JPS6272700A - ホルモン又は酵素のモノクロナ−ル抗体及びその製造方法とこれを用いた精製方法 - Google Patents
ホルモン又は酵素のモノクロナ−ル抗体及びその製造方法とこれを用いた精製方法Info
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- JPS6272700A JPS6272700A JP60210974A JP21097485A JPS6272700A JP S6272700 A JPS6272700 A JP S6272700A JP 60210974 A JP60210974 A JP 60210974A JP 21097485 A JP21097485 A JP 21097485A JP S6272700 A JPS6272700 A JP S6272700A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、被免疫動物に対して免疫学的寛容状態にある
ホルモン又は酵素に対するモノクロナール抗体及びその
製造方法並びにこれを用いた該ホルモン又は酵素の精製
方法に関する。
ホルモン又は酵素に対するモノクロナール抗体及びその
製造方法並びにこれを用いた該ホルモン又は酵素の精製
方法に関する。
（従来の技術）
牌臓細胞（Ｓｐｌｅｅｎ Ｃｅ１ｌｓ）及び骨髄腫細胞
（ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅ１ｌＳ）の細胞融合によるハイ
ブリドーマ細胞に特異抗体を産生さぜる方法は、ケーラ
ー（Ｋ６ｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（）ｆｉ １ｓ
ｔｅｉｎ）により報告され［Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｈｉ ｌ
５ｔｅｉｎ、Ｇ、 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５
６ ：４９５参照１、その後の種々の改良がなされて、
現在に至っている。
（ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅ１ｌＳ）の細胞融合によるハイ
ブリドーマ細胞に特異抗体を産生さぜる方法は、ケーラ
ー（Ｋ６ｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（）ｆｉ １ｓ
ｔｅｉｎ）により報告され［Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｈｉ ｌ
５ｔｅｉｎ、Ｇ、 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５
６ ：４９５参照１、その後の種々の改良がなされて、
現在に至っている。
しかし、一方被免疫動物に対して免疫学的寛容物質、即
ち免疫担当細胞に自己と認識されてしまう物質に対して
は、生体は一般に抗体を産生し得ないこともよく知られ
ている。
ち免疫担当細胞に自己と認識されてしまう物質に対して
は、生体は一般に抗体を産生し得ないこともよく知られ
ている。
（発明が解決しようとする問題点）
したがって、従来の方法では、生体活性物質のような物
質に対しては、上記のバイブリドーマを用いる方法も直
ちに適用することは困難であったので、特異抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞は産生じ得ないか極めて低率に
しか産生じ得なかったのである。
質に対しては、上記のバイブリドーマを用いる方法も直
ちに適用することは困難であったので、特異抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞は産生じ得ないか極めて低率に
しか産生じ得なかったのである。
（問題を解決するための手段）
このような現状に鑑みて、本発明者は、被免疫動物とし
て、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物を用いることに着目し、当該被免疫
動物を用いることにより、ホルモン又は酵素に対する抗
体産生ハイブリドーマ細胞の産生技術を確立し、これを
用いることによって本発明の目的とするモノクロナール
抗体を取得することに成功した。
て、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物を用いることに着目し、当該被免疫
動物を用いることにより、ホルモン又は酵素に対する抗
体産生ハイブリドーマ細胞の産生技術を確立し、これを
用いることによって本発明の目的とするモノクロナール
抗体を取得することに成功した。
すなわら本発明は、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝
的に自己免疫疾患になりやすい動物を、該動物と同一種
の正常な動物に対しては免疫学的寛容状態にあるホルモ
ン又は酵素で免疫し、この免疫動物から取得した抗体産
生細胞と骨髄種細胞から形成せしめたハイブリドーマを
クローン化することによって得られた抗体産生細胞から
産生した免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵素に対
して特異性を示すモノクロナール抗体を提供するもので
あり、且つこのモノ、クロナール抗体を製造する方法、
及びこれを用いて免疫学的寛容状態にあるホルモン、又
は酵素（例えばインスリンやエクオリン）を精製する方
法を提供するものである。
的に自己免疫疾患になりやすい動物を、該動物と同一種
の正常な動物に対しては免疫学的寛容状態にあるホルモ
ン又は酵素で免疫し、この免疫動物から取得した抗体産
生細胞と骨髄種細胞から形成せしめたハイブリドーマを
クローン化することによって得られた抗体産生細胞から
産生した免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵素に対
して特異性を示すモノクロナール抗体を提供するもので
あり、且つこのモノ、クロナール抗体を製造する方法、
及びこれを用いて免疫学的寛容状態にあるホルモン、又
は酵素（例えばインスリンやエクオリン）を精製する方
法を提供するものである。
本発明において、「自己免疫疾患状態」とは生体の病的
状態のひとつで、自己と非自己を識別する生体の認識機
構が不完全である状態であり、本来なら自己と免疫担当
細胞系に認識されて決して抗体産生を見ない物質に対し
ても抗体を産生じてしまう様になる生体の病的状態をい
う。この自己免疫疾患についてのざらに詳しい情報に関
しては、例えばＴＨＥＯＦＩＬＯＰＯＵＬＯ３，Ａ、
、 ＤＩＸＯＮ、 Ｆ、 （１９８２）Ａｌ１１． Ｊ
、 Ｐｏｔｈｏｌ、１０８ ： ３２１−３６５を参照
されたい。
状態のひとつで、自己と非自己を識別する生体の認識機
構が不完全である状態であり、本来なら自己と免疫担当
細胞系に認識されて決して抗体産生を見ない物質に対し
ても抗体を産生じてしまう様になる生体の病的状態をい
う。この自己免疫疾患についてのざらに詳しい情報に関
しては、例えばＴＨＥＯＦＩＬＯＰＯＵＬＯ３，Ａ、
、 ＤＩＸＯＮ、 Ｆ、 （１９８２）Ａｌ１１． Ｊ
、 Ｐｏｔｈｏｌ、１０８ ： ３２１−３６５を参照
されたい。
また、「遺伝的に自己免疫疾患になりやすい」動物とは
、該動物種において実験用近文系動物系（兄妹交配によ
って遺伝的に純化された系統）として系統育成されてい
る動物で、その９０％以上の個体が自己免疫疾患になる
動物をいう。
、該動物種において実験用近文系動物系（兄妹交配によ
って遺伝的に純化された系統）として系統育成されてい
る動物で、その９０％以上の個体が自己免疫疾患になる
動物をいう。
モノクロナール抗体の産生の技術において、抗原物質で
まず動物を免疫する必要がある。被免疫動物としては、
マウス、ことにＢＡＬＢ／ｃ系マウスが一般に用いられ
ている。これは細胞融合法を行う上で骨髄腫細胞と同系
同種のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）からの牌細胞を用いるの
が良いと一般的に信じられているからである。本発明者
は、このＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いて、免疫学的に寛
容状態にある物質に対する特異抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を得ることを試みたが満足する結果は得られ
なかった。
まず動物を免疫する必要がある。被免疫動物としては、
マウス、ことにＢＡＬＢ／ｃ系マウスが一般に用いられ
ている。これは細胞融合法を行う上で骨髄腫細胞と同系
同種のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）からの牌細胞を用いるの
が良いと一般的に信じられているからである。本発明者
は、このＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いて、免疫学的に寛
容状態にある物質に対する特異抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を得ることを試みたが満足する結果は得られ
なかった。
本発明において、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的
に自己免疫異常に陥るマウス系ＮＺＢとＮＺＷ系マウス
の第一代雑種（Ｆ１）即ち（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆｌ、又
はＮ２３系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／ｌ系、ＭＲＬ／ｎな
どのマウス（以下この様なマウスを「自己免疫異常マウ
ス」という）を免疫牌細胞を得るための被免疫動物とし
て用いることにより、極めて高率に本発明の目的とする
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を産生じ得ることが
見出だされた。
に自己免疫異常に陥るマウス系ＮＺＢとＮＺＷ系マウス
の第一代雑種（Ｆ１）即ち（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆｌ、又
はＮ２３系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／ｌ系、ＭＲＬ／ｎな
どのマウス（以下この様なマウスを「自己免疫異常マウ
ス」という）を免疫牌細胞を得るための被免疫動物とし
て用いることにより、極めて高率に本発明の目的とする
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を産生じ得ることが
見出だされた。
この自己免疫異常マウスはヒトの自己免疫疾患の一ツテ
あるＳ Ｌ Ｅ （Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅ
ｒｙｔｈｅｍａｔ。
あるＳ Ｌ Ｅ （Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅ
ｒｙｔｈｅｍａｔ。
５ＵＳ）全身性全身性紅斑性全癒性エリテマトーデスと
極めて類似した症状を呈する実験動物系でおることが知
られている。本発明では、これら動物が自然に発病して
くる週令の１〜２週令前のマウスを用い、この自己免疫
異常マウスに対して、免疫学的寛容状態にある物質を抗
原として免疫を開始し、抗体力価が充分に高くなるまで
免疫を繰り返し、例えば数回の追加免疫を行った後、最
終免疫の３日後に免疫動物から抗体産生細胞、例えば牌
細胞を取得し、これを骨髄腫細胞と細胞融合法により融
合させて、免疫学的寛容状態にある物質に対して特異性
を示す抗体を産生ずるハイブリドーマを形成させる。牌
細胞と骨髄腫細胞との融合はそれ自体公知の細胞融合法
、例えば前述のケーラー及びミルシュタインにより報告
された方法により容易に行うことができる。その際、Ｈ
ＡＴ選択培地のような融合細胞（ハイブリドーマ細胞）
のみが生存する限定選択培地を用いることにより、ハイ
ブリドーマ細胞を高収率で取得することができる。
極めて類似した症状を呈する実験動物系でおることが知
られている。本発明では、これら動物が自然に発病して
くる週令の１〜２週令前のマウスを用い、この自己免疫
異常マウスに対して、免疫学的寛容状態にある物質を抗
原として免疫を開始し、抗体力価が充分に高くなるまで
免疫を繰り返し、例えば数回の追加免疫を行った後、最
終免疫の３日後に免疫動物から抗体産生細胞、例えば牌
細胞を取得し、これを骨髄腫細胞と細胞融合法により融
合させて、免疫学的寛容状態にある物質に対して特異性
を示す抗体を産生ずるハイブリドーマを形成させる。牌
細胞と骨髄腫細胞との融合はそれ自体公知の細胞融合法
、例えば前述のケーラー及びミルシュタインにより報告
された方法により容易に行うことができる。その際、Ｈ
ＡＴ選択培地のような融合細胞（ハイブリドーマ細胞）
のみが生存する限定選択培地を用いることにより、ハイ
ブリドーマ細胞を高収率で取得することができる。
尚、本明細書において使用する「免疫学的寛容状態にあ
る物質」とは、正常状態にある生体ではすべての生体の
構成要素と産生物に対して、生体の免疫担当細胞系はこ
れを自己と認識してこれらの物質には抗体を産生じない
（例えば生体の産生ずるホルモンや神経伝達因子、酵素
などは一般には生体にとって自己と認識されてこれに対
する抗体は産生されない）物質のことをいう。
る物質」とは、正常状態にある生体ではすべての生体の
構成要素と産生物に対して、生体の免疫担当細胞系はこ
れを自己と認識してこれらの物質には抗体を産生じない
（例えば生体の産生ずるホルモンや神経伝達因子、酵素
などは一般には生体にとって自己と認識されてこれに対
する抗体は産生されない）物質のことをいう。
但しヒトとマウスの間のように種が異なると同様の活性
を有している物質でもその構造がよったく異なる物質で
あれば、この限りではない。即ち抗体は産生される訳で
ある。しかし一般的にいって、上記のホルモンや酵素は
種が異なっても物質の構造上の相違は極めて僅かなのが
普通であり、そのために種が異なる場合にも、これらの
物質に対して抗体を産生ざぜることは極めて困難である
場合が多い。
を有している物質でもその構造がよったく異なる物質で
あれば、この限りではない。即ち抗体は産生される訳で
ある。しかし一般的にいって、上記のホルモンや酵素は
種が異なっても物質の構造上の相違は極めて僅かなのが
普通であり、そのために種が異なる場合にも、これらの
物質に対して抗体を産生ざぜることは極めて困難である
場合が多い。
上記の如りジて調製されるハイブリドーマ細胞群からは
次いで、免疫に用いた抗原物質（免疫学的寛容状態にあ
る物質）に対して特異反応を示す抗体を産生ずる能力の
ある細胞を検索しクローニングする。この検索及びクロ
ーニングはそれ自体公知の方法で行うことができる［Ｋ
６ｈｌｅｒ、Ｈｉ １ｓｔｅｉｎらによる前述の文献参
照］、例えば、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により検索
し、これを限界希釈法によってクローニングすることに
より、モノクロナール抗体産生細胞を取得することがで
きる。
次いで、免疫に用いた抗原物質（免疫学的寛容状態にあ
る物質）に対して特異反応を示す抗体を産生ずる能力の
ある細胞を検索しクローニングする。この検索及びクロ
ーニングはそれ自体公知の方法で行うことができる［Ｋ
６ｈｌｅｒ、Ｈｉ １ｓｔｅｉｎらによる前述の文献参
照］、例えば、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により検索
し、これを限界希釈法によってクローニングすることに
より、モノクロナール抗体産生細胞を取得することがで
きる。
そしてこの細胞を常法により培養し、産生される抗体が
本発明の目的とするモノクロナール抗体である。
本発明の目的とするモノクロナール抗体である。
この場合の細胞融合の技術は融合細胞の培養により均質
な、いわゆるモノクロナール抗体を連続的に生産せしめ
ることを可能にする技術であり、その生産方法の一般的
な概要自体はすでに公知であり［Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｈｉ
１ｓｔｅｉｎらによる前述の文献参照］本発明におい
てもその方法をそのまま利用することができるので、こ
こでは該文献の引用を以て詳細な説明を省略する。
な、いわゆるモノクロナール抗体を連続的に生産せしめ
ることを可能にする技術であり、その生産方法の一般的
な概要自体はすでに公知であり［Ｋ６ｈｌｅｒ、 Ｈｉ
１ｓｔｅｉｎらによる前述の文献参照］本発明におい
てもその方法をそのまま利用することができるので、こ
こでは該文献の引用を以て詳細な説明を省略する。
以上述べた本発明の方法は、自己免疫異常系の動物を免
疫寛容物質で免疫することにより、免疫学的寛容状態を
簡単に破壊し得ることを証明したものであり、しかして
本発明の方法によれば、生体活性物質等従来の方法では
抗体を産生ずることが極めて困難であると考えられてい
た免疫学的寛容状態にある物質に対する抗体産生細胞系
を樹立することができる。
疫寛容物質で免疫することにより、免疫学的寛容状態を
簡単に破壊し得ることを証明したものであり、しかして
本発明の方法によれば、生体活性物質等従来の方法では
抗体を産生ずることが極めて困難であると考えられてい
た免疫学的寛容状態にある物質に対する抗体産生細胞系
を樹立することができる。
かようにして取得された抗体産生細胞系は試験管内で又
は動物の腹腔内で増殖することが可能であり、その培地
又は腹水からモノクロナール抗体を取得することができ
る。例えばＮＺＢ×ＮＺＷ。
は動物の腹腔内で増殖することが可能であり、その培地
又は腹水からモノクロナール抗体を取得することができ
る。例えばＮＺＢ×ＮＺＷ。
Ｆ１マウス又はＭＲＬ／ｌ系マウスの牌細胞とマウス骨
髄腫細胞（ＮＳ−１）とのハイブリドーマ細胞はすべて
ＢＡＬＢ／’Ｃ系マウスの腹腔内で増殖が可能であり、
宿主マウスの腹水中にモノクロナール抗体を産出する。
髄腫細胞（ＮＳ−１）とのハイブリドーマ細胞はすべて
ＢＡＬＢ／’Ｃ系マウスの腹腔内で増殖が可能であり、
宿主マウスの腹水中にモノクロナール抗体を産出する。
例えば、試験管内での増殖は、完全培地［ＲＰＨＩ−１
６４０、２ｍＨグルタミン、１ｍＨピルビン酸ナトリウ
ム、ファンジノン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ：０．２５μｇ
／ｍｉ＞、ストレプトマイシン（１５０μＣＩ／ｌｎ１
）、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ ／ｄ＞ 、及び１５
％馬血清を補充したもの］のような増殖培地中で、３７
℃、５％Ｃｏ２インキュベーター中にて培養することが
できる。またこの様にして培養されたハイブリド−マ細
胞は２×１０〜１Ｘ１０７細胞をマウス腹腔内に接種す
ることもできる。この場合接種に用いるマウスは、あら
かじめ（１〜２週間前）０．５ｄのプリスタン（Ｐｒｉ
ｎｓｔａｎｅ ： Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ社製）を
腹腔内に注入して前処理をほどこしておくことが望まし
い。接種後一般に４〜１０日で腹水採取が可能となる。
６４０、２ｍＨグルタミン、１ｍＨピルビン酸ナトリウ
ム、ファンジノン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ：０．２５μｇ
／ｍｉ＞、ストレプトマイシン（１５０μＣＩ／ｌｎ１
）、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ ／ｄ＞ 、及び１５
％馬血清を補充したもの］のような増殖培地中で、３７
℃、５％Ｃｏ２インキュベーター中にて培養することが
できる。またこの様にして培養されたハイブリド−マ細
胞は２×１０〜１Ｘ１０７細胞をマウス腹腔内に接種す
ることもできる。この場合接種に用いるマウスは、あら
かじめ（１〜２週間前）０．５ｄのプリスタン（Ｐｒｉ
ｎｓｔａｎｅ ： Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ社製）を
腹腔内に注入して前処理をほどこしておくことが望まし
い。接種後一般に４〜１０日で腹水採取が可能となる。
腹水中にはハイブリドーマ細胞の産生じた抗体が含まれ
ており、この中のハイブリドーマ細胞を遠心分離によっ
て除去した後、抗体原液として使用することができる。
ており、この中のハイブリドーマ細胞を遠心分離によっ
て除去した後、抗体原液として使用することができる。
（発明の効果）
本発明の方法で産生きれるモノクロナール抗体は従来の
文献に未載の新規且つ極めて有用な物質であり、かかる
モノクロナール抗体を用いれば、例えば、ホルモンや酵
素などの生体活性物質の超微量定量方法（μｃｙ−ｎｇ
）を確立することができる。ざらに、インスリンは糖尿
病治療には必須の物質であるが、現在用いられているイ
ンスリン製剤は一般にブタ由来のインスリンのＢ鎖３０
位のアラニンをスレオニンに変換することに−よって作
られた変換型インスリンであり、純粋にヒト由来のもの
に比して長期使用時に患者がこれに対して抗体を作って
しまい、インスリンでの治療が行えなくなるという症例
がある。この場合の原因は変換型インスリンそのものに
あるのか、該製剤中に微量に含まれる不純物によるもの
か充分解明されていない。又、遺伝子工学技術を活用し
た方法でヒト型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖を作り出すＤ
ＮＡをそれぞれ大腸菌等に組み込んでヒト型インスリン
のＡ鎖及びＢ鎖を産生じ、両者を化学的に結合させて得
たインスリンもあるが、これも先の変換型インスリンと
同様、問題がありその改善が望まれていた。しかし、本
発明の方法を応用すれば、各種の抗インスリン抗体を得
ることができ、この抗インスリン抗体を用いればそれら
の原因を解明することができる。ざらに抗インスリン抗
体を用いてアフィニティカラムを作成すれば、上記の不
純物を効率良く除去することができ、上記各インスリン
の精製方法となる。
文献に未載の新規且つ極めて有用な物質であり、かかる
モノクロナール抗体を用いれば、例えば、ホルモンや酵
素などの生体活性物質の超微量定量方法（μｃｙ−ｎｇ
）を確立することができる。ざらに、インスリンは糖尿
病治療には必須の物質であるが、現在用いられているイ
ンスリン製剤は一般にブタ由来のインスリンのＢ鎖３０
位のアラニンをスレオニンに変換することに−よって作
られた変換型インスリンであり、純粋にヒト由来のもの
に比して長期使用時に患者がこれに対して抗体を作って
しまい、インスリンでの治療が行えなくなるという症例
がある。この場合の原因は変換型インスリンそのものに
あるのか、該製剤中に微量に含まれる不純物によるもの
か充分解明されていない。又、遺伝子工学技術を活用し
た方法でヒト型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖を作り出すＤ
ＮＡをそれぞれ大腸菌等に組み込んでヒト型インスリン
のＡ鎖及びＢ鎖を産生じ、両者を化学的に結合させて得
たインスリンもあるが、これも先の変換型インスリンと
同様、問題がありその改善が望まれていた。しかし、本
発明の方法を応用すれば、各種の抗インスリン抗体を得
ることができ、この抗インスリン抗体を用いればそれら
の原因を解明することができる。ざらに抗インスリン抗
体を用いてアフィニティカラムを作成すれば、上記の不
純物を効率良く除去することができ、上記各インスリン
の精製方法となる。
また、本発明に従えば、各種の免疫学的寛容状態にある
物質に対する特異性モノクロナール抗体の入手が可能と
なり、それらの特異性モノクルナール抗体を用いること
によってかかる物質の生体内での局在を明らかにするこ
とにより種々の病気の診断に役立てることができ、さら
に、該特異性モノクロナール抗体をもちいてアフィニテ
ィカラムを作成することにより、免疫学的寛容状態にあ
る微量の生体活性物質を多量に精製することが可能とな
り各種の難病の治療処置に利用することができる。
物質に対する特異性モノクロナール抗体の入手が可能と
なり、それらの特異性モノクルナール抗体を用いること
によってかかる物質の生体内での局在を明らかにするこ
とにより種々の病気の診断に役立てることができ、さら
に、該特異性モノクロナール抗体をもちいてアフィニテ
ィカラムを作成することにより、免疫学的寛容状態にあ
る微量の生体活性物質を多量に精製することが可能とな
り各種の難病の治療処置に利用することができる。
（実施例）
次ぎに実施例を掲げて本発明の方法をざらに詳しく説明
する。
する。
実施例１：エクオリン（Ａｅｑｕｏｒ ｉ ｎ＞に対す
るモノクロナール抗体。
るモノクロナール抗体。
エクオリンはクラブＡｅｑｕｏｒｅａから分離された特
殊な発光蛋白質で、Ｃａ イオン分子と結合すると特異
螢光を発することで知られている。
殊な発光蛋白質で、Ｃａ イオン分子と結合すると特異
螢光を発することで知られている。
［Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｆ、 、 Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、
０． （１９７２）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ競７ ： ２８７−２８８］。この性質を利用して
細胞中のＣａ の定量など筋肉収縮の機構解明に有用
な物質であり、これに対する特異抗体はこれらの研究上
有効な手段を我々に与えるものである。
０． （１９７２）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ競７ ： ２８７−２８８］。この性質を利用して
細胞中のＣａ の定量など筋肉収縮の機構解明に有用
な物質であり、これに対する特異抗体はこれらの研究上
有効な手段を我々に与えるものである。
精製されたエクオリンを抗原としてＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ
１マウスを免疫して抗体産生能を検討した。このとき、
ＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウスの免疫時の０令及び同一の
抗原物質を従来一般にモノクロナール抗体産生のために
用いられているマウス種ＢＡＬＢ／Ｃ系に投与した場合
との比較実験も試みた。
１マウスを免疫して抗体産生能を検討した。このとき、
ＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウスの免疫時の０令及び同一の
抗原物質を従来一般にモノクロナール抗体産生のために
用いられているマウス種ＢＡＬＢ／Ｃ系に投与した場合
との比較実験も試みた。
抗原エクオリンを初回２０μｑ、第２回１０μｑ、最終
回５μＱをそれぞれ３群のマウスに注射した。
回５μＱをそれぞれ３群のマウスに注射した。
被免疫動物はＮＺＢｘＮＺＷ、Ｆ１マウス５週令と同系
０マウス１１週令とＢＡＬＢ／ｃマウス５週令の３群で
ある。
０マウス１１週令とＢＡＬＢ／ｃマウス５週令の３群で
ある。
免疫終了の後それぞれから牌細胞を得て、マウス骨髄腫
細胞Ｎ５−１とＰＥＧ法によって細胞融合せしめて、Ｈ
ＡＴ選択培地中に増殖してきたハイブリドーマを得た。
細胞Ｎ５−１とＰＥＧ法によって細胞融合せしめて、Ｈ
ＡＴ選択培地中に増殖してきたハイブリドーマを得た。
その結果は下記第１表に示すように、５週令（７）ＮＺ
Ｂ×ＮＺＷ、Ｆｌ ７９２群から１１６株、１１週令の
ＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウス群から２７株、ＢＡＬＢ／
ｃマウス群ではハイブリドーマ形成率は高く、６６２株
であった。しかしＢＡＬＢ／ｃマウス群の場合の特異抗
体の産生率は５株、０．７％にすぎない。これに対して
５週令のＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウスを用いた例では２
２株、１９．０％と極めて高率であった。ＮＺＢｘＮＺ
Ｗ、Ｆｌの加令の影響を示唆する結果で、１１週令のマ
ウスではハイブリドーマ形成率も特異抗体産生株も共に
低下の傾向を示している。即ち、特異抗体産生株は５例
１８．５％と低値を示した。
Ｂ×ＮＺＷ、Ｆｌ ７９２群から１１６株、１１週令の
ＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウス群から２７株、ＢＡＬＢ／
ｃマウス群ではハイブリドーマ形成率は高く、６６２株
であった。しかしＢＡＬＢ／ｃマウス群の場合の特異抗
体の産生率は５株、０．７％にすぎない。これに対して
５週令のＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ１マウスを用いた例では２
２株、１９．０％と極めて高率であった。ＮＺＢｘＮＺ
Ｗ、Ｆｌの加令の影響を示唆する結果で、１１週令のマ
ウスではハイブリドーマ形成率も特異抗体産生株も共に
低下の傾向を示している。即ち、特異抗体産生株は５例
１８．５％と低値を示した。
第１表：エクオリンに対するモノクロナール抗（以下余
白） ざらに酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって陽性を見た抗
体について、エクオリンの生化学的活性が中和されるか
否かを検討した結果を下記第２表に示す。Ｃａ イオン
と結合してエクオリンが特異螢光を発するのを阻止する
能力を有する抗体分子を産生ずるハイブリドーマが得ら
れたのは５週令のＮＺＢｘＮＺＷ、Ｆ１マウス群を用い
た場合が最も高く６株、１１週令のマウス群の場合には
１例得られたがＢＡＬＢ／Ｃマウス群によっては１例も
得られなかった。
白） ざらに酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって陽性を見た抗
体について、エクオリンの生化学的活性が中和されるか
否かを検討した結果を下記第２表に示す。Ｃａ イオン
と結合してエクオリンが特異螢光を発するのを阻止する
能力を有する抗体分子を産生ずるハイブリドーマが得ら
れたのは５週令のＮＺＢｘＮＺＷ、Ｆ１マウス群を用い
た場合が最も高く６株、１１週令のマウス群の場合には
１例得られたがＢＡＬＢ／Ｃマウス群によっては１例も
得られなかった。
（以下余白）
第２表：ＥＬＩＳＡ陽性とエクオリンの発光反応阻害性
を示す抗体産生ハイブリドーマ数実施例２：インスリン
に対するモノクロナール抗体。
を示す抗体産生ハイブリドーマ数実施例２：インスリン
に対するモノクロナール抗体。
インスリンは比較的低分子の蛋白性のホルモンでヒトと
ブタのインスリンは極めて類似していることが知られて
いる。
ブタのインスリンは極めて類似していることが知られて
いる。
この両者を抗原として４週令のＮＺＢ×ＮＺＷ。
Ｆ１マウスを用いて、初回５０μΩ、第２回２５μｑＳ
最終回３μｑの各インスリンを注射して免疫した。最終
免疫の３日後に各群のマウスから牌細胞を得てマウス骨
―肝細胞とＨＡＴ選択培地を用いるＰＥＧ法により細胞
融合させた。
最終回３μｑの各インスリンを注射して免疫した。最終
免疫の３日後に各群のマウスから牌細胞を得てマウス骨
―肝細胞とＨＡＴ選択培地を用いるＰＥＧ法により細胞
融合させた。
ここで用いたＰＥＧ法の詳細については、Ｇａｆｆｒｅ
、 Ｇ、 、 Ｈｏｗｅ、Ｓ、 Ｃ，、）ｌｉ ｌ５ｔ
ｅｉｎ、Ｃ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｇ、ｗ、 、ａｎｄ
ｔｌｏｗａｒｄ、Ｊ、Ｃ，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ
２６６．５５０ 、を参照されたい。又、トＩＡＴ選択
培地とはピポキサンチン、アミノプテリンとチミジンを
含む培地のことで、この培地中では、細胞融合の結果形
成されたハイブリドーマ細胞のみが増殖し、もとの骨髄
腫細胞は死滅する選択培地である。
、 Ｇ、 、 Ｈｏｗｅ、Ｓ、 Ｃ，、）ｌｉ ｌ５ｔ
ｅｉｎ、Ｃ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｇ、ｗ、 、ａｎｄ
ｔｌｏｗａｒｄ、Ｊ、Ｃ，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ
２６６．５５０ 、を参照されたい。又、トＩＡＴ選択
培地とはピポキサンチン、アミノプテリンとチミジンを
含む培地のことで、この培地中では、細胞融合の結果形
成されたハイブリドーマ細胞のみが増殖し、もとの骨髄
腫細胞は死滅する選択培地である。
トＩＡＴ選択培地に増殖してきたハイブリドーマ細胞株
について、各々の抗原に対する特異反応性を検討した結
果を第３表に示す。
について、各々の抗原に対する特異反応性を検討した結
果を第３表に示す。
ヒトのインスリンを抗原としてＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆｌを
免疫した場合には２２０株のハイブリドーマをＬこのう
ち酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって陽性と認められた
細胞株は３２株、１４．５％の陽性率であった。又、ブ
タ（Ｐｏｒｃｉｎｅ）のインスリンを抗原とした場合に
は、ハイブリドーマ細胞を２００株得た。この中で反応
特異性を示したのは６４株、３２．０％の陽性率を示し
た。
免疫した場合には２２０株のハイブリドーマをＬこのう
ち酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって陽性と認められた
細胞株は３２株、１４．５％の陽性率であった。又、ブ
タ（Ｐｏｒｃｉｎｅ）のインスリンを抗原とした場合に
は、ハイブリドーマ細胞を２００株得た。この中で反応
特異性を示したのは６４株、３２．０％の陽性率を示し
た。
第３表：インスリンに対するモノクロナール抗体産生ハ
イブリドーマの出炭頻度 実施例３：抗ブタインスリン活性及び抗ウシインスリン
活性を有するモノクロナール抗体。
イブリドーマの出炭頻度 実施例３：抗ブタインスリン活性及び抗ウシインスリン
活性を有するモノクロナール抗体。
（１） 抗インスリンモノクロナール抗体の製造ブタイ
ンスリン（ノボ製）１５μｑをＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１
７１クス（♂）の腹腔に７０インド完全アジユバントと
共に感作した。感作後１０〜１１日目に１目抜ｑのブタ
インスリンをフロイント完全アジュバントと共に腹腔に
再び感作した。Ｒ終免疫は２回目感作の１０〜２１日後
に３μｑブタインスリンを静脈内に投与することによっ
て行った。最終免疫の３〜４日俊に該マウスを層殺し牌
臓を摘出した。この牌細胞とマウスミエローマ細胞系Ｎ
５−１をＰＥＧ法により融合し９６ウエルマイクロタイ
タープレートに分注しＨＡＴ培地中で培養した。融合約
３週間後に胸腺細胞を支持細胞として限界希釈法で育成
した培養細胞のクローニングを実施した。
ンスリン（ノボ製）１５μｑをＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１
７１クス（♂）の腹腔に７０インド完全アジユバントと
共に感作した。感作後１０〜１１日目に１目抜ｑのブタ
インスリンをフロイント完全アジュバントと共に腹腔に
再び感作した。Ｒ終免疫は２回目感作の１０〜２１日後
に３μｑブタインスリンを静脈内に投与することによっ
て行った。最終免疫の３〜４日俊に該マウスを層殺し牌
臓を摘出した。この牌細胞とマウスミエローマ細胞系Ｎ
５−１をＰＥＧ法により融合し９６ウエルマイクロタイ
タープレートに分注しＨＡＴ培地中で培養した。融合約
３週間後に胸腺細胞を支持細胞として限界希釈法で育成
した培養細胞のクローニングを実施した。
（２）抗インスリンモノクロナール抗体の選択抗体価の
アッセイは酵素抗体法により９６ウエル平底マイクロタ
イタープレートで行った。炭酸ナトリウム緩衝液（１）
ｌ−１１０）に溶解した１、５μＣＩ／ｄのインスリ
ン（ウシ、ブタ、ヒト）をウェル当たり１００μｇ加え
、３７℃で一晩乾燥しウェルに固定した。このウェルを
リン酸−生理的食塩水緩衝液で洗浄し、（１）で得られ
た培養細胞の培養上清を希釈しウェルに移し、室温で−
晩又は３７℃で４時間反応させた。ウェルをリン酸−生
理的食塩水緩衝液で充分洗浄し１％ヤギ血清とパーオキ
シダーゼ結合型のウサギ抗マウスＩＣＩＧｏ、５μ（Ｊ
／ｄを含む緩衝液を１００μρずつ、各ウェルに添加し
た。室温にて２時間置き、クエン酸緩衡液、過酸化水素
、Ｏ−フェニレンジアミン（シグマ製）からなる基質を
各ウェルに加え室温で３０分反応し、硫酸で反応を停止
した。各ウェルについて４９２ｎｍの吸光度をＥＩＡリ
ーダー（ＭＴＰ−１２Ｆ２波長マイクロプレートフオト
メーター）で測定し、抗ウシインスリン及び族ブタイン
スリン活性を持つ抗体を生産する細胞を見出だした。
アッセイは酵素抗体法により９６ウエル平底マイクロタ
イタープレートで行った。炭酸ナトリウム緩衝液（１）
ｌ−１１０）に溶解した１、５μＣＩ／ｄのインスリ
ン（ウシ、ブタ、ヒト）をウェル当たり１００μｇ加え
、３７℃で一晩乾燥しウェルに固定した。このウェルを
リン酸−生理的食塩水緩衝液で洗浄し、（１）で得られ
た培養細胞の培養上清を希釈しウェルに移し、室温で−
晩又は３７℃で４時間反応させた。ウェルをリン酸−生
理的食塩水緩衝液で充分洗浄し１％ヤギ血清とパーオキ
シダーゼ結合型のウサギ抗マウスＩＣＩＧｏ、５μ（Ｊ
／ｄを含む緩衝液を１００μρずつ、各ウェルに添加し
た。室温にて２時間置き、クエン酸緩衡液、過酸化水素
、Ｏ−フェニレンジアミン（シグマ製）からなる基質を
各ウェルに加え室温で３０分反応し、硫酸で反応を停止
した。各ウェルについて４９２ｎｍの吸光度をＥＩＡリ
ーダー（ＭＴＰ−１２Ｆ２波長マイクロプレートフオト
メーター）で測定し、抗ウシインスリン及び族ブタイン
スリン活性を持つ抗体を生産する細胞を見出だした。
このようにして得たモノクロナール抗体をＪＩ−１とし
た。
た。
これはオフテロニー試験の結果ＩｇＭに属した。
このモノクロナール抗体（Ｊｌ−１＞を用いてブタ、ウ
シ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測定
した結果を第１図に示す。
シ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測定
した結果を第１図に示す。
実施例４：抗ヒトインスリン活性を有するモノクロナー
ル抗体（ＪＩ＝２＞ （１）抗インスリンモノクロナール抗体の製造。
ル抗体（ＪＩ＝２＞ （１）抗インスリンモノクロナール抗体の製造。
ヒトインスリン（ノボ製）をＮＺＢ×ＮＺＷ−Ｆ１マウ
ス（♂）に１５μｑをフロイントの完全アジュバントと
共に腹腔に感作した。１回目の感作後１０〜１１日目に
１目抜ｑヒトインスリンをフロインド不完全アジュバン
トと共に腹腔に２回目の感作をした。最終免疫は２回目
感作の１０〜２１日目に３目抜ヒトインスリンを静脈注
射することにより実施した。
ス（♂）に１５μｑをフロイントの完全アジュバントと
共に腹腔に感作した。１回目の感作後１０〜１１日目に
１目抜ｑヒトインスリンをフロインド不完全アジュバン
トと共に腹腔に２回目の感作をした。最終免疫は２回目
感作の１０〜２１日目に３目抜ヒトインスリンを静脈注
射することにより実施した。
１回目と２回目の感作の間に１回ヒトインスリンを皮下
投与し、２回目と最終感作の間にヒトインスリンを３回
皮下投与したところ、ハイブリドーマの形成に効果を示
した。
投与し、２回目と最終感作の間にヒトインスリンを３回
皮下投与したところ、ハイブリドーマの形成に効果を示
した。
最終免疫の３〜４日後に該マウスを層殺し、牌臓を摘出
した。この牌臓細胞とマウスミエローマ細胞系Ｎ５−１
とＰＥＧ法により融合し９６ウエルマイクロタイタープ
レートに分注し培養した。融合３週間後に限界希釈法で
クローニングを行った。
した。この牌臓細胞とマウスミエローマ細胞系Ｎ５−１
とＰＥＧ法により融合し９６ウエルマイクロタイタープ
レートに分注し培養した。融合３週間後に限界希釈法で
クローニングを行った。
（２）抗インスリンモノクロナール抗体の選択。
実施例３の（２）に記載の方法と同様の方法で測定し、
多くのモノクロナール抗体産生細胞の中から抗ヒトイン
スリンモノクロナール抗体産生細胞を得た。
多くのモノクロナール抗体産生細胞の中から抗ヒトイン
スリンモノクロナール抗体産生細胞を得た。
このようにして得たモノクロナール抗体をＪｌ−２とし
た。これはオフテロ二−試験の結果、ＩａＧに属した。
た。これはオフテロ二−試験の結果、ＩａＧに属した。
モノクロナール抗体Ｊ Ｉ−２を用いてブタ、ウシ、ヒ
トの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測定した結
果を第２図に示す。
トの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測定した結
果を第２図に示す。
実施例５：モノクロナール抗体産生ハイブリドーマのマ
ウス種による比較。
ウス種による比較。
ＢＡＬＢ／ｃマウス２４頭を２群に分け、ヒトインスリ
ンまたはブタインスリンを免疫原として免疫を行い、そ
れぞれ１２３８及び３７７３のハイブリドーマを得た。
ンまたはブタインスリンを免疫原として免疫を行い、そ
れぞれ１２３８及び３７７３のハイブリドーマを得た。
そのうち１３５及び４１０のハイブリドーマが抗インス
リン抗体を産生じた。
リン抗体を産生じた。
次ぎにＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウス３４頭を３群に分
け、ヒトインスリン、ブタインスリン、又はウシインス
リンを免疫原として免疫を行い、それぞれ１３８０．１
２８１及び６２４のハイブリドーマを得た。
け、ヒトインスリン、ブタインスリン、又はウシインス
リンを免疫原として免疫を行い、それぞれ１３８０．１
２８１及び６２４のハイブリドーマを得た。
そのうち２７０．２５１及び１２２のハイブリドーマが
抗インスリン抗体を産生じた。
抗インスリン抗体を産生じた。
インスリンによる免疫及び抗体の各種インスリンに対す
る反応性試験は実施例１又は２の方法に準じて行った。
る反応性試験は実施例１又は２の方法に準じて行った。
試験結果を第３表に示す。
実施例６：ヒトインスリンの精製法［変換型インスリン
（ブタインスリンの８鎖３０位のアラニンをスレオニン
に置換したヒト型インスリン）中のヒトインスリンを精
製する方法］ （１）モノクロナール抗体ＪＩ−２カラムの製造ＣＮＢ
ｒ活性化セファロース（ファルマシア製）１ｇに実施例
４により調整したモノクロナール抗体ＪＩ−２約１５ｆ
ｆｉｇをリガンドと゛して常法により結合し、モノクロ
ナール抗体Ｊｌ−２カラムを製造した。
（ブタインスリンの８鎖３０位のアラニンをスレオニン
に置換したヒト型インスリン）中のヒトインスリンを精
製する方法］ （１）モノクロナール抗体ＪＩ−２カラムの製造ＣＮＢ
ｒ活性化セファロース（ファルマシア製）１ｇに実施例
４により調整したモノクロナール抗体ＪＩ−２約１５ｆ
ｆｉｇをリガンドと゛して常法により結合し、モノクロ
ナール抗体Ｊｌ−２カラムを製造した。
（２）ヒトインスリンの精製法
変換型インスリン１ｍｆｆを０．１５Ｍ ＮａＣｌを
含むＯ，ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衛液（ｐＨ８，０
＞１０ｍに溶解し、（１）に記載した抗体カラムに１時
間当たり、０．５ｍの流速で通過させ、５０ｄの同緩衡
液（ｐＨ８，０＞で洗浄した。 次ぎにこのカラムに１
Ｍ−酢酸溶液１０ｍを通し、カラムに吸着したヒトイン
スリンを溶出した。この溶出液を凍結乾燥し約０．８η
の不純物を含まないヒトインスリンを得た。
含むＯ，ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衛液（ｐＨ８，０
＞１０ｍに溶解し、（１）に記載した抗体カラムに１時
間当たり、０．５ｍの流速で通過させ、５０ｄの同緩衡
液（ｐＨ８，０＞で洗浄した。 次ぎにこのカラムに１
Ｍ−酢酸溶液１０ｍを通し、カラムに吸着したヒトイン
スリンを溶出した。この溶出液を凍結乾燥し約０．８η
の不純物を含まないヒトインスリンを得た。
（以下余白）
第４表：ヒト、ブタ、ウシ各インスリンに反応する抗体
の数 （注） Ａ：ヒトインスリン Ｂニブタインスリン Ｃ：ウシインスリン へＢニ ヒトインスリン・ブタインスリンＡＣ： ヒト
インスリン・ウシインスリンＢＣニブタインスリン・ウ
シインスリンＡＢＣ：ヒトインスリン・ブタインスリン
・ウシインスリン
の数 （注） Ａ：ヒトインスリン Ｂニブタインスリン Ｃ：ウシインスリン へＢニ ヒトインスリン・ブタインスリンＡＣ： ヒト
インスリン・ウシインスリンＢＣニブタインスリン・ウ
シインスリンＡＢＣ：ヒトインスリン・ブタインスリン
・ウシインスリン
第１図は本発明のモノクロナール抗体ＪＩ−１を用いて
、ブタ、ウシ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免
疫法で測定した結果を示すグラフであり、第２図は同じ
く本発明のモノクロナール抗体ＪＩ−２を用いてブタ、
ウシ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測
定した結果を示すグラフである。 特許出願人 大正製薬株式会社 代理人 弁理士 野 崎 洟 也 第１図 イヌより４１電
、ブタ、ウシ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免
疫法で測定した結果を示すグラフであり、第２図は同じ
く本発明のモノクロナール抗体ＪＩ−２を用いてブタ、
ウシ、ヒトの各インスリンを抗原として酵素免疫法で測
定した結果を示すグラフである。 特許出願人 大正製薬株式会社 代理人 弁理士 野 崎 洟 也 第１図 イヌより４１電
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物を、該動物と同一種の正常な動物に
対しては免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵素で免
疫し、この免疫動物から取得した抗体産生細胞と骨髄腫
細胞から形成せしめたハイブリドーマをクローン化する
ことによって得られた抗体産生細胞から産生した、免疫
学的寛容状態にあるホルモン又は酵素に対して特異性を
示すモノクロナール抗体。 ２ 自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物がＮＺＢ×ＮＺＷの第一代雑種（Ｆ
＿１）マウス、又はＮＺＢ系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／ｌ
系もしくはＭＲＬ／ｎ系マウスである特許請求の範囲第
１項記載のモノクロナール抗体。 ３ 骨髄腫細胞がマウス骨髄腫細胞である特許請求の範
囲第２項記載のモノクロナール抗体。 ４ 免疫学的寛容状態にあるホルモンがインスリンであ
る特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のモノク
ロナール抗体。 ５ インスリンがブタインスリン又はウシインスリン又
はヒトインスリンである特許請求の範囲第４項記載のモ
ノクロナール抗体。 ６ 免疫学的寛容状態にある酵素がエクオリンである特
許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のモノクロナ
ール抗体。 ７ 自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物を、該動物と同一種の正常な動物に
対しては免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵素で免
疫し、この免疫動物から取得した抗体産生細胞と骨髄腫
細胞から形成せしめたハイブリドーマをクローン化する
ことによつて得られた抗体産生細胞から産生せしめるこ
とを特徴とする免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵
素に対して特異性を示すモノクロナール抗体の製造方法
。 ８ 自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
患になりやすい動物がＮＺＢ×ＮＺＷの第一代雑種（Ｆ
＿１）マウス、又はＮＺＢ系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／ｌ
系もしくはＭＲＬ／ｎ系マウスである特許請求の範囲第
７項記載の方法。 ９ 骨髄腫細胞がマウス骨髄腫細胞である特許請求の範
囲第８項記載の方法。 １０ 免疫学的寛容状態にあるホルモンがインスリンで
ある特許請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載の方法
。 １１ インスリンがブタインスリン又はウシインスリン
又はヒトインスリンである特許請求の範囲第１０項記載
の方法。 １２ 免疫学的寛容状態にある酵素がエクオリンである
特許請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載の方法。 １３ 自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫
疾患になりやすい動物を、該動物と同一種の正常な動物
に対しては免疫学的寛容状態にあるホルモン又は酵素で
免疫し、この免疫動物から取得した抗体産生細胞と骨髄
腫細胞から形成せしめたハイブリドーマ由来の免疫学的
寛容状態にあるホルモン又は酵素に対して特異性を示す
モノクロナール抗体を用いる上記ホルモン又は酵素の精
製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60210974A JPS6272700A (ja) | 1985-09-26 | 1985-09-26 | ホルモン又は酵素のモノクロナ−ル抗体及びその製造方法とこれを用いた精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60210974A JPS6272700A (ja) | 1985-09-26 | 1985-09-26 | ホルモン又は酵素のモノクロナ−ル抗体及びその製造方法とこれを用いた精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6272700A true JPS6272700A (ja) | 1987-04-03 |
Family
ID=16598210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60210974A Pending JPS6272700A (ja) | 1985-09-26 | 1985-09-26 | ホルモン又は酵素のモノクロナ−ル抗体及びその製造方法とこれを用いた精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6272700A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014117255A (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-30 | Tosoh Corp | インシュリン認識抗体およびそれを用いたインシュリン吸着剤 |
-
1985
- 1985-09-26 JP JP60210974A patent/JPS6272700A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014117255A (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-30 | Tosoh Corp | インシュリン認識抗体およびそれを用いたインシュリン吸着剤 |
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