延長して曲線８０とｈ'で交
わる直線はＣｈで示されている値の濃度を示す。
これは先に述べた一般の比較法に相当する。更に
同様にして、ｉ，ｊ及びｋから、直線８０に交わ
るように引いた延長線は、ｉ→ｉ'，ｊ→ｊ'及びｋ
→ｋ'の直線の長さに応じて濃度を与えてくれ、そ
れらの長さは、論理的にはすべて同じである。も
しｈにおけるＰの値が何らかの理由、例えば観察
したゾーンが不明瞭なために不確実である場合に
は、４つのすべての間隔の平均によつて、信頼で
きる値を得ることができる。

もう１つの方法は、ｈにおける測定の不正確を
改善できるばかりでなく、もとの試料中の蛋白の
濃度が、測定可能な沈降線を形成するのに必要な
限界値以下であるような場合にも、値を求めるこ
とができるという利点を持つている。後者の場
合、曲線８１の上の蛋白は得られた点ｉ，ｊ及び
ｋを結んで得られ、更にＰ軸の方に延長（外挿）
され、ｈにおけるＰを決める。このように曲線８
１を延長する際に曲線８０はガイドとして役に立
つ。例えば第１３図の曲線８０は、それが点ｉ，
ｊ及びｋを表わすようになるまで全体として左に
移動させたものである。こうして移動させた曲線
８０とＰ軸との交点は点ｈの値を与え、それから
濃度Ｃｈを求めることができる。また曲線８１を
横軸の負側−Chまで延長すると、濃度値Chに合
致する濃度を直接読み取ることができる。

上に述べた補足された標準線８１による方法
は、実験用及び対照用として、同じ溶液が使える
という大きな利点を持つている。特にその試料が
特定の病気の患者の人血清である場合には、この
利点によつて標準線を延長することによるいかな
る小さな誤差も解消することができる。種々の量
の蛋白を補足した試料の数を増やすことによつ
て、第１３図に示してある３点のみならず、数個
所で測定を行うことによつて、この外挿の信頼性
はほとんど無制限に向上させることができ、含ま
れる測定誤差についての正しい認識を得ることが
できる。

本発明はまた、抗原試料中のある種の蛋白の異
常を自動的に検出することができる。例えば正常
及び異常ガンマグロブリンは両者の間で、通常、
免疫拡散及び電気泳動易動度の範囲に僅かの差を
持つていて、しかも同じ抗体と反応し、異常な沈
降ゾーンを形成して一般にゾーンの長さに沿つて
非対称に分布する沈降を形成する。このような異
常性は、直線光強度和Ixの測定値を、例えばＸの
異なつた値と比較して検出することができる。非
対称性とかその他のこのような値の異常性を観察
することによつて異常が発生していることを知る
ことができる。そしてこの異常性は、もしＸのあ
る値において数個の独立した測定が行われ、また
測定誤差を計算した結果が統計的に顕著な変化を
示したら異常の存在が示されたことになる。

この方法は目的とする異常に対して、異なつた
応答をするようなパラメータについて、実測で得
られた値を比較するという一般的な方法の特別な
ケースであると考えられる。このような挙動を示
すある種のパラメータに対しては、夫々のパラメ
ータの測定値に相当する蛋白濃度値を比較する方
が、パラメータ値自体を直接比較するよりも効果
的である。例えば異常ガンマグロブリンの存在に
よつて上述のようにゾーンに沿つて起る光強度の
異常分布は、通常の場合よりもゾーンの出現を速
め、その結果として濃度の計算値が高くなるが、
一方総光強度和Izは、正常及び異常蛋白に対して
ほぼ等濃度値を示す傾向にある。このようにして
ゾーンの初出現時間T₀によつて得られる濃度値
と、Izによつて得られる濃度値の間の顕著な不一
致が、異常蛋白の存在を表示する。

異常蛋白の存在に対して、鋭敏に応答するその
他のパラメータは、ゾーンの軸方向の曲率であ
る。異常の存在によつて、ゾーンの長さ方向に沿
つた曲率は、異常に且つ非対称に変化する傾向が
あり一方全体としての曲率は正常以下になる傾向
がある。

例えば上述の光強度、又は、位置パラメータの
ように、２つ或いはそれ以上のパラメータの特異
な関数から成る多価パラメータを用いると更に有
利である。

２つのパラメータの導関数もパラメータとして
有利であり、一方は蛋白濃度の増加に伴つて増加
し、一方は低下する。こうしてこれらのパラメー
タの商とか、差を用いると、それらを個々に用い
るよりも、濃度に対して鋭い依存性を持つパラメ
ータを得ることができる。

ゾーンの初出現時間T₀は、蛋白濃度に対して
逆の関係を持つている例であり、特にこのような
商を求める際に利用できる。ｘ軸の任意に希望す
る値Ｘｇにおける抗体溝とゾーンとの距離もま
た、蛋白濃度と逆の関係を持つており、このよう
な商もパラメータとして用いられる。一般的に
は、濃度に直接依存するパラメータを、濃度に逆
依存するパラメータで割算しその結果の多価パラ
メータが、濃度に対して逆依存でなく、直線依存
となるようにする方がよい。

未知の試料について、実測によつて定められた
多価パラメータに対して比較のために適した対照
値は、既に述べたように、各成分のパラメータの
対照値から導出することができる。

既述の如く、位置及び光強度の測定やパラメー
タの誘導は、直接観察やマニユアルな方法で行う
ことができるが、本発明の特徴として、これらの
操作は特に一部又は全体を自動化するのに適して
いるということである。

本発明に必要な測定を行うについて、特に便利
で有効な方法は、スライドを光学的に走査する方
法であつて、テレビカメラのように、電荷結合型
走査装置又は、それと同等な方法で走査範囲の２
次元の組合せの見かけ上の光強度を表わすような
ビデオ信号を得る方法である。各エレメントの信
号は一般にデジタル変換され、プレート上の位置
に対応するｘ及びｙ座標、或いは測定時間と共に
電気的に記憶される。このような位置全体の信号
の組合せ又は、特定の位置の信号は、その後のデ
ータ処理に際して、呼び出すことができる。また
スライド上の像のいかなる部分でもＣＲＴ又はそ
れに相当するような方法で、走査中又はその後を
問わず表示することができる。走査や映像の記
憶、再生や像の特定の点をデジタル信号として抽
出するシステムは、エレクトロニクス技術では既
知の方法であり、この要求に合うような形で購入
することができる。

第１４図は、このような装置の一例を図示する
もので、テレビカメラ９０はレンズ９１によつて
カメラの感光面、モニタＣＲＴ９２、走査コント
ロール装置９４及び汎用コンピユータ１００にプ
レート２０の像を結ばせる。レンズ９１の調整に
よつてプレート２０は任意の倍率で像を作ること
ができる。プレートの任意の位置を中心にもつて
くるためには、例えば第２図の光源箱３０のよう
な照明付の支持台の上でプレートの位置を変えた
りカメラ回路で従来の電子的なバイアス制御を行
つてもよい。

特に、もし走査装置としてモニターＣＲＴに同
期した走査機構を用いることができるならば、ス
クリーン上での両座標軸方向の動きが連続的に等
しいような細かいステツプで機構を駆動すること
ができる。像は面積要素に分割され、例えばｘと
ｙ座標によつて識別される。マニユアル又は半自
動操作のために、モニター表示器には通常カーソ
ルがついており、電子的に作られた輝点が、各走
査毎にスクリーン上で面積要素からビデオ信号が
抽出されている位置を示す。オペレータのために
マニユアルでコントロールできるスイツチがあ
り、目で見ながらカーソルを自由に動かすことが
できる。装置はまた、デジタルなコマンドアドレ
スによるｘ及びｙ座標の値に応じて、カーソルを
直接希望の点に合わせることもできる。このよう
な信号はマニユアルでも、又は汎用コンピユータ
によるプログラムからでも得ることができる。

第１４図に例示されるようにカウンタ１０２は
クロツク１０３からのパルスを計数し、分岐線１
０４に連続的にｘ座標を表わすデジタル信号を与
える。回路１０６はライン１０７にその信号に応
じてｘ座標の最小単位毎のアナログのステツプ状
電圧を発生させる。分割回路１０８はｘ軸方向の
ビームの走査計数を行ない分岐線１０９に各掃引
毎にｙ座標を表わすデジタル信号を与える。回路
１１０はこの計数に応じて、ｙ座標の最小単位毎
のアナログのステツプ状電圧を、ライン１１１に
送り出す。ライン１０７と１１１のステツプ電圧
は、カメラ９０とＣＲＴ９２のｘ及びｙ方向の走
査を制御し、両者の同期状態を保つ。カメラ９０
からのビデオ信号は、ライン１１２を経てモニタ
ーＣＲＴ９２に送られ、スクリーン面でスライド
２０の光強度の変化を再現する。

選択回路１１８は通常Ｘ及びＹカウンタから成
つており、１１９で示される操作桿を手動で動か
すと、１個又は何個かのパルスを計数して上下に
カウントアツプ又はカウントダウンする。その結
果のデジタル信号は測定対象となつている場所の
ｘ及びｙ座標を表わし、レジスタ１１７に記憶さ
れる。比較回路１１４は、レジスタ１１７からの
特定の測定対象位置の座標とライン１０４と１０
９から走査ビームのｘ及びｙ座標を常に比較す
る。走査スポツトが記憶されていた位置（アドレ
ス）に来ると、通常各走査について１回ずつ、比
較回路１１４からスイツチング回路１２０に動作
信号が送られる。こうしてレジスタ１２５はその
ライン１２３にスライド上の特定された測定点を
走査した時の光強度に相当するデジタル信号を受
ける。回路１１４からの動作信号はカーソルコン
トロース回路１２６にも送られ、ビデオ信号に光
強度変調パルスを重畳して、１２７で示されるよ
うに、モニタースクリーン上で選択された点を識
別させる。

レジスタ１２５はまたライン１１５と１１６か
らｘ及びｙ座標信号を受け、また時間回路１２８
によつて作られた連続的な時間信号を受ける。こ
れらの信号は全てレジスタ１２５に蓄えられ、ラ
イン１２９からのマニユアルコントロール、又は
ライン１３０からのコンピユータコントロールに
よる読取り信号に応じコンピユータ１００に送ら
れる。

コンピユータ１００は測定点を個々に識別し、
またどのようなプログラムの要求にも応じてプレ
ート２０のスポツトの入力情報を受け入れる。こ
のような測定方法は、回路的には選択回路１１
８、レジスタ１１７及び比較回路１１４と似てお
り、選択回路１１８は測定点の動きの方向を選択
的に指示したり、必要な位置のデジタルアドレス
を指示する電気信号に従つて動作する。このよう
な装置を２つ作るよりも、第１４図に示すよう
に、スイツチ１３３がマニユアルからオートマチ
ツクの方に切替えられると、操作桿１１９は切り
離されて、選択回路１１８は分岐線１３２を経て
コンピユータ１００によつてコントロールされ
る。コンピユータ１００によるこのようなコント
ロールをするために、既に述べたようにコンピユ
ータ１００には位置や光強度の測定や、一般のパ
ラメータ誘導のプログラムが組み込まれている。

ゾーンを自動的に走査するために、プレートは
インキユベーシヨンチヤンバから適当に照明され
て、正確に定められた走査位置に移される方がよ
い。特に光学走査装置が電荷結合装置のように軽
量でコンパクトな場合には、例えば免疫拡散や免
疫電気泳動のプレートが並んでいる上で２次元方
向に動くことのできるプラツトホーム上に走査装
置を取付ける方が望ましい。このようにすると、
走査装置を用いて抗原や抗体を穴や溝に入れる目
的にも使用することができる。その目的でデジタ
ル信号でコントロールできるピペツトが走査装置
から少し外れたところに取付けてある。走査装置
からのビデオ信号は、コンピユータに送られ、コ
ンピユータは個々の穴の形を識別したり、自動読
取りによる識別ができるようにプログラムされて
いる。走査装置のピペツトを取付けたプラツトホ
ームがコンピユータコントロールによつてプレー
トの上を動き、走査軸が、ある定められた抗原穴
の上に正しく来た時に停止することができる。そ
れからプラツトホームは、ピペツトが丁度穴の上
に来るように定められたある距離だけ移動し、一
定量の試料が正しく穴の中に注入される。

こうして各操作毎に適当にピペツトを洗いなが
ら全ての穴の中に抗原溶液が注入されると、電気
泳動が始まる。同様にして電気泳動が終つた後
で、或いは電気泳動を行わない場合には抗原穴に
抗原を入れた直後に、この装置によつて抗体溝に
抗体が入れられる。一定時間の拡散の後に同じ走
査装置が、プレートの組合せの上に沈降ゾーンの
上を動いて走査を行う。

走査装置の走査能力はまた、穴に試料を注入す
る前にも発揮される。コンピユータは抗原穴と抗
体溝の相対位置を測定するようにプログラムされ
ており、プレートの中で穴や溝の相対位置や寸法
の正しくないものを記憶している。そして規格か
ら大きく外れたものは、試料注入の段階で排除さ
れ、規格から僅かにずれたものについては、最終
的にパラメータを誘導する段階で、自動的に補正
される。

最初のゾーンの走査過程は、ゾーンの形成が予
想される区域の上で測定のｘの値と、一定の間隔
で移動するｙの値によつて、連続的に測定される
アドレスからのビデオ信号を得るために、コンピ
ユータによつてコントロールされる段階である。
レジスタ１２５から受け入れたビデオ光強度値
は、各測定点毎にｘ，ｙ及びｔがデータとして記
憶される。このような各々のｙ走査が終ると、ｘ
座標は一定間隔だけ移動し、同様にｙ走査が行な
われて結果が記録され、目的の全区域をカバーす
るまでこれをくり返す。測定された各光強度値は
通常前回に測定され、記憶された値と比較され
る。もし測定された光強度がバツクグラウンド領
域の閾値以上であれば沈降ゾーンの存在を示すよ
うに定められている。また各々のｙ走査について
も、ゾーンを横切る時の最高光強度が定められ記
憶されていて、等間隔なｘの値に対する一連のｙ
の値から、ゾーンの軸が確定される。各ゾーンの
エンドポイントはｘの各方向において、光強度の
最高点（ピーク）が認められるようなｘの最端値
によつて認識される。更に精密な位置測定が必要
な場合にはエンドポイント付近の一定区域で、
ｘ，ｙの間隔を更に細かくして走査するようプロ
グラムされる。

このように位置し、記録された実際の沈降ゾー
ンに対して記録されたデータに直接数学的な処理
を施し、ｙ方向にゾーンを横切る各走査に対し
て、上述の直線光強度和であるパラメータIxを得
る。そしてこれらの各値の総和を求めるとそのゾ
ーンに対する総光強度和パラメータIzになる。ゾ
ーンエンドのｘ値と引き算するとパラメータＬに
なる。その他のパラメータは要求に応じて適当な
計算によつて求められる。

上記の測定は、１つ又はそれ以上の未知の試料
とそれに関する上記のくつかの標準溶液を含
み、未知の試料についての判定が完全にできるよ
うなプレートの１セツトについて単位測定として
行うのが望ましい。このようなプレートのセツト
の各走査の後にコンピユータは、沈降ゾーンが見
つかつた各蛋白の濃度を導出する。もしも既に述
べたように、多数の標準測定が含まれている場合
は、考えられる測定濃度は各々計算された濃度値
について求められる。コンピユータによつてこの
ような計算を行うことは既知である。試料の中に
各蛋白の濃度から、いつくかの独立した測定を行
うことができる。一般には異なつたいくつかのパ
ラメータを参考にして予想される誤差に従つて重
みづけをして平均を求める。

もし、その平均値に対する誤差の計算値が、測
定中の試料に対して一定の範囲内に収まれば、そ
れ以上他の測定を行う必要はない。コンピユータ
はそれによつて一般のプリントアウトか最終結果
の記録をしたりプログラムに必要なできるだけ多
くのオリジナルデータの収集を行う。例えば、解
析を依頼した医師がすべてのデータを磁気テープ
などに入れて将来の参考のために要求することも
できる。また免疫拡散を行つたプレートの写真
を、モニターＣＲＴを通して、又は直接にでも撮
ることができる。通常、蛋白の濃度が高くない場
合には、１サイクルの走査で、対象とする蛋白の
濃度を決めるのは良くない。ある時間、即ち数分
から１時間或いはそれ以上の時間、インキユベー
シヨンを追加した後、以上の走査をくり返し、測
定用のプレートと、それに対応する標準用プレー
トが走査される。コンピユータは通常前回の走査
ではゾーンがなかつた所に現われる新しいゾーン
を探したり、また前回に沈降ゾーンが見つかつて
記録されている区域を走査し、前回の記録からゾ
ーンの動きや拡大の程度を探索するようにプログ
ラムされている。こうして、コンピユータは走査
の度毎にデータ処理を続ける。

時には別個の蛋白による２つの沈降ゾーンが極
めて接近し、正常に沈降が形成されたそのが最後
に交差することがある。免疫電気泳動によつて作
られたゾーンでは、このようなゾーンの交差を予
測するようにプログラムされており、いつ交差が
起るかを予測して、種々のパラメータを誘導する
過程で適当な補正を行う。

測定中の蛋白が交差するような種類のものであ
れば、第１図Ｂのように各プレートがゾーン出現
の早期で、まだ交差が起る前に走査される。そし
てゾーンの軸とエンドポイントは確実に定位され
る。コンピユータは正規の各走査の一部として
も、実際の交差をチエツクできるようにプログラ
ムされている。例えば、各ゾーンの軸の測定点の
ｘ，ｙ座標を、隣りのゾーンのそれらと比較する
ことによつて、交差を示す特定の閾値での座標の
一致を求める。走査にはすべて、交差の可能性の
チエツクも含まれている。例えばコンピユータは
すべてのエンドポイントを実測値以上に延長し、
隣りのゾーンの延長されたエンドポイントと比較
する。このような軸の延長は各エンドポイント付
近で軸の勾配方向へ、リニアに延長するという簡
単な方法をとつている。または、観察されたゾー
ン軸を、放物線、又は他の曲線に一致させて正し
く延長するようにしてもよい。

ゾーンの交差は、また、ゾーンの軸の勾配の変
化率を計算することによつても検出できる。或い
は、ゾーンに沿つた一連の点によつて軸の曲率半
径を計算して検出することもできる。これらの関
数のなめらかな普通の変化から何か躍び離れた値
が出ればゾーンは２つか或いはそれ以上の交差区
域を含むことを示す。

実際の交差がゾーンの半分に及ぶ時でも、交差
区域内で観測した光強度値を、交差していない残
り半分で観測した光強度値で置換することによつ
て、充分に正確な補正を行うことができる。この
ような免疫電気泳動によるゾーンの２点間の対応
は、抗体溝にも最も近い点Ｘｇを中心として、そ
の両側にｘの等しい値の間隔の所で求められ、ま
た直接免疫拡散を行つたゾーンに対しては、ゾー
ン軸の両側について、ｙの等しい値の間隔の所で
求められる。交差している区域内にある軸は、外
挿によつて定位される。

必要に応じて更に正確な補正の方法も可能であ
る。例えば、コンピユータはゾーンの交差してい
ない半分側において選ばれた対称な点において測
定結果を調整し、ゾーンの非対称性を考慮に入れ
るようにプログラムしてある。非対称性が検知さ
れると、例えば交差する以前に観察された２点と
比較して、これらの値の間の比を求めて補正係数
とすることもできる。

その他の補正の例としては、実際に交差してい
る区域で実測された光強度値が、一部は一方のゾ
ーンによるものであり、他の一部は他のゾーンに
よるものであることを考慮に入れて補正する方法
である。コンピユータは交差区域での光強度値を
適当な値に分割するようプログラムされている。
適当な分割比を決めるためには、既に述べたよう
に、交差区域と対称な部分の夫々の値を比較すれ
ばよく、この際上述の調整は行つても、行わなく
ともよい。

可能であれば、交差区域の補正には２つかそれ
以上の別々の計算をあてはめ、その結果を平均し
て誤差を決定することが望ましい。しかし、元来
は交差の区域はゾーン全体に比べると小さな一部
にすぎない。従つて、交差の区域内で正しい値を
近似する場合の誤差は、受容できる程度のもので
あり、最終結果に大きい影響を与える程度のもの
でない。

また上述の交差の各タイプに対しても、交差に
影響されないゾーンの部分によつて得られた予備
的パラメータを用いることもできる。即ち、免疫
電気泳動に近い方法に対しては、ゾーンの中央付
近での測定が適しており、直接免疫拡散に近い方
法に対してはゾーンエンド付近での測定が適して
いる。

当業者には既に述べた方法の多くの特徴は、本
発明の範囲内で種々の等価的な代替技術で実現さ
せることができることが了解されよう。

例えば、インキユベーシヨンのどの時期におい
ても沈降ゾーンの測定は特定の光で行うことがで
きる。この方法は精密な時間測定を必要としない
ので、通常、反応が平衡に達した後において便利
である。

以上要するに生理学的な液体中の個々の蛋白の
濃度の真の定量的測定をうために、免疫拡散法、
免疫電気泳動及びアナログ的手段を用いて測定を
行う方法及び装置を説明した。ここに述べた方法
を実際に使用する際には、蛋白濃度の５％又はそ
れ以下の精度で測定されることが実証された。本
発明はこのようにして広い範囲にわたつて実験又
は診断のための測定技術を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫電気泳動のプレートの図であつ
て、第１図のＡは電気泳動後の代表的な各種蛋白
の分布を示し、第１図のＢ，Ｃ，Ｄはその後の拡
散と免疫沈降反応の各段階を示している。第２図
は、スライドを測定するための装置の縦断面図で
ある。第３図は、本発明に関して、沈降ゾーンの
特性を例示する図である。第４図はゾーンエンド
ポイントと時間との代表的な関係を示すグラフで
ある。第５図はゾーン長と、時間との代表的な関
係を示すグラフである。第６図はゾーンの初出現
時間と蛋白濃度との代表的な関係を示すグラフで
ある。第７図及び第８図はゾーン長に対する時間
と蛋白濃度の代表的な関係を示すグラフである。
第９図は２種のインキユベーシヨン時間におい
て、沈降ゾーンの濃淡を走査した実例を示すグラ
フである。第１０図は各蛋白濃度が形成する沈降
ゾーンの濃淡を走査したグラフである。第１１図
はパラメータIzと時間との関係の一例を表わすグ
ラフである。第１２図はパラメータIzと、蛋白濃
度におけるパラメータdIz／dtの関係例を示すグ
ラフである。第１３図は、未知の蛋白に既知の蛋
白を追加することによつて蛋白濃度値を誘導する
例を示すグラフである。第１４図は、本発明にお
ける電子走査装置の実施例のブロツクダイヤグラ
ムである。 ２０……プレート、２１，２２……抗原穴、２
４……抗体溝、９０，９１，９２……光学的手
段、９４……制御手段。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白を含有する抗原試料と、該抗原試料中の
   蛋白に特異的な抗体を含有する抗体源とを免疫拡
   散させて該抗原試料中の蛋白濃度を定量測定する
   方法であつて、 上記蛋白及び抗体を、当初これら反応物質がい
   ずれも存在しない支持媒体の領域を通じ反応しな
   がら拡散し合うようになして、少なくとも一つの
   有限長さの細長い沈降ゾーンを形成させること
   と、 光学的手段により上記沈降ゾーンを走査して一
   部が該沈降ゾーン内に分布し一部が該沈降ゾーン
   の外に分布した二次元の配列のそれぞれの位置に
   おける沈降濃度に応答して複数の電気的信号を発
   生させることと、 上記蛋白濃度に特有な変化を表わす上記沈降ゾ
   ーンの初出現時間に関するパラメータ値を複数の
   上記電気的信号から電子的に導出することと、
   上記抗原試料中の上記蛋白濃度を定量測定する
   指標を得るために、それぞれ既知の濃度の上記蛋
   白を含有する複数の対照抗原溶液の等価的な免疫
   拡散により生成された対照沈降ゾーンから導出さ
   れた基準パラメータ値と上記パラメータ値と比較
   すること を含むことを特徴とする蛋白の定量分析方法。 ２ 前記沈降ゾーンの走査段階が該沈降ゾーンの
   出現に従つて複数の特定された時間で反覆され、
   前記パラメータの値を導出する段階が、前記走査
   の度毎に前記複数の電気的信号から、時間の関数
   として特性的に変化するとともに前記沈降ゾーン
   の初出現時間において既知の値をとる第２のパラ
   メータの値を導出し、さらに前記第２のパラメー
   タの値が前記既知の値に復元する時間を外挿して
   初出現時間を導出することからなる特許請求の範
   囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 ３ 前記第２のパラメータが沈降ゾーンの複数の
   端部間の距離からなる特許請求の範囲第２項に記
   載の蛋白の定量分析方法。 ４ 前記第２のパラメータがゾーン内の光強度和
   からなる特許請求の範囲第２項に記載の蛋白の定
   量分析方法。 ５ 前記複数の電気的信号に応答して前記沈降ゾ
   ーンを表わす映像を陰極線管のスクリーン面に発
   生させることを含む特許請求の範囲第１項に記載
   の蛋白の定量分析方法。 ６ 沈降ゾーンを走査する前記段階が、該沈降ゾ
   ーンの出現する複数の時間に繰返され、前記複数
   の電気的信号が多数の前記位置における光強度の
   測定値、各測定値に対応する前記各位置及びその
   時点におけるｘ座標値及びｙ座標値を表わす特許
   請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 ７ パラメータ信号を導出する前記段階が、蛋白
   濃度の増加につれて増大する第１の信号を導出す
   ること、蛋白濃度の増加につれて減少する第２の
   信号を導出すること、並びに前記第１及び第２の
   信号の示差的な組合せを表わす第３の信号を組合
   わされたパラメータ信号として導出することを含
   む特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析
   方法。 ８ 前記組合わされたパラメータ信号が前記第１
   の信号と第２の信号との比を表わすものである特
   許請求の範囲第７項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 ９ 前記配列が、前記沈降ゾーン内の一方の側
   と、他の沈降ゾーンと重なり合う領域内とに少な
   くともそれぞれ一つの位置を含んでおり、複数の
   電気的信号を発生する沈降ゾーンの前記走査段階
   が、前記他の沈降ゾーンと重なり合う第１のゾー
   ンの他方の側にありかつ重なり合つていない領域
   にある第２の位置における電気的信号を発生さ
   せ、さらに前記第１の位置の前記電気的信号を導
   出するために前記第２の位置信号を用いることか
   らなる特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量
   分析方法。 １０ 前記抗原試料の各部分が、各試料部分の前
   記免疫拡散に先立つて前記蛋白の異なつた既知量
   を添加することにより高濃度化されており、ま
   た、前記走査段階、パラメータ値の導出段階及び
   対照パラメータ値と求められたパラメータ値とを
   比較する段階が、試料部分毎に形成された沈降ゾ
   ーンに対して行なわれることを含む特許請求の範
   囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １１ 前記抗原試料の各部分が、該各試料部分の
   免疫拡散に先立つて異なつた既知量の前記蛋白を
   添加することによつて高濃度化され、各試料部分
   の得られた沈降ゾーンを、前記走査段階、パラメ
   ータ値の導出段階、さらに添加した蛋白濃度に対
   して各試料部分に関する前記得られたパラメータ
   値を効果的にプロツトする段階並びにもとの試料
   中の前記蛋白濃度の値を前記得られたカーブの外
   挿によつて求める段階で処理する特許請求の範囲
   第１項に記載の蛋の白定量分析方法。 １２ 前記沈降ゾーンの走査段階に先立つて前記
   沈降ゾーンを染料で染色する段階を含む特許請求
   の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方法。 １３ 前記複数の電気的信号から、前記蛋白のあ
   る種の異常性の存在に応じて前記第１のパラメー
   タと特性的に異なるゾーンの第２のパラメータの
   相当値を電子的に送出する段階、及び前記第１の
   パラメータの値と前記第２のパラメータの値とを
   比較して前記異常性の存在を検出する段階を含む
   特許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 １４ 前記第２のパラメータがゾーン内の光強度
   和からなり、前記第１及び第２のパラメータ値が
   これらの値から導出された各蛋白濃度によつて比
   較される特許請求の範囲第１３項に記載の蛋白の
   定量分析方法。 １５ 蛋白を含有する抗原試料と、該抗原試料中
   の蛋白に特異的な抗体を含有する抗体源とを免疫
   拡散させて該抗原試料中の蛋白濃度を定量測定す
   る方法であって、 上記免疫拡散に先立ち、上記抗原試料を、上記
   抗体源と相互に拡散する方向とは直交する方向に
   選択的な蛋白の移動を行なわせることと、 上記蛋白及び抗体を、当初これら反応物質がい
   ずれも存在しない支持媒体の領域を通じ反応しな
   がら拡散し合うようになして、少なくとも一つの
   有限長さの細長い沈降ゾーンを形成させること
   と、 光学的手段により上記沈降ゾーンを走査して一
   部が該沈降ゾーン内に分布し一部が該沈降ゾーン
   の外に分布した二次元の配列のそれぞれの位置に
   おける沈降濃度に応答して複数の電気的信号を発
   生させることと、 上記蛋白濃度に特有な変化を表わす上記沈降ゾ
   ーンの初出現時間に関するパラメータ値を複数の
   上記電気的信号から電子的に導出することと、 上記抗原試料中の上記蛋白濃度を定量測定する
   指標を得るために、それぞれ既知の濃度の上記蛋
   白を含有する複数の対照抗原溶液の等価的な免疫
   拡散により生成された対照沈降ゾーンから導出さ
   れた基準パラメータ値と上記パラメータ値と比較
   すること を含むことを特徴とする蛋白の定量分析方法。 １６ 前記沈降ゾーンの走査段階が該沈降ゾーン
   の出現に従つて複数の特定された時間で反覆さ
   れ、前記パラメータの値を導出する段階が、前記
   走査の度毎に前記複数の電気的信号から、時間の
   関数として特性的に変化するとともに前記沈降ゾ
   ーンの初出現時間において既知の値をとる第２の
   パラメータの値を導出し、さらに前記第２のパラ
   メータの値が前記既知の値に復元する時間を外挿
   して初出現時間を導出することからなる特許請求
   の範囲第１５項に記載の蛋白の定量分析方法。 １７ 前記第２のパラメータが沈降ゾーンの複数
   の端部間の距離からなる特許請求の範囲第１６項
   に記載の蛋白の定量分析方法。 １８ 前記第２のパラメータがゾーン内の光強度
   和からなる特許請求の範囲第１６項に記載の蛋白
   の定量分析方法。 １９ 前記複数の電気的信号に応答して前記沈降
   ゾーンを表わす映像を陰極線管のスクリーン面に
   発生させることを含む特許請求の範囲第１５項に
   記載の蛋白の定量分析方法。 ２０ 沈降ゾーンを走査する前記段階が、該沈降
   ゾーンの出現する複数の時間に繰返され、前記複
   数の電気的信号が多数の前記位置における光強度
   の測定値、各測定値に対応する前記各位置及びそ
   の時点におけるｘ座標値及びｙ座標値を表わす特
   許請求の範囲第１項に記載の蛋白の定量分析方
   法。 ２１ パラメータ信号を導出する前記段階が、蛋
   白濃度の増加につれて増大する第１の信号を導出
   すること、蛋白濃度の増加につれて減少する第２
   の信号を導出すること、並びに前記第１及び第２
   の信号の示差的な組合せを表わす第３の信号を組
   合わされたパラメータ信号として導出することを
   含む特許請求の範囲第１５項に記載の蛋白の定量
   分析方法。 ２２ 前記組合わされたパラメータ信号が前記第
   １の信号と第２の信号との比を表わすものである
   特許請求の範囲第２１項に記載の蛋白の定量分析
   方法。 ２３ 前記配列が、前記沈降ゾーン内の一方の側
   と、他の沈降ゾーンと重なり合う領域内とに少な
   くともそれぞれ一つの位置を含んでおり、複数の
   電気的信号を発生する沈降ゾーンの前記走査段階
   が、前記他の沈降ゾーンと重なり合う第１のゾー
   ンの他方の側にありかつ重なり合つていない領域
   にある第２の位置における電気的信号を発生さ
   せ、さらに前記第１の位置の前記電気的信号を導
   出するために前記第２の位置信号を用いることか
   らなる特許請求の範囲第１５項に記載の蛋白の定
   量分析方法。 ２４ 前記抗原試料の各部分が、各試料部分の前
   記免疫拡散に先立つて前記蛋白の異なつた既知量
   を添加することにより高濃度化されており、ま
   た、前記走査段階、パラメータ値の導出段階及び
   対照パラメータ値と求められたパラメータ値とを
   比較する段階が、試料部分毎に形成された沈降ゾ
   ーンに対して行なわれることを含む特許請求の範
   囲第１５項に記載の蛋白の定量分析方法。 ２５ 前記抗原試料の各部分が、該各試料部分の
   免疫拡散に先立つて異なつた既知量の前記蛋白を
   添加することによつて高濃度化され、各試料部分
   の得られた沈降ゾーンを、前記走査段階、パラメ
   ータ値の導出段階、さらに添加した蛋白濃度に対
   して各試料部分に関する前記得られたパラメータ
   値を効果的にプロツトする段階並びにもとの試料
   中の前記蛋白濃度の値を前記得られたカーブの外
   挿によつて求める段階で処理する特許請求の範囲
   第１５項に記載の蛋白の定量分析方法。 ２６ 前記沈降ゾーンの走査段階に先立つて前記
   沈降ゾーンを染料で染色する段階を含む特許請求
   の範囲第１５項に記載の蛋白の定量分析方法。 ２７ 前記複数の電気的信号から、前記蛋白のあ
   る種の異常性の存在に応じて前記第１のパラメー
   タと特性的に異なるゾーンの第２のパラメータの
   相当値を電子的に送出する段階、及び前記第１の
   パラメータの値と前記第２のパラメータの値とを
   比較して前記異常性の存在を検出する段階を含む
   特許請求の範囲第１５項に記載の蛋白の定量分析
   方法。 ２８ 前記第２のパラメータがゾーン内の光強度
   和からなり、前記第１及び第２のパラメータ値が
   これらの値から導出された各蛋白濃度によつて比
   較される特許請求の範囲第２７項に記載の蛋白の
   定量分析方法。