JPS626678A - 耐熱性グルコアミラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、耐熱性のグルコアミラーゼの製造法に関する
ものである。

グルコアミラーゼ（ＥＣ３，２，１，３）はアミログル
コシグーゼとも呼ばれ、アミロース、アミロペクチン、
グリコーゲン及びデキストリン等のα−１゜４グルコシ
ド結合を有する多糖に作用し、その非還元末端からグル
コース単位に切断していく酵素として知られており、で
んぷんの加水分解工業やアルコール発酵工業及び酒類の
製造業等において重要な役割を担っている酵素である。

従来からグルコアミラーゼを安定、かつ、大量に採取す
るための酵素源として微生物が用いられており、特にリ
ゾプス・デレマー（Ｒ，ｄｅｌｅｌｎｅｒ）、リゾプス
・ニベウス（Ｒ，ｎ１ｖｅｕｓ）、リゾプス・ジャバニ
カス（Ｒ，ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・二
〃−（＾、ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・アワモリ
（Ａ。

ａｗａｍｏｒｉ）等の糸状菌や、酵母菌又は酵母類似菌
のエンドミコプシス属に属する菌株が強力なグルコアミ
ラーゼ産生菌として知られている。

しかしながら、これらの産生するグルコアミラーゼの最
適反応温度は５５℃〜６０℃であり、６０℃以上に最適
反応温度を有するグルコアミラーゼは報告されていない
。

でんぷんの加水分解工業において糖化工程は、５５℃超
〜６０℃未満で４８〜７２時間の長時間を要している。

更に、５５℃以下では微生物汚染の不安があり、６０℃
以上では酵素の失活が生ずるため、温度管理が厳しく要
求されている。

そこで、本発明者らは６０℃以上に最適反応温度をもつ
グルコアミラーゼが得られるならば、糖化反応時間の短
縮及び微生物汚染の防止など経済的効果が極めて大きい
ものと考え、鋭意研究した結′果、アスペルギルス・カ
ワチ（Ａ、　Ｋａｉｕａｃｂ　ｉ　）の生産するグルコ
アミラーゼが耐熱性を有し、最適反応温度が６５℃超〜
７５゛Ｃ未満であることを見いだしく第４図に示す。）
、本発明に到達した。

本菌株は、アスペルギルス・アワモリ（八、ａｕ＋ａ−
ｍｏｒｉ）の変異株とされており　（醗工、２８．１０
６（１９５０））、しょうちゅう用種麹のｍ株として広
く販売されている公知の菌株である。親株とされている
アスペルギルス・アワモリは前述のごとくグルコアミラ
ーゼを産生ずる糸状菌として知られているが、そのグル
コアミラーゼの最適反応温度は５５℃超〜６０℃未満で
ある（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　＋４１、２
１４９（１９７７））と報告され、耐熱性は認められな
い。本菌株の生産するグルコアミラーゼの耐熱性につい
ては全く報告されておらず、本発明者らが初めて発見し
た知見である。本菌株を培養し、培養物から採取される
グルコアミラーゼは６５℃超〜７５℃未満において最大
の活性を有することから、でんぷんの加水分解工業にお
ける糖化酵素としてのみならず、アルコール発酵工業及
び酒造用の糖化酵素としてのその利点が発揮され、経済
効果が高まることが期待できる。

本菌株を培養してグルコアミラーゼを生産するに際し、
使用する栄養培地としてはトウモロコシ、大麦、小麦、
米等の穀粉又はそれらのでんぷん、ジャガイモ及びサツ
マイモ等の芋類でんぷん及び穀物を加工する際に得られ
る小麦ふすま、白糠、米糠等の穀物廃棄物などを適宜組
合わせて用いる。

更に、ペプトン、酵母エキス、アンモニウム塩類、硝酸
塩類、その他の有機又は無機窒素源及びリン酸二カリ、
リン酸−カリ、硫酸マグネシウム等の無機塩を随時添加
するのもよい。

培養方法としては、通気かくはん若しくは振どう培養に
よる液体培養あるいは小麦ふすま等を用いての固体培養
を行うことができる。培養温度は２０″Ｃ超〜４５℃未
満の範囲で２日〜７日問程度培養を行えばよい。

本菌株は培養中に多量のクエン酸を生産するが、生産さ
れるグルコアミラーゼは耐酸性があることから（第３図
に示す。）、培養途中の中和は必要がない。培養終了後
培養物からグルコアミラーゼ含有液を採取するには、液
体培養の場合はろ過及び遠心分離等の手段にて行う。固
体培養の場合には、水又は各種塩溶液にて抽出する。こ
の培養ろ過液又は抽出液をグルコアミラーゼ粗酵素原液
とし、酵素の一般的分別採取法、すなわち、アルコール
沈殿法、硫安塩析法、イオン交換樹脂、イオン交換セル
ロース等のクロマトグラフィー、デルろ適法等を組合せ
ることにより、グルコアミラーゼを採取することができ
る。本菌株は、グルコアミラーゼＩ及びグルコアミラー
ゼＨの二つのグルコアミラーゼを生産するが、両者とも
耐熱性を有しており、本発明に含まれるものである。

次に、破砕精米を原料としてアスペルギルス・カワチを
固体培養してグルコアミラーゼ抽出液を得、次いで、限
外ろ過膜による濃縮、ＤＥ八へ−バイオゲルへ（バイオ
・ラド社）クロマトグラフィー、セファクリルＳ−３０
０（７フルマシア社）ゲルクロマトグラフィー処理して
得られた部分精製グルコアミラーゼＩ及びグルコアミラ
ーゼ■の酵素学的性質を記す。

（１）作ｍ 穀類及び芋類の各種でんぷんに作用し、よくグルコース
を生成し、がっ、イソマルトース、イソマル））リオー
ス等の転移糖を生成しない。

生でんぷんに対する作用は、グルコアミラーゼ■がグル
コアミラーゼＩより大きい。

（２）基質特異性 アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキスト
リン等のα−１，４グルコシド結合を有するを有する多
糖に作用する。

（３）最適反応ｐＨ ２％可溶性でんぷん１屑ｐに０．１Ｍマツキルバイ　ン
（Ｍａｃｌｌｖａｉｎ）緩衝液０．５１ｉ）及び酵素液
０．１１を加えて、４０℃、５５℃及び７０″Ｃにおい
て反応し、本酵素の最適反応ｐＨを求めたところ、グル
コアミラーゼＩ及び■ともｐｌ＋４．２付近にあり、反
応温度が低いとその範囲が広くなった。（第１図、第２
図に示す。） （４）安定ｐＨ範囲 本酵素の安定ｐＨ範囲をマツキルパイン緩衝液を用いて
測定した。その結果３０℃、６０分の処理ではグルコア
ミラーゼＩ及び■とも測定ｐＨの範囲の全域にわたって
安定であった。（第３図に示す。） （５）最適反応温度 ２％可溶性でんぷんＩＲｌに０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　
Ｈ４）０．２ｉｆ及び酵素液０．　ＩＲｌ加えて各温度
におけるグルコース生成量を測定した。その結果、グル
コアミラーゼＩ及びグルコアミラーゼ■とも７０℃付近
に最適反応温度を有する。（第４図に示す。）（６）温
度安定性 酵素液０．１ｚ１に０．２８酢酸緩衝液（ｐ　ｔｌ　４
　）を１ｚ１加えて各温度に１０分間放直後急冷し、こ
れから０．１屑りとり、常法により残存する活性を測定
した。

その結果、グルコアミラーゼＩ及び■ともに５０℃では
１００％の残存率であり、６５℃でも約７１％の残存率
を示した。（第５図に示す。）（７）阻害剤等の影響 本酵素に対する各種金属イオン（２Ｘ１０−１）の影響
については、第１表に示す。

本酵素に対する各種阻害剤の影響について第２表に示す
。

第１表及び第２表より明らかなようにグルコアミラーゼ
Ｉ及び■とも１こＣｕ’、Ｆｅコ＋、　Ｈｇ２＋イオン
で若干阻害され、Ｍｎ”イオンでも若干賦活される。ま
た、グルコアミラーゼ′ｌはＣＯ：士イオンでも若干賦
活される。各種阻害剤の影響は、グルコアミラーゼＩ及
び■ともほとんど影響が認められなかった。

第１表　　重金属の影響（相対活性） ＣａＣＩ２９８　　　　　　９４ ＣｏＳ０．　　　　　１１３　　　　　　９９ＣｕＳｏ
、　　　　　　　７２　　　　　　７２ＦｅＣｌ＝　　
　　　　　７６　　　　　　６６ＦｅＳｏ、　　　　　
　　９７　　　　　　９４ＩｇＣ１□　　　　　　８３
　　　　　５６ＭｇＣ１２１０２９９ ＨｎＣ１□１２７　　　　　１２４ Ｐｂ（ＣＩ、Ｃ００）２１０６　　　　　　９３ＺｎＳ
０４１００　　　　　　９７ 第２表　阻害剤の影響（相対活性） モノヨード酢酸　　　　　　　　　　２　　　９７　　
　１０６Ｐ−クロル安息香酸第二水銀　　　　　１　　
　９６　　　　９？ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　
　１　　１００　　　１０７７ツ化フエニルメチルスル
ホニル　　１．　　９．５　　　１０２Ｎ−エチルマレ
イミド　　　　　　　１０　　　９４　　　１０３以下
に、実施例をもって更に詳細に本発明の詳細な説明する
が、二゛れによって本発明が限定されるものではない。

なお、本発明で用いたグルコアミラーゼ活性測定法は、
次のとおりである。

２％可溶性でんぷんを基質として酢酸緩衝液中４０℃で
酵素を反応させ、生成するグルコースをグルコースオキ
シグーゼを用いる測定法（岩野、風聞、布用二日本醸造
協会雑誌、７１．３８３（１９７６））で定量して、６
０分間にＩＪ！ｌ？のグルコースを生成する活性を１単
位とした。また、生でんぷん分解力は小麦でんぷんを基
質として酢酸緩衝液中で３０℃で酵素を反応させ、グル
コアミラーゼ活性と同様に生成するグルコースを定量し
、６０分間にＩＪｇのグルコースを生成する活性を１単
位とした。更に、７０℃におけるグルコース生成量を４
０℃におけるそれで割った値をグルコアミラーゼの耐熱
性値と定義した。

実施例１ 破砕精米１０ｇを蒸きようし、放冷後アスペルギルス・
カワチ菌を接種し、４０℃で４８時間培養した。これに
０．５％食塩水１００ｄを加えて生産されたグルコアミ
ラーゼを抽出し、抽出液中のグルコアミラーゼ、生でん
ぷん分解力を測定１．　タ。

グルコアミラーゼは２３４単位／ｇ麹が得られ、生でん
ぷん分解力は１４．２単位／ｙ麹であった。生産された
グルコアミラーゼの耐熱性値は４．１５であった。

実施例２ 小麦ふすまｓｇ及び白糠２ｇに水を１０ｚｌ！加え１２
０℃、５分間オートクレーブ殺菌して得られた培地に７
スペルギルス・カワチ菌を接種し、４０℃で５日間培養
した。培養終了後０．５％食塩水１００１１１を加えて
、生産されたグルコアミラーゼを抽出した。抽出液中の
グルコアミラーゼは５７４位／Ｓふすまであった。生産
されたグル；アミラーゼの耐熱性値は３．３４であった
。

実施例３ 小麦ふすま８ｇ及び白糠２ｇに水１００屑ρ加え、１２
０’Ｃ１５分間オートクレーブ殺菌して得られた培地に
７スペルギルス・カワチ菌を接種し、４０℃で５日問振
どう培養した。培養終了後、ろ過して培養ろ液を得た。

培養液中のグル；アミラーゼは２１９単位／りふすまで
あった。生産されたグル；アミラーゼの耐熱性値は５．
３２であった。

実施例４ 破砕精米を原料として、アスペルギルス・カワチ菌を植
菌して３２℃〜４３℃で２日問培養した。

この米麹２ｋｇに０．５％食塩水（酢酸緩衝液１００　
ｍ　Ｍ（ｐＨ５，ｏ））８１加えて生産されたグルコア
ミラーゼを抽出した。遠心分離とろ過によって抽出液７
０５６１１を得た。この抽出液中には、グルコアミラー
ゼ３０．６単位／ｚ１が含まれていた。この抽出液を旭
化成工業（株）の限外ろ過モジュール（分画分子量１０
，０００）及びアミフン社（株）の限外ろ過膜Ｙ　Ｍ　
−１０（分画分子量１０，０００）を用いて４０ａｌま
で限外濃縮を行った。この濃縮液をＤＥＡＥ−バイオデ
ルＡ（バイオ・ラド社）を用いてイオン文換クロマトグ
ラフィーを行ったところ、グル；アミラーゼはＩと■に
分離された。グルコアミラーゼＩは４２０ｘ（ｌ得られ
、１４９単位／肩β含まれていた。全体の４０％の活性
で比活性は約５０倍上昇し、α−アミラーゼ活性、トラ
ンスグル　コシダーゼ活性、酸性プロテアーゼ活性及び
酸性カルボキシペプチダーゼ活性はほとんど認められな
かった。また、グル；アミラーゼ■は７３５ｚｆ得られ
、１２８単位７ｘｉ含まれて（・た。全体の６０％の活
性であるが、α−アミラーゼが混在していたので、更に
、セファクリルＳ−３００（７アルマシア社）を用いて
ゲルクロマトグラフィーを行い、ａ−アミラーゼを分離
した。グルコアミラーゼ■は１６１ｉ＋Ｎ得られ、４５
９単位／Ｉ１１含まれていた。

比活性は約６３倍上昇し、α−アミラーゼ活性、トラン
スグルコシダーゼ活性、酸性プロテアーゼ活性及び酸性
カルボキシペプチダーゼ活性はほとんど認められなかっ
た。グルコアミラーゼＩ及びＨの生でんぷん分解活性は
、それぞれ０．４８単位／ＩＩｌ、２．８０単位７ｍｌ
であった。グルコアミラーゼＩの耐熱性値は３．８及び
グル；アミラーゼ■の耐熱性値は５．２であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルコアミラーゼＩの最適反応ｐＨ及び第２
図はグルコアミラーゼ■の最適反応ｐＨを示す。第３図
はグルコアミラーゼｌ及びＨの１）１１安定性を３０℃
、６０分の処理条件で調べた結果を示す。第４図は、グ
ル；アミラーゼＩ及びＨの最適反応温度をｌ）　１１４
　、　Ｏの条件で調べた結果を示す。第５図は、グルコ
アミラーゼＩ及び■の熱安定性についてｐｌ＋４．０．
１０分の処理条件で調べた結果を示す。 グンシ］アぐラーで；゛工ｅｙ）」ン」【及プも煕バク
・・でてン′ンレ］ア沖−−［Ｃ゛工の囁−＝々１．万
≧Ｌメ１５ＰＦ’ｌ　Ｋ　７１１で箋３図 Ｈ グンレ：１７ｅラー’ｔＺ：’のｐ）４％レー＠１１　
Ｃ３００Ｃ，ＧＯ４）第４図 温泉（０Ｃ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アスペルギルス属に属する耐熱性グルコアミラーゼ生産
   菌を培養して、最適反応温度が６５℃〜７５℃である耐
   熱性グルコアミラーゼを生産させ、これを採取すること
   を特徴とする耐熱性グルコアミラーゼの製造法