JPS6258991A - 新規抗生物質ｍｄ９４４−ａｆ１およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明のＭＤ　９４４　　ＡＦＩは抗菌作用及び血圧降
下作用を有し、医薬品として期待される新規物質および
その製造性に関する。

〔従来の技術〕

血圧降下作用を有する微生物由来のペプチド系生理活性
物質として例えば、アンコベニン〔Ａｎｃｏｖｅｎｉｎ
、Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　
　３６．１　２９５（ｉ９８３）〕、ムラセイン［：Ｍ
ｕｒａｃｅｉｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｓ３７．３３０（ｉ９８４）１などが知られてい
る。

〔発明が解決しようとしている問題点〕従来、血圧降下
作用を有する物質に合成品、動物および植物由来のもの
が多い。最近、微生物の発酵生産物から効力が優れ、且
つ、副作用が少なく、その上新しい作用機序を有する血
圧降下作用物質が要望されている。

〔問題点を解決する為の手段〕

そこで、本発明者らは微生物の発酵生産物について種々
検索した結果、ストレプトミセス属に属する一菌株が抗
菌作用および降血圧作用を有する新規抗生物質ＭＤ　９
４４　　ＡＦｔを産生することを見い出した。

本発明は上記知見に基づ℃・で完成されたものである。

抗生物質ＭＤ　９４４−ＡＦ、を生成蓄積せしめ、この
培養物より抗生物質Ｍ　Ｄ　９４４　　Ａ　Ｆｌを採取
することより得られる。ＭＤ　９４４　　ＡＦＩの生産
菌の代表的なものとしてストレプトミセス・ヨコスカネ
ンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｙｏｋｏｓｕｋａ
ｎｅｎｓｉｓ　）　ＭＤ９４４　　ＡＲ（微工研菌寄第
８２０２３号二以下「ＭＤ　９４４−ＡＲ株」と略称す
る）があげられる。

この生産菌は昭和４８年６月、微生物化学研究所におい
て静岡県由比町の土壌より分離された放線菌で、ＭＤ９
４４−ＡＰＩの菌株番号が付された。

ＭＤ９４４−ＡＦＩ株の歯学的性状 １、形態 ＭＤ９４４−ＡＦＩ株は、顕微鏡下で分枝した基中菌糸
よりかぎ状あるいはらせん状の気菌糸を形成し、輪生枝
は認められない。成熟した胞子鎖は２０個以上の胞子の
連鎖を認め、胞子の大きさは０．５〜０．６　Ｘ　Ｏ，
８〜１．０　ミクロン位で、その表面はとげ状である。

２、各種培地における生育状態 色の記載について〔〕内に示す標準はコンテイナー・コ
ーポレション・オプ・アメリカのカラー・ハーモニイー
マニュアル（ｃｏｎ　ｔａｉｎｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　ＡｍｅｒｉｃａのＣｏ１ｏｒ　ｈａｒｍｏ
ｎｙ　ｍａｎｕａｌ　）を用いた。

（ｉ）　　シークロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養
） 無色〜うす黄の発育上に、白色の気菌糸を着生し、溶解
性色素は認められない。

（２）　　グルコース・アスパラギン寒天培地（２７°
Ｃ培養） うす黄〜うす黄茶の発育上に、茶巾〜うす茶（４ｅｃ、
　Ｂ１５ｑｕｅｌの気菌糸を着生し、溶解性色素はわず
かに黄色味をあびる程度である。

（３）　　グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ
−培地５．２７°Ｃ培養） う１黄〜うす黄茶の発育上に、茶巾〜うす茶（４ｅｃ、
　Ｂ１５ｑｕｅｌの気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。

（４１スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４．２
７℃培養） うす黄茶〜黄茶の発育上に、茶巾〜うす茶（４ｅｃ、　
Ｂ１５ｑｕｅ）の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずか
に茶色味をおびる程度である。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７．２７℃培養
） うす黄〜５す黄茶の発育上に、白〜茶巾〜うす茶の気菌
糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄色味をおびる程度
である。

（６）栄養寒天培地（２７°Ｃ培養） 発育はうす黄茶、気菌糸は着生せす、茶色の溶解性色素
を産生ずる。

（７）　　イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２．
２７℃培養） うす黄茶（３ｉｃ、　Ｌ（Ａｍｂｅｒ　）の発育上に、
白〜茶巾の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない
。

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３．２７°
Ｃ培養） うす黄〜うす黄茶の発育上に、茶巾〜うす茶（４ｅｃ、
　Ｂ１５ｑｕｅ　）の気菌糸を着生し、溶解性色素はわ
ずかに黄色味をおびる程度である。

（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 発育は無色〜うす黄、気菌糸は着生せず溶解性色素も認
められない。

（ｉ０）　　スターチ寒天培地（２７°Ｃ培養）無色の
発育上に、白色の気菌糸をうつすらと着生し、溶解性色
素は認められない。

（ｉ１）　　ＩＪンゴ酸石灰寒天培地（２７°Ｃ培養）
無色〜うす黄の発育上に、白色の気菌糸を５つすらと着
生し、溶解性色素は認められない。

（ｉ２）セルロース（２７°Ｇ培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められ
ない。

（ｉ３）ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（２０°Ｃ培養）では、発育は無色、
気菌糸は着生せす、茶色味の溶解性色素を産生ずる。

グルコース・ペプトン・ゼラチン培地 （２７℃培養）では、無色〜うす黄の発育上に、白色の
気菌糸を着生し、暗い茶の溶解性色素を産生ずる。

（ｉ４）脱脂牛乳（３７°Ｃ培養） 発育は黄茶〜５す茶、気菌糸は着生せず茶の溶解性色素
を産生ずる。

３、生理的性質 （ＩＩ　　生育温度範囲 スターチ・イースト寒天（可溶性スターチ１．０％、イ
ースト・エキス（犬五栄養化学裂）０．２％、紐寒天２
．０％、ｐＨ７，０〜７．２）を用い、２０°Ｃ１２４
°Ｃ１２７°Ｃ１３０°Ｃ１３７°Ｃ１５０℃の各温度
で試験の結果、５０℃を除いて、そのいずれの温度でも
発育したが、最適温度は２７〜３０℃付近と思われる。

（２）　　ゼラチンの液化（ｉ５％単純ゼラチン２０℃
培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン２７℃培養） 単純ゼラチン培地は培饗後１０日目頃から液化様の変化
をみとめたがその作用は極めて弱かった。一方、グルコ
ース・ペプトン・ゼラチン培地では培養後３日目頃から
液化が始まりその作用は、中等度あるいは強い方である
。

（３）　　スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天
培地及びスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養） いずれの培地においても、培養後１０日目頃から氷解性
が認められ、その作用は中等度〜弱い方である。

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳３７℃培
養） 培養後８日〜１０日目頃より、凝固なしにペフ′トン化
が始まり、１４日〜１６日目に完了、その作用は中等度
〜強い方である。

（５）　　メラニン様式素の生成（トリプトン・イース
ト・プロス、ｌ５Ｐ−培ｍｌ　；ペプトン・イースト・
鉄寒天、ｌ５Ｐ−培地６；チロシン寒天、ｌ５Ｐ−培地
７、いずれも２７°Ｃ培養） ペプトン・イースト・鉄寒天培地では、メラニン様色素
の生成が認められる。トリプトン・イースト・ブロス及
びチロシン寒天の場合は認められるが強い方ではない。

（６）炭素源の利用性（プリトノ・ム・コ°トチープ寒
天培地、ｌ５Ｐ−培地９．２７°Ｃ培養）グルコース、
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、シュクロース、イ
ノシトール、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトール、ラ
ムノース、ラフィノースの全てを利用する。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンコ゛酸石灰寒天２７℃
培養） 認められない。

（８）　　硝酸塩の還元反応（０，１％硝酸カリウム含
有ペプトン水、ｌ５Ｐ−培地８．２７°Ｃ培養） 陰性である。

以上の性状を要約すると、ＭＤ９４４−ＡＦＬ株は、胞
子のうを持たず、気菌糸はかぎ状あるいはらせん状で、
輪生枝は認められない。

胞子の表面はとげ状である。種々の培地で、うす黄〜う
す黄茶の発育上に、茶巾〜うす茶の気菌糸を着生し、溶
解性色素は示さな（・がわずかに茶色味をおびるメラニ
ン様色素は陽性、蛋白分解力は中等度、スターチの氷解
性は中等度〜弱い方である。

なお、全菌体中に含まれる２、６ジアミノピメリン酸は
ＬＬ−型であった。これらの性状より、ＭＤ９４Ｊ　　
ＡＰＩ株は、ストレプトミセス（Ｓ　１ｒｅｐ　ｊｏｍ
ｙｃｅｓ　）属に属す／ｐ放１ｉｉ１［、ｔられる。さ
らにＭＤ９４４−ＡＦＬ株に近縁の既知菌種を検索する
と次の種があげられる。すなわチ、ストレプトミセス・
ヨコスカネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｙｏｋ
ｏｓｕｋａｎｅｎｓｉｓ　）　（文献１）インターナシ
ョナルジャーナルオプシステイノク　バクテリオロジイ
ー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
、１９巻、５０２頁、１９６９；文献２）ナカムラ等（
Ｎａｋａｍｎｒａ　ｅｔ　ａｔ、）、スタディズオンア
クチノマイセーツ■１、オンストレプトマイセス　グロ
ジューシング９−β−Ｄ−リボ−フラノシルプリン、ジ
ャーナルオブアンチバイオチノクシリーズ （５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ
、　（（（、ｏｎ　ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ　９−β−Ｄ　−Ｒｉ　ｂｏ　−ｆｕｒａｎ
ｏｓｙｌｐｕｒｉｎｅ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＡｎＬ市１ｏｔｉｃｓ　５ｅｒ
ｉｅｓ　）　Ａ　１４巻、９４−９７Ｌ１９６１］、ス
トレプトミセス・サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　Ｌｈｅｒｍａｌｏｌｅｒａｎｓ）、・〔文献
１）インターナショナルジャーナルオブシステマティク
バクテリオロジイー （Ｉｎｔｅｒｒ＋ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ３
Ｑ１９巻、４８３頁、１９６９；文献２）ノζガノ等（
Ｐａｇａｎｏ　ｅｉ　ａｌ　）ファーメンテイテイブ力
ルポマイシン　プロダクツａ　７　（Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｒｅｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
　）　Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔ、２，９０２，４１２Ｓｅｐ
ｔ、１．１９５３　）である。これら２種のＩＳＰ菌株
とＭＤ９４４−ＡＦＬとを比較試験し、その成績の大要
を次に示した。

表にみられるごとく、ＭＤ　９４４−ＡＦＩ株は両者と
極めて近い性状を示している。ストレプトミセス・サー
モトレランスとは、気菌糸の色、牛乳のペプトン化が異
なる。一方、ストレプトミセス・ヨコスカネンシスとの
相異点は、シュクロースの利用のみである。しかもシュ
クロースの利用については、文献では、ＭＤ９４４−Ａ
ＦＩ株と同様に利用する場合もあり、大きな相異点とは
考えられない。ＭＤ９４４−ＡＦｌｉはストレプトミセ
ス・ヨコスカネンシスに極めて近縁の種と推定される。

よって、ＭＤ９４４−ＡＦＩ株をストレプトミセス・ヨ
コスカネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｙｏｋｏ
−ｓｕｋａｎｅｎｓｉｓ）ＭＤ９４４　　ＡＦＩと同定
した。

なお、ＭＤ９４４−ＡＦＩ株を工業技術院微生物工業技
術研究所に昭和５９年１２月２４日寄託申請し、受託番
号は微工研萌寄第８０２３号である。

本発明によりＭＤ　９４４−ＡＦ’　１を製造するには
先ず前記昭株を放線困が利用し得る栄養物な含有する培
地で好気的に培養する。栄養源としては、従来から放線
菌の培養に利用されている公知のものが使用でき、例え
ば、炭素源としてはグルコース、フラクトース、グリセ
リン、シュクロース、デキストリン、ガラクトース、有
機酸など単独かまたは組み合せて用いることができる。

無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コー
ン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油カス、カザミノ
酸、バクトソイトン、ソリュブル・ベジタブル・プロテ
ィン、オートミールなど単独または組み合わせて用いる
ことができる。その他必要に応じて食塩、炭酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩
化マンガン、燐酸塩など無機塩類を加えることができる
ほか有機物、たとえばアミノ酸類、ビタミン類、核酸類
や無機物を適当に添加することができる。

培養法としては液体培養法、特に深部攪拌培養法が最も
適している。培養温度は２５°〜３０°Ｃ１ｐＨは微酸
性から微アルカリ領域で培養を行うことが望ましい。液
体培養では通常３〜６日間培養を行うとＭＤ９４４−Ａ
ＦＬ物質が培養液中に生成蓄積される。培養液中の生成
量が最大に達したときに培養を停止し、函体を炉別して
得られる培養ＦＨ液液中り目的物を積層単離する。

培養原液から本物質の精製単離には一般に微生物代謝生
産物をその培養液から単ｍする為に用し・られる分離精
↓の方法が利用される。ＭＤ９４４−ＡＰＩは塩基性を
有し水、メタノールに溶けるが、アセトンをはじめとす
る一般有機溶媒に不溶な（・し、溶けにくい物質である
が、その精裂は塩基性マクロライド抗生物質の精製法が
応用できる。すなわち微アルカリ性条件下でローブタノ
ールによる抽出および酸性条件下で水に転溶する方法、
活性炭末および吸着樹脂に■ よる吸脱着法、セファデックス類のカラムクロマトグラ
フィーなどの方法を適当に組み合わせて用いることがで
きろ。例えば、培養ろ液を微アルカリ性に調整したのち
等量のＯ−ブタノールにて活性物質を抽出したのち、酸
性にて水に転溶し、濃縮によりブタノールを除去したの
ち活性炭にて吸着させ、水洗後含水アセトンにて溶出し
た。活性分画を集め、減圧下で濃縮し、凍結乾燥するこ
とにより黄褐色を呈する抗生物質ＭＤ９４４−ＡＰＬの
粗粉末が得られる。次にこ■ の粉末をメタノールに溶かし、セファデックスＬＨ−２
０カラムにて精製することによりＭＤ９４４−ＡＦＬの
無色の粉末を得る。

尚、培養中および積雲段階の力価の測定はマイコバクテ
リウムスメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ−ｕｍ
　ｓｍｅｇｍａＬｉｓ　）ＡＴＣＣ６０７の平板による
カップアッセイ法にて測定した。培養液ＩＵ／ｍｌとす
る。

次に以上のようにして得られた抗生物質ＭＤ９４４−Ａ
ＦＬの理化学的性質および生物学的性質を示す。

■、理理学学的性 質１）　　　外　　観 無色の粉末 （２）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値■ シリカゲル薄層（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　Ｆ２５４
０．２５ｍｍ　、　Ｍｅｒｃｋ　）およびセルロース薄
層（Ａｖ＋ｃｅｌＳＦ１０Ｘ１０ｃｍ、フナコシ薬品）
を使用しｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）の展
開溶媒系で展開することによりＲｆ＝０．０７および０
．７８を示す。

（３）高圧ｐ紙電気泳動によるＲｍ値 犠酸〜酢酸−水（２５：　７５　：　９００．　ｐｋ−
１１，６）のバッファー中３５００Ｖ、１０分間の比泳
動値（Ｒｍ、　Ａｌａ　＝　１．００　）はｏ、６９を
示す。

（４）紫外線吸収スペクトル 水溶液は末端吸収を示し、特長的な吸収を示さない。

（５）　　赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠として測定した赤外線吸収スペクトルを
第１図に示すと共に吸収極大匝（彼奴ｃｍ　　）を以下
に示す。

３３５０．３０５０．　２９５０．２８７’５．　１７
３５゜１６５０、　１５３５．　１４５５，１４１０．
１３９０゜１３７０、　１３３５．　１２８５．　１２
３５．　１１９０゜１１７０、　１１５０．　１１２５
．　１１１０．　１０９５゜１０５０、　１０２５．　
９７０，７００．　６７０（６）分子量 Ｆ　Ａ　Ｂ−Ｍ　Ｓ　（Ｆａｓ　ｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍ
ｂａｒｄｍｅｎ　ｔ　ＭａｓｓＳｐｅｃ　ｔｒｏｍｅ　
ｔｒｙ　）により測定した推定分子量は１．７３５［：
ｍ／ｚ＝１７３６　（ＭＨ）である。

（７）　　１”Ｃ−核磁気共鳴 重水中内部基準としてジオキサン（ｂｓ７．４）を使用
し、　ｒｌｌｌｌ定した４　００　Ｍｌ（Ｚの１３Ｃ−
核磁気共鳴スペクトルを第２図に示す。

（８）溶剤に対する溶解性 水、メタノールに溶けるがアセトン、酢酸エチル、エー
テルクロロホルム、ベンゼンなどの有機溶媒には難溶な
いし溶けない。

（９ｊ　　呈色反応 ニンヒドリン反応、ライドン・スミス反応、坂口氏反応
は共に陽性 （ｉ０）解離定数（ｐＫａ値） ｐＫａ　＝　９．９ （ｉ１）酸加水分解生成物 ６規定塩酸、１１０℃、１７時間封管中で加水分解後ア
ミノ酸分析を行い、そのモル比をもとめた。その結果を
第１表に示す、２、生物学的性質 １）抗菌活性 第２表 抗生物質ＭＤ　９４４−ＡＦ’　１はダラム陽性囚およ
び抗酸性菌に抗菌活性を示すが、ダラム陰性菌、カビ、
酵母類に対してほとんど抗菌活性を示さない。

２）血圧降下作用 抗生物質ＭＤ９４４−ＡＦＬを無麻酔高血圧ラット（Ｓ
ＨＲ）に腹腔内投与し８ＨＲの腹部大動脈の血圧および
心拍数を測定した結果を第３表に示す。

第３表 但し対照は生理食塩水。

第３表にみられるごとく抗生物質ＭＤ９４４−ＡＦ’ｌ
は無麻酔高血圧うソ）　（Ｓ）ＩＲ）に対し持続的な血
圧降下作用を示す。

以上述べた物理化学的性質および生物学的性質から本発
明の化合物に類似した抗菌作用および生理活性を有する
既知物質を検索したが該当する物質はみられずＭＤ９４
４　　ＡＦＬは新規ペプチド性抗生物質と判断された。

本発明の化合物のマウスでの急性毒性（Ｌ　Ｄ５ｏ　）
は約５０■／　ｋｇであった。

従って本発明仕合物は常法により医薬用賦形剤とともに
製剤イヒし、経口または注射などの方法により投与する
ことにより、血圧降下剤などとして使用することができ
る。

投与量は患者の病態、年令等により一概に決められない
が、２０ｍｇ／人／日〜２ｇ／人／日の範囲で１日１回
〜叙回投与すればよい。

以下本発明の実施例を示すが、これは単なる一例示であ
って何等本発明を限定するものでなく、種々の変法が可
能である。

実施例１゜ ロータリー型振盪機用５００　ｍｌ容三角フラスコにグ
リセロール２．０％、デキス）ｌＪｙ２，０％、ソイペ
プトン（Ｄｉｆｃｍ社）１．０％、酵母エキス（太五栄
養ＫＫ）０．３％、硫酸アンモニウム０．２％、炭酸カ
ルシウム０．２％消泡剤としてシリコンＫＭ−７０：　
大豆油（開法）（ｉ：１）０．０５％の培地（ｉ）８６
．８　）　１００ｍｌを分注し、１２０　℃、２０分間
オートクレーブ滅１した。これに、’ｙＩＤ９４４−Ａ
ＦＬ株（微工研甲請書受理番号第８０２３号の１白金耳
を接種し、２７°Ｃ１１８０回転／分の条件下で２日間
振盪培養した。これとは別にロータリー型振盪機用５０
０　ｍｌ容三角フラスコに上記培地１２５ｍ１を分注し
、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したフラスコ
に前記培養液３％（ｖ／ｖ）を無菌的に移植し、上記同
条件下で４日間振盪培養した。培養力価はミクロコツカ
ス・ラインダイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ−ｃｕｓ　
Ｉｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ　）の平板によるカップア
ッセイ法にて４１１１定した。培養液ｉｍｔ”３すＩＵ
とする。

以上の如く得られた培養Ｆ　′ｔＬ６１）を苛性ソーダ
ーにてｐＨ９に調整後等量のｎ−ブタノールを加え、攪
拌後ブタノール層６３００ｍ１を分別した。

これを減圧下、４０℃にて５００　ｍｌまでａ縮し矢に
等量の水を加え塩醒にてｐＨ２，０に調整し攪拌したの
ち活性物質を含む水層５５０ｍ１を得た。

再度上記転溶操作を行い茶喝色の乾固物１．３６ｇ（ｉ
，５０／Ｆｇ）を得た。この乾固・物を４５ｍ１の水に
溶解し、予め調↓した活性炭カラム（３０ｍｌ　）にチ
ャージし、活性物質を吸着させ、水洗後７５％含水アセ
トンにて溶出した。活性分画を染め、減圧下で濃縮し、
凍結乾燥することにより黄褐色の粉末４４３■（２，Ｏ
Ｕ／ｍｇ）を得た。

次にこの粉末を少量のメタノールに溶かし、予■ めセファデックス　ＬＨ−２０を充填したカラム（ｉ，
ｌＸ１１０ｃｍ、４００ｍ１　）にチャージし、メタノ
ールにて溶出し、活性分画を集め、減圧下で４縮、乾燥
することにより極く薄い黄色呈する粉末１２３ｍｇ（２
，８Ｕ／ｆｆ１ｇ　）を得た。最終的には極く少量の不
純物を除去する為にセファデッ■ クスＬＬ（−２０カラムに再クロマトを行うことにより
ＭＤ　９４４−ＡＦＬの無色の粉末９９＋１１ｇ（３，
０Ｕ／■）を得た。尚培養ろ液より最終段階までの収率
は約５％である。

実施例２゜ 前記実施例１．〔但し、消泡剤をポリエチレングリコー
ル、商品名東邦嵐１（東邦化学ＫＫ）０．０１％使用〕
記載の培地１．８を５１容の三角フラスコに分注し、１
２０℃、２０分間オートクレーブ滅１したのち、菌株Ｍ
Ｄ　９４４−ＡＦ’　１のスラントより１白金耳を無（
至）的に接種し、２７０Ｃ１１８０回転／分のロータリ
ー型振盪機にて４８時間培養した。ここに得られた前培
養液２！を予め２００２−タンク（ステンレス裂）に上
記の培地１２０形を仕込み、１２０℃、３０分殺菌した
タンクに接種し、２７℃、３５０回転／毎分の攪拌およ
び通気量１２０Ａ／毎分の条件にて６８時間深部培養し
た。尚、培養中の抗生物質ＭＤ９４４　　ＡＦＬの生産
量はマイコバクテリウム６０７の平板によるカップアッ
セイ法にて測定した。上記タンク培養によって得られた
培養液２２０−１３　（ｐＨ７，４）に濾過助剤ダイ力
■ ライト〔ダイカライド・オリエント■〕１１ｋｇを加工
、攪拌後フィルタープレスにて画体を炉別しろ液２０９
２を得た。次にろ液を苛性ソーダー溶液にてｐＨｓ、　
７に調整したのちローブタノール１５３！を加え充分攪
拌し、抗生物質ＭＤ９４４−ＡＦＬを含むブタノール層
１６７ノを得た。

次に減圧下で７６８ｅに濃縮したのち、等量の水を加え
１規定の塩酸にてＩ）Ｈ２に修正し、目的物質を水に転
溶した。ここに得られた水層約１０２を予め活性炭３０
０ｍ１を充填したカラムに通塔し、活性物質を吸着せし
めたのち、９００ｍ１の水で水洗し、ついで７５％アセ
トン水および０．１規定塩酸：アセトン（ｉ：１）にて
溶出し、活性分画を集め、１規定の苛性ソーダーにて中
和した。次にこの中和液を減圧下で濃縮し■ アセトンを留去したのちアンバーライト　ＸＡＤ−２（
３００ｍｌ）にて脱塩し、ＭＤ９４４　　ＡＦＬを含む
橙色の粗粉末３．１６　ｇ　（ｉ１，９０／■）を得た
。この粉末なｉｏｍｉのメタノールに溶解させ、予めセ
フ・デ・クス■ＬＨ−２０を充填したカラム（５Ｘ７５
ｃｍ、１５００ｍｌ　）にチャージし、メタノールにて
溶出し、活性分画を集め、濃縮し、凍結乾燥するこによ
り薄い黄色を呈する粉末２．０７ｇ（ｉ３，９Ｕ／’ｍ
ｇ）を得た。さらにこの粉末をｘ１５ｍｉの水に溶解し
、不溶物を濾過操−■ 作により除去し、予めカラムフィト（富士イヒ学工業Ｋ
Ｋ）４００ｍを充填したカラム（４，＋ｘ３０ｃｍ）に
チャージし、活性物質を吸着させ。

水洗後５％食塩水にて溶出した。活性分画を集メアンハ
ーライト■ＸＡＤ−２（２０Ｄａｄ）にて脱塩操作を行
い、無色の粉末１．７９１（ｉ４，４σ／■）を得た。

さらに極く少量の不純物を除く為にセファデックス■Ｌ
Ｈ−２０カラムにて再クロマトすることにより無色の粉
末１．１９６５’（２０Ｕ／ｒＩ！ｇ）を得た。尚培養
ν液より最終精製段階までの収率は約１２％である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明化合物の臭化カリウム錠として測定した
赤外線吸収スペクトルであり、第２図は重水中肉部基準
としてジオキサン（ｂ６７．４）を使用して測定した４
　００ＭＨ２の１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の理化学的性質を有する抗生物質ＭＤ９４４−
   ＡＦ＿１ （ａ）外観 無色の粉末 （ｂ）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値 シリカゲル薄層（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　Ｆ＿２＿
   ５＿４　０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）およびセルロース
   薄層（ＡｖｉｃｅｌＳＦ　１０×１０ｃｍ、フナコシ薬
   品）を使用しｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）
   の展開溶媒系で展開することによりＲｆ＝０．０７およ
   び０．７８を示す。 （ｃ）高圧ろ紙電気泳動によるＲｍ値 蟻酸−酢酸−水（２５：７５：９００、ｐＨ１．６）の
   バッファー中３５００Ｖ、１０分間の比泳動値（Ｒｍ、
   Ａｌａ．＝１．００）は０．６９を示す。 （ｄ）紫外線吸収スペクトル 水溶液は末端吸収を示し、特長的な吸収を示さない。 （ｅ）赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠として測定した赤外線吸収スペクトルを
   第１図に示す。その吸収極大値（波数ｃｍ＾−＾１）を
   以下に示す。 ３３５０、３０５０、２９５０、２８７５、１７３５、
   １６５０、１５３５、１４５５、１４１０、１３９０、
   １３７０、１３３５、１２８５、１２３５、１１９０、
   １１７０、１１５０、１１２５、１１１０、１０９５、
   １０５０、１０２５、９７０、７００、６７０ （ｆ）分子量 ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍ
   ｅｎｔ　ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により測
   定した分子量は１７３５〔ｍ／ｚ＝１７３６（ＭＨ）で
   ある。 （ｇ）＾１＾３Ｃ−核磁気共鳴 重水中内部基準としてジオキサン（ｄ６７．４）を使用
   し測定した４００ＭＨｚの＾１＾３Ｃ−核磁気共鳴スペ
   クトルを第２図に示す。 （ｈ）溶剤に対する溶解性 水、メタノールに溶けるがアセトン、酢酸エチル、エー
   テル、クロロホルム、ベンゼンなどの有機溶媒には難溶
   ないし溶けない。 （ｉ）呈色反応 ニンヒドリン反応、ライドン・スミス反応、坂口氏反応
   は共に陽性 （ｊ）解離定数（ｐＫａ値） ｐＫａ＝９．９ （ｋ）酸加水分解による構成アミノ酸のモル比リジン１
   　アラニン１ アルギニン　　　２　バリン　　　　　　１アスパラギ
   ン酸　１　イソロイシン　　　２グルタミン酸　　１　
   ロイシン　　　　　２プロリン　　　　１　フェニルア
   ラニン　１グリシン　　　　３ ２）ストレプトミセス属に属する抗生物質ＭＤ９４４−
   ＡＦ＿１を生産する能力を有する微生物を培養し、培養
   物中に抗生物質ＭＤ９４４−ＡＦ＿１を生成蓄積せしめ
   、これを採取することを特徴とするＭＤ９４４−ＡＦ＿
   １の製造法