JPS6262292B2 - - Google Patents
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- JPS6262292B2 JPS6262292B2 JP54140531A JP14053179A JPS6262292B2 JP S6262292 B2 JPS6262292 B2 JP S6262292B2 JP 54140531 A JP54140531 A JP 54140531A JP 14053179 A JP14053179 A JP 14053179A JP S6262292 B2 JPS6262292 B2 JP S6262292B2
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- blood cells
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- leukocytosis
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
- G01N33/555—Red blood cell
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
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- Y10S436/812—Infectious mononucleosis
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は伝染性単核白血球増加症（infectious
mononucleosis，伝染性単核細肥増多症、伝染性
単核細胞病ともいわれる）を検出するための試
薬、なかんずく、体液を用いて凝集法で検出する
ための試薬ならびにその製法に関する。
mononucleosis，伝染性単核細肥増多症、伝染性
単核細胞病ともいわれる）を検出するための試
薬、なかんずく、体液を用いて凝集法で検出する
ための試薬ならびにその製法に関する。
Ｐ氏腺熱としても知られている伝染性単核白血
球増加症（IM）は幼児および若い成人に現われ
る熱性疾患である。病原体は確実でなく、エプシ
ユタイン―バール（Epstein―Barr）ウイルス
（EBV）が病原体として働くものと想定されてい
る。患者の80％までに感染の進行の間に好異種抗
体が出現することが知られているので、その検出
は診断上の価値がある。好異種抗体は羊の赤血球
を凝集させる性質を有しているが、この凝集は単
核白血球増加症に特異的でない抗体によりしばし
ば妨害される。それゆえIMに特異的な好異種抗
体を確認し且つ区別するために、比較的複雑な、
時間のかかる一連の試薬（いわゆる示差吸着試
験）を行うことを余儀なくさせられている。
球増加症（IM）は幼児および若い成人に現われ
る熱性疾患である。病原体は確実でなく、エプシ
ユタイン―バール（Epstein―Barr）ウイルス
（EBV）が病原体として働くものと想定されてい
る。患者の80％までに感染の進行の間に好異種抗
体が出現することが知られているので、その検出
は診断上の価値がある。好異種抗体は羊の赤血球
を凝集させる性質を有しているが、この凝集は単
核白血球増加症に特異的でない抗体によりしばし
ば妨害される。それゆえIMに特異的な好異種抗
体を確認し且つ区別するために、比較的複雑な、
時間のかかる一連の試薬（いわゆる示差吸着試
験）を行うことを余儀なくさせられている。
羊の赤血球の代わりに馬の赤血球を使用するこ
とにより伝染性単核白血球増加症についての試験
の特異性が高められ得ることはすでに記載されて
いるが、この方法もまた満足のいくものではな
い。ドイツ特許第1598928号明細書によれば伝染
性単核白血球増加症の検出のための試薬が記載さ
れており、そこでは馬の赤血球をアルデヒドで処
理して安定化している。この方法は試験システム
の特異性および方法に関して先に記載されている
ものに比較して進歩したものである。しかしなが
らまた、それによつてすべての患者の血清のIM
―特異的な好異種抗体をそのものとして識別する
わけではない。
とにより伝染性単核白血球増加症についての試験
の特異性が高められ得ることはすでに記載されて
いるが、この方法もまた満足のいくものではな
い。ドイツ特許第1598928号明細書によれば伝染
性単核白血球増加症の検出のための試薬が記載さ
れており、そこでは馬の赤血球をアルデヒドで処
理して安定化している。この方法は試験システム
の特異性および方法に関して先に記載されている
ものに比較して進歩したものである。しかしなが
らまた、それによつてすべての患者の血清のIM
―特異的な好異種抗体をそのものとして識別する
わけではない。
従つて単核白血球増加症の検出のための高度に
特異的で極度に鋭敏な試験方式がなお求められて
いる。
特異的で極度に鋭敏な試験方式がなお求められて
いる。
今、動物の赤血球なかんずく去勢雄羊および馬
赤血球をスルホサリチル酸で処理するとIM抗体
を検出するための特異的な凝集試薬が得られるこ
とが見出された。
赤血球をスルホサリチル酸で処理するとIM抗体
を検出するための特異的な凝集試薬が得られるこ
とが見出された。
従つて本発明の目的は、スルホサリチル酸で処
理されそして所望の場合は色素で染色された哺乳
動物特に去勢雄羊あるいは馬類なかんずく馬に由
来する赤血球を含有する、伝染性単核白血球増加
症を体液を用いて凝集法で検出するための試薬を
提供するにある。
理されそして所望の場合は色素で染色された哺乳
動物特に去勢雄羊あるいは馬類なかんずく馬に由
来する赤血球を含有する、伝染性単核白血球増加
症を体液を用いて凝集法で検出するための試薬を
提供するにある。
赤血球をスルホサリチル酸で処理することは
H.Becht氏により「J.Immunol.」1968年第18〜22
頁に記載されている。この刊行物に記載の方法で
処理された赤血球は伝染性単核白血球増加症のた
めの試験試薬としては、高濃度のスルホサリチル
酸で処理されたものよりもより適していない。本
発明によれば、赤血球なかんずく去勢雄羊あるい
は馬の赤血球を２〜10％好ましくは2.5％（ｇ／
ｖ）のスルホサリチル酸水溶液好ましくは５―ス
ルホサリチル酸で赤血球の色が赤色から褐色に変
わるまで処理する。このために、およそ同量の水
あるいは適当な緩衝液中５〜20％（ｗ／ｖ）赤血
球のような濃い赤血球懸濁液とスルホサリチル酸
溶液とが混合される。赤血球溶液の緩衝化、なら
びに生理学的に受容され得る懸濁液安定化物質な
かんずく当業者によつて赤血球懸濁液の安定化に
一般に熟知されているポリビニルピロリドンある
いはデキストランのような適当な重合体の添加が
有利であることが明らかにされている。
H.Becht氏により「J.Immunol.」1968年第18〜22
頁に記載されている。この刊行物に記載の方法で
処理された赤血球は伝染性単核白血球増加症のた
めの試験試薬としては、高濃度のスルホサリチル
酸で処理されたものよりもより適していない。本
発明によれば、赤血球なかんずく去勢雄羊あるい
は馬の赤血球を２〜10％好ましくは2.5％（ｇ／
ｖ）のスルホサリチル酸水溶液好ましくは５―ス
ルホサリチル酸で赤血球の色が赤色から褐色に変
わるまで処理する。このために、およそ同量の水
あるいは適当な緩衝液中５〜20％（ｗ／ｖ）赤血
球のような濃い赤血球懸濁液とスルホサリチル酸
溶液とが混合される。赤血球溶液の緩衝化、なら
びに生理学的に受容され得る懸濁液安定化物質な
かんずく当業者によつて赤血球懸濁液の安定化に
一般に熟知されているポリビニルピロリドンある
いはデキストランのような適当な重合体の添加が
有利であることが明らかにされている。
懸濁液の色が赤色から褐色に変化するまで続け
られ、大抵は数分間の赤血球のスルホサリチル酸
処理の後、赤血球を沈降あるいは遠心分離により
分離され、等張の好ましくは緩衝化された塩溶液
中で繰返し洗浄される。この処理により試薬は基
本的には使用することができるようになる。IM
の検出には、赤血球懸濁液を細胞密度５〜20×
108／mlに調整する。
られ、大抵は数分間の赤血球のスルホサリチル酸
処理の後、赤血球を沈降あるいは遠心分離により
分離され、等張の好ましくは緩衝化された塩溶液
中で繰返し洗浄される。この処理により試薬は基
本的には使用することができるようになる。IM
の検出には、赤血球懸濁液を細胞密度５〜20×
108／mlに調整する。
貯蔵には、処理された赤血球からなる試薬につ
いて一般的に知られているような、懸濁液を安定
化させる添加物を添加することが好適であること
が判つた。これには生化学に慣用の中性塩、主と
して食塩、緩衝液混合物好ましくはクエン酸塩お
よびクエン酸、ぶどう糖のような炭水化物、ある
いはまたイノシン、アデニンあるいはグアノシン
のようなヌクレオチドならびにまたクロラムフエ
ニコールあるいはネオマイシンのような抗菌剤物
質が使用される。溶液は極端なPH値とされること
なく、むしろ中性点付近に保持される。特にPH
7.0〜7.5がよいことが判つた。
いて一般的に知られているような、懸濁液を安定
化させる添加物を添加することが好適であること
が判つた。これには生化学に慣用の中性塩、主と
して食塩、緩衝液混合物好ましくはクエン酸塩お
よびクエン酸、ぶどう糖のような炭水化物、ある
いはまたイノシン、アデニンあるいはグアノシン
のようなヌクレオチドならびにまたクロラムフエ
ニコールあるいはネオマイシンのような抗菌剤物
質が使用される。溶液は極端なPH値とされること
なく、むしろ中性点付近に保持される。特にPH
7.0〜7.5がよいことが判つた。
アルデヒドあるいはまたスルホサリチル酸で処
理された赤血球はその自然の赤血球に知られてい
る色の輝きを失う。それゆえに読み取り可能性お
よびそれによる好異種IM抗体の検出法の改良の
ために、スルホサリチル酸処理された赤血球を染
色することが本発明の他の目的である適当な色素
は、すでに従来当業者にとつて赤血球の染色に知
られており、また血清学、組織学あるいは細菌学
において使用されているようなものである。特に
適当なのは、クリスタルバイオレツト、マラカイ
トグリーン、フクシンのようなトリアリールアミ
ン、トリアリールメタンおよびメチン系列の塩基
性色素、トリパンブルーおよびポンソーレツドの
ような酸性および塩基性アゾ色素、エオシンおよ
びロダミンのようなフタレイン、さらにクマシー
ブルー（Coomassie blue）およびツイール
（Ziehl）およびニールセン（Neelsen）による顕
微鏡試料の着色の多数の態様に使用されるような
色素がそれらの中のいくつかの例としてあげられ
る。
理された赤血球はその自然の赤血球に知られてい
る色の輝きを失う。それゆえに読み取り可能性お
よびそれによる好異種IM抗体の検出法の改良の
ために、スルホサリチル酸処理された赤血球を染
色することが本発明の他の目的である適当な色素
は、すでに従来当業者にとつて赤血球の染色に知
られており、また血清学、組織学あるいは細菌学
において使用されているようなものである。特に
適当なのは、クリスタルバイオレツト、マラカイ
トグリーン、フクシンのようなトリアリールアミ
ン、トリアリールメタンおよびメチン系列の塩基
性色素、トリパンブルーおよびポンソーレツドの
ような酸性および塩基性アゾ色素、エオシンおよ
びロダミンのようなフタレイン、さらにクマシー
ブルー（Coomassie blue）およびツイール
（Ziehl）およびニールセン（Neelsen）による顕
微鏡試料の着色の多数の態様に使用されるような
色素がそれらの中のいくつかの例としてあげられ
る。
本発明による試薬を例えばクマシーブルー〔ア
ナゾレヌムナトリウム（Anazolenum
natricum）〕のような青色色素を用いて実施する
場合に特に明瞭に読みとり得る試験結果が得られ
る。
ナゾレヌムナトリウム（Anazolenum
natricum）〕のような青色色素を用いて実施する
場合に特に明瞭に読みとり得る試験結果が得られ
る。
例としてあげられている色素を用いる本発明に
より処理された赤血球の着色は血清学において知
られている処置により行われる。赤血球懸濁液に
色素溶液をそれに慣用の濃度で加えそして着色の
進行を観察する。色の強度が充分であるように見
えれば直ちに赤血球を沈降あるいは遠心分離によ
り色素溶液から分離し、赤血球を上記に記載され
ている方法で繰返し洗い、安定化剤を加え、それ
から赤血球５〜20×108個／mlを含有している懸
濁液に再懸濁する。
より処理された赤血球の着色は血清学において知
られている処置により行われる。赤血球懸濁液に
色素溶液をそれに慣用の濃度で加えそして着色の
進行を観察する。色の強度が充分であるように見
えれば直ちに赤血球を沈降あるいは遠心分離によ
り色素溶液から分離し、赤血球を上記に記載され
ている方法で繰返し洗い、安定化剤を加え、それ
から赤血球５〜20×108個／mlを含有している懸
濁液に再懸濁する。
着色されまたは着色されていない赤血球を含有
する試薬は室温よりも低い温度で、しかしながら
０℃以上好ましくは約＋３〜＋６℃の温度で好ま
しくは貯蔵される。
する試薬は室温よりも低い温度で、しかしながら
０℃以上好ましくは約＋３〜＋６℃の温度で好ま
しくは貯蔵される。
IM抗体の検出のための診断法は、好異種抗体
の疑いのある血清に希釈系列下で本発明により処
理された赤血球の一定量を加え、場合によつては
生じる凝集を評価する。凝集は好ましくはガラス
スライド上あるいは個々の区画に細分されている
比較的大きいプレート上で行われる。特に良好に
は試験はまた知られた小点プレート上で行われ
る。その際着色された赤血球は特にその凝集を輝
いて示し、着色されていないものに比較してより
良好に読み取ることを可能にする。
の疑いのある血清に希釈系列下で本発明により処
理された赤血球の一定量を加え、場合によつては
生じる凝集を評価する。凝集は好ましくはガラス
スライド上あるいは個々の区画に細分されている
比較的大きいプレート上で行われる。特に良好に
は試験はまた知られた小点プレート上で行われ
る。その際着色された赤血球は特にその凝集を輝
いて示し、着色されていないものに比較してより
良好に読み取ることを可能にする。
肉眼でみられる大きな凝集、いわゆる塊がみら
れる場合に、IMの検体についての試験結果は陽
性である。疑わしい場合はルーペあるいはプレー
ト顕微鏡を使用すると凝集の認識が容易になる。
供試赤血球の懸濁液が微細な均質のままに留まつ
ているときには試験結果は陰性である。
れる場合に、IMの検体についての試験結果は陽
性である。疑わしい場合はルーペあるいはプレー
ト顕微鏡を使用すると凝集の認識が容易になる。
供試赤血球の懸濁液が微細な均質のままに留まつ
ているときには試験結果は陰性である。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例
Ａ 馬の赤血球の処理
アルゼフエルス（Alsevers）溶出中の新たな
馬の血液（１：１）350mlを遠心分離し、赤血球
沈降物の10倍量（容量に基づく）のPH7.2のりん
酸塩緩衝化食塩溶液（PBS）でそれぞれ10分間ず
つ５回洗う。遠心分離は3000U／分で行われる。
その間にポリビニルピロリドン（PVP、分子量
350000）15ｇをりん酸塩緩衝したNaCl溶液
（PBS、PH7.2）1500ml中に溶解させる。最後の赤
血球洗浄後に１％PVP―PBS溶液を添加すること
により沈降物を５〜10％赤血球懸濁液に調整す
る。
馬の血液（１：１）350mlを遠心分離し、赤血球
沈降物の10倍量（容量に基づく）のPH7.2のりん
酸塩緩衝化食塩溶液（PBS）でそれぞれ10分間ず
つ５回洗う。遠心分離は3000U／分で行われる。
その間にポリビニルピロリドン（PVP、分子量
350000）15ｇをりん酸塩緩衝したNaCl溶液
（PBS、PH7.2）1500ml中に溶解させる。最後の赤
血球洗浄後に１％PVP―PBS溶液を添加すること
により沈降物を５〜10％赤血球懸濁液に調整す
る。
１％PVP溶液中の2.5％５―スルホサリチル酸
溶液の同量を滴下しそして室温で撹拌（磁気撹拌
器）して30〜40分間の間全体を反応するのにまか
せた。赤色から褐色への変化はスルホサリチル酸
―PVP―PBS溶液の添加完了後すぐに起る。赤血
球懸濁液の変色の30分後に赤血球をPH7.2のPBS
中で５回洗いそして遠心分離（１回の洗浄当り
3000rpmで20分）により取得する。
溶液の同量を滴下しそして室温で撹拌（磁気撹拌
器）して30〜40分間の間全体を反応するのにまか
せた。赤色から褐色への変化はスルホサリチル酸
―PVP―PBS溶液の添加完了後すぐに起る。赤血
球懸濁液の変色の30分後に赤血球をPH7.2のPBS
中で５回洗いそして遠心分離（１回の洗浄当り
3000rpmで20分）により取得する。
Ｂ スルホサリチル酸処理赤血球の着色
赤く染色した懸濁液を調製するには着色溶液と
してツイール―ニールセンス―カーボルフクシン
溶液（ZN溶液、メルク9215）を使用する。スル
ホサリチル酸処理した赤血球の着色は前記Ａによ
る赤血球沈降物の２回目の洗浄の後に行われる。
これには沈降物をZN溶液からPH7.2のPBSを用い
て１：30希釈することにより調製されるZN着色
溶液中にとりそして全体を室温で15分間保持す
る。次いで前記Ａに記載されているようにしてPH
7.2のPBS中でさらに３回洗う。最後の洗浄上澄
み液は透明である。最後の沈降物に安定化剤溶液
（後記Ｃ）を添加することにより10％の赤色に着
色した赤血球懸濁液が調製される。これは次に処
理されるまで冷蔵庫に保管される。
してツイール―ニールセンス―カーボルフクシン
溶液（ZN溶液、メルク9215）を使用する。スル
ホサリチル酸処理した赤血球の着色は前記Ａによ
る赤血球沈降物の２回目の洗浄の後に行われる。
これには沈降物をZN溶液からPH7.2のPBSを用い
て１：30希釈することにより調製されるZN着色
溶液中にとりそして全体を室温で15分間保持す
る。次いで前記Ａに記載されているようにしてPH
7.2のPBS中でさらに３回洗う。最後の洗浄上澄
み液は透明である。最後の沈降物に安定化剤溶液
（後記Ｃ）を添加することにより10％の赤色に着
色した赤血球懸濁液が調製される。これは次に処
理されるまで冷蔵庫に保管される。
Ｃ 安定化剤溶液（PH7.2）
以下の物質を蒸留水1000ml中に溶解させる。
20.5ｇ／ 無水ぶどう糖
8.0ｇ／ クエン酸ナトリウム・3H2O
4.2ｇ／ NaCl
0.55ｇ／ クエン酸
0.429ｇ／ クロラムフエニコール
0.122ｇ／ ネオマイシン塩酸塩（１
ｇ当りネオマイシンＢ塩基832mg） 4.0ｇ／ イノシン 0.2ｇ／ アデニン 0.2ｇ／ グアノシン 0.1ｇ／ チメロサール この溶液を5n NaOHを用いてPH7.3に調整しそ
して減菌条件下に濾過する。
ｇ当りネオマイシンＢ塩基832mg） 4.0ｇ／ イノシン 0.2ｇ／ アデニン 0.2ｇ／ グアノシン 0.1ｇ／ チメロサール この溶液を5n NaOHを用いてPH7.3に調整しそ
して減菌条件下に濾過する。
Ｄ IM試薬の調製
ガラススライド上あるいはガラス凝集プレート
上でIM試薬を使用するために安定化剤溶液（前
期Ｃ）中の７％赤血球懸濁液を調製する。この細
胞濃度は、着色されていない赤血球にも、そして
また着色されている赤血球にも適用される。
上でIM試薬を使用するために安定化剤溶液（前
期Ｃ）中の７％赤血球懸濁液を調製する。この細
胞濃度は、着色されていない赤血球にも、そして
また着色されている赤血球にも適用される。
磁器小点プレートを使用するに際して安定化剤
溶液Ｃ中の3.5％細胞濃度が至適であると判つ
た。着色された赤血球は明瞭な凝集形成を示し、
従つて反応のより良好な読み取り可能性を示す。
試薬の充填はねじ蓋および約35μの滴下溶量を
有する滴下ピペツトを有する小びん中に行なわれ
る。この試薬を＋４℃〜＋６℃で保管する。
溶液Ｃ中の3.5％細胞濃度が至適であると判つ
た。着色された赤血球は明瞭な凝集形成を示し、
従つて反応のより良好な読み取り可能性を示す。
試薬の充填はねじ蓋および約35μの滴下溶量を
有する滴下ピペツトを有する小びん中に行なわれ
る。この試薬を＋４℃〜＋６℃で保管する。
Ｅ IM試薬の実施
患者の血清１滴（35μ）を試験プレートの上
の中央にピペツトで滴下し、IM試薬(D)の１滴と
清潔な撹拌棒を用いて注意深く混合する。次いで
試験プレートを約２分間軽くまわす。
の中央にピペツトで滴下し、IM試薬(D)の１滴と
清潔な撹拌棒を用いて注意深く混合する。次いで
試験プレートを約２分間軽くまわす。
伝染性単核白血球増加症についての陽性結果
は、肉眼的にみえる粗い凝集（境界上にはん点の
形成）がみられる場合に存在する。疑わしい場合
の決定にはルーペあるいはプレート顕微鏡が使用
される。
は、肉眼的にみえる粗い凝集（境界上にはん点の
形成）がみられる場合に存在する。疑わしい場合
の決定にはルーペあるいはプレート顕微鏡が使用
される。
陰性の結果は凝集形がないことが特徴である。
懸濁液はこまかい粒子を有する均質のままであ
る。
懸濁液はこまかい粒子を有する均質のままであ
る。
伝染性単核白血球増加症の患者107例中本発明
による試薬での試験で88.8％が陽性であつた。
による試薬での試験で88.8％が陽性であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ スルホサリチル酸で処理された哺乳動物の赤
血球を含有する、伝染性単核白血球増加症を体液
を用いて凝集法で検出するための試薬。 ２ 赤血球が馬の赤血球であることを特徴とする
前記特許請求の範囲第１項による試薬。 ３ 赤血球が色素で染色されていることを特徴と
する前記特許請求の範囲第１項または第２項によ
る試薬。 ４ 動物の赤血球の５〜20％水性懸濁液に色が赤
から褐色に変わるまでスルホサリチル酸の２〜10
％水溶液を加え、次いでこの赤血球が場合によつ
ては色素で染色されていることを特徴とする伝染
性単核白血球増加症を体液を用いて凝集法で検出
するための試薬の製法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19782847877 DE2847877A1 (de) | 1978-11-04 | 1978-11-04 | Reagenz zum nachweis der infektioesen mononucleose |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=6053854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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