JPS6269980A - 遺伝子操作されたｌ−アミノ酸類生産用微生物 - Google Patents
遺伝子操作されたｌ−アミノ酸類生産用微生物Info
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- JPS6269980A JPS6269980A JP61219854A JP21985486A JPS6269980A JP S6269980 A JPS6269980 A JP S6269980A JP 61219854 A JP61219854 A JP 61219854A JP 21985486 A JP21985486 A JP 21985486A JP S6269980 A JPS6269980 A JP S6269980A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−アミノ酸類（以後［アミノ酸］と呼ぶ）
の生産において有意に増幅されたトランスアミナーゼ活
性を有する微生物の使用に関する。より詳しくは、この
トランスアミナーゼ活性の遺伝情報を指定する遺伝子は
、天然のバクテリアのゲノムから多数のコピーのプラス
ミド（ｍｕＩｔ １ｐｌｅ ｃｏｐｙ
ｐｌａｓｍｉｄｓ） 、こ転移される。これらの組み
換えプラスミドで形質転換された微生物は、適当な条件
下で有意に増大したトランスアミナーゼ活性を示す。そ
の上、この酵素の活性は熱的に安定である。その結果、
アミ７基転移（ｔ ｒａｎｓａｍｉｎａｔ ｉ ａｎ）
を経るアミノ酸の生産において、ここに記載する遺伝子
操作された有機体は自然の分離物より性能が有意にすぐ
れている。
の生産において有意に増幅されたトランスアミナーゼ活
性を有する微生物の使用に関する。より詳しくは、この
トランスアミナーゼ活性の遺伝情報を指定する遺伝子は
、天然のバクテリアのゲノムから多数のコピーのプラス
ミド（ｍｕＩｔ １ｐｌｅ ｃｏｐｙ
ｐｌａｓｍｉｄｓ） 、こ転移される。これらの組み
換えプラスミドで形質転換された微生物は、適当な条件
下で有意に増大したトランスアミナーゼ活性を示す。そ
の上、この酵素の活性は熱的に安定である。その結果、
アミ７基転移（ｔ ｒａｎｓａｍｉｎａｔ ｉ ａｎ）
を経るアミノ酸の生産において、ここに記載する遺伝子
操作された有機体は自然の分離物より性能が有意にすぐ
れている。
アミノ基転移は、通常、アミノ基およびケト基を２種類
の出発物質の間で転移させるアミノ酸とケト酸との間の
反応と定義される。ケト酸前駆物質は酵素的にそれらの
対応するアミノ酸に転化できることは知られている。こ
れらの基の実際の転移を仲介する酵素は、互換的に「ト
ランスアミナーゼ（ｔ ｒａｎｓａｍｉ ｎａｓｅｓ）
Ｊまたは「アミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）Ｊと呼ばれる。このタイプの反
応の一例として、米国特許第３，１８３，１７０号［キ
タイ（Ｋｔａｉ）ら］は、収穫したバクテリア細胞、乾
燥した細胞、細胞冷浸物（ｍａｃｅｒａｔｅｓ）を包含
する種々の源から得られた多酵素系の存在下に、ケト酸
前駆物質をアミノ基転移することを開示している。キタ
イ（Ｋｔａｉ）らの多酵素系は、デヒドロゲナーゼ、ヒ
ドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、水素受容体および
電子伝達系から成る。
の出発物質の間で転移させるアミノ酸とケト酸との間の
反応と定義される。ケト酸前駆物質は酵素的にそれらの
対応するアミノ酸に転化できることは知られている。こ
れらの基の実際の転移を仲介する酵素は、互換的に「ト
ランスアミナーゼ（ｔ ｒａｎｓａｍｉ ｎａｓｅｓ）
Ｊまたは「アミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）Ｊと呼ばれる。このタイプの反
応の一例として、米国特許第３，１８３，１７０号［キ
タイ（Ｋｔａｉ）ら］は、収穫したバクテリア細胞、乾
燥した細胞、細胞冷浸物（ｍａｃｅｒａｔｅｓ）を包含
する種々の源から得られた多酵素系の存在下に、ケト酸
前駆物質をアミノ基転移することを開示している。キタ
イ（Ｋｔａｉ）らの多酵素系は、デヒドロゲナーゼ、ヒ
ドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、水素受容体および
電子伝達系から成る。
一例として、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のアミノトランス
フェラーゼ遺伝子は、ゲルファント（Ｇｅｔｆａｎｄ）
ら、ジャーナル・才ブ・バクテリア細胞−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）、［アスパラン酸塩および芳香族アミ
ノ酸のアミノトランスフェラーゼにおいて欠失する大ｐ
Ａ菌突然変異体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｍｕｔａｎｔｓ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ
Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ
Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、１３０．４２９−４０ペ
ージ（１９７７）に記載されており、そして１ｌｖＥ、
ｔｙｒＢおよびａｓｐＣと表示されている。
フェラーゼ遺伝子は、ゲルファント（Ｇｅｔｆａｎｄ）
ら、ジャーナル・才ブ・バクテリア細胞−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）、［アスパラン酸塩および芳香族アミ
ノ酸のアミノトランスフェラーゼにおいて欠失する大ｐ
Ａ菌突然変異体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｍｕｔａｎｔｓ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ
Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ
Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、１３０．４２９−４０ペ
ージ（１９７７）に記載されており、そして１ｌｖＥ、
ｔｙｒＢおよびａｓｐＣと表示されている。
大腸ｉ？４（Ｅ、ｃｏｌｉ）の機能的ｔｙｒＢおよびａ
ｓ ｐ Ｃ遺伝子の存在は、チロシン、フェニルアラ
ニンおよびアスパラギン酸についての栄養要求性を開放
することは知られている。欧州特許出願第８４１００５
２１．８号（１９８４年８月２９日公告第０ １１６
８６０す）［Ｇ、Ｄ、シールレ・アンド・カンパニー（
Ｓ ｅ ａ ｒ ｌ ｅ ＆Ｃｏ、］には、１ｌｖＥ
、ｔｙｒＢおよびａｓｐＣアミノトランスフェラーゼ遺
伝子を分離し、そしてそれらのアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子産生物を産生できる組み換え微生物の構成に使
用できることが開示されている。
ｓ ｐ Ｃ遺伝子の存在は、チロシン、フェニルアラ
ニンおよびアスパラギン酸についての栄養要求性を開放
することは知られている。欧州特許出願第８４１００５
２１．８号（１９８４年８月２９日公告第０ １１６
８６０す）［Ｇ、Ｄ、シールレ・アンド・カンパニー（
Ｓ ｅ ａ ｒ ｌ ｅ ＆Ｃｏ、］には、１ｌｖＥ
、ｔｙｒＢおよびａｓｐＣアミノトランスフェラーゼ遺
伝子を分離し、そしてそれらのアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子産生物を産生できる組み換え微生物の構成に使
用できることが開示されている。
コピー数がバクテリアのゲノムトに通常見出される数よ
り多いネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からの熱的に安定なトランスアミ
ナーゼ遺伝子からなる新規な微生物株を構成するために
、組み換えＤＮＡ法を使用する。この遺伝子は、ＡＴ
ｓｔｙ ２と表示された酵素の遺伝情報を指定し、
多数のコピーのプラスミドの中に挿入され、そして組み
換えプラスミドは適当な宿主の中に導入される。形質転
換された宿主中に発現された得られる増大された水僧の
トランスアミナーゼ遺伝子産生物は、外因的に提供され
たアミノ供与体およびケト酸前駆物質のアミ７ノ、（転
移によりＬ−アミノ酸を過剰生産させる。したがって、
熱的に安定な発現された酵素は、高温への暴露時の失活
に対する感受性が低い。本発明の発現された酵素による
前駆物質の生物転化（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は
、天然の分離物に比較して、有意の増大された商業的な
州のアミノ酸産生物を生ずる。
り多いネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からの熱的に安定なトランスアミ
ナーゼ遺伝子からなる新規な微生物株を構成するために
、組み換えＤＮＡ法を使用する。この遺伝子は、ＡＴ
ｓｔｙ ２と表示された酵素の遺伝情報を指定し、
多数のコピーのプラスミドの中に挿入され、そして組み
換えプラスミドは適当な宿主の中に導入される。形質転
換された宿主中に発現された得られる増大された水僧の
トランスアミナーゼ遺伝子産生物は、外因的に提供され
たアミノ供与体およびケト酸前駆物質のアミ７ノ、（転
移によりＬ−アミノ酸を過剰生産させる。したがって、
熱的に安定な発現された酵素は、高温への暴露時の失活
に対する感受性が低い。本発明の発現された酵素による
前駆物質の生物転化（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は
、天然の分離物に比較して、有意の増大された商業的な
州のアミノ酸産生物を生ずる。
本発明の主目的は、熱的に安定な産生物がアルファーケ
ト酸のアミノ酸への立体特異的転化の原因となる、トラ
ンスアミナーゼ遺伝子の多数のコピーからなる微生物株
を提供することである。このような株は、有意に増大し
たアミノ酸への転化速度を示し、反応器内の滞留時間を
実質的に減少させる。
ト酸のアミノ酸への立体特異的転化の原因となる、トラ
ンスアミナーゼ遺伝子の多数のコピーからなる微生物株
を提供することである。このような株は、有意に増大し
たアミノ酸への転化速度を示し、反応器内の滞留時間を
実質的に減少させる。
本発明の他の目的は、慣用法により固定化することがで
きかつ、固定化の後でさえ、改良された半減期の特性を
有する、すなわち、容易には劣化または失活しない、組
み換え微生物を提供することである。
きかつ、固定化の後でさえ、改良された半減期の特性を
有する、すなわち、容易には劣化または失活しない、組
み換え微生物を提供することである。
また、本発明の目的は、遺伝子のＤＮＡ配列の欠失また
は転換、またはプラスミドの損失に関連する処理問題を
全く減少するために、構造的に安′Ｊｉ！でありかつコ
ピーの数が安定である、プラスミド構造の中に所望のト
ランスアミナーゼ遺伝子を位置させることである。本発
明の追加の目的は、大きいコピー数のプラスミドのＦに
トランスアミナーゼ遺伝子を位置させて酵素の発現を高
い水準にすることである。
は転換、またはプラスミドの損失に関連する処理問題を
全く減少するために、構造的に安′Ｊｉ！でありかつコ
ピーの数が安定である、プラスミド構造の中に所望のト
ランスアミナーゼ遺伝子を位置させることである。本発
明の追加の目的は、大きいコピー数のプラスミドのＦに
トランスアミナーゼ遺伝子を位置させて酵素の発現を高
い水準にすることである。
本発明の他の［１的は、プラスミドを有するスペクチノ
マイシン耐性遺伝子を使用することである。
マイシン耐性遺伝子を使用することである。
ネズミチフスＩＪ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ；ａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）の熱的に安定はトランスアミナーゼ遺
伝ｆを、アミノ酸の生産において使用するために宿り中
でクローニングしかつ発現させる。まず、トランスアミ
ナーゼ遺伝子を分離し、そして好ましくは多コピー黄択
可能なベクターの中に結合させる。トランスアミナーゼ
遺伝子を含有する組み換えベクターで適当な宿主を形質
転換する。所望のトランスアミナーゼ遺伝子の選択は、
所望のアミノ酸についての宿主微生物の栄養安求性の相
補性により、および発現された酵素の熱安定により１γ
証される。この酵素はＡＴ ｓｔｙ ２と表示された
。問題のネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
） トランスアミナーゼ遺伝子で形質転換された発現
宿主、あるいは形質転換された宿主の一部分または抽出
物は、アルファーケト酸前駆物質およびアミノ供か体の
存在Ｆにアミノ酸を産生しかつ蓄積することができる。
ｉｍｕｒｉｕｍ）の熱的に安定はトランスアミナーゼ遺
伝ｆを、アミノ酸の生産において使用するために宿り中
でクローニングしかつ発現させる。まず、トランスアミ
ナーゼ遺伝子を分離し、そして好ましくは多コピー黄択
可能なベクターの中に結合させる。トランスアミナーゼ
遺伝子を含有する組み換えベクターで適当な宿主を形質
転換する。所望のトランスアミナーゼ遺伝子の選択は、
所望のアミノ酸についての宿主微生物の栄養安求性の相
補性により、および発現された酵素の熱安定により１γ
証される。この酵素はＡＴ ｓｔｙ ２と表示された
。問題のネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
） トランスアミナーゼ遺伝子で形質転換された発現
宿主、あるいは形質転換された宿主の一部分または抽出
物は、アルファーケト酸前駆物質およびアミノ供か体の
存在Ｆにアミノ酸を産生しかつ蓄積することができる。
所望のトランスアミナーゼ活性は、この生物転化のため
に使用したとき、非常に有意に延長された半減期を有す
る。
に使用したとき、非常に有意に延長された半減期を有す
る。
この説明において、「トランスアミナーゼ遺伝子」につ
いての言及は、ＡＴ ｓｔｙ ２１１体の遺伝子、
遺伝子プラス追加のＤＮＡ、またはトランスアミナーゼ
遺伝子の機能的部分からなるＤＮＡ断片を包含すること
を意味する。言及するＡＴｓｔｙ ２トランスアミナー
ゼ遺伝子は、その発現産生物が、熱安定性によりおよび
ケト酸前駆物質の対応するアミノ酸への急速な転化の能
力により特徴づけられるトランスアミナーゼ酵素である
ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝子
である。トランスアミナーゼ遺伝子はネズミチフス菌（
Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ゲノムから直接分離され
るか、あるいはネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）遺伝子物質の任意の便利な源から得ることがで
きる。この微生物はアメリカンΦタイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、２０８５２）（１９８５
ＡＴＣＣカタログ リスト５１の入手可能な菌株）から
入手可能である。菌株は、また、ネズミチフス菌（Ｓ、
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を使用する研究を実施する種
々の研究所から入手Ｏｆ能である。
いての言及は、ＡＴ ｓｔｙ ２１１体の遺伝子、
遺伝子プラス追加のＤＮＡ、またはトランスアミナーゼ
遺伝子の機能的部分からなるＤＮＡ断片を包含すること
を意味する。言及するＡＴｓｔｙ ２トランスアミナー
ゼ遺伝子は、その発現産生物が、熱安定性によりおよび
ケト酸前駆物質の対応するアミノ酸への急速な転化の能
力により特徴づけられるトランスアミナーゼ酵素である
ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝子
である。トランスアミナーゼ遺伝子はネズミチフス菌（
Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ゲノムから直接分離され
るか、あるいはネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）遺伝子物質の任意の便利な源から得ることがで
きる。この微生物はアメリカンΦタイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、２０８５２）（１９８５
ＡＴＣＣカタログ リスト５１の入手可能な菌株）から
入手可能である。菌株は、また、ネズミチフス菌（Ｓ、
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を使用する研究を実施する種
々の研究所から入手Ｏｆ能である。
ゲノムまたは遺伝子物質を制限エンドヌクレアーゼで部
分的に消化し、そして便利な大きさ、例えば、約１０〜
２５キロ塩基、の断片が分離される。次いで、これらの
断片をトランスアミナーゼ活性のクローンの分離を可能
とするのに適するベクターの中に結合し、そして前記ク
ローンは熱的に安定な遺伝子産生物を発現する。ラムダ
クローニングベクター、例えば、後述するものを選択す
る場合、Ｓａｕ ３Ａが発生した断片を受容して比較
的不規則なライブラリーを形成するので、Ｓａｕ ３
Ａ制限エンドヌクレアーゼを使用する・ 好ましい実施態様において、大腸菌（Ｅ、ｃ。
分的に消化し、そして便利な大きさ、例えば、約１０〜
２５キロ塩基、の断片が分離される。次いで、これらの
断片をトランスアミナーゼ活性のクローンの分離を可能
とするのに適するベクターの中に結合し、そして前記ク
ローンは熱的に安定な遺伝子産生物を発現する。ラムダ
クローニングベクター、例えば、後述するものを選択す
る場合、Ｓａｕ ３Ａが発生した断片を受容して比較
的不規則なライブラリーを形成するので、Ｓａｕ ３
Ａ制限エンドヌクレアーゼを使用する・ 好ましい実施態様において、大腸菌（Ｅ、ｃ。
１ｉ）アミノトランスフェラーゼ陰性宿主は相補性につ
いてアッセイするために便利に使用される。ａｓｐＣ−
ｔｙｒＢ−１ｌｖＥ−が得られる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）株、すなわち、すべてのトランスアミナーゼ活性を欠
く株、が得らレル。
いてアッセイするために便利に使用される。ａｓｐＣ−
ｔｙｒＢ−１ｌｖＥ−が得られる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）株、すなわち、すべてのトランスアミナーゼ活性を欠
く株、が得らレル。
ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら、ジャーナル・才ブ
・バクテリオロジ−（Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉＯｌ、）、「
アスパラン酸塩および芳香族°アミノ酸のアミノトラン
スフェラーゼにおいて欠失する大腸菌突然変異体（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｍｕｔａｎｔｓ
Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎ Ａｓｐａｒｔａｔｅ
ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１
ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅｓ）Ｊ、Ｖｏ
ｌ、１３０．４２９−４０ページ（１９７６）に記載さ
れいる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＧ３０を使用するこ
とができる。この菌株は、大腸菌ジェネテイツク・スト
ック・センター（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ
５ｔｏｌｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、 イエール大学、
米国コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である
。ＤＧ３０はチロシン、フェニルアラニンおよびアスパ
ラギン酸についての栄養要求性である。あるいは、大腸
菌ジェネテイツク・ストック−センター（Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｌｃｋ、Ｃｅｎｔｅｒ）
から入手可能な大１県菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株Ｄ
Ｇ４４を使用できる。ＤＧ４４はａｓｐＣ−ｔｙｒＢ−
であり、そしてアスパラギン酸、チロシンおよびフェニ
ルアラニンについての栄養要求性である。
・バクテリオロジ−（Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉＯｌ、）、「
アスパラン酸塩および芳香族°アミノ酸のアミノトラン
スフェラーゼにおいて欠失する大腸菌突然変異体（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｍｕｔａｎｔｓ
Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎ Ａｓｐａｒｔａｔｅ
ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１
ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅｓ）Ｊ、Ｖｏ
ｌ、１３０．４２９−４０ページ（１９７６）に記載さ
れいる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＧ３０を使用するこ
とができる。この菌株は、大腸菌ジェネテイツク・スト
ック・センター（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ
５ｔｏｌｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、 イエール大学、
米国コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である
。ＤＧ３０はチロシン、フェニルアラニンおよびアスパ
ラギン酸についての栄養要求性である。あるいは、大腸
菌ジェネテイツク・ストック−センター（Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｌｃｋ、Ｃｅｎｔｅｒ）
から入手可能な大１県菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株Ｄ
Ｇ４４を使用できる。ＤＧ４４はａｓｐＣ−ｔｙｒＢ−
であり、そしてアスパラギン酸、チロシンおよびフェニ
ルアラニンについての栄養要求性である。
他の栄養要求性は得ることができ、あるいはつくること
ができる。
ができる。
トランスアミナーゼ陰性大腸菌（Ｅ、Ｃ０１ｉ）株ＤＧ
３０およびＤＧ４４は非常に低い頻度で形質転換し、こ
うしてトランスアミナーゼ活性をもつクローンの検出の
可能性を減少させる。ラムダファージはこれらの宿主を
非常に高い頻度で形質導入することができるので、トラ
ンスアミナーゼ活性クローンを分離する可能性はラムダ
クローニングベクターの使用で大きく増加される。
３０およびＤＧ４４は非常に低い頻度で形質転換し、こ
うしてトランスアミナーゼ活性をもつクローンの検出の
可能性を減少させる。ラムダファージはこれらの宿主を
非常に高い頻度で形質導入することができるので、トラ
ンスアミナーゼ活性クローンを分離する可能性はラムダ
クローニングベクターの使用で大きく増加される。
より低い温度においてプラスミドとしておよびより高い
温度で溶菌性ファージとして存在することができるファ
ージを使用することが最も好ましい。この「プラスミド
Ｊのアプローチは形質導入の効率について、および慣用
のプラスミド回収技術による同定されたトランスアミナ
ーゼ遺伝子含有ＤＮＡの容易な分離について好ましいが
、本発明の実施のために必要とされない、プラスミドの
アプローチおよび適当なラムダクローニングベクターを
構成する方法は、Ｓ、エレッジ（Ｅ １１ ｅｄｇｅ）
ら、ジャーナル番オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）、「大腸菌突然変異体の相補性による
遺伝子の同定のためのプラスミドベクター（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ Ｖｅｃｔ。
温度で溶菌性ファージとして存在することができるファ
ージを使用することが最も好ましい。この「プラスミド
Ｊのアプローチは形質導入の効率について、および慣用
のプラスミド回収技術による同定されたトランスアミナ
ーゼ遺伝子含有ＤＮＡの容易な分離について好ましいが
、本発明の実施のために必要とされない、プラスミドの
アプローチおよび適当なラムダクローニングベクターを
構成する方法は、Ｓ、エレッジ（Ｅ １１ ｅｄｇｅ）
ら、ジャーナル番オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）、「大腸菌突然変異体の相補性による
遺伝子の同定のためのプラスミドベクター（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ Ｖｅｃｔ。
ｒｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
Ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｍｕｔａｎｔｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、１６２゜７７７−
８３ページ（１９８５）に詳述されている。
Ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｍｕｔａｎｔｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、１６２゜７７７−
８３ページ（１９８５）に詳述されている。
組み換えファージのライブラリーをスクリーニングする
ために大］揚菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）トランスアミナーゼ陰
性宿主を使用する前に、温度感受性ラムダリプレッサー
を発現する遺伝子を含有するプラスミドで形質転換する
ことによって宿主株を準備する。温度感受性リプレッサ
ーの存在下に、記載するラムダファージは約３０°Ｃに
おいてプラスミドとしておよび約３７℃において溶菌性
ファージとして存在することができる。大１１！菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）栄養要求株を形質転換するために使用する
適当なプラスミドは、温度感受性ラムダリプレッサーを
発現するｃＩ８５７遺伝子を含有するプラスミドｐｓＥ
１０３である。このプラスミドの構成は上に引用したエ
レッジ（Ｅｌｌｅｇｄｅ）らの論文に記・成されている
。ｃＩ８５７遺伝子を含有する任意のプラスミドを使用
できる。唯一の要件は、温度感受性ラムダリプレッサー
自体の存在である。
ために大］揚菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）トランスアミナーゼ陰
性宿主を使用する前に、温度感受性ラムダリプレッサー
を発現する遺伝子を含有するプラスミドで形質転換する
ことによって宿主株を準備する。温度感受性リプレッサ
ーの存在下に、記載するラムダファージは約３０°Ｃに
おいてプラスミドとしておよび約３７℃において溶菌性
ファージとして存在することができる。大１１！菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）栄養要求株を形質転換するために使用する
適当なプラスミドは、温度感受性ラムダリプレッサーを
発現するｃＩ８５７遺伝子を含有するプラスミドｐｓＥ
１０３である。このプラスミドの構成は上に引用したエ
レッジ（Ｅｌｌｅｇｄｅ）らの論文に記・成されている
。ｃＩ８５７遺伝子を含有する任意のプラスミドを使用
できる。唯一の要件は、温度感受性ラムダリプレッサー
自体の存在である。
発現されたトランスアミナーゼ触媒は使用温度において
急速な劣化または失活にさらされないということが、本
発明の１つの要件である。この熱安定性は、はぼ１０℃
〜４２℃範囲の温度において生物触媒の使用半減期を実
質的に増加する。さらに、熱的に安定な酵素は固定化に
典型的に使用される温度における失活の感受性が低いで
あろう。この固定化の温度は約４５〜５０℃までである
ことがある。
急速な劣化または失活にさらされないということが、本
発明の１つの要件である。この熱安定性は、はぼ１０℃
〜４２℃範囲の温度において生物触媒の使用半減期を実
質的に増加する。さらに、熱的に安定な酵素は固定化に
典型的に使用される温度における失活の感受性が低いで
あろう。この固定化の温度は約４５〜５０℃までである
ことがある。
熱失活アミノ酸生産アッセイを使用して、組み換えトラ
ノスアミナーゼ含有クローンをスクリーニングする。こ
のアッセイは、熱感受性であるトランスアミナーゼ遺伝
子と熱安定性であるトランスアミナーゼ遺伝ｆ−との区
別をｒ＝（能とする。超音波処理した細胞をアルファー
ケト酸およびアミノ供与体（例えば、アスパラギン酸）
と、約５５°Ｃの温度における２０〜３０分間の熱衝撃
の前および後に接触させる。この処理後に前駆物質をア
ミノ酸の酵素的に転化する能力を、アミノ酸産生物につ
いて、例えば、ＨＰ Ｌ Ｃにより、アッセイすること
のよって測定する。この壱力を示すクローンは所望のＡ
Ｔ ｓｔｙ ２遺伝了−を含有する。
ノスアミナーゼ含有クローンをスクリーニングする。こ
のアッセイは、熱感受性であるトランスアミナーゼ遺伝
子と熱安定性であるトランスアミナーゼ遺伝ｆ−との区
別をｒ＝（能とする。超音波処理した細胞をアルファー
ケト酸およびアミノ供与体（例えば、アスパラギン酸）
と、約５５°Ｃの温度における２０〜３０分間の熱衝撃
の前および後に接触させる。この処理後に前駆物質をア
ミノ酸の酵素的に転化する能力を、アミノ酸産生物につ
いて、例えば、ＨＰ Ｌ Ｃにより、アッセイすること
のよって測定する。この壱力を示すクローンは所望のＡ
Ｔ ｓｔｙ ２遺伝了−を含有する。
この方法とともに使用するために選択されるアルファー
ケト酸は、どのアミノ酸が所望の産生物であるかに依存
する。例えば、フェニルピルビン酸はＬ−フェニルアラ
ニンに、アルファーケトイソカプロン酸はＬ−ロイシン
に、アルファーケトイソバレリン酸はＬ−バリンに、ア
ルファーケト−β−メチル７ヘレリン酸はＬ−インロイ
シンに、ピリビン酩はＬ−アラニンに、オキサル酩酊は
Ｌ−アスパラギン酸に、β−ヒドロキシ−アルファーケ
ト酪酸はＬ−スレオニンに、Ｐ−ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸はＬ−チロシンに、インドールピルビン酸はＬ
−１リブトフアンに、それぞれ、転化される。理解でき
るように、ｆｆ通のＬ−アミノ酎前駆物質は本発明の方
法に使用される。
ケト酸は、どのアミノ酸が所望の産生物であるかに依存
する。例えば、フェニルピルビン酸はＬ−フェニルアラ
ニンに、アルファーケトイソカプロン酸はＬ−ロイシン
に、アルファーケトイソバレリン酸はＬ−バリンに、ア
ルファーケト−β−メチル７ヘレリン酸はＬ−インロイ
シンに、ピリビン酩はＬ−アラニンに、オキサル酩酊は
Ｌ−アスパラギン酸に、β−ヒドロキシ−アルファーケ
ト酪酸はＬ−スレオニンに、Ｐ−ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸はＬ−チロシンに、インドールピルビン酸はＬ
−１リブトフアンに、それぞれ、転化される。理解でき
るように、ｆｆ通のＬ−アミノ酎前駆物質は本発明の方
法に使用される。
しかしながら、ＡＴ ｓｔｙ ２酵素はフェニルピ
ルビン酸をＬ−フェニルアラニンに転化するときとくに
高い活性を有することが証明された。もちろん、これら
の前駆物質は熱失活アミノ酸産生アンセイおよび所望の
Ｌ−アミノ酸の生産の両者において利用できる。
ルビン酸をＬ−フェニルアラニンに転化するときとくに
高い活性を有することが証明された。もちろん、これら
の前駆物質は熱失活アミノ酸産生アンセイおよび所望の
Ｌ−アミノ酸の生産の両者において利用できる。
いったん熱安定性トランスアミナーゼ活性クローンが分
離されると、活性が染色体の復帰細胞よりはむしろ、Ａ
Ｔ ｓｔｙ ２遺伝子を含有する組み換プラスミド
の存在の結果であることを確証するために確認を行う。
離されると、活性が染色体の復帰細胞よりはむしろ、Ａ
Ｔ ｓｔｙ ２遺伝子を含有する組み換プラスミド
の存在の結果であることを確証するために確認を行う。
クローンを約４２℃において生長させかつファージの産
生について誘導する。ファージの力価を測定して、十分
な量が存在することを確保する０次に、ＡＴ ｓｔｙ
２からなると信じられるプラスミドベクターをプラ
スミドの形態のクローンから分離する。
生について誘導する。ファージの力価を測定して、十分
な量が存在することを確保する０次に、ＡＴ ｓｔｙ
２からなると信じられるプラスミドベクターをプラ
スミドの形態のクローンから分離する。
これらの分離したプラスミドは標準手順、例えば、マニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クロー
ニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、２５０−５１ページ［コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏａｒｔｏｒ
ｙ）１９８２］に記載されている形質転換手順、あるい
はディビス（Ｄａｖｉｓ）ら、アドバンスト・バクルド
・スプリング−ハーバ−（ｃｏｌｃｉ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）１９８０］に記載されている形質導
入手順を使用してトランスアミナーゼ陰性大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）株の中に導入される。機能的トランスアミナ
ーゼ遺伝子からなる遺伝物質のみは、宿主株の損傷を補
充し、その栄養要求性からそれを開放するであろう。す
なわち、発現されたトランスアミナーゼ遺伝子からなる
形質転換体は補充のアミノ酸を含まない最少培地の平板
上で生長することができる。宿主の栄養要求が開放され
るので、これらのクローン中のプラスミドはトランスア
ミナーゼ遺伝子を含みかつそれを発現することを推定す
ることができる。
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クロー
ニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、２５０−５１ページ［コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏａｒｔｏｒ
ｙ）１９８２］に記載されている形質転換手順、あるい
はディビス（Ｄａｖｉｓ）ら、アドバンスト・バクルド
・スプリング−ハーバ−（ｃｏｌｃｉ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）１９８０］に記載されている形質導
入手順を使用してトランスアミナーゼ陰性大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）株の中に導入される。機能的トランスアミナ
ーゼ遺伝子からなる遺伝物質のみは、宿主株の損傷を補
充し、その栄養要求性からそれを開放するであろう。す
なわち、発現されたトランスアミナーゼ遺伝子からなる
形質転換体は補充のアミノ酸を含まない最少培地の平板
上で生長することができる。宿主の栄養要求が開放され
るので、これらのクローン中のプラスミドはトランスア
ミナーゼ遺伝子を含みかつそれを発現することを推定す
ることができる。
雑種ファージを含有するクローンが所望の熱的に安定な
トランスアミナーゼ遺伝子で同定されると、それらのク
ローンからのファージを染色体のｃＩ８５７遺伝子を含
有する宿主の中に形質導入して、組み換えプラスミドＤ
ＮＡを分離するとき、もとのプラスミド、すなわち、ｐ
ｓＥ１０３による汚染を防止する。形質導入された細胞
をファージの産生および溶菌を誘発させるために十分な
温度（すなわち、３７℃）でインキュベーションする。
トランスアミナーゼ遺伝子で同定されると、それらのク
ローンからのファージを染色体のｃＩ８５７遺伝子を含
有する宿主の中に形質導入して、組み換えプラスミドＤ
ＮＡを分離するとき、もとのプラスミド、すなわち、ｐ
ｓＥ１０３による汚染を防止する。形質導入された細胞
をファージの産生および溶菌を誘発させるために十分な
温度（すなわち、３７℃）でインキュベーションする。
所望の遺伝子を含有するファージはこうして分離される
。これは所望のトランスアミナーゼ遺伝子の染色体外の
状態を確証する。分離されたファージは、必要に応じて
、制限マツピングのために、および多数のコピーのベク
ターへのサブクローニングのために使用できる。
。これは所望のトランスアミナーゼ遺伝子の染色体外の
状態を確証する。分離されたファージは、必要に応じて
、制限マツピングのために、および多数のコピーのベク
ターへのサブクローニングのために使用できる。
ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子を含む遺伝物質がいったん
分離されると、その遺伝子を大きいコピー数のプラスミ
ドに移すことが望ましい、形質転換された宿主中のプラ
スミドの多数のコピーはトランスアミナーゼ遺伝子の多
数のコピーを保証するであろう。このようにして、各細
胞のトランスアミナーゼ活性を多数倍に増大することが
できる。この時に、また、制限エンドヌクレアーゼを使
用する切断により組み換えＤＮＡ断片の大きさを減少す
ることが望ましいことがある。
分離されると、その遺伝子を大きいコピー数のプラスミ
ドに移すことが望ましい、形質転換された宿主中のプラ
スミドの多数のコピーはトランスアミナーゼ遺伝子の多
数のコピーを保証するであろう。このようにして、各細
胞のトランスアミナーゼ活性を多数倍に増大することが
できる。この時に、また、制限エンドヌクレアーゼを使
用する切断により組み換えＤＮＡ断片の大きさを減少す
ることが望ましいことがある。
トランスアミナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、所
望の宿主株の形質転換に適当な多数のコピーのベクター
にサブクローニングする。選択可能なプラスミド、例え
ば、抗生物質耐性遺伝子をもつプラスミドを使用して、
生物学的選択およびプラスミドの維持を可能とすること
が好ましい。
望の宿主株の形質転換に適当な多数のコピーのベクター
にサブクローニングする。選択可能なプラスミド、例え
ば、抗生物質耐性遺伝子をもつプラスミドを使用して、
生物学的選択およびプラスミドの維持を可能とすること
が好ましい。
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）が宿主微生物である場合、とく
に適当なベクターはプラスミドｐＢＲ３２２であり、こ
れはアンピシリン耐性（Ａｐｒ）およびテトラサイクリ
ン耐性（ＴＣｒ）のための遺伝ｆを有し、そして典型的
には約１０〜２０コピーで存在するであろう。抗生物質
耐性をプラスミドの維持のために使用するとき、そのプ
ラスミドを維持する微生物（その抗生物質耐性の１また
は２以七の遺伝子およびまたトランスアミナーゼ遺伝子
をもつ）のみは、適当な抗生物質を添加されている培地
中で生長するであろう。他の抗生物質あるいはプラスミ
ドの維持および安定性のための他の方法を、必要に応じ
て、使用することができる。
に適当なベクターはプラスミドｐＢＲ３２２であり、こ
れはアンピシリン耐性（Ａｐｒ）およびテトラサイクリ
ン耐性（ＴＣｒ）のための遺伝ｆを有し、そして典型的
には約１０〜２０コピーで存在するであろう。抗生物質
耐性をプラスミドの維持のために使用するとき、そのプ
ラスミドを維持する微生物（その抗生物質耐性の１また
は２以七の遺伝子およびまたトランスアミナーゼ遺伝子
をもつ）のみは、適当な抗生物質を添加されている培地
中で生長するであろう。他の抗生物質あるいはプラスミ
ドの維持および安定性のための他の方法を、必要に応じ
て、使用することができる。
ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴ
ｓｋｙ ２）ランスアミナーゼ遺伝子を含有するこ
とが決定されたＬで分離されたＤＮＡ断片を、慣用法に
より選択したプラスミドの中に結合する。断片は七で分
離された組み換プラスミドから、適当な制限酵素を使用
する消化によって切除することができる０次いで、切除
されたＤＮＡ断片を選択したプラスミド中に結合する。
ｓｋｙ ２）ランスアミナーゼ遺伝子を含有するこ
とが決定されたＬで分離されたＤＮＡ断片を、慣用法に
より選択したプラスミドの中に結合する。断片は七で分
離された組み換プラスミドから、適当な制限酵素を使用
する消化によって切除することができる０次いで、切除
されたＤＮＡ断片を選択したプラスミド中に結合する。
この説明に従い作成されたプラスミドの部分的制限マー
２ブを第１図および第２図に示す。第１図は、実施例■
およびＶにおいて調製されたプラスミドｐＡＨ２７の制
限酵素の分析を表わす。第２図および第３図は、実施例
■および■において調製した、それぞれ、プラスミドｐ
ＧＡ１０８およびＰＧＡ１１５の制限酵ぶの分析を表わ
す。
２ブを第１図および第２図に示す。第１図は、実施例■
およびＶにおいて調製されたプラスミドｐＡＨ２７の制
限酵素の分析を表わす。第２図および第３図は、実施例
■および■において調製した、それぞれ、プラスミドｐ
ＧＡ１０８およびＰＧＡ１１５の制限酵ぶの分析を表わ
す。
好ましい実施態様を参照すると、ここでラムダ（ＳＦ３
（実施側型参照）または同様な構造を使用し、Ｓｐｒｍ
伝子はトランスアミナーゼ遺伝子に隣接して位置しそし
て両者の遺伝子を含むＤＮＡ断片を切除するであろう適
当な制限エンドヌクレアーゼを選択するように注意する
。ＡＴ ｓｔｙ ２トランスアミナーゼ遺伝子の上流
に３ ｐ ｒを含有するプラスミドは顕著な性能を与え
ることが発見され、そして最も好ましい構造である。ス
ペクチノマイシンは、コストが比較的低くかつ耐久性が
あるので、プラスミドの維持によく適する。さらに、ト
ランスアミナーゼ遺伝子の発現はＳｐｒ遺伝子プロモー
ターにより増大することができる。いずれの場合におい
ても、この実施態様は予期されないほどに高い水準のト
ランスアミナーゼの発現および安定性を生ずる。
（実施側型参照）または同様な構造を使用し、Ｓｐｒｍ
伝子はトランスアミナーゼ遺伝子に隣接して位置しそし
て両者の遺伝子を含むＤＮＡ断片を切除するであろう適
当な制限エンドヌクレアーゼを選択するように注意する
。ＡＴ ｓｔｙ ２トランスアミナーゼ遺伝子の上流
に３ ｐ ｒを含有するプラスミドは顕著な性能を与え
ることが発見され、そして最も好ましい構造である。ス
ペクチノマイシンは、コストが比較的低くかつ耐久性が
あるので、プラスミドの維持によく適する。さらに、ト
ランスアミナーゼ遺伝子の発現はＳｐｒ遺伝子プロモー
ターにより増大することができる。いずれの場合におい
ても、この実施態様は予期されないほどに高い水準のト
ランスアミナーゼの発現および安定性を生ずる。
組み換えプラスミドが所望のトランスアミナーゼ遺伝子
を含有することを確認するために、プラスミドを再分離
し、そして、前述のように、トランスアミナーゼ陰性株
の中に導入することができる。トランスアミナーゼ遺伝
子をもつプラスミド奢受取った有機体のみは最少培地上
でクローンを形成するであろう、追加の確認は、そのプ
ラスミド［］体を選択する方法の生長により実施するこ
とができる。例えば、プラスミドがスペクチノマイシン
耐性の遺伝情報を指定する遺伝子を含む場合、その抗生
物質を含有する平板りの生長はそのプラスミドの存在を
証明する。
を含有することを確認するために、プラスミドを再分離
し、そして、前述のように、トランスアミナーゼ陰性株
の中に導入することができる。トランスアミナーゼ遺伝
子をもつプラスミド奢受取った有機体のみは最少培地上
でクローンを形成するであろう、追加の確認は、そのプ
ラスミド［］体を選択する方法の生長により実施するこ
とができる。例えば、プラスミドがスペクチノマイシン
耐性の遺伝情報を指定する遺伝子を含む場合、その抗生
物質を含有する平板りの生長はそのプラスミドの存在を
証明する。
未発１ｙ１の最も好ましい実施態様において、プラスミ
ドは実施例■〜■に記載するようにして調製する。すな
わち、ＤＮＡ断片はネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）の熱的に安定ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子
およびスペクチノマイシン耐性の遺伝子の両者を含有す
るであろう。好ましいプラスミドベクターはｐＢＲ３２
２であり、そして好ましい宿主微生物株は大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）である。予期されないほどに高くかつ安定な
水準のトランスアミナーゼ活性が得られる。これはＤＮ
Ａ断片の比較的大きい大きさのために異常である。比較
的大きいＤＮＡ断片は低いコピー数を生じ、それゆえ低
い発現水準を生ずることが期待されるであるからである
。さらに、この大きさのプラスミドは比較的不安定であ
ることが期待されるであろう。しかしながら、ＤＮＡ断
片およびプラスミドの大きさを減少させる試み（実施例
■）は、トランスアミナーゼはトランスアミナーゼ活性
を減少させ（実施例Ｖｌ）かつ安定性を減少させた。
ドは実施例■〜■に記載するようにして調製する。すな
わち、ＤＮＡ断片はネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）の熱的に安定ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子
およびスペクチノマイシン耐性の遺伝子の両者を含有す
るであろう。好ましいプラスミドベクターはｐＢＲ３２
２であり、そして好ましい宿主微生物株は大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）である。予期されないほどに高くかつ安定な
水準のトランスアミナーゼ活性が得られる。これはＤＮ
Ａ断片の比較的大きい大きさのために異常である。比較
的大きいＤＮＡ断片は低いコピー数を生じ、それゆえ低
い発現水準を生ずることが期待されるであるからである
。さらに、この大きさのプラスミドは比較的不安定であ
ることが期待されるであろう。しかしながら、ＤＮＡ断
片およびプラスミドの大きさを減少させる試み（実施例
■）は、トランスアミナーゼはトランスアミナーゼ活性
を減少させ（実施例Ｖｌ）かつ安定性を減少させた。
いったんＡＴ ｓｔｙ ２が所望のプラスミドにに
位置すると、組み換えプラスミドを所望の宿主の中に導
入する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株は、その取扱いがよ
く知られているので、とくに適当な宿主である。その上
、ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
トランスアミナーゼ遺伝子の大１場菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
の中への導入は、異常にかつ予期されないほどに高くか
つ安定な水準の発現を生ずることが発見された。サルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株それ自体を、必要に応
じて、宿主として使用することができる。
位置すると、組み換えプラスミドを所望の宿主の中に導
入する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株は、その取扱いがよ
く知られているので、とくに適当な宿主である。その上
、ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
トランスアミナーゼ遺伝子の大１場菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
の中への導入は、異常にかつ予期されないほどに高くか
つ安定な水準の発現を生ずることが発見された。サルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株それ自体を、必要に応
じて、宿主として使用することができる。
本発明の新しくつくられた微生物の株は、熱的に安定な
ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴ
ｓｔｙ ２ｉｊｉ伝子の多数のプラスミドが位置す
るコピーを含み、そして天然の分離物に比較してトラン
スアミナーゼ活性の多数倍の増加を示す０組み換え微生
物は、細胞中のトランスアミナーゼ活性を最大にするた
めに適する条件下にそれを生長させることによって準備
する。一般に、健康な細胞の生長を達成するために慣用
の条件は適当であろう、すなわち、微生物は約６゜５〜
約８、好ましくは約７〜８のｐＨにおいて生長させるこ
とができる。温度は約２０〜４２℃、好ましくは約３７
℃であるべきである。
ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴ
ｓｔｙ ２ｉｊｉ伝子の多数のプラスミドが位置す
るコピーを含み、そして天然の分離物に比較してトラン
スアミナーゼ活性の多数倍の増加を示す０組み換え微生
物は、細胞中のトランスアミナーゼ活性を最大にするた
めに適する条件下にそれを生長させることによって準備
する。一般に、健康な細胞の生長を達成するために慣用
の条件は適当であろう、すなわち、微生物は約６゜５〜
約８、好ましくは約７〜８のｐＨにおいて生長させるこ
とができる。温度は約２０〜４２℃、好ましくは約３７
℃であるべきである。
普通の生長培地を使用して本発明の組み換え細胞を調製
することができる。この培地は炭素源、窒素源、無ｍ塩
類を含有し、そして、必要に応じて、選択した有機体の
生長に必要であることがある他の少雀の有機または無機
の栄養物質を含有する。一般に、次のガイドラインは適
当である。炭素源として、発酵性糖類を使用できる。窒
素源として、尿素、蛋白質加水分解物、有機酸のアンモ
ニウム塩類（例えば、酢酸アンモニウムまたはシュウ酸
アンモニウム）および／または無機酸のアンモニウム塩
類（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまた
は塩化アンモニウム）は満足すべきものであろう、無機
要素（例えば、リン酸カリウムまたはリン酸マグネシウ
ム）および／またはビタミン類（例えば、チアミノ、ビ
オチン）を添加することができる。生長培地の成分の特
別の選択は選択した微生物に依存するであろう。
することができる。この培地は炭素源、窒素源、無ｍ塩
類を含有し、そして、必要に応じて、選択した有機体の
生長に必要であることがある他の少雀の有機または無機
の栄養物質を含有する。一般に、次のガイドラインは適
当である。炭素源として、発酵性糖類を使用できる。窒
素源として、尿素、蛋白質加水分解物、有機酸のアンモ
ニウム塩類（例えば、酢酸アンモニウムまたはシュウ酸
アンモニウム）および／または無機酸のアンモニウム塩
類（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまた
は塩化アンモニウム）は満足すべきものであろう、無機
要素（例えば、リン酸カリウムまたはリン酸マグネシウ
ム）および／またはビタミン類（例えば、チアミノ、ビ
オチン）を添加することができる。生長培地の成分の特
別の選択は選択した微生物に依存するであろう。
細胞を生長後に収穫し、そして細胞あるいはその一部分
または抽出物をケト酸前駆物質およびアミノ供与体の対
応するアミノ酸への生物転化において使用できる。トラ
ンスアミナーゼ酵素を前記前駆物質およびアミノ供与体
と接触させる任意の便利な方法または手順を使用できる
０例えば、全細胞、超音波処理した細胞または酵素抽出
物（粗製または精製した）を使用できる。あるいは、前
記前駆物質およびアミノ供与体を生長培地に添加して、
生きている、活性的に生長する培養物の発酵によって生
物転化を実施することができる。
または抽出物をケト酸前駆物質およびアミノ供与体の対
応するアミノ酸への生物転化において使用できる。トラ
ンスアミナーゼ酵素を前記前駆物質およびアミノ供与体
と接触させる任意の便利な方法または手順を使用できる
０例えば、全細胞、超音波処理した細胞または酵素抽出
物（粗製または精製した）を使用できる。あるいは、前
記前駆物質およびアミノ供与体を生長培地に添加して、
生きている、活性的に生長する培養物の発酵によって生
物転化を実施することができる。
バッチまたは連続反応器において使用すために細胞また
は酵素を固定化することが好ましい、このようにして、
細胞または酵素のトランスアミナーゼ活性の利用を最高
とすることができ、それと同時に取扱いを最小としかつ
生長培地および条件の要件を排除することができる０本
発明の熱的に安定なトランスアミナーゼは、高温を必要
とする方法による固定化のために理想的である。固定化
の工程に要求される温度に暴露した後でさえ、実質的な
トランスアミナーゼ活性は保持される。
は酵素を固定化することが好ましい、このようにして、
細胞または酵素のトランスアミナーゼ活性の利用を最高
とすることができ、それと同時に取扱いを最小としかつ
生長培地および条件の要件を排除することができる０本
発明の熱的に安定なトランスアミナーゼは、高温を必要
とする方法による固定化のために理想的である。固定化
の工程に要求される温度に暴露した後でさえ、実質的な
トランスアミナーゼ活性は保持される。
固定化された細胞または酵素は、前駆物質およびアミノ
供与体の溶液と直接接触させることができる。アミノ供
寮体対ケト酸前駆物質のモル比、すなわち、アスパラギ
ン酸対フェニルピルビン酸のモル比は、約ｌ＝１〜約１
．５： １であるべきである。
供与体の溶液と直接接触させることができる。アミノ供
寮体対ケト酸前駆物質のモル比、すなわち、アスパラギ
ン酸対フェニルピルビン酸のモル比は、約ｌ＝１〜約１
．５： １であるべきである。
本発明の微生物株は、アルファーケト酸のアミノ酸への
転化において有意な方法の利益を提供する。トランスア
ミナーゼ活性は、アミノ酸への転化速度が非常に急速で
あるようなものである。これは反応器内の滞留時間を短
縮する０次いで、前駆物質の破壊に関連する問題は、反
応時間の減少によって軽減されうる０本発明の微生物株
は、長い半減期により特徴づけられるトランスアミナー
ゼ酵素を産生じ、触媒の有効寿命を大きく延長する。細
胞中のトランスアミナーゼ活性の量および安定性は、こ
こに記載する技術により大きく増大される。
転化において有意な方法の利益を提供する。トランスア
ミナーゼ活性は、アミノ酸への転化速度が非常に急速で
あるようなものである。これは反応器内の滞留時間を短
縮する０次いで、前駆物質の破壊に関連する問題は、反
応時間の減少によって軽減されうる０本発明の微生物株
は、長い半減期により特徴づけられるトランスアミナー
ゼ酵素を産生じ、触媒の有効寿命を大きく延長する。細
胞中のトランスアミナーゼ活性の量および安定性は、こ
こに記載する技術により大きく増大される。
以下の実施例は例示の目的で与えられ、そしてここに記
載する本発明を限定する意味ではない。
載する本発明を限定する意味ではない。
本発明の説明を通じて、次の略号を使用した：Ａｐｙ
−アンピシリン耐性 ＡＴＰ −アゾンシントリホスフェート℃ −セ氏 ＤＮＡ −デオキシリポ核酸 ＤＴＴ −ジチオスレイトール ＥＤＴＡ −エチレンジアミノ四酢酸ｇ −グラム ＨＰＬＣ−高圧液体クロマトグラフィーＩＡＡ −イ
ソアミルアルコール ｋｂ −キロ塩基 Ｍ −モル ｍＭ −ミリモル 終ｇ −マイクログラム 用ｌ −マイクロリットル ｍ１ｎ−分 ｎｍ −ナノメートル ＯＤ −光学濃度 ＯＤＵ −光学濃度単位 Ｐ−５−Ｐ −ピリドキシアル−５−ホスフェート ＰＥＧ −ポリエチレングリコール ＲＰＭ −回転７分 ＳＤＳ −１−デシル硫酸ナトリウムＳｐ ｒ −
スペクチノマイシン耐性ＴＣＡ −トリクロロ酢酸 Ｔｃｒ −テトラサイタリン耐性 Ｔｃ５− テトラサイタリン感受性 ＴＥＳ −）リスーＥＤＴＡ−塩化ナトリウム Ｔｒｉｓ −）リス（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン 次の培地、緩衝液または原溶液を実施例における使用の
ために調製した。すべては脱イオン水を使用してつくっ
た。
−アンピシリン耐性 ＡＴＰ −アゾンシントリホスフェート℃ −セ氏 ＤＮＡ −デオキシリポ核酸 ＤＴＴ −ジチオスレイトール ＥＤＴＡ −エチレンジアミノ四酢酸ｇ −グラム ＨＰＬＣ−高圧液体クロマトグラフィーＩＡＡ −イ
ソアミルアルコール ｋｂ −キロ塩基 Ｍ −モル ｍＭ −ミリモル 終ｇ −マイクログラム 用ｌ −マイクロリットル ｍ１ｎ−分 ｎｍ −ナノメートル ＯＤ −光学濃度 ＯＤＵ −光学濃度単位 Ｐ−５−Ｐ −ピリドキシアル−５−ホスフェート ＰＥＧ −ポリエチレングリコール ＲＰＭ −回転７分 ＳＤＳ −１−デシル硫酸ナトリウムＳｐ ｒ −
スペクチノマイシン耐性ＴＣＡ −トリクロロ酢酸 Ｔｃｒ −テトラサイタリン耐性 Ｔｃ５− テトラサイタリン感受性 ＴＥＳ −）リスーＥＤＴＡ−塩化ナトリウム Ｔｒｉｓ −）リス（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン 次の培地、緩衝液または原溶液を実施例における使用の
ために調製した。すべては脱イオン水を使用してつくっ
た。
最少培地
Ｍｇ５Ｏａ ｅ７Ｈ２００，２０ｇ／ｌクエン酸塩−木
和物 ２．００ｇ／ｌに２ ＨＰＯ４１０、
ＯＯｇ／ ｌ ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・ ３．５０ｇ／ １Ｈ
２０ グルコース ０．５０％コハク酸塩
０．２５％マレイン酸塩
０．２５％ヒスチジン Ｏ、ｌ
Ｏｍｇ／ｍ １アルギ＝ン０ 、１０ｍｇ／ｍ ｌ アスパオラギ７ ０．１０ｍｇ／ｍｌグルタ
ミ７ ０．１０ｍｇ／ｍｌイソロイシン
０．１０ｍｇ／ｍｌロイシン
０ 、１０ｍｇ／ｍ ｌバリン
０ 、１０ｍｇ／ｍ Ｌグルタミン酸
０．１０ｍｇ／ｍｌアルファーケトーグルタ ０
、１０ｍｇ／ｍ ｌレート チアミ７−ＨＣＩ Ｏ、ｌ Ｏｍｇ／
１寒天ノープル（Ｄｉｆｃ １．５０％最初の４つ
の成分を混合し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処
理して滅菌した。培地は別個にオートクレーブ処理した
。滅菌した成分を混合し、冷却し、次いで残りの成分を
加えた。
和物 ２．００ｇ／ｌに２ ＨＰＯ４１０、
ＯＯｇ／ ｌ ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・ ３．５０ｇ／ １Ｈ
２０ グルコース ０．５０％コハク酸塩
０．２５％マレイン酸塩
０．２５％ヒスチジン Ｏ、ｌ
Ｏｍｇ／ｍ １アルギ＝ン０ 、１０ｍｇ／ｍ ｌ アスパオラギ７ ０．１０ｍｇ／ｍｌグルタ
ミ７ ０．１０ｍｇ／ｍｌイソロイシン
０．１０ｍｇ／ｍｌロイシン
０ 、１０ｍｇ／ｍ ｌバリン
０ 、１０ｍｇ／ｍ Ｌグルタミン酸
０．１０ｍｇ／ｍｌアルファーケトーグルタ ０
、１０ｍｇ／ｍ ｌレート チアミ７−ＨＣＩ Ｏ、ｌ Ｏｍｇ／
１寒天ノープル（Ｄｉｆｃ １．５０％最初の４つ
の成分を混合し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処
理して滅菌した。培地は別個にオートクレーブ処理した
。滅菌した成分を混合し、冷却し、次いで残りの成分を
加えた。
複合培地（ｃｏｍｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ）［ルリアブ
イヨン（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）］バタトリトリプ
トン（Ｔ １０．０ｇ７１Ｍ）（Ｄｉｆｃｏ） バクトー酵母エキス（Ｔ ５．０ｇ７１Ｍ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） ＮａＣ１１０，Ｏｇ／ｌ ＮａＯＨ１，５ｇ／ｌ 培地を１２１°Ｃで１５分間オートクレーブ処理して滅
菌した。培地は液体の形態で、あるいは固体の平板の形
態で使用した。固体の平板は１．５％の寒天ノープル（
Ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ）（Ｄｉｆｃｏ）で固化するこ
とによって調製した。
イヨン（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）］バタトリトリプ
トン（Ｔ １０．０ｇ７１Ｍ）（Ｄｉｆｃｏ） バクトー酵母エキス（Ｔ ５．０ｇ７１Ｍ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） ＮａＣ１１０，Ｏｇ／ｌ ＮａＯＨ１，５ｇ／ｌ 培地を１２１°Ｃで１５分間オートクレーブ処理して滅
菌した。培地は液体の形態で、あるいは固体の平板の形
態で使用した。固体の平板は１．５％の寒天ノープル（
Ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ）（Ｄｉｆｃｏ）で固化するこ
とによって調製した。
リゾチーム緩衝液
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ３０，０ｍＭ８．０）
Ｎａ２ ＥＤＴＡ ５０．Ｏｍ
ＭＮａＣｌ ５０
．０ｍＭスクロース ２５．０％リゾ
チーム １．０ｍｇ／ｍｌリゾチーム
を使用前に添加した。
ＭＮａＣｌ ５０
．０ｍＭスクロース ２５．０％リゾ
チーム １．０ｍｇ／ｍｌリゾチーム
を使用前に添加した。
ＳＤＳ緩衝液
ＳＤＳ （１０％） ２０．０ｍ１Ｎａ
２ ＥＤＴＡ （５００、５００，０ｍＭＯｍｍ）（ｐ
Ｈ８，０） ＴＥＳ １２０．０ｍ１ＴＥＳ
緩衝液 Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｌ （ｐＨ ７，５） ０．０２０ＭＮａＣ
ｌ Ｏ，１００ＭＮａ２ ＥＤＴ
Ａ （５００、５００，０ｍＭＯｍｍ）（ｐ）１８．０
） 丈エニ里里員垂 ＡＴＰ １．０ｍＭＤＴＴ
２０．ＯｍＭ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｌ （ｐＨ５０，０ｍＭ７．
８） ＭｇＣ１２１０，０ｍＭ 変性ロウリイ（Ｉ、ｏｗｒｙ）培地 バタトリトリプトン（Ｔ ｌｏ、００ｇ７１Ｍ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） バクトー酵母エキス（Ｔ ５．００ｇ／ＩＭ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） ＮａＣ［５，００ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４０、５０ｇ／ Ｉ Ｋ ２ ＨＰ Ｏ４４、ＯＯｇ ／ ｌＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，２５ｇ／ｌ この培地を１２０℃で２０分間オートクレーブ処理して
滅菌した。
２ ＥＤＴＡ （５００、５００，０ｍＭＯｍｍ）（ｐ
Ｈ８，０） ＴＥＳ １２０．０ｍ１ＴＥＳ
緩衝液 Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｌ （ｐＨ ７，５） ０．０２０ＭＮａＣ
ｌ Ｏ，１００ＭＮａ２ ＥＤＴ
Ａ （５００、５００，０ｍＭＯｍｍ）（ｐ）１８．０
） 丈エニ里里員垂 ＡＴＰ １．０ｍＭＤＴＴ
２０．ＯｍＭ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｌ （ｐＨ５０，０ｍＭ７．
８） ＭｇＣ１２１０，０ｍＭ 変性ロウリイ（Ｉ、ｏｗｒｙ）培地 バタトリトリプトン（Ｔ ｌｏ、００ｇ７１Ｍ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） バクトー酵母エキス（Ｔ ５．００ｇ／ＩＭ）（Ｄ
ｉｆｃｏ） ＮａＣ［５，００ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４０、５０ｇ／ Ｉ Ｋ ２ ＨＰ Ｏ４４、ＯＯｇ ／ ｌＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，２５ｇ／ｌ この培地を１２０℃で２０分間オートクレーブ処理して
滅菌した。
トランスアミナーゼ溶液
フェニルピルビン酸 ３１．００ｇ、’１アスパ
ラギン酸 ２Ｂ、９０ｇ／ｌＺｎＳＯ４・
７Ｈ２０１０，００ｇ／ｌピリドキサルー５−ホス
０．０２ｇ／ｌフェート この水溶液を調製し、そしてｐＨをＮａＯＨで７．８に
調節した。
ラギン酸 ２Ｂ、９０ｇ／ｌＺｎＳＯ４・
７Ｈ２０１０，００ｇ／ｌピリドキサルー５−ホス
０．０２ｇ／ｌフェート この水溶液を調製し、そしてｐＨをＮａＯＨで７．８に
調節した。
試薬（実施例■）
ピリドキサルー５−ホス ２ 、５ｍｇフェート
アルファーケトゲルタレ−１０５，０ｍｇト
Ｌ−７エニルアラニン ２４５．０ｍｇフェナジ
ンメトサルフェー ３ 、０ｍｇト ニトロブルーテトラゾリウ ２４．０ｍｇム ５０．０ｍｌの贋の試薬をトの成分からつくり、これに
０．１ＭのＫＨＰＯａ （示したｐＨを午えるために
十分な比率のに２ＨＰＯ４およびＫＨ２ｐｏ、、の混合
物）を攪拌しながら添加して、−ハ１人＆九−ＬＸ’）
ζ１ヂ１４実施例Ｉ （トランスアミナーゼ遺伝子の分離） ラムダ５Ｅ４１種ファージの形態のネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝
子ライブラリーを、Ｇ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、
マサチュセッッ・インスチュート・オブψテクノロジー
（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た。ラムダ
ＳＥ４は、複製のプラスミド起源および低いコピー数の
プラ；ｚ、ミドｐＤＰＴ４２７のスペクチノマイシン耐
性遺伝子（Ｓ ｐ ｒ）をラムダ１０５９の中に結合す
ることによって構成した。これらのすべてはＳ。
ンメトサルフェー ３ 、０ｍｇト ニトロブルーテトラゾリウ ２４．０ｍｇム ５０．０ｍｌの贋の試薬をトの成分からつくり、これに
０．１ＭのＫＨＰＯａ （示したｐＨを午えるために
十分な比率のに２ＨＰＯ４およびＫＨ２ｐｏ、、の混合
物）を攪拌しながら添加して、−ハ１人＆九−ＬＸ’）
ζ１ヂ１４実施例Ｉ （トランスアミナーゼ遺伝子の分離） ラムダ５Ｅ４１種ファージの形態のネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝
子ライブラリーを、Ｇ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、
マサチュセッッ・インスチュート・オブψテクノロジー
（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た。ラムダ
ＳＥ４は、複製のプラスミド起源および低いコピー数の
プラ；ｚ、ミドｐＤＰＴ４２７のスペクチノマイシン耐
性遺伝子（Ｓ ｐ ｒ）をラムダ１０５９の中に結合す
ることによって構成した。これらのすべてはＳ。
エレッジ（Ｅｌｌｅｄｇｅ）ら、ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。
クテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。
１、）、「大腸菌の突然変異体の相補性による遺伝子の
同定のためのプラスミドベクター（Ｐｈａｓｍｉｄ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｂｙＣｏｍｐｌｅｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ ｃ＋ｆ Ｅ ５ｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｍｕｔ ａｎｔｓ
）］、Ｖｏ１．１６２．７７７−８３ページ（１９８５
）に記載された。温度感受性ラムダリプレッサーの存在
下のこのラムダの構成は、低温においてプラスミドとし
て、すなわち、溶原状態で、そして高温において溶菌状
態で存在することができる。
同定のためのプラスミドベクター（Ｐｈａｓｍｉｄ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｂｙＣｏｍｐｌｅｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ ｃ＋ｆ Ｅ ５ｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｍｕｔ ａｎｔｓ
）］、Ｖｏ１．１６２．７７７−８３ページ（１９８５
）に記載された。温度感受性ラムダリプレッサーの存在
下のこのラムダの構成は、低温においてプラスミドとし
て、すなわち、溶原状態で、そして高温において溶菌状
態で存在することができる。
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｃｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕ ｒ ｉ ｕｍ）ＤＮＡをＳａｕ ３Ａで部分
的に消化し、そして１２−１７ｋｂ断片を分離した。ラ
ムダＳＥ４をＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化
した。このサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を線状
ラムダＳＥ４へ結合した。試験管内のバッキングの後、
１２−１７ｋｂのＤＮＡ断片を含有する組み換えファー
ジを選択した。これらの工程のため、エレッジ（Ｅ ｌ
ｌ ｅｄｇｅ）らの論文に記載される手順に従った。
ｉｍｕ ｒ ｉ ｕｍ）ＤＮＡをＳａｕ ３Ａで部分
的に消化し、そして１２−１７ｋｂ断片を分離した。ラ
ムダＳＥ４をＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化
した。このサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を線状
ラムダＳＥ４へ結合した。試験管内のバッキングの後、
１２−１７ｋｂのＤＮＡ断片を含有する組み換えファー
ジを選択した。これらの工程のため、エレッジ（Ｅ ｌ
ｌ ｅｄｇｅ）らの論文に記載される手順に従った。
選択した組み換えファージは、Ｐ２溶原菌を通して継代
後１大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｍ５１５８の中に導入した
。
後１大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｍ５１５８の中に導入した
。
ラムダＳＥ４組み換えファージを、高温の誘導を用いて
、大Ｉ！！菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｍ５１５８から分離した
。細胞を３０℃において中期の対数増殖期（ＯＤｓ ｓ
ｏ ＝０ 、４）に生長させ、４３℃の水浴振盪器へ
３０分間移し、次いで３７℃でほぼ２時間インキュベー
ションした。ＣＨＣ１３をインキュベーション後に添加
した。１．０×１０４〜５．０ＸＩＯ８７ｙ−ジ／ｍｌ
の力価が回収された。
、大Ｉ！！菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｍ５１５８から分離した
。細胞を３０℃において中期の対数増殖期（ＯＤｓ ｓ
ｏ ＝０ 、４）に生長させ、４３℃の水浴振盪器へ
３０分間移し、次いで３７℃でほぼ２時間インキュベー
ションした。ＣＨＣ１３をインキュベーション後に添加
した。１．０×１０４〜５．０ＸＩＯ８７ｙ−ジ／ｍｌ
の力価が回収された。
ラムダファージのライブラリーをスクリーニングする前
に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１
２株ＤＧ３０およびＤＧ４４〔両者は大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃ。
に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１
２株ＤＧ３０およびＤＧ４４〔両者は大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃ。
上止〕ジェネチック・ストック・センター（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、イ工−ル大学、
コネチカット州ニューヘブンから入手した］を、温度感
受性ラムダリプレッサーを発現するｃＩ８５７遺伝子を
含有するプラスミドｐＳＥ１０３［Ｇ、ウォーカー（Ｗ
ａ ｌ ｋ ｅ ｒ）から入手しそしてエレッジ（Ｅｌ
ｌｅｄｇｅ）らの論文に記載される］で形質転換した。
ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、イ工−ル大学、
コネチカット州ニューヘブンから入手した］を、温度感
受性ラムダリプレッサーを発現するｃＩ８５７遺伝子を
含有するプラスミドｐＳＥ１０３［Ｇ、ウォーカー（Ｗ
ａ ｌ ｋ ｅ ｒ）から入手しそしてエレッジ（Ｅｌ
ｌｅｄｇｅ）らの論文に記載される］で形質転換した。
さらに、ｐＳＥ１０３はプラスミドの維持のためのカナ
マイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）を有する。いったん形質
転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）
株（ＤＧ３０およびＤＧ４４／ｐＳＥ１０３）がＦで得
られた組み換えラムダファージで形質導入されると、ラ
ムダは低温において溶原状態でおよび高温において溶菌
状態で維持することができる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＤＧ３０およびＤＧ４４
は、ゲル７７７ド（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら、ジャーナルｅ
オブ争パタテリオロシー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）
、［アスパラギン酸塩および芳香族アミノ酸アミノトラ
ンスフェラーゼにおいて欠ける大腸菌突然変異体（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｄ
ｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎ ｔｈｅ Ａｓｐａｒｔ
ａｔｅ ａｎｄＡｒｏｍａｔｉｃ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅｓ）Ｊ、Ｖｏｌ。
マイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）を有する。いったん形質
転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）
株（ＤＧ３０およびＤＧ４４／ｐＳＥ１０３）がＦで得
られた組み換えラムダファージで形質導入されると、ラ
ムダは低温において溶原状態でおよび高温において溶菌
状態で維持することができる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＤＧ３０およびＤＧ４４
は、ゲル７７７ド（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら、ジャーナルｅ
オブ争パタテリオロシー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）
、［アスパラギン酸塩および芳香族アミノ酸アミノトラ
ンスフェラーゼにおいて欠ける大腸菌突然変異体（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｄ
ｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎ ｔｈｅ Ａｓｐａｒｔ
ａｔｅ ａｎｄＡｒｏｍａｔｉｃ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄ Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅｓ）Ｊ、Ｖｏｌ。
１３０．４２９−４０ （１９７７）に記載されている
。株ＤＧ３０はラムダ感受性でありそしてアミノトラン
スフェラーゼ陰性（すなわち、ａｓｐＣ−ｔ ｙ ｒＢ
−ｉ Ｉ ｖＥ−） である。ＤＧ４４は、１ｌｖＥ＋
であることを除外して、ＤＧ３０の遺伝子型を有する；
すなわち、それはラムダ感受性でありそしてａｓｐＣ−
ｔｙｒＢ−ｉ １ｖＥ＋である。１ｌｖＥ遺伝子は分枝
鎖状アミノ酸アミノトランスフェラーゼの遺伝情報を指
定する。
。株ＤＧ３０はラムダ感受性でありそしてアミノトラン
スフェラーゼ陰性（すなわち、ａｓｐＣ−ｔ ｙ ｒＢ
−ｉ Ｉ ｖＥ−） である。ＤＧ４４は、１ｌｖＥ＋
であることを除外して、ＤＧ３０の遺伝子型を有する；
すなわち、それはラムダ感受性でありそしてａｓｐＣ−
ｔｙｒＢ−ｉ １ｖＥ＋である。１ｌｖＥ遺伝子は分枝
鎖状アミノ酸アミノトランスフェラーゼの遺伝情報を指
定する。
ラムダ列をもつ温度感受性リプレッサーを含有する大＋
１９菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏ １ｉ
）ＤＧ４４細胞の形質導入および相補性は、次のように
して実施した：ＤＧ４４／ｐｓＥ１０３を５０ 、０４
ｇ ／ ｍ ｌのカナマイシンおよび０゜２％のマル
ト−スを含有するルリアブイヨン中で３０°Ｃにおいて
、中期の対数増殖期（約ＯＤ ５５０＝０．４）まで生
長させた。培養物を遠心し、そしてｌ／１０容量のシリ
アブイヨン中に再懸濁させた。細胞培養物の０．１ｍｌ
の部分を上で分離した組み換えファージのライブラリー
で、０．５の複数の感染を使用して、形質導入した。ラ
ムダファージを添加し、たのち、培養物を３０℃で３０
分間振盪せずにインキュベーションし、次いでｌＯ，Ｏ
ｍＭのＴｒｉｓおよびＩＯ，ＯｍＭのＭｇ５Ｏａを含有
する溶液（ｐＨ７、５） （７）ｌ 、 Ｏｎｌで洗浄
した。細胞を遠心しそして０ 、１ ｍ ｌの同一溶液
中に再懸濁させ、そして最少培地、すなわち、フェニル
アラニン、チロシンおよびアスパラギン酸を含まない培
地、上に薄くかぶせ（ｐｉａｔｅ）た。平板（ｐｌａｔ
ｅｓ）Ｌ、それらの上にコロニーが現われるまで、約４
０間、３０℃でインキュベーションした。この最少培地
上で生長できるコロニーのみは、トランスアミナーゼ組
み換えラムダファージを含有するものである。
１９菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏ １ｉ
）ＤＧ４４細胞の形質導入および相補性は、次のように
して実施した：ＤＧ４４／ｐｓＥ１０３を５０ 、０４
ｇ ／ ｍ ｌのカナマイシンおよび０゜２％のマル
ト−スを含有するルリアブイヨン中で３０°Ｃにおいて
、中期の対数増殖期（約ＯＤ ５５０＝０．４）まで生
長させた。培養物を遠心し、そしてｌ／１０容量のシリ
アブイヨン中に再懸濁させた。細胞培養物の０．１ｍｌ
の部分を上で分離した組み換えファージのライブラリー
で、０．５の複数の感染を使用して、形質導入した。ラ
ムダファージを添加し、たのち、培養物を３０℃で３０
分間振盪せずにインキュベーションし、次いでｌＯ，Ｏ
ｍＭのＴｒｉｓおよびＩＯ，ＯｍＭのＭｇ５Ｏａを含有
する溶液（ｐＨ７、５） （７）ｌ 、 Ｏｎｌで洗浄
した。細胞を遠心しそして０ 、１ ｍ ｌの同一溶液
中に再懸濁させ、そして最少培地、すなわち、フェニル
アラニン、チロシンおよびアスパラギン酸を含まない培
地、上に薄くかぶせ（ｐｉａｔｅ）た。平板（ｐｌａｔ
ｅｓ）Ｌ、それらの上にコロニーが現われるまで、約４
０間、３０℃でインキュベーションした。この最少培地
上で生長できるコロニーのみは、トランスアミナーゼ組
み換えラムダファージを含有するものである。
実施例■
（８的に安定なトランスアミナーゼ
活性の検出）
実施例Ｉからのクローンをアッセイして、熱安定性を示
すトランスアミナーゼ酵素、すなわち、ＡＴ ｓｔｙ
２酵素の遺伝情報を指定する遺伝子を含有するもの
を選択した。試験すべき菌株をルリアブイヨン上で３０
℃において一夜生長させた。細胞を超音波処理し、各試
料を２つの部分に分割した。一方の部分（約１．０ｍ１
）を氷上に２３分間対照として保持した。他方（約１．
０ｍ１）を５５℃に水浴振盪器中で２３分間インキュベ
ーションした。各部分（すなわち、各クローンについて
対照および加熱した部分）からの０．５ｍｌに、９０．
Ｏｎｌのアスパラギン酸（０，１Ｍ） 、 ３０ 、
Ｏｍｇｃ７）Ｐ−５−Ｐおよび１８６０．０ｍｇのフェ
ニルピリビン酸から構成された溶液の４．５ｍｌを添加
した。これらを３０℃でインキュベーションした。試料
を最初におよび６０分に取り、そして試料の０ 、８
ｍ ｌにつ！！４０．０鉢ｌのＴＣＡ（５０％の原溶液
）の添加により反応を停止させた。試料をＨＰＬＣによ
りフェニルアラニンについて分析した。ＤＧ４４−■お
よびＤＧ４４−ＩＶと表示した２つのクローンは熱的に
安定なトランスアミナーゼ活性を明確に示し、対照の部
分と比較して、トランスアミナーゼ活性のほぼ７５％は
加熱後に保持された。
すトランスアミナーゼ酵素、すなわち、ＡＴ ｓｔｙ
２酵素の遺伝情報を指定する遺伝子を含有するもの
を選択した。試験すべき菌株をルリアブイヨン上で３０
℃において一夜生長させた。細胞を超音波処理し、各試
料を２つの部分に分割した。一方の部分（約１．０ｍ１
）を氷上に２３分間対照として保持した。他方（約１．
０ｍ１）を５５℃に水浴振盪器中で２３分間インキュベ
ーションした。各部分（すなわち、各クローンについて
対照および加熱した部分）からの０．５ｍｌに、９０．
Ｏｎｌのアスパラギン酸（０，１Ｍ） 、 ３０ 、
Ｏｍｇｃ７）Ｐ−５−Ｐおよび１８６０．０ｍｇのフェ
ニルピリビン酸から構成された溶液の４．５ｍｌを添加
した。これらを３０℃でインキュベーションした。試料
を最初におよび６０分に取り、そして試料の０ 、８
ｍ ｌにつ！！４０．０鉢ｌのＴＣＡ（５０％の原溶液
）の添加により反応を停止させた。試料をＨＰＬＣによ
りフェニルアラニンについて分析した。ＤＧ４４−■お
よびＤＧ４４−ＩＶと表示した２つのクローンは熱的に
安定なトランスアミナーゼ活性を明確に示し、対照の部
分と比較して、トランスアミナーゼ活性のほぼ７５％は
加熱後に保持された。
実施例■
（アミノトランスフェラーゼ活性を
含有する雑種ファージの確認）
実施例ＩＩからのＤＧ４４−ＩおよびＤＧ４４−■のク
ローンを試験して、トランスアミナーゼの発現が、染色
体の復帰細胞よりはむしろ、ＡＴｓｔｙ ２遺伝子を
含有する雑種ファージの結果であることを確認した。ク
ローンを複合培地上で生長させ、そしてファージの産生
について誘導した。各クローンについて、はぼ２．０ｘ
ｌＯ３フアージ／ ｍ Ｉのファーシカ価が検出された
。分離したファージを、各々温度感受性ラムダリプレッ
サーを含有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｔ）ＤＧ４４／ｐｓＥ１０３およびＤＧ３０／ｐ
ｓＥ１０３の中に形質導入した。
ローンを試験して、トランスアミナーゼの発現が、染色
体の復帰細胞よりはむしろ、ＡＴｓｔｙ ２遺伝子を
含有する雑種ファージの結果であることを確認した。ク
ローンを複合培地上で生長させ、そしてファージの産生
について誘導した。各クローンについて、はぼ２．０ｘ
ｌＯ３フアージ／ ｍ Ｉのファーシカ価が検出された
。分離したファージを、各々温度感受性ラムダリプレッ
サーを含有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｔ）ＤＧ４４／ｐｓＥ１０３およびＤＧ３０／ｐ
ｓＥ１０３の中に形質導入した。
細胞を最少培地（すなわち、フェニルアラニン、チロシ
ンおよびアスパラギン酸を含まない培地）Ｈに薄くかぶ
せ、モして３０’Ｃ！でインキュベーションした。５日
後、再補充された（ｒｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）Ｄ
Ｇ４４／ｐｓＥ１０３クローンが明らかであり、そして
延長したインキュベーションは、また、再補充されたＤ
Ｇ３０／ｐＳＥ１０３クローンを明らかにした。実施例
Ｈに記載した熱失活−フェニルアラニン産生アッセイを
実施し、そしてすべてのクローンは熱安定性のトランス
アミナーゼ活性を示した。
ンおよびアスパラギン酸を含まない培地）Ｈに薄くかぶ
せ、モして３０’Ｃ！でインキュベーションした。５日
後、再補充された（ｒｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）Ｄ
Ｇ４４／ｐｓＥ１０３クローンが明らかであり、そして
延長したインキュベーションは、また、再補充されたＤ
Ｇ３０／ｐＳＥ１０３クローンを明らかにした。実施例
Ｈに記載した熱失活−フェニルアラニン産生アッセイを
実施し、そしてすべてのクローンは熱安定性のトランス
アミナーゼ活性を示した。
ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子を含有するＤＮＡを大ｒｉ
Ｙに得るために、次の手順に従い、大規模のプラスミド
の調製を行った。５０．０ｇｇ／ｍｌのスペクチノマイ
シンを含む複合培地に形質導入した細胞を接種し、そし
て−夜インキユベーションした。細胞を遠心し、そして
沈殿物を４．０ｍｌのリゾチーム緩衝液中に再懸濁させ
、そしてツルへル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＳ−３４遠心管
中に入れた。リンチーム細胞懸濁液３７℃で１５分間イ
ンキュベーションし、そして１６．０ｍｌのＳＤＳ緩衝
液をおだやかに攪拌しながら透明になるまで添加した。
Ｙに得るために、次の手順に従い、大規模のプラスミド
の調製を行った。５０．０ｇｇ／ｍｌのスペクチノマイ
シンを含む複合培地に形質導入した細胞を接種し、そし
て−夜インキユベーションした。細胞を遠心し、そして
沈殿物を４．０ｍｌのリゾチーム緩衝液中に再懸濁させ
、そしてツルへル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＳ−３４遠心管
中に入れた。リンチーム細胞懸濁液３７℃で１５分間イ
ンキュベーションし、そして１６．０ｍｌのＳＤＳ緩衝
液をおだやかに攪拌しながら透明になるまで添加した。
５ｍｌの５ＭのＮａＣ１を添加し、−２０℃で１時間イ
ンキュベーションし、次いで５Ｓ−３４０−ター内で２
０．ＯＯＯＲＰＭで３０．０分間遠心した。５ ｍ ｌ
の５０％のＰＥＧ型８０００をト澄み液に添加し、これ
を氷りで１時間インキュベーションし、１０．ＯＯＯＲ
ＰＭで１０．０分間遠心し、そしてト澄み液を廃棄した
。沈殿物を５ 、０ ｍ ｌのＴＥＳ緩衝液中におだや
かに溶解し、そし７０．３３ｍ１の２．０ｍｇ／ ｍ
ｌのＲＮａｓｅ溶液を添加した。これを６５°Ｃで２０
〜３０分間インキュベーションした。容管に、９．３ｇ
の塩化セシウムを添加し、そして混合した。最終の体積
をＴＥＳ緩衝液でｉｏ、。
ンキュベーションし、次いで５Ｓ−３４０−ター内で２
０．ＯＯＯＲＰＭで３０．０分間遠心した。５ ｍ ｌ
の５０％のＰＥＧ型８０００をト澄み液に添加し、これ
を氷りで１時間インキュベーションし、１０．ＯＯＯＲ
ＰＭで１０．０分間遠心し、そしてト澄み液を廃棄した
。沈殿物を５ 、０ ｍ ｌのＴＥＳ緩衝液中におだや
かに溶解し、そし７０．３３ｍ１の２．０ｍｇ／ ｍ
ｌのＲＮａｓｅ溶液を添加した。これを６５°Ｃで２０
〜３０分間インキュベーションした。容管に、９．３ｇ
の塩化セシウムを添加し、そして混合した。最終の体積
をＴＥＳ緩衝液でｉｏ、。
ｍｌ／管に調節した。次に、１００．０琲ＩのｌＯ、Ｏ
ｍ ｇ ／ ｍ ｌの臭化エチジウムを容管に添加し、
そして混合した。各試料を自己密閉型超遠心機の管に入
れ、そして４０ 、ＯＯＯＲＰＭで４℃において約４８
．０時間遠心した。プラスミドの帯を注射器で集め、モ
してＩＡＡを使用する抽出により臭化エチジウムを除去
した。試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩおよびｉｏ、
ｏｍＭのＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）の緩衝液中で、緩衝
液を数回交換しながら、−夜透析した。
ｍ ｇ ／ ｍ ｌの臭化エチジウムを容管に添加し、
そして混合した。各試料を自己密閉型超遠心機の管に入
れ、そして４０ 、ＯＯＯＲＰＭで４℃において約４８
．０時間遠心した。プラスミドの帯を注射器で集め、モ
してＩＡＡを使用する抽出により臭化エチジウムを除去
した。試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩおよびｉｏ、
ｏｍＭのＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）の緩衝液中で、緩衝
液を数回交換しながら、−夜透析した。
さらに、次の迅速プラスミド分離を用いて、プラスミド
をＤＧ４４−ＩおよびＤＧ４４−ＩＶから分離した。５
０ｇｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５．０ｍｌのルリア
ブイヨン中で細胞を一夜生長させた。培養物を１０．Ｏ
ＯＯＲＰＭで１０分間遠心し、そして沈殿物を１．４ｍ
ｌのりゾチーム緩衝液中に再懸濁させ、次いでこれを２
つの０゜７ｍｌの部分（ＡおよびＢ）に分割し、そして
エンペンドルフのマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ
）管に入れた。細胞を３７℃で２０分間インキュベーシ
ョンし、次いで４０．０ｐｌの１０％のＳＤＳを各マイ
クロフージ管に倒立により混合しながら添加した。次に
、６０ＩＪ、ｌの５ＭのＮａｃｌを容管に添加し、そし
て倒立により混合した。管を１５分間マイクロフージ内
で遠心し、モしてに澄み液（プラスミドＤＮＡを含有す
る）を新しい管にデカンテーションにより入れ、沈殿を
除去しないように注意した。この七澄み液に、５、Ｏ，
ｌの２ 、０ ｍ ｇ ／ ｍ ｌのＲＮＡ ａ ｓ
ｅ溶液を添加した。これを３７℃で１５分間インキュベ
ーションし、次いで等体積のフェノール：ＣＨＣｌ３（
１：ｌ）で１回および等体積のＣＨＣｌ３ ： ＩＡ
Ａ （２４： ｌ）で１回抽出した。管に冷エタノール
を充填し、混合し、そして−２０℃で１時間インキュベ
ーションした。試料を５分間マイクロフーシし、そして
上澄み液を注ぎ出した。
をＤＧ４４−ＩおよびＤＧ４４−ＩＶから分離した。５
０ｇｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５．０ｍｌのルリア
ブイヨン中で細胞を一夜生長させた。培養物を１０．Ｏ
ＯＯＲＰＭで１０分間遠心し、そして沈殿物を１．４ｍ
ｌのりゾチーム緩衝液中に再懸濁させ、次いでこれを２
つの０゜７ｍｌの部分（ＡおよびＢ）に分割し、そして
エンペンドルフのマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ
）管に入れた。細胞を３７℃で２０分間インキュベーシ
ョンし、次いで４０．０ｐｌの１０％のＳＤＳを各マイ
クロフージ管に倒立により混合しながら添加した。次に
、６０ＩＪ、ｌの５ＭのＮａｃｌを容管に添加し、そし
て倒立により混合した。管を１５分間マイクロフージ内
で遠心し、モしてに澄み液（プラスミドＤＮＡを含有す
る）を新しい管にデカンテーションにより入れ、沈殿を
除去しないように注意した。この七澄み液に、５、Ｏ，
ｌの２ 、０ ｍ ｇ ／ ｍ ｌのＲＮＡ ａ ｓ
ｅ溶液を添加した。これを３７℃で１５分間インキュベ
ーションし、次いで等体積のフェノール：ＣＨＣｌ３（
１：ｌ）で１回および等体積のＣＨＣｌ３ ： ＩＡ
Ａ （２４： ｌ）で１回抽出した。管に冷エタノール
を充填し、混合し、そして−２０℃で１時間インキュベ
ーションした。試料を５分間マイクロフーシし、そして
上澄み液を注ぎ出した。
第２回のマイクロフージ後に各クローンについてのＡお
よび８部分中に残る沈殿は１次のようにして合わせた：
各々にｔｏｏ、ｔｔの水を添加し、沈殿物を溶解し、そ
して１つの２００ｇ１の管中に合わせ、これに２０≠ｌ
の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）および０．５ｍ
ｌの冷エタノールを添加した。試料を５分間ミクロフー
ジし、Ｌ澄み液を注ぎ出し、そして沈殿物を１５０ｇ１
の１０ 、０ｍＭノＴ ｒ ｉ ｓおよびｉｏ、ＯｍＭ
のＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ８，０）中に再懸濁した。
よび８部分中に残る沈殿は１次のようにして合わせた：
各々にｔｏｏ、ｔｔの水を添加し、沈殿物を溶解し、そ
して１つの２００ｇ１の管中に合わせ、これに２０≠ｌ
の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）および０．５ｍ
ｌの冷エタノールを添加した。試料を５分間ミクロフー
ジし、Ｌ澄み液を注ぎ出し、そして沈殿物を１５０ｇ１
の１０ 、０ｍＭノＴ ｒ ｉ ｓおよびｉｏ、ＯｍＭ
のＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ８，０）中に再懸濁した。
試料（各２Ｊｔｌ）をアガロースゲル上に走行させた。
また、ちょうど記載した手順により調製したＤＧ４４／
ｐＳＥ １０３を対照としてアガロースゲル１−、に使
用した。これは雑種ファージで本来形質導入した宿主株
であり、そしてラムダプラスミドを含有しない。対照は
２つの帯を示し、これらは染色イ１２のＤＮＡおよびｐ
ｓＥ１０３プラスミドに相当した。ＤＧ４４−Ｉおよび
ＤＧ４４−ＩＶの試料について、５０ｋｂより多い、第
３帯が現われ、これは期待するように大きいプラスミド
に相当する。ＤＧ４４−ＩおよびＤＧ４４−１’Ｖのフ
ァージは、それぞれ、ラムダＳＥ４ ＡＨ−Ｉおよび
ラムダＳＥ４ ＡＨ−ＩＴと表示した。
ｐＳＥ １０３を対照としてアガロースゲル１−、に使
用した。これは雑種ファージで本来形質導入した宿主株
であり、そしてラムダプラスミドを含有しない。対照は
２つの帯を示し、これらは染色イ１２のＤＮＡおよびｐ
ｓＥ１０３プラスミドに相当した。ＤＧ４４−Ｉおよび
ＤＧ４４−ＩＶの試料について、５０ｋｂより多い、第
３帯が現われ、これは期待するように大きいプラスミド
に相当する。ＤＧ４４−ＩおよびＤＧ４４−１’Ｖのフ
ァージは、それぞれ、ラムダＳＥ４ ＡＨ−Ｉおよび
ラムダＳＥ４ ＡＨ−ＩＴと表示した。
実施例■
（Ｈｉｎｄｍエンドヌクレアーゼを使用する多重コピー
のプラスミド中への熱的に安定トランスアミナーゼ遺伝
子のサブクローニング） 熱安定性ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
）ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子を、雑種ラムダＳＥ４
ＡＨ−ｒＶ；７ｙ−ジＤＮＡから、ＨｉｎｄＩＩＩエ
ンドヌクレアーゼを使用してサブクローニングした。Ｈ
ｉｎｄｍエンドヌクレアーゼによる雑種ファージ完全消
化物を調製した。ラムダＳＥ４ ＡＨ−１のＤＮＡの
制限酵素分析により、はぼ１７ｋｂで離れる２つのＢｉ
ｎｄ ｍ部位がトランスアミナーゼ遺伝子およびスペ
クチノマイシン耐性（Ｓｐ）遺伝子にまたがることが明
らかにされた（第１図）。プラスミドｐＢ１３２２を、
また、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化した。雑種ファージＤ
ＮＡからの１７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２の独特
Ｈｉｎｄ ｍ部位の中に結合し、テトラサイクリン耐
性遺伝子を失活したが、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ
ｒ）は完全な状態で残った。したがって、雑種プラスミ
ドを含有する形質転換された微生物は遺伝子型５ｐｒＡ
ｐｒＴｃｒを示すであろうことが期待された。結合は１
．０ルｇのＨｉｎｄ−説ホスホリル化ｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ、Ｌ、ＯｌＬｇのＨｉｎｄ ｌｌｌ−切断ラムダ
ＳＥ４ ＡＨ−ＩＴのＤＮＡ、２５．０．１のりガー
ゼ緩衝液、およびｌ １．位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅ
、Ｃ，６，５，１，ｌ）を１６℃で一夜インキユベーシ
ョンすることによって実施した。
のプラスミド中への熱的に安定トランスアミナーゼ遺伝
子のサブクローニング） 熱安定性ネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
）ＡＴ ｓｔｙ ２遺伝子を、雑種ラムダＳＥ４
ＡＨ−ｒＶ；７ｙ−ジＤＮＡから、ＨｉｎｄＩＩＩエ
ンドヌクレアーゼを使用してサブクローニングした。Ｈ
ｉｎｄｍエンドヌクレアーゼによる雑種ファージ完全消
化物を調製した。ラムダＳＥ４ ＡＨ−１のＤＮＡの
制限酵素分析により、はぼ１７ｋｂで離れる２つのＢｉ
ｎｄ ｍ部位がトランスアミナーゼ遺伝子およびスペ
クチノマイシン耐性（Ｓｐ）遺伝子にまたがることが明
らかにされた（第１図）。プラスミドｐＢ１３２２を、
また、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化した。雑種ファージＤ
ＮＡからの１７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２の独特
Ｈｉｎｄ ｍ部位の中に結合し、テトラサイクリン耐
性遺伝子を失活したが、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ
ｒ）は完全な状態で残った。したがって、雑種プラスミ
ドを含有する形質転換された微生物は遺伝子型５ｐｒＡ
ｐｒＴｃｒを示すであろうことが期待された。結合は１
．０ルｇのＨｉｎｄ−説ホスホリル化ｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ、Ｌ、ＯｌＬｇのＨｉｎｄ ｌｌｌ−切断ラムダ
ＳＥ４ ＡＨ−ＩＴのＤＮＡ、２５．０．１のりガー
ゼ緩衝液、およびｌ １．位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅ
、Ｃ，６，５，１，ｌ）を１６℃で一夜インキユベーシ
ョンすることによって実施した。
インキュベーション後、結合混合物をコンピテント（ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨ２細胞
に形質転換した。ＤＨ２株はｒｅｃＡ−であるので選択
した。ＤＨ２株は大腸菌遺伝子貯蔵センター（Ｅ、ｃｏ
ｌ ｉ Ｇｅｎｅｔ ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎ
ｔｅｒ）から得た。これはプラスミドが比較的安定であ
り、モしてゲノムと結合しないであろうことを意味する
。形質転換は次の手順により実施した：ＤＨ２をシリア
ブイヨン中で３７℃において激しく振盪しながら０Ｄ５
５ｏ＝０．５に生長させ、次いで氷上で冷却し、そして
無菌の５０ｍ１の遠心器の管中で７００ＯＲＰＭで遠心
した。沈殿物を等体積の冷たい（４°Ｃ）無菌のＯ，１
ＭのＭｇＣ１２中に再懸濁した。この混合物をＬのよう
に遠心し、そＬ７て沈殿物をｌ／２体積の冷たい（４℃
）無菌の０．１ＭのＣａＣｌ２中に再懸濁し、そして氷
りで２０分間冷却した。この懸濁液を上のように遠心し
、そして１／２０体積の冷たい（４℃）無菌の０゜１Ｍ
のＣａＣｌ２中に再懸濁した。０．２ｍｌの体積のこれ
らのコンピテント細胞を、Ｈの節に記載した結合反応混
合物を含有する無菌の管に添加した。ＤＮＡ／細胞懸濁
液を氷上で３０分間インキュベーションし、次いで４２
℃で２分間熱パルスを与えた。細胞をルリアブイヨンで
１０倍に希釈し、そして３７℃で２時間インキュベーシ
ョンしてプラスミドを発現させた。
ｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨ２細胞
に形質転換した。ＤＨ２株はｒｅｃＡ−であるので選択
した。ＤＨ２株は大腸菌遺伝子貯蔵センター（Ｅ、ｃｏ
ｌ ｉ Ｇｅｎｅｔ ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎ
ｔｅｒ）から得た。これはプラスミドが比較的安定であ
り、モしてゲノムと結合しないであろうことを意味する
。形質転換は次の手順により実施した：ＤＨ２をシリア
ブイヨン中で３７℃において激しく振盪しながら０Ｄ５
５ｏ＝０．５に生長させ、次いで氷上で冷却し、そして
無菌の５０ｍ１の遠心器の管中で７００ＯＲＰＭで遠心
した。沈殿物を等体積の冷たい（４°Ｃ）無菌のＯ，１
ＭのＭｇＣ１２中に再懸濁した。この混合物をＬのよう
に遠心し、そＬ７て沈殿物をｌ／２体積の冷たい（４℃
）無菌の０．１ＭのＣａＣｌ２中に再懸濁し、そして氷
りで２０分間冷却した。この懸濁液を上のように遠心し
、そして１／２０体積の冷たい（４℃）無菌の０゜１Ｍ
のＣａＣｌ２中に再懸濁した。０．２ｍｌの体積のこれ
らのコンピテント細胞を、Ｈの節に記載した結合反応混
合物を含有する無菌の管に添加した。ＤＮＡ／細胞懸濁
液を氷上で３０分間インキュベーションし、次いで４２
℃で２分間熱パルスを与えた。細胞をルリアブイヨンで
１０倍に希釈し、そして３７℃で２時間インキュベーシ
ョンしてプラスミドを発現させた。
細胞を５０ 終１ ／ ｍ ｌのスペクチノマイシンを
含有するルリアブイヨンの平板上に薄くかぶせ（０，１
ｍｌの細胞懸濁液／平板）、そして３７℃で１６〜２４
時間インキュベーションした。各Ｓｐ コロニーを、
５０ ｐ−ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリン、２０ ｇ
ｇ ／ ｍ １のテトラサイクリンまたは５０ｇｇ／ｍ
ｌのスペクチノマイシンを含有する別々のルリアブイヨ
ンの平板上にパッチング（ｐａｔｃｈｉｎｇ）した、２
２のＳｐｒコロニーはＡｐ Ｓｐ 遺伝子型を示し
た。これらの１つを除外したすべてはＴｃ であった
。
含有するルリアブイヨンの平板上に薄くかぶせ（０，１
ｍｌの細胞懸濁液／平板）、そして３７℃で１６〜２４
時間インキュベーションした。各Ｓｐ コロニーを、
５０ ｐ−ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリン、２０ ｇ
ｇ ／ ｍ １のテトラサイクリンまたは５０ｇｇ／ｍ
ｌのスペクチノマイシンを含有する別々のルリアブイヨ
ンの平板上にパッチング（ｐａｔｃｈｉｎｇ）した、２
２のＳｐｒコロニーはＡｐ Ｓｐ 遺伝子型を示し
た。これらの１つを除外したすべてはＴｃ であった
。
実施例■に記載する手順に従い、Ａｐ ｓｐクローン
について急速なプラスミドの分離を実施した。これらの
ＤＮＡ調製物のＨｉｎｄ ｍ制限エンドヌクレアーゼ
消化物のアガロース電気泳動は、これらの４つのクロー
ンが期待するＤＮＡ断片のパターンを含有することを明
らかにした：はぼ１７ｋｂの断片（トランスアミナーゼ
遺伝子）および４．３ｋｂ ＣＰＢＲ３２２）の断片。
について急速なプラスミドの分離を実施した。これらの
ＤＮＡ調製物のＨｉｎｄ ｍ制限エンドヌクレアーゼ
消化物のアガロース電気泳動は、これらの４つのクロー
ンが期待するＤＮＡ断片のパターンを含有することを明
らかにした：はぼ１７ｋｂの断片（トランスアミナーゼ
遺伝子）および４．３ｋｂ ＣＰＢＲ３２２）の断片。
すべての４つのプラスミド含有クローンを定量的トラン
スアミナーゼアッセイにかけた。試験すべき細胞を、５
０．０ｇｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む複合培地
中で一夜生長させた。２５〜４５．１の量の細胞懸濁液
を２４ウエルの力価の皿に、４５０７ｚｌの試薬と一緒
に添加した（実施例■）。この力価の皿を約２時間３７
℃でインキュベーションした。青色はトランスアミナー
ゼ活性を示した。
スアミナーゼアッセイにかけた。試験すべき細胞を、５
０．０ｇｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む複合培地
中で一夜生長させた。２５〜４５．１の量の細胞懸濁液
を２４ウエルの力価の皿に、４５０７ｚｌの試薬と一緒
に添加した（実施例■）。この力価の皿を約２時間３７
℃でインキュベーションした。青色はトランスアミナー
ゼ活性を示した。
すべての４つのクローンは、親株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ２と比較したとき、かな
り増大したトランスアミナーゼ活性（すなわち、色の濃
度による）を有することが発見され、ここで親株は約＋
１の活性値を与え、そしてクローンは約＋５の相対的活
性値を与えた。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ２と比較したとき、かな
り増大したトランスアミナーゼ活性（すなわち、色の濃
度による）を有することが発見され、ここで親株は約＋
１の活性値を与え、そしてクローンは約＋５の相対的活
性値を与えた。
４つのクローンをＤＨ２／ｐＡＨ５、ＤＨ２／ＰＡＨ１
７、ＤＨ２／ｐＡＨ１８およびＤＨ２／ＰＡＨ２７と表
示した。クローンの１つＤＨ２／ｐＡＨ２７は、最終的
にアメリカン・タイプ◆カルチー？−１１．：１１／ク
シ、ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
７、ＤＨ２／ｐＡＨ１８およびＤＨ２／ＰＡＨ２７と表
示した。クローンの１つＤＨ２／ｐＡＨ２７は、最終的
にアメリカン・タイプ◆カルチー？−１１．：１１／ク
シ、ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏ
ｃｋｖｉ ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ。
ｃｋｖｉ ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ。
Ａ、２０８５２）に公衆に入手可能であるように受託さ
れ、そして受託番号ＡＴＣＣ５３２４８を与えられた。
れ、そして受託番号ＡＴＣＣ５３２４８を与えられた。
実施例Ｖ
（実施例■のプラスミドの制限分析）
実施例■の３つのプラスミドは、二重の制限エンドヌク
レアーゼの消化およびテトラサイクリン感受性により決
定して、同一のインサート（ｉｎｓｅｒｔ）の大きさお
よび向きを有するように思われた。それらの１つ、ｐＡ
Ｈ２７、を、表Ｉに列挙するような、９種類の制限エン
ドヌクレアーゼの各々で完全に消化することにより、制
限分析にかけた。生ずる断片をアガロースの電気泳動ゲ
ル」二で大きさにより分割した。表Ｉにおける最初の６
つのエンドヌクレアーゼは、ｐＡＨ２７を切断して３〜
８つの断片を生成した。これらの断片は各場合において
雑種プラスミドについて２１〜２２ｋｂまでに付加し、
それらは大体１７ｋｂのインサートおよび４．３ｋｂの
ｐＢＲ３２２に相当した。
レアーゼの消化およびテトラサイクリン感受性により決
定して、同一のインサート（ｉｎｓｅｒｔ）の大きさお
よび向きを有するように思われた。それらの１つ、ｐＡ
Ｈ２７、を、表Ｉに列挙するような、９種類の制限エン
ドヌクレアーゼの各々で完全に消化することにより、制
限分析にかけた。生ずる断片をアガロースの電気泳動ゲ
ル」二で大きさにより分割した。表Ｉにおける最初の６
つのエンドヌクレアーゼは、ｐＡＨ２７を切断して３〜
８つの断片を生成した。これらの断片は各場合において
雑種プラスミドについて２１〜２２ｋｂまでに付加し、
それらは大体１７ｋｂのインサートおよび４．３ｋｂの
ｐＢＲ３２２に相当した。
表■
エンドヌクレ
アーゼ １片 断片の大きさくｋｂ）７．２、４
．４、４．０、 Ｐｖｕ Ｉ ８ ２．５、１．７、１
．５．１．０、１．０ Ｐｖｕ ＩＩ ５ ８．０、４．５、４
．３．２．３、２．０ Ｃ１ａ Ｉ ４ ７．４、５．０、４．
７．４．０ Ｓａｌ Ｉ ４ ７．６、７．０、５．
０．１．３ Ｂａｍ ＨＩ ３ ９．５、６．６、５．０
Ｂｇｌ ＩＩ ３ ２０、１．０、１．
０Ｂｃｌ Ｉ １ ２１Ｐｓｔ
Ｉ １ ２１Ｅｃｏ ＲＩ
１ ２１次いで、制限部位の間の関係および距離
を、二重エンドヌクレアーゼ消化により決定した。得ら
れる制限地図を第１図に示す。
．４、４．０、 Ｐｖｕ Ｉ ８ ２．５、１．７、１
．５．１．０、１．０ Ｐｖｕ ＩＩ ５ ８．０、４．５、４
．３．２．３、２．０ Ｃ１ａ Ｉ ４ ７．４、５．０、４．
７．４．０ Ｓａｌ Ｉ ４ ７．６、７．０、５．
０．１．３ Ｂａｍ ＨＩ ３ ９．５、６．６、５．０
Ｂｇｌ ＩＩ ３ ２０、１．０、１．
０Ｂｃｌ Ｉ １ ２１Ｐｓｔ
Ｉ １ ２１Ｅｃｏ ＲＩ
１ ２１次いで、制限部位の間の関係および距離
を、二重エンドヌクレアーゼ消化により決定した。得ら
れる制限地図を第１図に示す。
実施例■
（Ｓａｕ ３Ａを使用する熱的に安定なトランスアミ
ナーゼ遺伝子の多重コピーのプラスミドへのサブクロー
ニング） 熱安定性トランスアミナーゼ遺伝子を、また、Ｓａｕ
３Ａ制限エンドヌクレアーゼを使用して雑種ラムダＳ
Ｅ４ ＡＨ−ＩＴファージからサブクローニングした
。ラムダＳＥ４ ＡＨ−ｒＶは、実施例ＩＩおよび実
施例■のＤＧ４４−ｒＶクローンから得られたファージ
を表示する。Ｓａｕ ３Ａエンドヌクレアーゼによる
雑種ファージの部分的消化物を調製し、監視して大きさ
の範囲４〜１２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐ
ＢＲ３２２をＢａｍＨＩ部位で開き、そして雑種ファー
ジからのＳａｕ ３Ａ断片を実施例■の手順に従い挿
入した。断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入す
ると、Ｔｃ 遺伝子は失活するが、Ａｐｒ遺伝子は無
傷で残る。これらのクローンは、トランスアミナーゼ遺
伝子を含有するより小ざいＤＮＡ断片が挿入されたので
、スペクチノマイシン耐性であることが期待されない。
ナーゼ遺伝子の多重コピーのプラスミドへのサブクロー
ニング） 熱安定性トランスアミナーゼ遺伝子を、また、Ｓａｕ
３Ａ制限エンドヌクレアーゼを使用して雑種ラムダＳ
Ｅ４ ＡＨ−ＩＴファージからサブクローニングした
。ラムダＳＥ４ ＡＨ−ｒＶは、実施例ＩＩおよび実
施例■のＤＧ４４−ｒＶクローンから得られたファージ
を表示する。Ｓａｕ ３Ａエンドヌクレアーゼによる
雑種ファージの部分的消化物を調製し、監視して大きさ
の範囲４〜１２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐ
ＢＲ３２２をＢａｍＨＩ部位で開き、そして雑種ファー
ジからのＳａｕ ３Ａ断片を実施例■の手順に従い挿
入した。断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入す
ると、Ｔｃ 遺伝子は失活するが、Ａｐｒ遺伝子は無
傷で残る。これらのクローンは、トランスアミナーゼ遺
伝子を含有するより小ざいＤＮＡ断片が挿入されたので
、スペクチノマイシン耐性であることが期待されない。
結合後、この混合物をコンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌ １）ＤＧ３０細胞（アミノトランスフェラーゼ陰性
）に実施例■の手順により形質転換したが、ただし細胞
は００ｓ ｓ ｏ ＝０ 、２５に生長させた。細胞は
、５０．ＯＩＬｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリ
アブイヨンの平板上に薄くかぶせ、次いでアンピシリン
およびテトラサイクリンを含有する同様な平板上にパッ
チングして、Ａｐ Ｔｃ 遺伝子型について試験し
、そして最少培地上に薄くかぶせて栄養要求の相補性に
ついて試験した。
ｌ １）ＤＧ３０細胞（アミノトランスフェラーゼ陰性
）に実施例■の手順により形質転換したが、ただし細胞
は００ｓ ｓ ｏ ＝０ 、２５に生長させた。細胞は
、５０．ＯＩＬｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリ
アブイヨンの平板上に薄くかぶせ、次いでアンピシリン
およびテトラサイクリンを含有する同様な平板上にパッ
チングして、Ａｐ Ｔｃ 遺伝子型について試験し
、そして最少培地上に薄くかぶせて栄養要求の相補性に
ついて試験した。
実施例ｍに記載する手順に従い、迅速プラスミド分離を
Ａｐ Ｔｃ クローンについて実施した。１３のＡ
ｐ Ｔｃ クローンのプラスミドのＨｉｎｄ ｍ
制限エンドヌクレアーゼ消化物の７ガロース電気泳動に
より、２つのクローンが、それぞれ、８．３ｋｂおよび
９．４ｋｂのインサートを有する雑種プラスミド（ｐＧ
Ａ１１５およびｐＧＡ１０８と表示した）を含有するこ
とが決定された。これらのクローンを実施例■の定量的
アッセイにかけ、そして約＋２〜＋３の増大した活性値
を午えた。トランスアミナーゼ活性が雑種プラスミドか
ら誘導されたことを立証するために、ｐＧＡ１１５およ
びｐＧＡ１０８を実施例■の手順により分離し、そして
実施例■の形質転換手順によりＤＧ３０ （アミノトラ
ンスフェラーゼ陰性）宿主中に導入し、細胞を０Ｄ５５
ｏ＝０・２５に生長させた。分離したｐＧＡ１０８また
はｐＧＡｌ１５プラスミドによる形質転換後、ＤＧ３０
宿主はそれらの栄養要求性から開放された。クローンの
１つ、ＤＨ２／ＰＧＡ１１５、は最終的にアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション［Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｖｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ
ｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
Ａｐ Ｔｃ クローンについて実施した。１３のＡ
ｐ Ｔｃ クローンのプラスミドのＨｉｎｄ ｍ
制限エンドヌクレアーゼ消化物の７ガロース電気泳動に
より、２つのクローンが、それぞれ、８．３ｋｂおよび
９．４ｋｂのインサートを有する雑種プラスミド（ｐＧ
Ａ１１５およびｐＧＡ１０８と表示した）を含有するこ
とが決定された。これらのクローンを実施例■の定量的
アッセイにかけ、そして約＋２〜＋３の増大した活性値
を午えた。トランスアミナーゼ活性が雑種プラスミドか
ら誘導されたことを立証するために、ｐＧＡ１１５およ
びｐＧＡ１０８を実施例■の手順により分離し、そして
実施例■の形質転換手順によりＤＧ３０ （アミノトラ
ンスフェラーゼ陰性）宿主中に導入し、細胞を０Ｄ５５
ｏ＝０・２５に生長させた。分離したｐＧＡ１０８また
はｐＧＡｌ１５プラスミドによる形質転換後、ＤＧ３０
宿主はそれらの栄養要求性から開放された。クローンの
１つ、ＤＨ２／ＰＧＡ１１５、は最終的にアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション［Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｖｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ
ｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、２０８５２）に、公衆
が入手可能であるように、受託され、そして受託番号Ａ
ＴＣＣ５３２４７を与えられた。
が入手可能であるように、受託され、そして受託番号Ａ
ＴＣＣ５３２４７を与えられた。
実施例■
（実施例■のプラスミドの制限分析）
実施例■のｐＧＡ１０８およびｐＧＡ１１５プラスミド
を、表Ｈに列挙する制限エンドヌクレアーゼを使用する
完全消化により、制限分析にかけた。得られる断片をア
ガロース電気泳動ゲル上で大きさにより分割した。断片
は各場合プラスミドの近似する大きさまで付加し、それ
らの大きさはほぼ８．３ｋｂのインサー）（ｐＧＡ１１
５について）または９．４ｋｂのインサート（ｐＧＡ１
０８について）、および４．３ｋｂのｐＢＲ３２２に相
当した。
を、表Ｈに列挙する制限エンドヌクレアーゼを使用する
完全消化により、制限分析にかけた。得られる断片をア
ガロース電気泳動ゲル上で大きさにより分割した。断片
は各場合プラスミドの近似する大きさまで付加し、それ
らの大きさはほぼ８．３ｋｂのインサー）（ｐＧＡ１１
５について）または９．４ｋｂのインサート（ｐＧＡ１
０８について）、および４．３ｋｂのｐＢＲ３２２に相
当した。
友旦
エンドヌクレ
アーゼ １ 断片の大きさくｋ ｂ）ｐＧＡ ｌ
１５ （１２，６ｋ ｂ） Ｐｓｔ Ｉ ３ ６．５．４．５、１、６Ｓａ
ｌ Ｉ ２ ７．７．４．９Ｈｉｎｄ ｍ
２ ６．９．５．６Ｅｃｏ ＲＩ １
１２．６Ｃ１ａＩ １ １２．６Ｂ
ｇｌｌＴＯ−− Ｂａ市 ＨＩ Ｏ−− ｐＧＡ １０８ （１３，７ｋ ｂ） Ｐｖｕ Ｉ ４ ６．２、３．４、２
．３．１．８ Ｓａｌ Ｉ ４ ６．３、５．３、１
．２．０．９ Ｐｓｔ Ｉ ３ ８．２、３．８、１
．７Ｃ１ａ Ｉ ２ ７．４、６．３
Ｅｃｏ ＲＩ １ １３．７Ｈｉｎｄ
ｆＩＩ １ １３．７ Ｂａｍ Ｈｌ １ １３．７ＢｃｌｌＯ
−− 制限部位の間の関係および距離を、二重エンドヌクレア
ーゼ消化を用いるそれ以上の断片化によって決定した。
１５ （１２，６ｋ ｂ） Ｐｓｔ Ｉ ３ ６．５．４．５、１、６Ｓａ
ｌ Ｉ ２ ７．７．４．９Ｈｉｎｄ ｍ
２ ６．９．５．６Ｅｃｏ ＲＩ １
１２．６Ｃ１ａＩ １ １２．６Ｂ
ｇｌｌＴＯ−− Ｂａ市 ＨＩ Ｏ−− ｐＧＡ １０８ （１３，７ｋ ｂ） Ｐｖｕ Ｉ ４ ６．２、３．４、２
．３．１．８ Ｓａｌ Ｉ ４ ６．３、５．３、１
．２．０．９ Ｐｓｔ Ｉ ３ ８．２、３．８、１
．７Ｃ１ａ Ｉ ２ ７．４、６．３
Ｅｃｏ ＲＩ １ １３．７Ｈｉｎｄ
ｆＩＩ １ １３．７ Ｂａｍ Ｈｌ １ １３．７ＢｃｌｌＯ
−− 制限部位の間の関係および距離を、二重エンドヌクレア
ーゼ消化を用いるそれ以上の断片化によって決定した。
得られる制限地図を第２図および第３図に示す。
実施例■
（トランスアミナーゼ活性の相対的増加）定埴的アッセ
イを実施して、大腸菌（Ｅ、ｃ。
イを実施して、大腸菌（Ｅ、ｃ。
１ｉ）ＤＨ２から大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌ １）ＤＨ２／
ｐＡＨ２７まで、および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＧ３
０およびＤＧ２７がら大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌ １）ＤＧ
３０／ｐＧＡ１０８およびＤＧ３０／ｐＧＡ １１５ま
でのトランスアミナーゼ活性のｌす、を酎１に！ｖＩ加
を油密１．た一フ、ニルピルビンＭぼっいての塩化第二
鉄の測色アッセイ（後述する手順）は、次の反応を触媒
する細胞不合抽出物の能力を測定する： アルファーケトグルタレート＋Ｌ−フェニルアラニン９
グルタメート＋フェニルピリベート各株の細胞不合抽出
物は、細胞を超音波処理し、次いで５Ｓ−３４０−ター
内で１５．００ＯＲＰＭで１時間遠心することによって
調製した。
ｐＡＨ２７まで、および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＧ３
０およびＤＧ２７がら大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌ １）ＤＧ
３０／ｐＧＡ１０８およびＤＧ３０／ｐＧＡ １１５ま
でのトランスアミナーゼ活性のｌす、を酎１に！ｖＩ加
を油密１．た一フ、ニルピルビンＭぼっいての塩化第二
鉄の測色アッセイ（後述する手順）は、次の反応を触媒
する細胞不合抽出物の能力を測定する： アルファーケトグルタレート＋Ｌ−フェニルアラニン９
グルタメート＋フェニルピリベート各株の細胞不合抽出
物は、細胞を超音波処理し、次いで５Ｓ−３４０−ター
内で１５．００ＯＲＰＭで１時間遠心することによって
調製した。
細胞不合抽出物の各々の試料を、Ｐ−５−Ｐの基質溶液
と組み合わせ、そして３７℃の水浴中でインキュベーシ
ョンし、必要に応じて０．２５Ｍのリン酸カリウムで希
釈した。試料を１０分毎に渦形成した。１時間後、５０
．０．１の試料を取り、５．０ｍ１ｃ７）現像溶液（Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ５ｏｌｕｔｉｏｎ）に添加し、
そして渦形成した。５．０分後、６４０ｎｍにおける光
学濃度を読取った。このアッセイにより、表■に示す６
株の相対的活性が決定された。
と組み合わせ、そして３７℃の水浴中でインキュベーシ
ョンし、必要に応じて０．２５Ｍのリン酸カリウムで希
釈した。試料を１０分毎に渦形成した。１時間後、５０
．０．１の試料を取り、５．０ｍ１ｃ７）現像溶液（Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ５ｏｌｕｔｉｏｎ）に添加し、
そして渦形成した。５．０分後、６４０ｎｍにおける光
学濃度を読取った。このアッセイにより、表■に示す６
株の相対的活性が決定された。
人里
（トランスアミナーゼ活性の比較）
株 相対的駐
ＤＨ２１
ＤＨ２／ｐＡＨ２７３１
ＤＧ３０ ０ＤＧ２７
１ＤＧ３０／ｐＧＡ１０
８ １ １ ．６ＤＧ３０／ｐＧＡ１１５
１３．７実施例Ｘ （ｐＡＨ２７の安定性） 選択的圧力としてスペクチノマイシンの存在下および不
存在下のプラスミドＰＡＨ２７の安定性を研究した。５
００ ｍ ｌの刻み目を付けたエルレンマイヤー振盪フ
ラスコに、５０ｐｐｍのスペクチノマイシンを含む変性
ロウリイ培地およびそれを含まない変性ロウリイ培地の
ｌｏＯｍｌの部分を添加した。３７℃で４８時間生長さ
せたＤＨ２／ｐＡＨ２７（実施例■）の２つの斜面培地
を１６ｍ１の０．９％の食塩溶液（ｓａｌｉｎｅ ５
ｏ１ｕｔｆｏｎ）で洗浄することによって調製した１、
ｏｍｌの細胞懸濁液で、フラスコを接種した。振盪フラ
スコを３７℃で２５ＯＲＰＭにおいてインキュベーショ
ンした。２４時間後に、新しいフラスコを系統的転移（
ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）より接種した。こ
の系統的転移を２４時間毎に反復した。
１ＤＧ３０／ｐＧＡ１０
８ １ １ ．６ＤＧ３０／ｐＧＡ１１５
１３．７実施例Ｘ （ｐＡＨ２７の安定性） 選択的圧力としてスペクチノマイシンの存在下および不
存在下のプラスミドＰＡＨ２７の安定性を研究した。５
００ ｍ ｌの刻み目を付けたエルレンマイヤー振盪フ
ラスコに、５０ｐｐｍのスペクチノマイシンを含む変性
ロウリイ培地およびそれを含まない変性ロウリイ培地の
ｌｏＯｍｌの部分を添加した。３７℃で４８時間生長さ
せたＤＨ２／ｐＡＨ２７（実施例■）の２つの斜面培地
を１６ｍ１の０．９％の食塩溶液（ｓａｌｉｎｅ ５
ｏ１ｕｔｆｏｎ）で洗浄することによって調製した１、
ｏｍｌの細胞懸濁液で、フラスコを接種した。振盪フラ
スコを３７℃で２５ＯＲＰＭにおいてインキュベーショ
ンした。２４時間後に、新しいフラスコを系統的転移（
ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）より接種した。こ
の系統的転移を２４時間毎に反復した。
全細胞のトランスアミナーゼ活性を２４時間毎に７ツセ
イした。系統的転移の５日後に、二重反復実験のフラス
コの平均活性は、スペクチノマイシンの存在下に初期の
特異的フェニルアラニンの産生速度の９９％が保持され
、これに対してその不存在下では４２％が保持された。
イした。系統的転移の５日後に、二重反復実験のフラス
コの平均活性は、スペクチノマイシンの存在下に初期の
特異的フェニルアラニンの産生速度の９９％が保持され
、これに対してその不存在下では４２％が保持された。
このことにより、プラスミドＰＡＨ２７は大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ＤＨ２中で、培地中に５０ｐｐｍのスペクチ
ノマイシンを使用することによって安定に維持されたこ
とが立証される。
ｃｏｌｉ）ＤＨ２中で、培地中に５０ｐｐｍのスペクチ
ノマイシンを使用することによって安定に維持されたこ
とが立証される。
フェニルピルビン酸、ナトリウム塩についての塩化第二
鉄の潤色アッセイ フェニルピルビン酸（ＰＰＡ）は第二鉄イオンと青色の
錯塩を形成する。青色の濃度は、ＰＰＡの存在量に比例
する。
鉄の潤色アッセイ フェニルピルビン酸（ＰＰＡ）は第二鉄イオンと青色の
錯塩を形成する。青色の濃度は、ＰＰＡの存在量に比例
する。
ス遠：
ｌ、現像溶液（ＤＳ）（ｌｏｏｏｍｌ）次の成分を混合
し、そして水浴中で室温に冷却する。内容物を１リツト
ル容のフラスコに添加し、そして脱イオン水でその体積
にする。部分：０．５ｇｃ７）ＦｅＣ１３−６Ｈ２０：
２０．Ｏｍｌの氷酢酸；６００．Ｏｍｌのジメチルス
ルホキシド； ２００ 、Ｏｍｌの脱イオン水。
し、そして水浴中で室温に冷却する。内容物を１リツト
ル容のフラスコに添加し、そして脱イオン水でその体積
にする。部分：０．５ｇｃ７）ＦｅＣ１３−６Ｈ２０：
２０．Ｏｍｌの氷酢酸；６００．Ｏｍｌのジメチルス
ルホキシド； ２００ 、Ｏｍｌの脱イオン水。
２、Ｎａ−ＰＰＡ標準溶液（１０ｇ／１）５００．０ｍ
ｇのＮａ−ＰＰＡ＠Ｈ２０を５０、Ｏｍｌの０．１Ｍの
Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ緩衝液／ −ｙ ｏ 八′Ｘ １９
つＡ給−３Ｇ勧ふブ カ勧ふフ小で攪拌する。この溶液
を５０．Ｏｍｌの容量測定フラスコに入れ１丁ｒｉｓ／
ＨＣｌ１１衝液でその体積にする。冷蔵して貯蔵する。
ｇのＮａ−ＰＰＡ＠Ｈ２０を５０、Ｏｍｌの０．１Ｍの
Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ緩衝液／ −ｙ ｏ 八′Ｘ １９
つＡ給−３Ｇ勧ふブ カ勧ふフ小で攪拌する。この溶液
を５０．Ｏｍｌの容量測定フラスコに入れ１丁ｒｉｓ／
ＨＣｌ１１衝液でその体積にする。冷蔵して貯蔵する。
Ｏ，１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ緩衝液について：９００．
Ｏｍｌの脱イオン水を１２．１１ｇのＴｒｉｓに添加す
る、Ｐ）ＩＩＨＣｌで８．０に調節する：容量測定フラ
スコに注ぎ入れる；脱イオン水を１０００ ｍ ｌに添
加する。
Ｏｍｌの脱イオン水を１２．１１ｇのＴｒｉｓに添加す
る、Ｐ）ＩＩＨＣｌで８．０に調節する：容量測定フラ
スコに注ぎ入れる；脱イオン水を１０００ ｍ ｌに添
加する。
塗ヱ駕：
Ｎａ−ＰＰＡ！！３？ｐ溶液および５．Ｏ，ｌの現像溶
液をガラスの分光光度計の管に添加する。渦を形成しな
がら混合する。５分間放置する（ＤＳを第１管に添加し
たとき時間測定を開始する）、６４０ｎｍにおいて光学
濃度（ＯＤ）を読む、Ｎａ−ＰＰＡ−Ｈ２Ｏの標準検量
線（垂直軸は吸収である；水平軸はｍｇＮａ−ｐＰＡ６
）（２０／ｍ１ＤＳである）。
液をガラスの分光光度計の管に添加する。渦を形成しな
がら混合する。５分間放置する（ＤＳを第１管に添加し
たとき時間測定を開始する）、６４０ｎｍにおいて光学
濃度（ＯＤ）を読む、Ｎａ−ＰＰＡ−Ｈ２Ｏの標準検量
線（垂直軸は吸収である；水平軸はｍｇＮａ−ｐＰＡ６
）（２０／ｍ１ＤＳである）。
ｍｇＮａ−ＰＰＡ＊
Ｎａ−ＰＰＡ・Ｈ２０Ｈ２０／ａｘｌＤｓ５鉢１
０．０１１０壓１
０．０２１５、ｌ Ｏ，０３２
０牌１ ０．０４２５牌１
０．０５３０ルｌ
Ｏ，０６肚ｐ： Ｎａ−ＰＰＡ＠Ｈ２０（ｍｇ／ｍ１）＝本発明の原理、
好ましい実施態様および実施の方法を以上説明した。こ
こで保護されるべきことを意図する本発明は、開示した
特定の形態に限定されると解釈すべきではない。なぜな
ら、これらは制限的よりはむしろ例示的と見なすべきで
あるからである。本発明の精神から逸脱しないで、種々
の変更および変化を行うことができる。
０．０１１０壓１
０．０２１５、ｌ Ｏ，０３２
０牌１ ０．０４２５牌１
０．０５３０ルｌ
Ｏ，０６肚ｐ： Ｎａ−ＰＰＡ＠Ｈ２０（ｍｇ／ｍ１）＝本発明の原理、
好ましい実施態様および実施の方法を以上説明した。こ
こで保護されるべきことを意図する本発明は、開示した
特定の形態に限定されると解釈すべきではない。なぜな
ら、これらは制限的よりはむしろ例示的と見なすべきで
あるからである。本発明の精神から逸脱しないで、種々
の変更および変化を行うことができる。
第１図は、ｐＡＨ２７の部分的制限地図の概略的表示で
ある。 第２図は、ｐＧＡ１０８の部分的制限地図の概略的表示
である。 第３図は、ｐＧＡ１１５の部分的制限地図の概略的表示
である。
ある。 第２図は、ｐＧＡ１０８の部分的制限地図の概略的表示
である。 第３図は、ｐＧＡ１１５の部分的制限地図の概略的表示
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、熱的に安定なトランスアミナーゼ酵素の遺伝情報を
指定するネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝子からなるＤＮＡ断片を含有
することを特徴とする組み換えプラスミドで形質転換さ
れた宿主微生物株。 ２、前記遺伝子の発現産生物はアルファーケト酸および
アミノ供与体の対応するＬ−アミノ酸への立体特異的ア
ミノ基転移を触媒する特許請求の範囲第１項記載の株。 ３、前記アルファーケト酸はフェニルピルビン酸であり
、そして前記アミノ酸はＬ−フェニルアラニンである特
許請求の範囲第２項記載の株。 ４、前記トランスアミナーゼ酵素はＡＴ ｓｔｙ ２で
ある特許請求の範囲第１項記載の株。 ５、トランスアミナーゼ酵素の高い水準の産生により特
徴づけられる特許請求の範囲第１項記載の株。 ６、形質転換されていない宿主微生物株のそれの約３０
倍までのトランスアミナーゼ活性を示す特許請求の範囲
第５項記載の株。 ７、長い半減期により特徴づけられる特許請求の範囲第
１項記載の形質転換された株の前記遺伝子の発現産生物
。 ８、前記宿主微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の株である特許請求の
範囲第１項記載の株。 ９、前記ＤＮＡ断片は約２５キロ塩基までである特許請
求の範囲第１項記載の株。 １０、前記組み換えプラスミドは多数のコピーのプラス
ミドである特許請求の範囲第１項記載の株。 １１、前記組み換えプラスミドは宿主に１種または２種
以上の抗生物質に対する耐性を付与する１または２以上
の遺伝子を含有する特許請求の範囲第１項記載の株。 １２、スペクチノマイシンに対して耐性である特許請求
の範囲第１１項記載の株。 １３、前記プラスミド上に、熱的に安定なトランスアミ
ナーゼ遺伝子より上流に位置して、スペクチノマイシン
耐性遺伝子が存在する特許請求の範囲第１２項記載の株
。 １４、前記組み換えプラスミドはプラスミドｐＢＲ３２
２から誘導される特許請求の範囲第１０項記載の株。 １５、前記組み換えプラスミドは第１図、第２図および
第３図の組み換え制限地図の１つを示すことにより特徴
づけられる特許請求の範囲第１項記載の株。 １６、ＡＴＣＣ ５３２４７または５３２４８である特
許請求の範囲第１項記載の株。 １７、遺伝子産生物が熱的に安定性でありかつフェニル
アラニン、チロシンおよびアスパラギン酸についての栄
養要求性から宿主微生物を開放することができることに
よって特徴づけられるネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）トランスアミナーゼ
遺伝子からなることを特徴とする組み換えプラスミド。 １８、前記遺伝子産生物は酵素ＡＴ ｓｔｙ ２である
特許請求の範囲第１７項記載の組み換えプラスミド。 １９、工程： （ａ）制限エンドヌクレアーゼで消化することによって
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）ゲノムの断片を分離し、 （ｂ）前記断片をラムダファージ中に結合し、 （ｃ）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のトランスアミナーゼ陰
性株を、温度感受性ラムダリプレッサーを発現する遺伝
子を含有するプラスミドで形質転換し、 （ｄ）形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株を工程
（ｂ）において準備した雑種ファージで形質導入し、 （ｅ）雑種ファージを含有するクローンを熱的に安定な
トランスアミナーゼ遺伝子で同定し、 （ｆ）トランスアミナーゼ遺伝子からなるＤＮＡ断片を
分離し、そして （ｇ）前記ＤＮＡ断片をプラスミドの中に結合する、 によって調製されたことを特徴とするネズミチフス菌（
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）トラ
ンスアミナーゼ酵素の遺伝情報を指定する遺伝子の存在
により特徴づけられるプラスミド。 ２０、前記遺伝子の発現産生物は熱的に安定である特許
請求の範囲第１９項記載のプラスミド。 ２１、前記遺伝子の発現産生物は酵素ＡＴ ｓｔｙ ２
である特許請求の範囲第１９項記載のプラスミド。 ２２、多数のコピーのプラスミドである特許請求の範囲
第１９項記載のプラスミド。 ２３、宿主微生物株を特許請求の範囲第１９項記載のプ
ラスミドで形質転換することによって調製されたことを
特徴とする、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）トランスアミナーゼ酵素を産
生する能力により特徴づけられる宿主微生物株。 ２４、熱的に安定なネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）トランスアミナーゼ酵
素の遺伝情報を指定するＤＮＡからなる１種または２種
以上の組み換えプラスミドを含有する形質転換された宿
主微生物株を培養することを特徴とする、熱的に安定な
トランスアミナーゼ酵素を生産する方法。 ２５、前記酵素はＡＴ ｓｔｙ ２である特許請求の範
囲第２４項記載の方法。 ２６、工程： （ａ）熱的に安定なネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）トランスアミナーゼ遺
伝子からなる１種または２種以上のプラスミドを含有す
る形質転換された宿主微生物株を選択し、そして （ｂ）前記宿主微生物あるいはその一部分または抽出物
を、アルファーケト酸およびアミノ供与体と接触させて
対応するＬ−アミノ酸を生成させる、 からなることを特徴とするＬ−アミノ酸を生産する方法
。 ２７、前記遺伝子の発現産生物は酵素ＡＴ ｓｔｙ ２
である特許請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８、選択した株の全細胞、あるいはその一部分または
抽出物を固定化する特許請求の範囲第２６項記載の方法
。 ２９、工程（ｂ）において生成したＬ−アミノ酸を分離
する特許請求の範囲第２６項記載の方法。 ３０、前記アルファーケト酸はフェニルピリビン酸であ
り、そして前記Ｌ−アミノ酸はＬ−フェニルアラニンで
ある特許請求の範囲第２６項記載の方法。
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|---|---|---|---|
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