JPS6261926A - 制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物由来のプロテアーゼを有効成分とする
制癌剤に関する。

本発明者らは、永年にわたる制癌剤の研究の経験にもと
すき、より副作用の少ない有効なる制癌剤を目指して研
究を行ない、従来の制癌剤とは分子の性状ならびに作用
機構において全く異なる範梼の物質である微生物由来の
プロテアーゼが極めて有効な制癌作用を有することを始
めて見い出した。

本発明の制癌剤の有効成分である微生物由来のプロテア
ーゼの作用は蛋白質の分解と、それに伴う細胞破壊であ
り、従来の制癌剤の作用とは全く異なった範１の作用を
もつ制癌剤である。

〔従来技術〕

本発明者らは、以前より腫瘍組織においては、血管とリ
ンパ管の構築が、正常組織とは大きく異なることを見い
出していた。即ち腫瘍組織局所に高分子制癌剤を投与し
たときの挙動は低分子のそれとは全く異なり、高分子物
質は血行性にもリンパ行性にも回収排泄されることがな
く、長期にわたりその腫瘍局所に停滞する現象が見られ
るのである。

これは、分子量の大きいことが、その薬剤の拡散速度を
低下させ、また血管内皮に対する通過を低くするため、
血管への浸透と、それにつづく回収能率を低下させると
考えられる。さらに、本発明者らは、腫瘍局所には、リ
ンパ管が欠如していることも既に見い出していた。正常
組織では、このリンパ系こそが、このような組織内の高
分子ならびに油滴の回収の主たる経路であるが、腫瘍組
織ではこれを欠如しているために、酵素等の高分子は、
腫瘍局所に長期に残存するのである（イワイ、ケイ（Ｉ
ｗａｉ、　Ｋ、）らキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅｓ、）　４４巻２１１５頁〜２１２１頁１９８
４年、マエダ、エッチ（Ｍａｅｄａ　、　ｔ（、）らジ
ャーナル・オフ・プロティン・ケミストリー（Ｊ、Ｐｒ
ｏｔ、　Ｃｈｅｍ、）３巻１８１頁−１９３頁１９８４
年及び前田浩、今野俊光、「癌と化学療法」１２巻７７
３頁〜７８２頁１９８５年）。

本発明者らは、これらの知見に着目し、その局所に高分
子物質である微生物由来のプロテアーゼを注入すると、
そのいくつかは癌細胞に強力にかつ長期間にわたり毒性
を発揮し、顕著な制癌効果が認められるのではないかと
の推考に至ったのである。

従来においては、このような考えにもとずく制癌剤はな
かったが、最近になって、本発明者らの意図する制癌剤
に類するものとして、ヒト尿中に由来する酸性プロテア
ーゼを有効成分とする抗癌剤が開示された（特開昭５８
−１３５２３号）。

〔解決すべき問題点〕

これまで開発された制癌剤は主として低分子のものであ
り、せっかく優れた薬効を有していても薬剤が拡散し易
く、そのため薬効を持続出来ないという欠点があり、一
方特開昭５８−１３５２３号に開示された制癌剤は、ヒ
ト尿中に微量に存在する酸性プロテアーゼを有効成分と
するものであるが、該酸性プロテアーゼを大量に製造す
るのはきわめて困難なことである。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、優れた制癌作用を有し、しかも
薬効が持続し、かつ正常細胞に対する毒性の低いものを
見い出すべく鋭意検討した。

そして、微生物由来の数種のプロテアーゼがマウスの実
験腫瘍のすべてに対して顕著な制癌作用を有することを
見出した。投与したプロテアーゼは癌局所において長期
間作用を持続し、かつ又正常細胞に対する細胞毒性は癌
細胞よりもかなり少ないことがイン・ビトロ（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ）試験で明らかとなり１本発明を完成するに至
った。

即ち、本発明は、微生物由来のプロテアーゼを有効成分
として含有する制癌剤に関する。

本発明の制癌剤の有効成分である微生物由来のプロテア
ーゼは微生物を培養し、培養物から採取することによっ
て、又は微生物由来の市販のプロテアーゼを購入するこ
とによっても調製することができる。

微生物を培養してプロテアーゼを取得する場合には、セ
ラチア・マルセッセンス（Ｓ６ｒａｔｉａｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓ）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌ、ｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、バ
チルス１エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）、スト
レプトマイセス、エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　
ｓｐ、）等の微生物をトリプトソイ培地、コンステープ
リカー培地、ワックスマン培地その他適宜工夫をこらし
た培地で２０〜４０℃、好ましくは３０℃付近で好気的
に２０〜５０時間培養し、菌体をろ過または遠心などで
分離すると培養上清中にプロテアーゼ活性が見い出され
る。培養上清を２〜２０倍濃縮後、透析その他の工程を
適宜にはさみ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分別沈澱、塩析などの手段を経て純度９５％以上の
精製プロテアーゼを調製することができる。又微生物を
培養することなく入手できる市販品の例としては、サブ
チリシン及びプロナーゼ（いずれも商品名）等がある。

これら制癌作用を有するプロテアーゼはいずれも微生物
由来の中性プロテアーゼである。しかし、アクロシリン
トリウム・エスピー（Ａｃｒｏｃｙｌｉｎｄｒｉｕｍ　
ｓｐ、）の産生ずる酸性プロテアーゼでは、腫瘍の増殖
を促進する逆の効果を示し、また、動物由来のトリプシ
ン、キモトリプシン及ヒヘフシン、植物由来のパパイン
等は　α□アンチ　トリプシン、α２アンチキモトリプ
シン、α２−　マクログロブリン等の生体中のプロテア
ーゼ阻害物質により完全にその活性が阻害され、制癌作
用は全く見られなかった。

以下に５本発明の製造例、試験例、実施例を示す。

製造例１ セラチア−ＶルセッセンスＫｕｍｓ　３９５８　ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮｏ　８４３６（本菌株はヒト角膜潰瘍患者より
分離され、熊本大学医学部で保存されている菌株であり
、かつ微工研に寄託番号８４３６として寄託されている
）をトリプトソイ液体培地にて一夜培養し、その２ｍＱ
を同上培地２００〜３５０＋ｎＱを含む１Ｑの坂ロフラ
スコに入れ、振盪下（１〜２）１ｚ）３０℃にて培養し
、プロテアーゼ活性が最大の平衡値になる２５〜３０時
間後に、培養液をろ液と菌体に分離し、得られたろ液を
減圧下に３０℃以下で４倍濃縮又は９０％飽和硫安を加
え沈澱物として濃縮し、ついで蒸留水に対して、常法に
より透析（４℃、４８〜７２時間）し、凍結乾燥する。

このものをさらにＤＥＡＥ−セルロースカラム（カラム
サイズ、　４　Ｘ　４０ｃｍ）にかけ０．０ＩＭ　トリ
ス塩酸緩衝液（ＰＨ８、３）を用いＮａＣ１の濃度勾配
下に溶出した。溶出パターンは第１図に示される。

なお、プロテアーゼ活性は、カゼイン分解能及び本発明
者らが開発した蛍光偏光法マエダ、エッチ（Ｍａｅｄａ
、　Ｈ，）：アナリチカル・バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　９２巻２２２−２２７頁
１９７９年によって測定した。

溶出区分をさらに透析し、凍結乾燥し、セファデックス
Ｇ−１００（登録商標）などを用い、より純度の高いプ
ロテアーゼとすることができる（溶出パターンは第２図
に示される）。こうして得られたプロテアーゼは０．５
〜１．０％Ｎａドデシル硫酸存在下、７５％ポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動させると貼−のバンドを示し
た。そしてこのものを本発明者らは５６にプロテアーゼ
と命名した。５６にプロテアーゼの酵素化学的性質につ
いては、本発明者およびマツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ
）らによりジャーナル・オフ・バクテリオロジイ（Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５７巻（１）２２５頁〜２
３２頁１９８４年に記載されている。

次に微生物由来のプロテアーゼが優れた制癌作用を示す
ことを各種プロテアーゼの培養細胞に対する細胞毒性と
その細胞毒性に対する血清の影響。

制癌作用、マウス固型腫瘍での有効性及び急性毒性試験
等の試験において説明する。

試験例１ 各種プロテアーゼの培養細胞に対する細胞毒性とその細
胞毒性に対する血清の影響： 制癌剤として有望と考えられるプロテアーゼは生体内に
多量に存在する各種のプロテアーゼ阻害剤により阻害さ
れないことが必要である。

本発明者らは、各種培養細胞に各種プロテアーゼを加え
殺細胞効果を調べるとともに、同時に血清を加えその影
響をも刺入た。

１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地また
はＥａｇｌｅのＭＥＭ培地０．５＋ｎＱをＬａｂ　Ｔｅ
ａｋプラスチックチェンバー（８穴型）に入れ、それに
約Ｉ×１０４個の各種癌細胞浮遊液（０，５ｍ１Ｉ中）
を加え３７℃、５％ＣＯ□（９５％空気の気組成）中で
インキュベータにて培養する。２日目に一群は、そのま
までＯ，Ｌｎ＋Ｑの各種プロテアーゼ液を加え、他の１
群はその培地に対して血清を含まない培地におきかえて
各種プロテアーゼを同様に添加し、１時間培養及び２４
時間培養後における細胞数と形態学的検討により。

制癌効果を判定した。

その結果は表１及び表２に示される。表１より明らかの
ように無血清培地での各種プロテアーゼの細胞毒性は、
主として癌細胞に強く出現し、正常細胞にはほとんど出
現しないことがわかる。又表２より明らかなように血清
の影響により各種プロテアーゼの癌細胞毒性の経時的効
果の増強が異なることがわかった。即ち５６にプロテア
ーゼ、サブチリシン、プロナーゼでは１時間処理の場合
の殺細胞効果に比較して２４時間処理の場合の殺細胞効
果が著明に増大しており、一方、トリプシン、パパイン
ではほとんど増強しなかった。

表２　血清添加によるプロテアーゼ活性の細胞傷外性の
変化（即ち、血清添加プロテアーゼ２４時間処理による
効果の増強）細胞ａ）　　　　　細胞毒性の経時的効果
の増強（倍）ｂ）（１時間処理に対する強さ） アーゼ　　　シン １１ｅｐ２　　　　　＞６４　　　　　２０　　　　　
　８　　　　なし〜４　　　なし〜４１１ＳＧ　　　　
　　３２　　　　１６　　　　　８　　　　２〜４　　
　２〜４１１ｅＬａ　　　　　３２　　　　１２　　　
　　８　　　　２〜４　　　　２〜４Ｃ％　　　　　３
２　　　　１０　　　　　８　　　　　２　　　　　２
ＷＩＳＨ１６１０８４２ Ｖｅｒｏ　　　　　１６　　　　１０　　　　　２　　
　、　　２〜４　　　２〜４１１ＥＬ　　　　　＞４　
　　　−　　　　　−　　　　　２　　　　　２ＧＭＫ
　　　　　　２　　　　　２　　　　　２　　　　　２
　　　　　２ｂ）数字はもとのプロテアーゼの効果に対
して２４時間処理後に同等の効果を発揮する時の希釈倍
数。例えば１表２中の３２は血清の存在下でも２４時間
後には３２分の１の量で同等の力価を発揮する事を示す
。

試験例２　各種プロテアーゼの制癌作用：マウス固型腫
瘍での有効性（即ちメチルコランスレン誘発癌（Ｍｅｔ
ｈ　Ａ腫瘍）での効果）：Ｂａ１ｂ／ＣマウスにＭａｔ
ｈ　Ａ腫瘍約１０’個を皮内に注射器で０．０５ｄ接種
し、約７〜９日後に腫瘍の直径が８〜１０ｍｍになるの
をまって、各腫瘍に対し、所定の濃度に溶解した各プロ
テアーゼを０．１ｍＱづつ腫瘍内に注入した。投与２回
（連日各１回）後の腫瘍の直径をみたものが第３図に示
される。

第３図より明らかのように、各種プロテアーゼのうち５
６にプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、プロナーゼ、サ
ブチリシンの４種に関しては、腫瘍の消失がみられたが
、酸性プロテアーゼ、トリプシン、パパインでは腫瘍増
殖抑制作用がほとんどないことがわかる。

試験例３５６にプロテアーゼの制癌作用：（１）　Ｓ−
１８０での制癌効果： 試験例２と同様にしてｄｄＹマウスにて作成したＳ−１
８０固型腫瘍に対して、種々の量の５６にプロテアーゼ
を静注にて合計７回２〜３日目毎に投与し制癌効果を測
定した。その結果は第４図に示される。

即ち第４図より明らかのように３０μｇ／ｋｇ以上の投
与で有効であることがわかり、３００μｇ／ｋｇヲ５回
投与することにより腫瘍はほぼ完全に消失し、かつプロ
テアーゼ投与による副作用は何ら認められなかった。

（２）　Ｍｅｔｈ　Ａ腫瘍（腹水型）接種マウスに対す
る延命効毀： Ｍｅｔｈ　Ａ腹水胆癌腫瘍細胞５　Ｘ　１０ｓ個をマウ
スに接種後、２４時時間上り５６にプロテアーゼによる
治療を開始し１合計１０回連日投与した。その結果は第
５図に示される。即ち第５図より明らかのように対照に
比してＩ　Ｂ／ｋｇ及び３　ｍｇ／ｋｇ投与のいずれも
顕著な延命効果を示すことがわかる。

（３）　Ｍｅｔｈ　Ａ固型腫瘍に対する経口投与での増
殖抑制効果： Ｍｃｔｈ　Ａ腫瘍細胞２Ｘ１０’個をマウスの側腹部に
波向注射し、２４時間後より一群（１０匹）に対し５６
にプロテアーゼ２０ｍｇ入りのエサを与え、対照群（１
０匹）にはエサのみを与え、腫瘍の発育を比較検討した
。

エサを与えて１０日後の腫瘍サイズの平均値を比較した
ところ、５６にプロテアーゼ投与群は、その直径が７．
７ｃ＋ｎであり、対照群の直径は、８．９ｃｍで明らか
に有意差がみられた（Ｆ検定、有意水準２．５％）。

試験例４　各種プロテアーゼの急性毒性試験：体重２０
〜２５のｄｄＹマウスを１群１０匹とし、生理食塩水に
溶解した各種プロテアーゼ（５６にプロテアーゼ、サブ
チリシン、プロナーゼ）を静脈内又は腹腔内にそれぞれ
投与した後、１週間にわたって症状をａ察したが、いず
れのプロテアーゼ投与の場合も、何ら異常は認められな
かった。

以上で明らかのように、５６にプロテアーゼ、サブチリ
シン、プロナーゼ、放線菌の産生ずる中性プロテアーゼ
の何れもが、顕著な制癌作用を有することが判明した。

従って、これらのプロテアーゼを有効成分とする制癌剤
の実用化は大いに期待されるものである。

これらのプロテアーゼをヒトに投与するに際しては、直
接腫瘍内、腹腔内、あるいは経口投与によって有効に治
療されうる。

これらのプロテアーゼの投与量は、その腫瘍の大きさ、
増殖速度、その他により一定ではないが、腫瘍内には通
常１０μｇより１ｍｇを１〜数ケ所注入する。また腹腔
内腹膜、その他の播種性の腹腔的腫瘍に対しては、通常
希釈した酵素溶液１〜２００ｍ１２を腹腔内に注入する
。

さらに経口投与の場合は、通常成人−人当り１■から数
ｇを一度に又は分割して投与する。

剤型としては、粉末、水溶液、顆粒状、カプセル剤、腸
溶剤、あるいは油剤として油溶化して用いることも出来
、また合剤として、これらプロテアーゼの不活性化をも
たらす胃液中のペプシンから守るために、ペプシンの阻
害剤と併用することも可能である。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 製造例１で製造した５６にプロテアーゼ　１００ｍｇを
１０ｍΩの生理食塩水に溶解し、メンブレンフィルター
を用いて無菌的に濾過し、濾液を滅菌したガラス容器に
充填して凍結乾燥し、これを密栓して注射用凍結乾燥粉
末剤とした。

実施例２ 実施例１に準じて得られた５６にプロテアーゼ粉末剤１
００ｇ、乳糖９７ｇおよびステアリン酸マグネシウム３
ｇをそれぞれ秤量したのち均一に混合した後、このもの
をＮｏ、２のゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填し
たのち腸溶皮膜を施し、腸溶カプセル剤とした。

実施例３ サブチリシン（商品名）２００ｍｇを１０ｍ１２の生理
食塩水に溶解し、メンブレンフィルターを用いて無菌的
に濾過し濾液を滅菌したガラス容器に１０ｍＭずつ充填
して凍結乾燥し、これを密栓して注射用凍結乾燥粉末剤
とした。

実施例４ 実施例３に準じて得られたサブチリシン粉末剤Ｉｇ、結
晶セルロース８４．５ｇ、マニトールＬｏｇ、カルボキ
シメチルセルロースカルシウム２．０ｇ、ステアリン酸
マグネシウム１．０ｇ及び硬化油１．５ｇをそれぞれ秤
量したのち、均一に混合した粉末を押出機にて顆粒化し
、内服用顆粒剤を製造した。

実施例５ プロナーゼ（商品名）５００ｍｇを１０ｍＱの生理食塩
水に溶解し、メンブレンフィルターを用いて無菌的に濾
過し、濾液を滅菌したガラス容器に１０ｍＱずつ充填し
て凍結乾燥し、これに密栓して注射用凍結乾燥粉末剤と
した。

実施例６ 実施例５に準じて得られたプロナーゼ粉末剤１ｇ、結晶
セルロース８４．５ｇ、乳糖ｌｏｇ、カルボキシメチル
セルロースカルシウム２ｇ、ステアリン酸マグネシウム
１ｇ、ステアリン酸１．５ｇを均一によく混合した粉末
を打錠機により重ｉｔ　１００ｍｇの素錠を製したのち
、このものに腸溶剤皮のコーティング剤でコーティング
し、腸溶錠剤を製造した。

〔本発明の効果〕

本発明の微生物由来のプロテアーゼを有効成分とする制
癌剤は、薬効を持続でき、かつ正常細胞に対する毒性が
低いという特長を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、セラチア・マルセッセンス由来の５６にプロ
テアーゼの精製工程におけるＤＥＡＥ−セルロースカラ
ム溶出パターンを示すものであり、第２図は、同じくセ
ファデックス　Ｇ−１ｏｏによる溶出パターンを示すも
のである。 第３図は、各種プロテアーゼのＭｅｔｈ　Ａ腫瘍に対す
る制癌作用を示しており、矢印にてプロテアーゼをｌ１
ｆｆ！瘍内投与した。第４図は、５６にプロテアーゼの
Ｓ−１８０固型腫瘍に対する制癌作用を示しており、矢
印にて５６にプロテアーゼを投与した場合を示し、第５
図は５６にプロテアーゼのＭｅｔｈ　Ａ腹水腺癌腫瘍細
胞に対する制癌作用を示し、矢印にて５６にプロテアー
ゼを投与した場合を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物由来のプロテアーゼを有効成分とする制癌剤
   。 ２、微生物由来のプロテアーゼが中性プロテアーゼであ
   る特許請求の範囲第１項記載の制癌剤。 ３、微生物由来のプロテアーゼがセラチア・マルセッセ
   ンスに由来する中性プロテアーゼである特許請求の範囲
   第１項記載の制癌剤。