JPS6288961A

JPS6288961A - アルブミンとグロブリンの分離方法

Info

Publication number: JPS6288961A
Application number: JP60228967A
Authority: JP
Inventors: Takashi Hamaguchi; 隆濱口
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1985-10-16
Filing date: 1985-10-16
Publication date: 1987-04-23
Anticipated expiration: 2011-12-11
Also published as: JP2562576B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ産業上の利用分野）本発明は、クロマトグラフィーを用いたアルブミンの迅
速分離法に関する。

最近、血液の有効利用と輸血による副作用の防止の両面
から、全血をそのまま保存血液として１史用するので汀
なく、できるだけ細かい成分に分けて患者にとって必要
な成分のみを号・貰注し、他の成分はそれを必要とする
別の馨者に役立てようという方式、すなわち、成分製剤
としての＋１１用が急増してきた。

アルブミン製剤は最も広く用いられている成分製剤の一
つで、厚生省薬務局の生物学的製剤基準によれば、「加
熱人血漿蛋白」と［人ｉｎ　ｔｉＩアルブミン］とがあ
り、浮腫、腹水の防止に、また、出血性ショックや火傷
の救急治療、さらには１ｍ漿交換時の輸液として有用で
ある、アルブミン製剤の需要針は、その供給計をはるかに超え
、このアンバランスは、今ｔＳ：、ますます深刻化する
可能性が強い。当然ながら供給量には限度があるので、
効率のよい、留製法の開発が熱望されている。

一方、アルブミンは臨床検査の分野でも極めて重要であ
る。

一般に、多くの疾患でアルブミンＦｉ減少することが多
く、アルブミンとグロブリンの油化、いわゆるＡ／Ｇ比
は低下することが多い。例えば、肝硬変、慢性肝炎、肝
癌１、色性肝炎、肝委酪等の肝機能障害にともなうアル
ブミンの減少、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、
悪性リンパ腫、膠原病、肝硬変、慢性感染症、梅毒、関
節リウマチ、マラリア等にともなうグロブリンの減少を
反映する、このような理由で、Ａ／Ｇ比は最も頻繁に行
なわれる健康診断（スクリーニング）の項目の一つであ
る。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）！Ｔｒｉ嘴蛋白質の従来の分画法には、塩析法、コーン
（Ｃｏｈｎ　）分別法、ポリエチレングリコール法等が
あるが、中でも１９４０年代に開発された冷エタノール
を使用するコーン法が最も幅広く使用されている。にも
かかわらず、この方法には多くの欠点がある。一つは、
高濃度のエタノールを使用するため、多くの貴重な生物
学的に活性な血漿蛋白の変性と不活性化をまねく。さら
に、この方法は、多数の処理工程からなり、煩雑で長時
間を要し、かつ、バッチ方式でのみ実施可能な方法であ
る。

半透膜による分離法は、操作性は高いが、満足できる分
離能を有するものは未だない。

また、最近では、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー法等が開発されている。

例えば、カチオン交検体とアニオン交換体を組み合わせ
て、血漿製品からアルブミンを単離する方法（特開昭５
２−４７９１５）が開発されているが、凝血因子Ｉ、　
　ＩＩ、■、■、ＩＸ、Ｓ−よびＸｌおよびＩｇＧの主
要部分を実質的に含まない血漿フラクションにしか適用
できず、また、操作が簡便であるとけ言えない。

また、一方、親水性担体を用いた分子篩クロマトグラフ
ィーによるσ１漿蛋白質の分離方法Ｃ％開昭５４−４６
８１３）が開発されている。この方法によれば、α、β
、ｒの各グロブリンおよびアルブミンの相互分離が従来
法と比較すると良好であるが、アルブミンと他の成分と
の分離は不充分である。

例えば、ＩｇＧの一部およびトランスフェリンのほぼ全
量がアルブミン分画に混入してしまう。また、これらの
分離に３０分以上を要する。

一方、Ａ／Ｇ比の測定は、従来、塩析法、ｐ紙電気泳励
法、セルロースアセテート膜法、屈折法等があるが、各
々の測定法による正常値が、それぞれ１．０〜１．５．
１．６　Ｓ−１，９，１，６〜２．４．１．５〜２．４
と大きくばらつく。したがって、Ａ／Ｇ比ｄ１１１定の
信頓できる標準法の開発が待たれる。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速かつ１ｍ便な操作で、アルブミンを含む体液
または１ｍ漿製品から、アルブミンと他の成分全効率よ
く分離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、主鎖に直接結合したアルコール性
水酸基とイオン交換基とを有する硬質の全多孔性粒状架
橋共重合体を固定相とし、ｐＨ６，５〜１０．０、イオ
ン強度０．０５〜１．５の移動相を用いた液体クロマト
グラフィーによって、アルブミンを含む体液またはｌ［
ｉｌ漿堰品から、従来法と比較してはるかに短時間のう
ちに、また、簡便に、さらに効率よく、アルブミンと他
の成分とを分離する方法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で固定相として用いられる硬質の全多値性粒状架
橋共重合体ｃ以下、単にゲルと表わす）は、少なくとも
主鎖に結合したアルコール性水酸基を有する。主鎖に直
接結合したアルコール性水酸基とは、例えば、酢酸ビニ
ルや炭酸ビニレンの重合体をケン化して得られる水酸基
のことである。

水酸基の量は、ゲル乾燥重叶当り５〜９　ｍｅｑ／？の
範囲にあるのがよい。ここで、水酸基の前は、例えば、
水酸基を無水酢酸と反応させて、消費した無水酢酸の！
またはゲルの重量変化を６１１１定することで求めるこ
とができる。

また、本発明のゲルは、水酸基の他にイオン交換基を有
する。例えば、アミン基、ジエチルアミノ基等の弱塩基
性アニオン交換基、４級アンモニウム基等の強塩基性ア
ニオン交換基、あるいはカルボキシル基、リン酸基等の
弱酸性カチオン交換基、スルホン酸基のような！ｉｌｉ
酸性カチオン交換基が好ましい。中でも塩基性アニオン
交換基が好運しく、特に、ジエチルアミノ基等の弱塩基
性アニオン交する基が好ましい。また、イオン交換基の
量は、０．１〜３　、０　ｍｅｑ　／ｆの範囲にあるの
が好ましい。イオン交換基の情は、通常のイオン交換樹
脂の交摸容看の測定方法で求めることができる。

上記の水酸基およびイオン交換基は、ゲル全体に分布し
ても、また、ボア形成部分すなわちボア＆面のみに分布
してもよい。

本発明の架橋共重合体の架喬構造は特に限定されないが
、例えば、トリアリルイソシアヌレート、ジアリルイソ
シアヌレートやトリアリルシアヌレート等のトリシアヌ
レート環やトリアジン環を有する架橋性単忙体単位によ
って架橋された構造等を挙げることができる。なかでも
トリアリルイソシアヌレートによって架橋された構造が
好ましい。

本発明で用いる硬質のゲルとは、機械的強度が大で、し
かも内部までボアが分布した構造を有するゲルのことで
ある。このようなゲルは、前述したセファデックスのよ
うな軟質のゲルと異なり、乾燥状態でも膨潤時のボア構
造を実質的に維持するため、乾燥状態での比表面積が大
である。本発明のゲルは、通常、乾燥ゲル重ｔ＋ｔ　３
　Ｆ）　２　ｒｎ”／　１以上、好ましくは５〜ｔｏｏ
ｏｒＩＬ２／ｙの比表面積を有する。一方、軟質ゲルの
乾燥時の比表面積１ηＬ２／ｙ以下の小さい僅を示す。

比表面積が本発明の範囲にあるゲルは、機械的強度が大
きいので、クロマトグラフィー用の４ｐ体として用いた
ときに、溶ｍ浴媒を高流速で通液することができ、迅速
な分離・分析が可能となる。ゲル中のボアの大きさは、
少なくともアルブミンが浸透できる程度の大きさであれ
ばよい。ボアの大きさは、デキストラン、ポリエチレン
グリフール等の分子全既知の標準サンプルヲ用いてゲル
パーミェーションクロマトグラフィーを行ない、得られ
た検量線から公知の方法で推定することができる。

本発明のゲルの粒径は、通常は１〜２０００μｍの範囲
にあるのがよい。高速液体クロマトグラフィー用充填削
として用いる場合は、平均粒径が２〜１５μｍｎの範囲
にあるのが好ましい。人前サンプルの分離ｆＣ目的とす
る場合は、より大きい粒径でよい。

本発明の硬質ゲルの一例は、特開昭５９−８２６１号公
報に示されている。

アルブミンの分離は、前記ゲルを通常ステンレスやガラ
スのカラムに充填し、いわゆる液体クロマトグラフィー
によって行なわれるが、薄層クロマトグラフィーとして
行なってもよい。

本発明のクロマトグラフィーで用いる移動相のｐＨは６
．５〜１０．０である。さらに好ましくは７．０〜９．
５である。また、移動相のイオン強度は０．０５〜１．
５、さらに好ましくは０．５〜１．０である。

サラに、エタノール、メタノール、アセトニトリル、エ
チレングリコール等の水溶性の有機溶媒を少量加えるこ
とにより、クロマトグラムの形状はシャープになり、蛋
白質の回収率を上げることができる。

通常、クロマトグラフィーを行なう間、移動相の組成は
変化させることなく一定組成のままでよいが、必要によ
っては、段階的または連続的に変化させてもよい。

本発明で対象とするアルブミンを含む体液または皿泉製
品とは、血漿、血清、胎盤血清、胎盤エキス、髄液等の
ような人間および人間以外の（動物の体液またはそれら
の分１ｌｉｌｉｌｉ物のうちアルブミンを含むものを言
う。

（実施例）以下に本発明の実施例を示すが、本発明のめ囲は、これ
らの実施例により限定されるものではない。

実施例１アルブミンの分離は、匂下に示すような条件の液体クロ
マトグラフィーで行なった。なお、カラム（Ａｓａｈｉ
ｐａｋ　ＥＳ−５０２Ｎ　）は、主鎖に直接結合したア
ルコール性水酸基とイオン交閑）＆（ジエチルアミン基
）とを４１する硬質の全多孔性粒状架篇重合体を固定相
とした高速液体クロマトグラフィー用充填カラムである
。

カラム：旭化成工業：閑　商品名Ａｓａｈｉｐａｋ　ＥＳ−５０２Ｎ内径７．６＋ｎｔｘ、長さ１０Ｇ移動相：　５０　ｍＮビストリｘ−ＨＣ１＋５００ｒｎ
ＭＮａＣ１＋１０％エタノール（ｐＨ７，０）ポンプ二日本分光工業１掬　商品名ＴＲＩ　ＲＯＴＡＲ−Ｖ（流ｔ、ｔ　：　１．Ｏｔａｐ
／ｒｔａｔ　）検出器：日本分光工業］閑　　商品名ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＶＩ　（波長：２８０＋ａｍ）
温　　度：　３５Ｃ（結　果）血清（オーフ・ダイアグノスティック・システムズ丁−
夷のノーマルコントロール［ｍｔｆり（７）分１１！１
１Ｊｆｃ＠１図に示した。クロマトグラムかられかるよ
うに、アルブミンとグロブリンの分離は約４分で完了し
た。

実施ｌ＋１１２移動相：５０ｒｒＬＭエタノールアミｙ　−ＨＣ／−＋
　５００　ｒｎＭＮａＣ１＋４％エタノール（ｐＨ９，
５）その他は実施例１とまったく同一の条件で血清の分
離を行なった。

（結　果）得られたクロマトグラムを第２図に示した。図かられか
るように、アルブミンとグロブリンの分離は約５分で完
了し、その分離は極めて良好であった。

（発明の効果）本発明のクロマトグラフィーによるアルブミンとグロブ
リンの分離方法においては、主鎖に直接結合したアルコ
ール性水酸基の他に、イオン交換基を導入した硬質の全
多孔性粒状架橋共重合体を固定相とし、ｐ　Ｈ６，５〜
１０．０、イオン強度０．０５〜１．５の移動相を用い
ることによって、アルブミンとグロブリンの分子量、等
電点、親疎水性等の物性の差を利用し、かつ、それらの
ゲルへの吸着をできるだけ押えることによって、アルブ
ミンとグロブリンの分離を短時間のうちに効率よく行な
うことができるようになった。しかも、クロマトグラフ
ィーを行なう間、移動相の組成は変化させることなく一
定組成のままでもよいので、操作も極めて簡便である。

本発明の比較例として、前述したイオン交換クロマトグ
ラフィー法（特開昭５２−４７９１５）と、分子篩クロ
マトグラフィー法（特開昭５４−４６８１５）が挙げら
れるが、前者は、擬餌因子とＩｇＧを含まない血漿フラ
クションにしか適用できないという条件付きで、分離度
と操作性に問題がある。後者は、やはり分離度と迅速性
に問題がある。

以上述べたように、本発明におけるアルブミンとそれ以
外の成分（グロブリン）の分離は、従来のいかなる方法
と比較しても、分離能、迅速性、簡便性等のあらゆる点
においてけるかに優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１によって健常人血清を分だした結果を
示すクロマトグラム、第２図は実施例２によって同じく
健常人血清を分離した結果を示すクロマトグラムである
。

Claims

【特許請求の範囲】

主鎖に直接結合したアルコール性水酸基とイオン交換基
とを有する硬質の全多孔性粒状架橋共重合体を固定相と
し、ｐＨ６．５〜１０．０、イオン強度０．０５〜１．
５の移動相を用いた液体クロマトグラフィーによつて、
アルブミンを含む体液または血漿製品から、アルブミン
と他の成分とを分離することを特徴とするアルブミンと
グロブリンの分離方法。