JPS6265682A - ヒト単球懸濁培養物、その製造方法及びそれを含む薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ この発明は精製ヒト単球の生体外での培養に関する。さ
らに詳細に言うと、この発明は、無血清培地中に懸濁し
た形態での精製ヒト単球の培養に関する。

［従来技術］ 単核食細胞（単球）は、その種々の形態において、哺乳
動物の免疫応答の多くの重要な局面に関与することか示
されている。単球及びマクロファージは、抗原を処理す
る能力の故に（ロゼンタル　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ、　３０３．１１５３．１９８０）　、並びに
インターロイキン１　（ＩＬ−１）、コロニー刺激因子
（Ｃ８Ｆ）　、インターフェロン（ＩＦＮ）及びプロス
タグランジンＥ　（ＰＧＥ）のような、多くの免疫応答
に対し単球やマクロファージか免疫調節物として機能す
ることを可能にする可溶性因子を分泌する能力の故に（
ニブシュタイン、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｌｙ＋５ｐｈ
ｏｋｉｎｅｓ；　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
Ｙ、　ｐｐ、１２３−１５２．１９７９；５ｔｅｖｅｎ
ｓｏｎ、　Ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ　５ｙｓｔｅ＠、　ＡＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖ
ｅ　　Ｔｒｅａｔｉｓｅ、　　Ｖｏｌ、　　Ｖｌ：　　
ＰｌｅｎｕａＰｒｅｓｓ、　ＮＹ、　ｐｐ、７９−９１
．１９８２）免疫応答の開始に必須的であることか知ら
れている。さらに、中球は補体成分を分泌しくナタンら
、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ。

Ｍｅｄ、　３０３．６２３．１９８０）、抗体依存性細
胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を包含する細胞毒機能を媒介
することかできる（ボブラックら、Ｂｆｏｏｄ　４８．
８０９．１９７６）のて、体液性免疫において最終エフ
ェクター細胞として重要な役割を演することが知られて
いる。

ヒト単球の生体外での機能の評価は多くの技術的及び理
論的問題によって妨げられてきた。第１に、単球は、ヒ
トの末梢血液中に占める割合か極めて小さい（一般的に
５％未満）。従って、これを大量に得ることかかなり困
難であった。さらに、ネガティブ選択によって精製され
たヒト中球の集団を大規模に分離することを可能にする
技術かほとんど開発されていない。その代わり、一般的
に、かなり不純な少量の弔疎かパーコールのような勾配
によって分離され（ヘスターら、１９８＋）　、又は、
より純度の高い細胞がポジティブ選択によって、それら
をプラスチック又はガラス製のラブウェア（ｌａｂｗａ
ｒｅ）上に付着させることによって分離されている（ワ
アーブ、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１４７、１６９５．１９７８）。

単球がポジティブ選択により得られた場合には、それら
なさらに研究するために取り除くことが困難になる。付
着した細胞をプラスチック又はガラス表面から取り除く
にはかなり過酷な種々の方法が採用される。すなわち、
ゴムポリスマン（ペンライン、Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍ
ａｃｒｏｐｈａｇｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、　Ｉ）Ｉ
）、　６５−７７、１９８１）　、　ＥＤＴＡ　（アカ
−マンとダグラス、Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、　１２０．
１３７２゜１９７９）　、又はリドカイン含有溶液（コ
スキら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｎｄ　ＴｕｍｏｒＩｍｍ
ｕｎｉｔｙ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、
　３５９．１９７６）の使用などである。付着及びポジ
ティブ選択の潜在的問題は、細胞か培地中に入れられた
ときにさらに複雑になる。なぜなら、多くの研究者は、
単球が容易に付着するある種のポリスチレンラブウェア
を用いているからである。

付着した単球はもちろん、そのヒト末梢血液中に懸濁さ
れた正常な状態とは異なる状態にある。従って、その機
能もまた異なっているかもしれない。さらに、それらか
一般的に培養される培地状態下に置かれたときには、ヒ
ト単球は多くの理論的及び技術的不十分さを露呈する。

これらの問題は主として、ヒト単球のような代謝活性の
ある細胞のための多くの標準的な実験室培地中の栄養素
か限られていること、及びヒト単球を異なるヒト固体か
らの血清（ＡＨ血清）又は他の種からの血清（例えばウ
シ胎児血清）中て培養することによるアーティファクト
に起因する。従って、ヒト中球を培養するための一貫し
た均一な条件を異なるバッチにおいても確保することが
てきない。

対照的に、この発明は、精密に規定された無血清培地及
び長期間の懸濁培養において単一の供給者から高度に濃
縮された大量、すなわち１０８又はそれ以１−のヒト単
球を得る条件を与える。このような実質的に無限な同厚
のヒト単球を供給することによって、単球を実験的、薬
剤的、治療的目的、特に免疫治療に用いることが可能に
なる。

［発明の開示］ 従って、この発明の１つの目的は、無血清培地中で懸濁
培養された、単離された実質的に純粋なヒト中球を提供
することである。

さらにまた、この発明の目的は、精製されたヒト中球を
無血清培地中で懸濁状態て生体外で培養し活性化する方
法を提供することである。

さらにまた、この発明の目的は、適当な担体、アジュバ
ント及び／又は生物学的応答修飾剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＢＲＭ
）を含む非付着性の容器中に懸濁された、単離、精製さ
れたヒト単球から木質的に成る、免疫治療のための医薬
組成物を提供することである。

さらにまた、この発明の目的は、適当なアジュバント及
び／又は生物学的応答修飾剤を含む又は含まない無血清
培地中に懸濁された、免疫治療量の単離、精製された単
球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物のガン
の治療方法を提供することである。

この発明の他の目的及び利点は以下の詳細な説明を読み
進むに従って明らかになってぃくてあろう。

［発明を実施するための最良の態様］ 」二足及び］−記以外のこの発明の［１的は、無菌の無
血清培地中に懸濁された、単離された実質的に純粋なヒ
ト単球を提供することによって達成される。この発明の
単離、培養されたヒト中球は生物学的応答修飾剤及び／
又はアジュバントによって補強、活性化され得る。

この発明の重要な局面の１つに、ヒト単球に対して不活
性、すなわち無害てあり、かつヒト単球か付着しない装
置、容器、器具、実験設ｉｉＩｋｇ−を用いるというこ
とかある。ヒト中球を取り扱うあらゆる場合において、
無害て非付着性の器具を用いることはこの発明の重要な
特徴である。この発明に用いることかできる、不活性、
無害、非付着性て減菌可能な材料の好ましい例としてポ
リテトラフルオロエチレン（テフロン）を挙げることか
できる。ヒト単球に対して無害て非付着性の材料である
ならば、当業者にとって明らかな又は示唆される他の類
似の材料も用いることかできる。

もっとも、テフロンは、市販されており、（例えばプラ
ウエア州つイルミントンのデュポン社から）容易に入手
可能であるので好ましい。

この発明に従った容器は、ソリッドなテフロンシートか
らつくることかえきる。このような容器又は実験器具の
例として、好ましくは０．１ないし２００１容量の、種
々の形状、サイズのフラスコ及びマイクロタイタープレ
ートを挙げることができる。もちろん、便利なように、
ソリッドなテフロン容器の形状及びサイズは、試験、培
養又は他の準備的作業に定型的に用いられる他の実験器
具と類似するように選択される。

この明細書で用いる「実質的に純粋な」又は「実質的に
精製された」という語は、ヒト単球が、当業者に一般的
に知られた方法によって得ることか可能な最大限に純粋
であることを意味する。もっとも、実質的に純粋である
ためには９０％以りの純度か必要である。

「活性化された」単球及び単球の「活性化」という語は
、単離された単球が、単球の免疫制御的、生物学的若し
くは理化学的性質又は中球本来の性質又は機能を刺激し
、修飾し又は高めるてあろう薬剤又は因子に接触させら
れ又は処理されていることを意味する。このような薬剤
又は因−ｆは適当な抗原、アジュバント、生物学的応答
修飾剤等を包含する。

「不活性な」容器という語は、容器を構成する材料か、
容器中て培養される単球の自然な、すなわち正常な機能
に対し毒的な作用を示さないことを意味する。

生物学的応答修飾剤という語はインターフェロン（ＴＦ
Ｎ）のようなサイトカイン：インターロイキン−１（Ｉ
Ｌ−１）のようなリンホカイン；ポリリボイノシン酸、
ポリリボシチジル酸、ポリＬ−リジン、カルボキシメチ
ルセルドース（ポリＩＣＬＣ）及びレハミソル（Ｉｅｖ
ａｍｉｓｏｌｅ）のような免疫調節機能を有する合成化
学薬剤：ハチル・カルメッデ・グエリン（ＲＣＧ）　、
コリネバクテリウム・バーハム、スタフィロコツカス・
タンパクＡ、単一クローン抗体、腫瘍抗原製剤のような
免疫調節アジュバントを包含する広範囲の化合物を包含
する。コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）及びプロスタグラン
ジンＥ　（ＰＧＥ）は他の適当な生物学的応答修飾剤の
例である。

ヒト単球はこの分野において広く知られた常法によって
末梢血液から単離することができる。

もっとも、単球の単離及び精製のための好ましい方法及
び材料は後述する。用いた他の好ましい方法及び材料も
また記載する。以下に引用される全での刊行物はこの明
細書に組み入れられたものとする。

ヒト単球の単離 白血球をリューカフニレシス（Ｉｅｕｋａｐｈｅｒｅｓ
ｉｓ）によって得た（遠心■リューカフニレシス装置、
イリノイ州ディアフィールト、トラベノール・ラボラト
リーズ社製）。次に単球を対向流遠心懸濁分離法（ＣＣ
Ｅ）　　（ステイーブンランとファウチ、Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇ
ｙ、　ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、ｐｐ
、７５−８０．１９８１）によって未分画の中核白血球
試料から分離した。得られた単球試料の純度及び生存性
を、ステイーブンランとファウチ（上述）に記載された
方法に従って、非特異的エステラーゼ染色、ライト染色
及びラテックスビーズ取り込み（ｌａｔｅｘ　ｂｅａｄ
ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）によって測定した。通常の供給者
−人当たりの単球の平均収量は約５５０万細胞である（
ステイーブンランら、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｓ
ｈ、　６２゜３５３、１９８：ｌ）。

培養方法 精製ヒト単球を単細胞懸濁状態に保つために、テフロン
製（マサチューセッツ州、コーニング、コーニング・グ
ラス・ワーク社製）の特に開発された培養プレートを用
いた新しい培養方法か開発された。これらの培養プレー
トは、標準的な２４穴の平底ポリスチレン培養プレート
（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コスタ−・プラ
スチックス社製）の寸法に丁度一致する。ヒト単球を自
動細胞計数器（イリノイ州、エルムハースツ、エレクト
ロゾーン／セロスコープ・パーティクル・データ社製）
で計数し、無血清培地にューヨーク州、バッファロー、
ロスウェル・パーク・メモリアル・インスティテユート
社製）又はＲＰＭＩ］６４０＋１ｏｚヒト血清＋Ｌ−グ
ルタミンに１０６単球／１の濃度で懸濁した。ヒト血清
を用いた試験ては、１０％を越える濃度を採用すると生
物学的応答修飾剤分泌の改善は見られなかった。従って
、ＲＰＭＩＩ　６４０中１０％ヒトＡＢを標準血清含有
培地として用いた。抗生物質は細胞培養懸濁液に加えな
かった。

Ｃ３Ｆ及びＰＧＥ分泌の活性化剤及びその最適濃度は、
１００　ＩＬｇ／ｍｌのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）
（カリフォルニア州、う・ジョラ、カルバイオケム社製
）　、　５　＃Ｌｇ／ｍｌのリボ多糖（ＬＰＳ）　　（
ミズーリー州、セント・ルイス、シグマ社製）、および
５０ＪＬｇ／ｍｌのポリリボイノシン酸ポリリボシチジ
ル酸（ポリＩ：Ｃ）　（シグマ社製）であった。インタ
ーフェロン（ＩＦＮ）分泌の活性化剤として、至適終濃
度２００　ＪＬｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃ（シグマ社製）を
ウェルに加えた。懸濁単球培養物は５＄ＣＯ２インキユ
ベーター中て３７°Ｃてインキュベートした。調べた生
物学的応答修飾剤の最大濃度は培養４８時間後に観察さ
れた。この時点てプレートを２００ｇ’ｔ’１回遠心し
、」１清を回収してＩＦＮ、Ｃ３Ｆ又はＰＧＥ活性を調
べた。全での培養物は各３回づつつくって試験した。

培養後の単球の食作用、回収及び生存性４８時間培養し
た後、種々の単球試料の生存性をトリパン・ブルー染料
排除、ラテックスビーズ取り込み及び培養物中に残留す
る細胞数を計数することによって生存性を調べた。ラテ
ックスビーズ、次いでトリパン・ブルー染料を培養物に
加えた。培養物の１部を３０分後にテフロン懸濁培養物
から吸引し、位相顕微鏡で観察して生存細胞及び食作用
を有する単球のパーセントを調べた。付着した単球ポリ
スチレン培養プレートについては、その場て食作用及び
生存性を逆位相顕微鏡で観察して調べた。懸濁液中の細
胞数の測定は、培養ウェルなゆっくりと数回ピペッティ
ングし、吸引物中の細胞を計数することによって行なっ
た。伺着細胞数の測定は、吸引後のウェルにｌｌのＲＰ
Ｍ１１６４０を加えた後、ゴム製ポリスマンで激しくひ
っかき、離脱した細胞を計数した。

無血清培地 細胞は、ヒト血清アブルミン（無脂肪酸、４　ｍｇ／■
ｌ）、コレステロール（純度９９％以上、２０ｇｇ／ｍ
ｌ）　、　Ｌ−ａ−７ｔスチジルコリン（８ｏ＃Ｌｇ／
ｌ）、及びヒトトランスフェリン（純度９８％）　（以
上、全てシグマ・ケミカル社製）、インシュリン（０，
１２８ユニツト／■１、インジアナ州、インジアナポリ
ス、イーライイ・リリー社製）、塩化第一鉄（７ｘ　１
０−”Ｍ、ニューシャーシー州、フェアロラン、フィシ
ャー・サイエンティフィック社製）及びβ−メルカプト
エタノール（１０−’Ｍ、ニューヨーク州、ロチニスタ
ー、イーストマン・コダック社製）を加えたイスコベの
修飾ダルベツコ培地（ＭＤＭ）から成る、ブラウンら（
Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

１１５、１９１）によって記載された無血清培地中て培
養した。Ｌ−α−フォスファチシルコリン及びコレステ
ロールは一緒に製造し、ブランソン超音波破砕器で６に
セットして４°Ｃで６０分間超音波破砕した。この試料
は、他の試料と同様に、次にろ過しく０．４５−糟、ニ
ューヨーク州、ロチニスター、ナルゲ社製）　、−２０
°Ｃで貯蔵した。

インターフェロン測定 ＩＦＮの培養」１清活性は、マイクロタイタープレート
（メリーラント州、ロックビル、バイオフルイド社製）
中て、水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に感染したヒト
包皮の細胞変性効果を阻害することによって測定し、対
照標準中位て表現されている。対照ヒトαＩＦＮは国立
アレルギー及び感染疾病研究所から供給された。

ＰＧＥ放射免疫測定 ＰＧＥをスチールら（Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

６４、２８７．２９７９）及びスチールら（Ｊ、　Ｒｉ
ｏｔ、　Ｃｈｅｗ。

２５６、２６９．１９８１）によって記載された方法に
従って放射免疫測定（ＲＩＡ）によって測定した。全で
の結果は培養」−清１ｍｌ当たりのＰＧＨのピコグラム
数で表現されている。

コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）測定 刺激した単球上清中のＣ３Ｆ濃度をラディッシュら（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３９．２５４４．１９７９）及
びシュリックら（Ｍｅｃｈａｎｉｓ＋＊ｓ　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｅ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ。

Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　ＮＹ、　１９８４）に
よって記載されたように測定した。　ＧＭ−Ｃ３Ｆは、
１．０１のＣ３Ｆ供給源の存在下で１０５個の正常な骨
髄細胞によって形成されたミニロイドコロニーの数から
計算し、ユニット／１で表わした。

統計学的手法 それぞれの実験において、全での主要変数（プレートの
型、培地の型、活性化剤及び供給者）並びに主要変数相
互作用を包含する直線的統計モデルを採用した。変数の
分析はＣ３Ｆの生データ、ＩＦＮの自然対数、及びＰＧ
Ｅデータの刺激指数（刺激／対照値）に基づいて行ない
主要効果の有意性を決定した。３以七のレベルの因子の
ために、ダンカンの多範囲試験を採用して一対的な差の
有意性を決定した（スネデカーとコクラン、５ｔａｔｉ
ｓｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｐｐ、２３３−２３
７．１９８０）。

ヒト単球の生存性及び数に対する培養システム変テフロ
ンプレート中て培養した場合とポリスチレンプレート中
て培養した場合、及び１０ＸＡＲ中で培養した場合と無
血清培地中で培養した場合について、ヒト単球の機能を
調べるために比較実験を行なった。第１表に示すように
、培養４８時間後の生存性、食作用及び単球の総回収量
についてはいずれの培養条件を採用しても有意の差は見
られなかった。注目すべきことに、１０＄ＡＢ血清を用
いても無血清培地を用いても、ポリスチレンプレート中
て培養された単球はその８５％以上が底に付着したか、
テフロンプレート中で培養した場合にはいずれの培地を
用いても培養４８時間後の単球の９０％以」−は懸濁液
中に残留した。

ＩＦＮ分泌に対する培養システム変数の効果単球を至適
濃度のポリｌ：ｃ（２００ｋｇ／ｌ）　　（投与量応答
曲線によって決定）と接触させ、」１清を至適時点（４
８時間）て回収すると、ＡＢ血清培地を用いた場合と無
血清培地を用いた場合との間に有意差か見られた。５つ
の別々の実験において、ポリスチレンプレート中で培養
された単球は無血清条件下（第２表）てＩＦＮ分泌が増
加したか（ｐ＜　ｏ、旧）、分泌されたＩＦＮの量には
それぞればらつきが見られた。単球をテフロンプレート
中で培養した場合にも無血清培地中で培養すると同様な
有為なＩＦＮ分泌の増加か見られた。２種類の培養プレ
ート（テフロンとポリスチレン）を用いた比較実験にお
いて、ＩＦＮの生産は培養容器の材料の違いによっては
有意の差か見られなかった（第１表）。これらの結果は
、単球のＩＦＮ分泌にとって付着することか必要てはな
いこをと明確に示している。

Ｃ３Ｆノ）　に太　る、　システムｌ　の　１無血清Ｊ
Ｒ地を用いた場合とＡＢ血清培地を用いた場合、ポリス
チレン培養プレートを用いた場合とテフロン培養プレー
トを用いた場合の効果か第３表にまとめられている。付
着性及び懸濁性培養システムのいずれを用いた場合ても
、無血清培地を採用することによってＣ３Ｆの生産のベ
ースラインに有意の影響は見られなかった。対照的に、
至適投与量のＬＰＳ、ＭＤＰ及びポリＩ：Ｃ／ＬＣを用
いると、Ｃ３Ｆの分泌か有意に高まった（ｐ＜０．旧）
。

ＡＢ培地を用いた場合ても無血清培地を用いた場合でも
、単球はテフロン培養プレートを用いた方がポリスチレ
ンプレートを用いるよりも多くのＣ３Ｆを分泌する傾向
かあることがわかる。

Ｉ’ＧＥ分泌に対する培養システム変数の効果ヒト中球
によるＰＧＥの放出に対する無血清培地の最も有為な効
果は生産のベースラインレート（ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｒ
ａｔｅ）を下げることである（ｐ＜ｏ、旧）。

ベースラインかＦがることにより、ポリＩ　：Ｃ／ｌ、
Ｃ１ＬＰＳ又はＭＤＰて刺激した後の刺激指数か有意に
大きくなる（Ｐ＜　０．０１）　　（第４表）。テフロ
ンプレート及びポリスチレンプレートのいずれを用いて
もＰＧＥの放出の刺激指数には有意の差は見られなかっ
た。

での　血球　性化（ＥＶＬＡ）　　療 Ｅ　Ｖ　１．Ａ治療の目的はガン又は免疫疾患を有する
患者の末梢血液又は骨髄から実質的な数の白血球を取り
除き、続いである細胞毒的な白血球集団を精製すること
である。精製された白血球は次に生体外で殺腫瘍性又は
免疫治療性活性環境下で拡張及び／又は活性化され、患
者中の腫瘍領域又は免疫疾患領域に再び注入される。

ヒト血液単球及びその分化した組織性対応物であるマク
ロファージは、直接的に又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤ
ＣＣ）機構によって広範囲の腫瘍標的を殺すことかでき
ることか知られている（ケラ−１Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎ　
ＮｅｏｐｌａｓｉａＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　４８７−５０８．１９７６；　ヒブス、Ｔｈｅ　
　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　　ｉｎ　　Ｎｅｏｐｌａｓｉ
ａ、　　ＮＹ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　８３−
８９．１９７６；エバンス、Ｉｍｍｕｎｏｂ　ｉｏ　ｌ
ｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、　ＮＹ
：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　５：１５−５７６
、１９７６、ハスキル、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ
、　２０：４３２−４４０．１９７７）。しかしながら
、従来、単球を用いたＥＶＬＡは行なわれていなかった
。

ＥＶＬＡのプロトコールをデザインする場合には、いく
つかの臨床に関する基準を考慮しなければならない。第
５表に示すように、臨床的に用いることができる（すな
わち、滅菌されているたけてなくあらゆる毒素を含まな
い）、巾−の精製され、滅菌された、無毒の細胞毒的白
血球集団を採用することか重要である。精製された白血
球集団を用いることにより、それぞれの型の細胞につい
での精密な毒性及び生理学的測定か可能になる。

単一の型の細胞の投与か免疫疾患の治療に有効でない場
合には、単一の型の細胞ベースライン臨床データを集め
て合理的な「組合せＥＶＬＡＪプロトコールをデザイン
することができる。

患者に注入した際に臨床効果を得るためには十分な数（
少なくとも５００万）の細胞を得ることか重要である。

また、これらの細胞を懸濁状態に維持して、細胞塊を注
入しようとする際に遭遇する臨床的問題を回避すること
も必須的である。

白血球活性化物質は臨床グレードのものでなければなら
ない。移植物対宿主疾患の問題が臨床的に最小限に抑え
られるまでは、ＥＶＬＡプロトコールを自己の白血球を
用いるもののみに限定することが好ましい。生体外での
試験により患者の白血球か患者の腫瘍細胞に対して活性
を有することが示された場合には、その細胞毒的白血球
を患者の腫瘍部分に「滞在させる」機構を考え出さなけ
ればならない。

第　　５　　表 ＥＶＬＡ治療プロトコールの好ましい条件Ａ、単一の精
製された細胞毒的エフェクター細胞を採用すべきである
。

Ｂ、臨床的に使用可能なようにエフェクター細胞を精製
することが可能である（すなわち、ピロゲン、病原物質
及び毒物を含まない）。

Ｃ０増幅及び／又は活性化物質を用いる場合には、それ
らは精製すべきであり、また、臨床グレートのもの（Ｉ
ＮＤ健か必要）を用いるべきである。

Ｄ、ＦＤＡは患者に用いる前に「活性化されたエフェク
ター細胞」について個別の許可を取ることを要求するで
あろう。

Ｅ、細胞は抗生物質、動物血清及びあらゆる他の感作剤
の不存在下において懸濁培養することが可能であるべき
である。

Ｆ、臨床的応答及び／又は毒性を引き出すのに十分なエ
フェクター細胞を得る機構を同定すべきである。

Ｇ、移植物対宿主疾患の問題が解決されるまでは自己の
細胞を採用すべきである。

Ｈ，エフェクター細胞を腫瘍部位に滞留させる機構を同
定すべきである。

■、生体外での試験において、精製エフェクター細胞の
活性が患者の腫瘍細胞型に対して活性を有することが示
されるべきである。

腹膜結腸直腸ガン肺病に対する単球ＥＶ１．Ａプロトコ
ール 上述したように、抗原の提供、αインターフェロン、イ
ンターロイキン１、コロニー刺激因子及びある種の補体
系の重要な成分を包含する、単球／マクロファージ細胞
型の多数の免疫学的工フェクター細胞機能か特徴づけら
れている。単球及びマクロファージはまた、肉芽腫の形
成を包含する、多くの細胞媒介免疫応答の主たる細胞性
成分であると信しられている。単球及びマクロファージ
はまた食作用を有することか知られており、これらは免
疫グロブリンＧに対してＦｃレセプターを発現するので
、これらは抗体依存性細胞性細胞Ｉｉｉ性反応（Ａ［Ｉ
ＣＣ）の１な関与物質である。

中球か有能な殺腫瘍性エフェクター細胞であると特徴づ
けられたのはつい最近である。ヒト単球は生体外て腫瘍
標的を認識して殺す能力を有しており、この作用は抗体
とは独立しており、インターフェロンやムラミルジペプ
チドのような物質によって促進されるのかもしれない。

単球及びマクロファージはヒト及び鰯歯動物において細
胞性浸潤物のまたる成分である。ヒト及び鰯歯動物から
の腫瘍に関連したマクロファージを用いた生体外での実
験により、これらの細胞は種々の生物学的応答修飾剤に
よって殺腫瘍活性を有するように活性化することかでき
ることが示された。この明細歯に記載した懸濁培養系中
のヒト血液単球の生体外での再現性のある活性ももちろ
ん臨床的な用途か存在することを示している。

この研究はＥＶＬＡ治療の臨床的な実行可能性を示した
初めでのものである。

第６表に示すように、Ｅ　Ｖ　Ｌ　Ａプロトコールのヒ
ト血液単球の取り扱いに関する多くの技術的及び理論的
困難性が解決された。この明細書に記載したように、２
つの血液成分分離技術、すなわち、サイトフェレシス（
ステイーブンソンら、Ｐｌａｓ■ａＴｈｅｒ　Ｔｒａｎ
ｓｆｕｓ、　Ｔｃｅｈｎｏｌ、　４：５７−６３．　１
９８３゜Ｆｅｎｗａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イ
リノイ州ディアフィールト）及び対向流遠心懸濁分離（
ステイーブンソン、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉ−ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　Ｐａｒｔ　　Ｇ、　　ＮＹ
：Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｂｃｃｋｍａ
ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフｒ）レニア州パロ
・アＪレト）の組合せによって、高度に精製された血液
単球を大量に単離する技術が開発された。これらの技術
の組合せを用いることによって、純度９０％以上のヒト
単球を１０’以上得ることが、細胞を懸濁状態に維持す
ることか可能なネガティブ選択法により可能になった。

このようにして得られる細胞は無菌であり、抗生物質も
いずれの毒物も含まない。−１−述した方法を採用する
ことにより、十分な量の自己の単球を単一の患者から得
ることかでき、有為な臨床的効果を示した。さらに、こ
れらの殺腫瘍的細胞を腫瘍部位に滞留させる能力もまた
、腹膜結腸直腸ガン肺病の患者において示された（第７
表）。

第　　６　　表 単球によるＥＶＬＡ治療 Ａ、同定された精製エフェクター単球を得る技術；対向
流遠心懸濁分離 Ｂ、１球精製及び活性技術は細胞ピロゲン、病原物質及
び毒物フリー状態をもたらす。

Ｃ０精製された、臨床グレートの単球活性化物質（ガン
マインターフェロン）が利用可能である。

Ｄ、精製ガンマインターフェロンによって活性化された
単球の使用許可かＦＤＡから下りた。

Ｅ、抗生物質、動物血清又は他の感作剤を用いることな
く懸濁状態で単球を培養することが可能である。

Ｆ、臨床効果をもたらし得る十分量の単球を得る方法が
同定された：対向流遠心懸濁分離Ｇ、自己単球はＥ’Ｖ
ＬＡに用いることができる。

Ｈ９活性化された単球を患者の腫瘍部位に滞留させる機
構が同定された：腹膜結腸直腸ガン肺病１、種々のヒト
腫瘍細胞に対する単球の細胞毒性の生体外試験か現在性
なわれている。

腹腔結腸直腸ガン肺病は結腸ガンの転移てあり、完全に
致命的である。有効な治療法は今のところまたない。末
期には、疾病は離れた器官（肺や骨のような）に転移し
やすいと信じられており、しばしば内臓に直接局所的に
拡大して患者を殺す。局所的に残留するというこの傾向
は、この転移疾病を局所的に排除することによって患者
の寿命及び患者の状態か大幅に改善されるかもしれない
ということを示唆している。５−フルオロウラシル（５
−Ｆｌｌ腹腔洗詐プロＩ−コール）（スカーベーカー、
Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏ
ｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｉｃｏｔｔ　
Ｃｏ、、　１９８２）を注入するためにテンクホフカテ
ーテルか腹腔内に挿入されている患者を用いた実験によ
り、殺腫瘍性白血球を患者の腫瘍部位に直接入れること
か優れた臨床的効果をもたらすことが示された。

第　　７　　表 腹腔結腸直腸ガン肺病に対する単球−Ｅ　Ｖ　Ｌ　Ａプ
ロ１〜コール 第０週　腫瘍除去ｆ術／テンクホフカテーテルの挿入 患者のサイトフェレシス／単球の懸濁分離１６週間毎週
　ガンマインターフェロン中での中球の一夜活性化 纂 活性化された単球の腹腔内汀入 第１６週　再診断開腹術 第１７−４１週　ＥＶＬＡ治療の維持（必要な場合）こ
の発明に従った腹膜性ガン肺病の中球ＥＶＬＡプロトコ
ールはメリーラント州ベセスダの国立ガン研究所で行な
われた。第１図に示すように、腹腔結腸直腸ガン肺病で
あると診断された患者を国立ガン研究所に呼び、腫瘍除
去手術を行なって外科的に可能な限り疾患フリーの状態
にし、併せて腹腔内に通しるテンコホフカテーテルを挿
入した。ｆ術直後、ガンマインターフェロンによって活
性化された約５００万ないし９００万の精製血液中球を
患者の腹腔内に注入した。これらの細胞は２時間のサイ
トフェレシスの後に対向流遠心懸濁分離による精製を行
なうことによって得られた。この後、精製された単球を
１０００ユニツト／ｍｌの濃度のガンマインターフェロ
ン（イムノモジュレータ−・ラボラトリーズ社製）中て
一夜懸濁培養した。ガンマインターフェロン中て一夜活
性化した後、単球をデンケホフカテーテルを介して腹腔
に注入した。さらに患者の活性単球か腹腔内に最大限に
分散するように患者に２リツトルのインバーゾル（イリ
ノイ州ディアフィールド、トラベノール・ラボラトリー
ズ社製）のような腹腔洗浄液を投り、シた。この型の治
療法に対する患者の反応をはっきりと確認するために単
球ＥＶＬＡの終了時期である第１６週に再診断開腹術を
行なった。単球ＥＶＬＡ治療に対して完全な又は部分的
な反応を示した患者については、単球ＥＶＬＡ治療を６
カ月間続けることにした。

単球ＥＶＬＡプロトコールに関する臨床的観察最初に２
人の患者が国立ガン研究所の生物学的治療及び外科支部
において単球ＥＶＬＡプロトコールに従って処置を受け
た。２人の患者の病状及び単球ＥＶＬＡ治療に対する反
応は非常に似ていた。２人とも白人の女性であり、年令
は３８歳と４１歳で、１人は１２力月前に腹腔結腸直腸
ガン肺病であると診断され、もう１人は６力月前に診断
された。２人とも離れた器官に転移した証拠はなく、ま
た他の重大な疾病を有していなかった。２人とも機能状
態は良好であった。２人の患者とも腹腔表面かガンによ
って激しく侵されており、腹腔の隔壁が識別てきない程
度であった。もっとも、患者は２人とも他のどの部分よ
りも小腸に可視的な転移疾病か少なかった。肉眼で見え
る限りの疾患部分を除去する手術は成功した。１人の患
者は、悪性腫瘍部分を除くために結腸の大部分を除去し
なければならなかった。もう１人の患者は同し［１的の
ために牌臓を除去しなければならなかった。

、壱者は２人とも単球ＥＶＬＡ治療を非常に良く許容し
た。第２の患者かられかったように、最初の除去手術か
ら患者か回復した後はこの治療は通院治療によって安全
に行なうことかできることかわかった。典型的には、患
者は通院部のサイトフェレシスユニットに朝到着し、こ
こで２時間サイトフェレシス操作を受けて５　ｘ　１０
９ないし９　ｘ　１０９個の白血球が除去される。この
操作の後、患者は家に戻り、その午後及び夜に患者の単
球は懸濁分離によって精製され、ガンマインターフェロ
ン（１０００ユニツト／■ｌ）中て懸濁培養される。次
の朝、患者は通院部に来て、活性化された血液単球及び
２リツトルの追加的な腹腔内インバーゾルを注入される
。この注入には通常３０分を要する。

患者は次に経１１鎮痛剤及びチレノールを持って帰宅す
る。−・般的に４ないし６時間以内の単球の注入で患者
は低度の発熱（−貫して１０１０Ｆ未満）及び腹痛を覚
え始める。発熱はチレノールて抑えることかでき、痛み
も通常経口的鎮痛剤によって抑えることかできる（痛み
があまりにも激しい場合には、通院部において患者は非
経［１的麻酔剤を投与された）。１２時間以内に２人の
患者とも一般的に低度の発熱と腹痛がおさまり、週の残
りは通常の日常生活を送った。２人の患者とも、サイト
フェレシス操作後の４ないし７週間は低度の顆粒球減少
症を起こした（総白血球数か約３，５００）。この時点
てＥＶＬＡ治療の頻度を２週間に１回にして末梢白血球
数を正常化した。

プロトコールの中間時点に、腹腔内に注入された単球の
移動パターンを１１１インジウムで半球を予めラベルす
ることによって調べた。第２図は、腹腔内での１１１イ
ンジウムラベルした中球の典型的な分散状態を示す。再
診断手術において手術後接着のためであることか判明し
た、取り込みの少ないわずかな部分を除き、単球は均一
に分散していた。１１１インジウムラベルした単球を腹
腔内に注入した後５０以内の、これらの患者から得られ
た解読可能な像から、細胞は腹腔外には移動しなかった
ことか示された。それどころか、単球は組織マクロファ
ージに変わりながら腹腔の細胞性マトリックス内に取り
込まれていくように思われた。

２人の患者とも再診断開腹術を受けた。２人の患者とも
、最初の手術の際に数万の転移病巣を有する最もひどく
侵された部位を包含する腹腔の表面の大部分が正常に戻
っていた。２人の患者とも結腸又は内臓に大きな病巣を
有さす、離れた器官への転移も見られなかった。もっと
も、２人とも、中球の接近か制限された部位（主として
腹腔接着の故に）に極めて小さな疾病部分か残存した。

彼女等は、接着を取り除き、その部分をさらし、そして
病巣（全て１ｃｍ未満）を外科的に除去することによっ
て疾患フリーの状態になった。２人の患者とも、再診断
開腹術後の回復期間中、単球Ｅ　Ｖ　１．Ａ治療を受は
続けた。

Ｌ述した結果から、活性化された血液単球を用いた腹腔
結腸直腸ガン肺病の免疫治療が実行可能であることが明
らかに示された。最大の抗腫瘍効果を得るために、活性
化された単球を天然のキラーリンパ球、抗原特異的キラ
ーリンパ球、Ｂ細胞等のような他の因子と組合せること
もできる。このような「組合せＥＶＬＡＪ治療は、天然
の免疫系を置換し、補充し、真似し、又は再構築するこ
とができる。

もちろん、生体外て培養された、自己の懸濁液中単球の
利用可能性により、免疫調節システムが免疫疾患の故に
悪影響を受けている哺乳動物中の免疫調節システムを免
疫治療し及び／又は補強するための新たな展望か開けた
。

この明細書で記載した実施例は例示の目的のみのために
記載されたものてあって、種々の修飾又は変更が当業者
によって示唆されるてあろうし、それらはこの明細書及
び特許請求の範囲の範囲及び精神に包含されることか理
解される。

【図面の簡単な説明】

第１図は腹腔結腸直腸ガン肺病のための中球ＥＶＬＡプ
ロトコールに従った操作のフローシートを示す図、 第２図は腹腔結腸直腸ガン肺病患者の腹腔に１１１イン
ジウム標識した活性化単球を注入した後４時間後の単球
の分散状態を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）単離、精製されたヒト単球を、不活性な容器中に
   入れられた培地中で、単球が容器に付着しないように培
   養することから成る、生体外でのヒト単球懸濁培養物の
   製造方法。
2. （２）前記単球を無血清培地中で培養する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. （３）１０＾８個以上の単球を得る特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
4. （４）前記単球はポリテトラフルオロエチレン容器中で
   培養される特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）単離され、実質的に純粋な、機能的なヒト単球懸
   濁培養物。
6. （６）前記単球は無血清培地中で培養される特許請求の
   範囲第５項記載の培養物。
7. （７）前記単球は生物学的応答修飾剤によって活性化さ
   れている特許請求の範囲第６項記載の培養物。
8. （８）免疫治療量の単離され、実質的に純粋な機能的ヒ
   ト単球懸濁培養物及び薬理的に許容できる担体とから成
   るヒトの免疫治療のための薬剤組成物。
9. （９）前記単球は活性化された単球である特許請求の範
   囲第８項記載の組成物。
10. （１０）生物学的応答修飾剤をさらに含む特許請求の範
    囲第９項記載の組成物。