JPS6284025A - 繊維芽細胞増殖促進作用を有する胎盤由来蛋白加水分解物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔イ〕発明の目的 本発明は、ヒト及び他の哺乳動物の胎盤不溶性蛋白質分
を出発原料となし、これよりアルカリ加水分解物を得た
後、さらに、これから細胞に対する毒性物質を除去して
得られる、胎盤組織中の不溶性蛋白から繊維芽細胞増殖
促進作用を有する、加水分解物の製造法に関するもので
ある。

［産業上の利用分野］ 本発明による。ｔａ；ａ芽細胞増殖促進作用を有する加
水分解物（以下促進剤と略記する。）は、わが国の薬事
法で定められた、医薬品、医薬部外品、化粧品に広く利
用することが出来る。その適応領域は、内科的殊患、皮
膚、口腔、眼、耳、鼻、肛門、陰部などの潰Ｓ（ただれ
）、外傷などである。

さらに具体的に利用分野を述べれば、例えば、上述した
各部位に用いられる、絆創膏類、ガーゼ、リント布、バ
ルブ繊ｍ（製紙類）、及び他の繊維を用いて織布された
、又は、加工きれた素材に含浸させて、局所に貼布して
用いる医療用又は、化粧料や、さらに、点眼点鼻などの
薬剤、平削、及び軟膏類又は液剤などに配合して用いる
ことが出来る。又、本発明による促進剤は、皮膚及び真
皮の発育促進、皮膚の老化防止、並びに創傷治癒促進、
毛髪発育促進を目的とした、各種の薬剤、又は、化粧料
中に用いてもよく、きらに内部的な疾患としては、例え
ば、胃や、−二脂腸潰瘍に対する治療に当って、直接又
は他の薬剤と併用して用いることが出来る。

すなわち、本発明による促進剤は、組織の再生修復に係
る、繊維芽細胞の活性を高めるものである。

［従来の技術］ 胎盤を出発原料となし、これより各種の加水分解物を得
て、医薬品や化粧品に用いることは、古くから知られて
いる。又、最近では、例えば、本発明者らによる胎盤を
もとに、その加水分解物を得て、メラニン生成抑制剤と
なす方法がある。

［刊行物の所在コ （１）特許公報　　：昭５６−０４４０４６号（２）公
開特許公報：昭５８−１７７９１８号［発明が解決しよ
うとする問題点］ 従来法による、胎盤から加水分解物を得るに当っては、
その操作上からして、得られた加水分解物中の、特有の
臭いと共に、色調を帯びることが一つの欠点として上げ
られてきた。そのために、工程中で例えば活性炭、ケイ
ソウ土などの処理が行なわれてきたが、今だ、臭いと色
を除去するに当っては、完璧な、しかも、簡易な処理手
段はなかった。すなわち、胎盤そのものには、多量の血
液が含まれ、洗浄によって完全に除去することは困難で
あった。この事は、特にアルカリにて加水分解物を得る
際に、赤血球由来のヘム色素や、血液独特のにおいの混
入を避けることが困難であった。さらに、本発明らの検
索の結果、こういった加水分解物は、そのままでは一般
的なアミノ酸、ペプチド溶液と比較して、ｉｎ　　ｖ＋
ｔｒｏで細胞に対する、毒性作用が比較的強く示される
ことである。従って、車なる脱色、脱臭処理のみでは、
解決できないわけである。そこで、この点を、解決する
策を求め、従来の加水分解物に対する改良を目的となし
、その研究を開始した。

〔口〕発明の構成 問題点を解決するための手段 本発明者は、従来の胎盤アルカリ加水分解物から、にお
い、色の点でよりすぐれたものを得るべく検討中、特に
色素の成分が細胞に対する毒性作用の原因物質であるこ
とを確認した。

そこで、この欠点を解決するべく、種々の公知な加水分
解法をもとに、含まれる毒性作用物質の、工程中での除
去操作手段の開発に当り、毒性作用を有しない新規な胎
盤の加水分解物を得ることに成功した。

一方、本発明による方法で得られた、加水分解物は、さ
らに研究（検索）を続けた結果、皮膚繊維芽細胞の増殖
促進作用を有することがわかった、すなわち、本発明は
、繊維芽細胞促進作用を有する、胎盤不溶性蛋白をもと
に、その加水分解物の製造法に関するものであるが、そ
の基本的な条件及び操作における要点（主要部）は、具
体的には、次のＡ−Ｃで示すごとくにより、その目的が
達成される。

（Ａ）出発原料 出発原料は、ヒトを含む哺乳動物の胎盤であるＣＢ）操
作手段と作用 赤血球に由来するヘム色素を除くためには、比較的低分
子量を分画する目的の限外濾過膜、又はゲル濾過によっ
て、胎盤加水分解物中のベブタイド成分と分離すること
が出来る。又一方、ｐＨをある一定の酸性領域に！！ｌ
ｔすることによって、色素成分を不溶性となし、分離除
去することが出来る。この様にして得られた胎盤加水分
解物は、従来法による加水分解物に比べて、細胞に対す
る毒性作用が第２図の様に滅弱していることが解った、
さらに、この改良された胎盤加水分解物は、ある投与量
では逆に細胞に対する増殖促進作用のあることが解った
。（第３図） （Ｃ）基本工程 以下に示す実施例では、特定した抽出分離の条件下で、
最も簡易な方法を示すも、その抽出法としては、従来の
加水分解物をもとに、その工程中で、前記（Ｂ）の操作
を加えることにより、達成出来る。つまり、従来から知
られている塩析分離、透析、限外濾過、ゲル濾過等のさ
まざまの抽出法の工程中で、組み合わせることにより、
得ることが出来る。

ｒ実施例１− 水に可溶な胎盤加水分解物は、基本的な工程は、公知の
方法によって得ることが出来るが、ここでは、例えば、
新鮮な凍結胎盤１ｋｇを細砕し、５！２の精製水を加え
てホモジナイズした後、遠心分離して残渣を得る。この
処理を繰り返し、出来る限り、血液成分を除去する０次
にこの残渣にアセトンを加えて洗浄後、０．ＩＮ水酸化
ナトリウム１２を加えて、低温下でブレンダーにてホモ
ジナイズする０次にこれを遠心分離して、その上清液を
得る。この上清液を塩酸を用いて、ｐＨを４８５〜５．
０にＭｉｌｌ！ｉｔ、、生じた沈殿を濾過したのち、０
．２２μｍのフィルター（ミリボア製）で無菌濾過し、
凍結乾燥して約３００１の粉末を得る。

上記の工程中、目的達成のための、主要部となす手段は
、ｐＨ４，５〜５．０となす点にある。

ｒ実施例２Ｊ 実施例１と同様に、アルカリ処理によって水に可溶な胎
盤加水分解物を得たのち、この水溶液を限外濾過膜（分
画分子量１．０００）により濾過し、通過しない濃縮部
を０．２２μｍのフィルターで無菌濾過し、凍結乾燥す
る。その収量は胎盤１ｋｇ当り約１００［である。

上記の工程中、目的達成のための主要部は、分子量１，
０００以下の成分を除去させる点にある尚、前記した（
Ｂ）の作用に関する、第１〜３図について、その測定法
は、次の通りである。

〔細胞増殖促進作用の測定に関する注解〕細胞増殖促進
作用を表現する方法は、今日一般に知られている生長因
子でも、的確に効力を表現する方法はない、細胞毒性を
表現する方法としては、さまざまな方法が示され、増殖
率の抑制として、細胞数、蛋白量等で定量的に示きれる
。そこで本発明者らは、この細胞毒性試験とは逆に、増
殖率の促進として、定量的に表現する方法を鋭意検討し
た結果、目的物質を加えない対照群の細胞増殖率をゼロ
近くに抑制することにより、目的物質の細胞増殖促進作
用を、定量的に表現する方法を開発した。この方法をよ
り具体的に示せば、培養液に加える血清の量をｍ整する
ことにより、行なうことが出来た０本試験法を確立する
に当っては、さまざまの株細胞で検討してきたが、それ
らは正常細胞とは異なり、生体での細胞機能のモデルと
は言いがたいことから、ここでは、正常組織から取り出
した、初代細胞で検索することにした、すなわち、モル
モットの皮膚から無菌的にｍａを分離し、−゛定期間継
代した変異していない細胞を対象として、目的物質の細
胞増殖促進度を表現することとした０例えば、モルモッ
ト（）＼−トレー系、雌）から採取した繊維芽細磨は、
５％牛脂児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルのＭＥＭ
培地中で盛んに分裂増殖し、その倍数増殖時間は、１第
１図」に示すように、約４８時間であり採取後、約１年
で株化した。そこで本発明の目的物質の細胞増殖促進率
表現のためには、出来るだけ正常に近い細胞という条件
から、採取後６ケ月までに増殖継代した細胞を凍結保存
することにより、目的物質の抽出（分離）のために使用
した。

その方法は、まず、直径３．５ｃｍのベトリデイシュ（
：Ｉ−ニング社製）に、１ｍｆｆ１の培養液あたり４〜
５ｘｔｏ’個の細胞を植え、低濃度のＦＢＳを加えたイ
ーグルのＭＥＭ培地を、２〜３日目ごとに交換する。細
胞数は、２〜３日目ごとにビュルケルチュルクの血球計
算を用いて測定する、尚、この際同時に蛋白量、核酸量
を測定しても良い、目的物質は生理食塩水にて調製し、
培地あたり１０分の１の量を、培地交換の都度添加し、
対照には、同量の生理食塩水のみ添加する。

〔ハ〕発明の効果 本発明による、胎盤不溶性蛋白の加水分解物から、色、
においの点で改良された加水分解物は、同時に細胞に対
する毒性が少ない点でも優れたものであり、又ある投与
量では、皮膚の繊維芽細胞の増殖促進作用を有すること
である。皮膚及び臓器の結合組織細胞である繊維芽細胞
は、結合組織繊維やヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
等の基質の同化及び異化といった代謝に係わる細胞であ
り、組織の再生修復に関与する細胞である。このことか
ら、胎盤不溶性蛋白の加水分解物を化粧品、医薬品等に
損傷修復、抗潰瘍等の目的で使用する上で、含有する細
胞に対する毒作用物質を除去することは意義があると考
えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に於て用いた細胞の増殖曲線である。 第２図は、＠１図と同し条件で培養下の細胞をコントロ
ールとして〔イ〕、本発明による促進剤を蛋白量で換算
して培地あたり１ｍｇ／ｍｆｆ添加したもの〔口〕、及
び実施例１で得た促進剤を蛋白量で換算して培地あたり
１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｒ添加したもの〔ハ〕の細胞増殖
曲線である。 第３図は、本発明の促進剤を培地あたり１．０ｍｇ／ｒ
ｔｅ添加したもの（、）の１１１胞増殖曲線であり、（
ｂ）はその対照群で、添加するＦＢＳの量を調節するこ
とにより、増殖率をゼロ近くに抑制したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 胎盤の水及び塩類溶液に不溶な蛋白成分を、アルカリ加
   水分解処理した後、ｐＨを４．５〜５．０に調整するこ
   とによって、細胞に対する毒性作用物質を沈殿除去する
   か、又は、限外濾過膜、ゲル濾過によって分子量１，０
   ００以下の成分を除去し、細胞に対する毒性作用物質を
   除去することを特徴とする、繊維芽細胞増殖促進作用を
   有する、胎盤不溶性蛋白の加水分解物の製造法。