JPS6260106B2

JPS6260106B2 -

Info

Publication number: JPS6260106B2
Application number: JP55035217A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Asakura
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1980-03-19
Filing date: 1980-03-19
Publication date: 1987-12-15
Also published as: JPS56130160A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景技術分野本発明は、体液中の免疫抑制機能を有する細胞
の除去装置に関する。先行技術及びその問題点免疫抑制性細胞の一種であるサプレツサーＴ細
胞は、健康人でも血液中に低比率で存在し、自己
抗体産生による自己抗原との反応を未然に阻止し
て、生体の維持に寄与している。しかし、癌患
者、免疫不全症患者など免疫系が異常となつた疾
患患者では、このサプレツサーＴ細胞が異常に増
強されて、ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞など抗体産生
を促進させる細胞の機能を抑制する。このためこ
れらの患者は、液性免疫能のみならず細胞性免疫
能まで低下し、この結果非自己あるいは修飾され
た自己抗原に対して生体防御反応が働かず、疾患
の進行を促進して、その症状を悪化させることと
なる。従来は、サプレツサーＴ細胞の増強を阻止する
ために、化学療法、放射線療法、外科療法などが
なされているが、これら療法は、他の細胞をも損
傷するためその目的を十分には達成できない。免疫抑制性細胞を血液から分離してこれを取除
くことも考えられるが、従来の技術では他の有用
な細胞までも除去してしまう。発明の目的本発明の目的は、免疫抑制性細胞であるサプレ
ツサーＴ細胞を選択的に除去する方法およびその
装置を提供するものである。上記目的を達成するものは、サプレツサーＴ細
胞を含む体液を、抗サプレツサーＴ細胞抗体を固
定した担体に接触させ、該体液内のサプレツサー
Ｔ細胞を該担体に補足させて除去するサプレツサ
ーＴ細胞除去方法である。また、前記抗サプレツサーＴ細胞抗体は、免疫
抑制能をもつ抗原に対して免疫反応性を有する非
動化した血清を赤血球で吸収操作した後この血清
から1/3硫安飽和法にて分離したγ−グロブリン
分画のものであることが好ましい。また、上記目的を達成するものは、サプレツサ
ーＴ細胞を含む体液が流通可能な容器と、該容器
内に収容された抗サプレツサーＴ細胞抗体を固定
した担体とからなるサプレツサーＴ細胞除去装置
である。また本発明は担体が繊維状物、管状物、顆粒状
物、球状物又は膜状物であり、その材質が活性
炭、多糖体、蛋白質又は合成樹脂である。更にまた抗体は、免疫抑制能をもつ抗原に対し
て免疫反応性を有する非働化した血清を赤血球で
吸収操作した後、この血清から1/3硫安飽和法に
て抽出したγ−グロブリン分画のものである。発明の具体的説明第１図は体液中免疫抑制性細胞の除去装置を示
し、この除去装置は容器１内に担体２を収容して
いる。この容器１は、両端に血液流入口３及び血
液流出口４を形成し、出入口部にそれぞれフイル
ター５，５を設けている。これらフイルター５，
５は、担体２が容器１外に流出するのを防ぐもの
である。この担体２は、免疫抑制性細胞の細胞膜抗原す
なわち細胞膜を抗原として特異的に反応する抗体
を固体化したもので、繊維状物、管状物、顆粒状
物又は球状物で形成されている。この担体２は、
ここを通る血液等の体液が抗体と効率よく接触す
る程度充填するのが好ましい。これらの形状を有する担体２の材質としては、
活性炭、多糖体、蛋白質、合成樹脂などが適当
で、多糖体としてセルロース、アガロース、フイ
ブリン、コラーゲンなどが挙げられる。又合成樹
脂としてポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ
カーボネイト、ナイロン、シリコーン、ポリオキ
シメチレンなどが挙げられる。なおこれらの材質
は担体２の全体に限らず、抗体を付着する表面に
のみ形成してもよい。担体２に固定される抗体は、除去すべき免疫抑
制性細胞がサプレツサーＴ細胞のときは、抗サプ
レツサーＴ細胞抗体である。この抗サプレツサー
Ｔ細胞抗体は例えば免疫抑制能が確認された細胞
を抗原として所定の動物に免疫し、免疫後の血液
から血清を分離して非働化し、更に赤血球で吸収
操作を行つた血清から1/3硫安飽和法で抽出した
γ−グロブリン分画のものである。この抗体を担
体に固定化するには、例えばグルタールアルデヒ
ドを用いた公知方法を用いておこなう。しかして上記担体２を収容した容器１は、第２
図に示すように血液流入口３をドリツプチヤンバ
ー６を介して人体７又は血液保存器に接続し、血
液流出口４をドリツプチヤンバー８を介して人体
７又は血液保存器に接続している。なお図示して
いないが、この装置には血液の凝固を防止するた
めにヘパリンなどの抗凝固剤を血液中に供給する
機構が設けられている。発明の具体的作用及び効果このように構成された体液中免疫抑制性細胞の
除去装置は、血液ポンプ９の作動により血液が容
器１を通つて体内に返送される。容器１内では、
担体２に所定の抗体が固定化されているため、こ
れが免疫抑制性細胞の細胞膜抗原に特異的に反応
して、この細胞を選択的に補捉する。この場合免
疫抑制性細胞以外の細胞はこの抗体で補捉され
ず、体内に戻される。また担体２に抗体を固定化
して免疫抑制性細胞を除去するので、流路系の閉
塞や処理能の低下などの操作上の問題はなんら発
生しない。以上の如き本発明効果は、以下に示す実験によ
つて確認された。まずこの実験で抗原とするサプレツサーＴ細胞
は次のようにして得た。人間の肘静脈から血液200mlを採血し、フイコ
ールーコンレイ比重液に重層し、2000γpmで20
分間遠心分離した後、中間層のリンパ球層を分離
してこれを生理食塩水で２×10⁶ケ／ml浮遊液と
する。この浮遊液を２％ノイラミニダーゼ処理羊
赤血球と混和して400×ｇで５分間遠心分離し、
これを４℃で１時間静置する。ここでリンパ球を
静かに浮遊させて、再度フイコールーコンレイ比
重液にかけ、2000γpmで20分間遠心分離する。
分離されたロゼツト形成細胞を0.83％塩化アンモ
ニウム溶液で羊赤血球を溶血させた後、生理食塩
水で洗浄（1000γpm、10分間、３回）する。こ
の操作で得られたＴ細胞を２×10⁶ケ／mlになる
ように生理食塩水を加えて調製する。次にこれに１％ウサギ抗−ヒトIgG−抗体感作
ニワトリ赤血球を等量混和し、４℃で24時間静置
する。これをフイコールーコンレイ比重液に重層
し、2000γpmで10分間遠心分離して沈殿したロ
ゼツト形成細胞を取出し、次いで0.83％塩化アン
モニウム液でにわとり赤血球を溶血させて、生理
食塩水で洗浄（1000γpm、10分間、３回）す
る。このような操作で得られたサプレツサーＴ細胞
の免疫抑制能を調べるために、次のような測定を
おこなつた。別の健常人から得たリンパ球をフイコールーコ
ンレイ比重遠沈法により、Ｂ細胞、Ｔ細胞に分離
し、各々の細胞数を２×10⁵ケ／ml、８×10⁵ケ／
mlになるように20％FCS（牛胎児血清）加
RPMI1640−HEPESで調製して対照細胞群とす
る。また分離したＴ細胞を健常ヒトリンパ球に加
えるときは、Ｂ細胞２×10⁵ケ／ml、Ｔ細胞２×
10⁵ケ／ml、前記分離したＴ細胞８×10⁵ケ／mlに
なるように前記培地で調製して、被験細胞群とす
る。対照細胞群、被験細胞群各１mlにPWM（ポ
ークウイードマイトジエン）10μｇを添加して、
５％CO₂インキユベータ中で37℃で７日間培養す
る。これら対照細胞群、被験細胞群にウサギ抗ヒ
トIg（IgG＋IgA＋IgM）血清を用いて螢光染色
し、MEM培地で洗浄（1000γpm、５分間、３
回）したのち螢光顕微鏡下で500ケ以上の細胞を
観察し、細胞質内に特異螢光を有する細胞を陽性
としてかぞえ、Ig保有細胞出現率から免疫抑制能
をみた。その結果、対照細胞群では抗体産生細胞
（Ig保有細胞）が６％であるのに対し、被験細胞
群では1.5％と低く、前記分離したＴ細胞に免疫
抑制能があることが示された。一方サプレツサーＴ細胞の抗体は次のようにし
て得た。免疫抑制能が確認されたリンパ球１×10⁷ケを
抗原として、うさぎに10日間隔で２回免疫した。
最終免疫から７日後全採血し、分離した血清を56
℃で30分間処理して非働化した。これを等量のヒ
トAB型赤血球で37℃、１時間吸収操作をしたの
ち、同様にヒトＢ細胞でも吸収操作を行つた。こ
のうさぎ抗−ヒトサプレツサーＴ細胞血清を硫酸
アンモニウムを用いた1/3飽和法にてγ−グロブ
リン分画を得、これをウサギ抗−ヒトサプレツサ
ーＴ細胞抗体（以下抗体と略す）とした。次にこの抗体を検定すべく、次の細胞障害性試
験を行つた。前述したサプレツサーＴ細胞及び非サプレツサ
ーＴ細胞をそれぞれ2500ケ／mm^３に調製し、マイ
クロテストプレート（＃3034、フアルコン、商品
名）にマイクロシリンジで１μ加えた。次に前記抗体を１μ加え、22℃で45分間培養
する。そのあとウサギ補体５μを加えて、22℃
で90分間培養する。これにエオジン２μを加
え、更にホルマリン（PH7.0）を加えて染色固定
する。そして顕微鏡下で生細胞、死細胞をカウン
トし、死細胞率を算定した結果、サプレツサーＴ
細胞群は死細胞が95％であるのに対し、非サプレ
ツサーＴ細胞がは死細胞が５％であつた。以上の
結果からこの抗体がサプレツサーＴ細胞に特異的
に反応して死滅させることが確認された。またこ
の抗体の細胞毒性を調べるべく、マイクロテスト
プレートを用いたウサギ抗−ヒトサプレツサーＴ
細胞抗体によるヒトリンパ球細胞障害性試験を行
なつた。その結果第１表に示すようにこの抗体は
2500倍希釈まで細胞毒性を示し、力価の高いこと
が認められた。

【表】

【表】次に本発明の実施例につき説明する。上述した実験例で用いた抗体をグルタールアル
デヒドを用いた公知法によりナイロン粒子からな
る平均粒径250μｍの担体に固定した。この担体
を充填率40％で容器に収容し、第２図に示す除去
装置（容量10ml）を組んだ。ついで胃癌患者から
採取した血液30mlを用いてサプレツサーＴ細胞の
除去試験を行つた。ここで容器は生理食塩水で十
分に洗浄し、発熱性物質、細菌などの有害物質が
残存していないものを用いた。血液を毎時120mlの流量で容器内に通して循環
させ、これを２時間行なつて実施前後の血液中の
サプレツサーＴ細胞をダブルロゼツト法で測定し
た。その結果実施前はリンパ球中のサプレツサー
Ｔ細胞比率が20％を示したが、実施後では４％の
正常域にまで低下していることが認められた。また実施前後にPWM刺激による抗体産生細胞
出現率を細胞形質内イムノグロブリン螢光染色に
より測定した。その結果実施前では2.5％と低い
が、実施後では７％と正常域にまで回復したこと
が確認された。以上の結果から明らかなように本発明によれ
ば、免疫抑制性細胞の細胞膜抗原に特異的に反応
する抗体を利用したので、該細胞を選択的にしか
も顕著に除去でき、免疫系が関与している疾患に
きわめて有意義である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す除去装置の断
面図、第２図は同除去装置を組込んだシステムの
説明図である。１……容器、２……担体。

Claims

【特許請求の範囲】１サプレツサーＴ細胞を含む体液を、抗サプレ
ツサーＴ細胞抗体を固定した担体に接触させ、該
体液内のサプレツサーＴ細胞を該担体に補足させ
て除去することを特徴とするサプレツサーＴ細胞
除去方法。２前記抗サプレツサーＴ細胞抗体は、免疫抑制
能をもつ抗原に対して免疫反応性を有する非動化
した血清を赤血球で吸収操作した後この血清から
1/3硫安飽和法にて分離したγ−グロブリン分画
のものである特許請求の範囲第１項に記載のサプ
レツサーＴ細胞除去方法。３サプレツサーＴ細胞を含む体液が流通可能な
容器と、該容器内に収容された抗サプレツサーＴ
細胞抗体を固定した担体とからなることを特徴と
するサプレツサーＴ細胞除去装置。４前記担体が繊維状物、管状物、顆粒状物、球
状物又は膜状物である特許請求の範囲第３項に記
載のサプレツサーＴ細胞除去装置。５前記担体が、活性炭、多糖体、蛋白質又は合
成樹脂である特許請求の範囲第３項に記載のサプ
レツサーＴ細胞除去装置。６前記抗サプレツサーＴ細胞抗体は、免疫抑制
能をもつ抗原に対して免疫反応性を有する非動化
した血清を赤血球で吸収操作した後この血清から
1/3硫安飽和法にて分離したγ−グロブリン分画
のものである特許請求の範囲第３項ないし第５項
のいずれかに記載のサプレツサーＴ細胞除去装
置。