JPS63101331A - ヒト精子不動化抗体の対応抗原 - Google Patents
ヒト精子不動化抗体の対応抗原Info
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- JPS63101331A JPS63101331A JP61246250A JP24625086A JPS63101331A JP S63101331 A JPS63101331 A JP S63101331A JP 61246250 A JP61246250 A JP 61246250A JP 24625086 A JP24625086 A JP 24625086A JP S63101331 A JPS63101331 A JP S63101331A
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- Japan
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- human
- sperm
- treatment
- antigen
- antibody
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
この発明は、ヒト精子不動化抗体の産生な誘起すること
かてきる新規な抗原に関する。この抗原は、避妊ワクチ
ン及び試薬としての用途を有する。
かてきる新規な抗原に関する。この抗原は、避妊ワクチ
ン及び試薬としての用途を有する。
［従来の技術］
従来より、原因不明不妊婦人の十数％に、精子不動化抗
体の存在が報告されている。しかしながら、これらの精
子不動化抗体の対応抗原については研究が進んでいない
。
体の存在が報告されている。しかしながら、これらの精
子不動化抗体の対応抗原については研究が進んでいない
。
［発明が解決しようとする問題点］
この発明の目的は、ヒト精子不動化抗体の産生を誘起す
ることかてきる新規な抗原を提供することである。
ることかてきる新規な抗原を提供することである。
［問題点を解決するための手段］
すなわち、この発明は、男性−性器から分泌され、精子
に付着する精子被覆抗原（ｓｐｅｒｍｃｏａｔｉｎｇａ
ｎｔｉｇｅｎ）てあって、その分子量か約ｚｏｏｏｏて
あり、精漿中ては分子量約４４００００以上の高分子と
して存在し、アルカリ処理、熱処理、酸化処理又はスト
レプトマイセス・グリセウスによって生産されるプロテ
アーゼ混合物ての処理によりその抗原活性が減少し、酸
処理、還元処理、トリプシン処理、混合グリコシダーゼ
処理によりその抗原活性か実質的に変化しない、ヒト精
子不動化抗体の産生な誘起することかてきる抗原を提供
する。
に付着する精子被覆抗原（ｓｐｅｒｍｃｏａｔｉｎｇａ
ｎｔｉｇｅｎ）てあって、その分子量か約ｚｏｏｏｏて
あり、精漿中ては分子量約４４００００以上の高分子と
して存在し、アルカリ処理、熱処理、酸化処理又はスト
レプトマイセス・グリセウスによって生産されるプロテ
アーゼ混合物ての処理によりその抗原活性が減少し、酸
処理、還元処理、トリプシン処理、混合グリコシダーゼ
処理によりその抗原活性か実質的に変化しない、ヒト精
子不動化抗体の産生な誘起することかてきる抗原を提供
する。
［５？：頃Ｉの効果］
この発明により、新規なヒト精子不動化抗体産生誘起抗
原か提供される。この発明の抗原の対応抗体は、後述す
るように、その精子不動化部か非常に大きい。従って、
この発明の抗原は、優れた避妊ワクチンとして用いるこ
とかてきる。さらに、この発明の抗原に対応するヒト精
子不動化抗体は補体とともに局所的に性器に適用するこ
とによって避妊薬として用いることかてきるか、この発
明の抗原は、このような精子不動化抗体の産生を誘起し
、又は精製するための試薬としての用途も有する。
原か提供される。この発明の抗原の対応抗体は、後述す
るように、その精子不動化部か非常に大きい。従って、
この発明の抗原は、優れた避妊ワクチンとして用いるこ
とかてきる。さらに、この発明の抗原に対応するヒト精
子不動化抗体は補体とともに局所的に性器に適用するこ
とによって避妊薬として用いることかてきるか、この発
明の抗原は、このような精子不動化抗体の産生を誘起し
、又は精製するための試薬としての用途も有する。
［発明の詳細な説明］
本願発明者は、先に出願した特願昭６１−１５３５８１
において、高力価のヒト精子不動化ヒト単一クローン抗
体及びそれを産生するバイプリトーマを記載した１本願
発明は、このような、ヒｌ−精子不動化ヒト抗体の対応
抗原に係る。」；記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗
体を産生ずるハイブリ１−一マは、精子不動化抗体を有
する不妊婦人の末梢血リンパ球をＰＷＭレクチンとヒト
精子で刺激し、これを常法に従ってマウスミエローマ細
胞と融合することによって得られた。得られたバイプリ
トーマによって産生されるヒト精子不動化ヒト単一クロ
ーン抗体は、瓦類を有するヒト免疫クロッリンＭに属し
、精子不動化値がＳｉ２゜とじて約５０００以上であり
、精子凝集値が約１：１６００希釈以上てあり、ヒト射
精精子、精漿及び精子に対して特異的に反応し、ヒト母
乳、ヒト血清、ヒト不丸抽出倍、ヒト肝臓抽出液、ヒト
脾臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト赤血球、ヒト白血球と
は反応せず、フタ射精精子とは弱い交差反応性を示すが
ウシ射精精子、ヤギ射精精子、ウサギ射精精子、ハムス
ター精巣−に１体精子及びう・ント精巣上体精子とは反
応しない。
において、高力価のヒト精子不動化ヒト単一クローン抗
体及びそれを産生するバイプリトーマを記載した１本願
発明は、このような、ヒｌ−精子不動化ヒト抗体の対応
抗原に係る。」；記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗
体を産生ずるハイブリ１−一マは、精子不動化抗体を有
する不妊婦人の末梢血リンパ球をＰＷＭレクチンとヒト
精子で刺激し、これを常法に従ってマウスミエローマ細
胞と融合することによって得られた。得られたバイプリ
トーマによって産生されるヒト精子不動化ヒト単一クロ
ーン抗体は、瓦類を有するヒト免疫クロッリンＭに属し
、精子不動化値がＳｉ２゜とじて約５０００以上であり
、精子凝集値が約１：１６００希釈以上てあり、ヒト射
精精子、精漿及び精子に対して特異的に反応し、ヒト母
乳、ヒト血清、ヒト不丸抽出倍、ヒト肝臓抽出液、ヒト
脾臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト赤血球、ヒト白血球と
は反応せず、フタ射精精子とは弱い交差反応性を示すが
ウシ射精精子、ヤギ射精精子、ウサギ射精精子、ハムス
ター精巣−に１体精子及びう・ント精巣上体精子とは反
応しない。
この栄−クローン抗体につき、さらに抗体吸収試験を行
なったところ、無精子症患者精漿］、Ｏｍｇ／ｍｌ、精
嚢腺分泌液１０ＩＩｇ／ｍｌてほぼ完全に抗体活性か吸
収された。さらに前立腺抽出液ては５０Ｂ／ｍｌて４Ｈ
の活性か吸収されたか、不丸抽出液てはｌ００ｍｇ／■
１ても活性か吸収されなかった。これらの基実より、上
記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体の対応抗原は、
男性−性器より分泌され精子に付着する、いわゆる精子
被覆抗原であると考えられた。
なったところ、無精子症患者精漿］、Ｏｍｇ／ｍｌ、精
嚢腺分泌液１０ＩＩｇ／ｍｌてほぼ完全に抗体活性か吸
収された。さらに前立腺抽出液ては５０Ｂ／ｍｌて４Ｈ
の活性か吸収されたか、不丸抽出液てはｌ００ｍｇ／■
１ても活性か吸収されなかった。これらの基実より、上
記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体の対応抗原は、
男性−性器より分泌され精子に付着する、いわゆる精子
被覆抗原であると考えられた。
そこてヒト精漿をゲルろ過クロマトグラフィーにより分
画し、各分画な上記屯−クローン抗体を吸着体として用
いた酵素免疫分析により分析したところ、分子量４４万
以上の高分子分画に活性か認められた。この分画から、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び引き続くウ
ェスタン・プロッティング法により上記ヒト精子不動化
ヒト単一クローン抗体の対応抗原な単離することに成功
した。
画し、各分画な上記屯−クローン抗体を吸着体として用
いた酵素免疫分析により分析したところ、分子量４４万
以上の高分子分画に活性か認められた。この分画から、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び引き続くウ
ェスタン・プロッティング法により上記ヒト精子不動化
ヒト単一クローン抗体の対応抗原な単離することに成功
した。
この発明のヒト精子不動化抗体産生誘起抗原は、０ 、
０５ Ｍ Ｎ ａ ＯＩｆ （ｐ ＩＩ ］、 ３ ）
によるアルカリ処理（２０’Ｃ，１時間） 、 １００
℃、１０分間の熱処理、ｃ度１０■Ｍの過ヨウ素酸塩に
よる酸化処理（２０°Ｃ１１時間）又はストレプトマイ
セス・グリセウスによって生産されるプロテアーゼ混合
物（商品名プロナーゼ）による処理（濃度０．１Ｈ／ｍ
ｌ、３７°Ｃ，１時間）によってその抗原活性か減少す
る。
０５ Ｍ Ｎ ａ ＯＩｆ （ｐ ＩＩ ］、 ３ ）
によるアルカリ処理（２０’Ｃ，１時間） 、 １００
℃、１０分間の熱処理、ｃ度１０■Ｍの過ヨウ素酸塩に
よる酸化処理（２０°Ｃ１１時間）又はストレプトマイ
セス・グリセウスによって生産されるプロテアーゼ混合
物（商品名プロナーゼ）による処理（濃度０．１Ｈ／ｍ
ｌ、３７°Ｃ，１時間）によってその抗原活性か減少す
る。
しかしなから、 ０．１ Ｍグリシン−ＩＩＣ： ｌ
（ｐＨ２，５）による酸処理（２０°Ｃ１１蒔間）、濃
度ＩＭの２−メルカプトエタノールによる還元処理（２
０℃、１時間）、濃度０．１Ｂ／ｍｌのトリプシンによ
る処理（３７℃、１時間）、濃度ｌ■ｇ／■ｌのグリコ
シダーゼによる処理（３７℃、１時間）によってはその
抗原活性が実質的に変化しない。なお、特許請求の範囲
中の各処理は、上記条件における処理を意味する。
（ｐＨ２，５）による酸処理（２０°Ｃ１１蒔間）、濃
度ＩＭの２−メルカプトエタノールによる還元処理（２
０℃、１時間）、濃度０．１Ｂ／ｍｌのトリプシンによ
る処理（３７℃、１時間）、濃度ｌ■ｇ／■ｌのグリコ
シダーゼによる処理（３７℃、１時間）によってはその
抗原活性が実質的に変化しない。なお、特許請求の範囲
中の各処理は、上記条件における処理を意味する。
この発明の抗原は、ヒト精子不動化ヒト抗体の産生な誘
起することかてきるのて、避妊ワクチンとしての用途を
有する。また、ヒト精子不動化ヒト抗体と特異的に結合
するイ莞力を有するのて、避妊薬として用いることがて
きる該抗体を精製する際の試薬としての用途を有する。
起することかてきるのて、避妊ワクチンとしての用途を
有する。また、ヒト精子不動化ヒト抗体と特異的に結合
するイ莞力を有するのて、避妊薬として用いることがて
きる該抗体を精製する際の試薬としての用途を有する。
［実施例］
強い精子不動化及び精子凝集抗体を有する、１５年以上
不妊の３９歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の精子不動化及び精子凝集抗体か存在すること
を除き、他に合理的な不妊の原因は発見されなかった。
不妊の３９歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の精子不動化及び精子凝集抗体か存在すること
を除き、他に合理的な不妊の原因は発見されなかった。
彼女の血清中の抗体力価は、精子不動化値かＳ Ｉ ５
．とじて４５．０ （礒島と香山、 ＱｕａｎＬｉｔａ
ｔｉｖｅ ｅｓｔｉ＋５ａｔｉｏｎｏｆ ｓｐｅｒ
ｍ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｒ＋Ｌｉｂｏｄ
ｙ ｉｎ ｔｈｅ ５ｅｒａｏｆ ｗｏｍａｎ
ｗｉｔｈ ５ｔｅｒｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ
ｅｔｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ５０％ ｓｐｅｒｍ ｉ
ｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ （Ｓ１５ｏ）
。
．とじて４５．０ （礒島と香山、 ＱｕａｎＬｉｔａ
ｔｉｖｅ ｅｓｔｉ＋５ａｔｉｏｎｏｆ ｓｐｅｒ
ｍ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｒ＋Ｌｉｂｏｄ
ｙ ｉｎ ｔｈｅ ５ｅｒａｏｆ ｗｏｍａｎ
ｗｉｔｈ ５ｔｅｒｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ
ｅｔｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ５０％ ｓｐｅｒｍ ｉ
ｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ （Ｓ１５ｏ）
。
Ｉｎ Ｒｅｃｅｎｔ 八ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
ｔｌｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｃａｍ
ｐｏｓ ｄａＰａｚ、、 Ａ、、 Ｄｒｉｌｌ、 Ｖ、
Ａ、、 １ｌｙａｓｈｉ。
ｔｌｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｃａｍ
ｐｏｓ ｄａＰａｚ、、 Ａ、、 Ｄｒｉｌｌ、 Ｖ、
Ａ、、 １ｌｙａｓｈｉ。
１１、、Ｒｅｄｒｉｇｕｅｓ、Ｗ、 ａｎｄ ５ｃ
ｈａｌｌｙ、 Ａ、Ｖ、 ｅｄｓ）。
ｈａｌｌｙ、 Ａ、Ｖ、 ｅｄｓ）。
ｐｐｌＯ−１５，ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄｉｃａ、 Ａ
ｍｓｔｅｒｄａｍ； １９７６）、精子凝集値か１＝３
２希釈（Ｆｒｉｂｅｒｇ、 Ｊ、 （＋９７４）。
ｍｓｔｅｒｄａｍ； １９７６）、精子凝集値か１＝３
２希釈（Ｆｒｉｂｅｒｇ、 Ｊ、 （＋９７４）。
八ｓｉｍｐｌｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｉｃｒｏ＋
ｉｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｓｐｅｒｍ−ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇａｃｔ
ｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍｉｎｆｅｒｔ
ｉｌｅ ＠ｅｎ ａｎｄｗｏｍｅｎ、 Ａｃｔａ ０
ｂｓｔｅＬ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、 ５ｃａｎｄ、 ５ｕｐ
ｐｌ。
ｉｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｓｐｅｒｍ−ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇａｃｔ
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ｉｌｅ ＠ｅｎ ａｎｄｗｏｍｅｎ、 Ａｃｔａ ０
ｂｓｔｅＬ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、 ５ｃａｎｄ、 ５ｕｐ
ｐｌ。
３６：２ｌ−２９）であった。末梢血リンパ球は、フイ
コールーコンレー密度勾配遠心により単離した。
コールーコンレー密度勾配遠心により単離した。
リンパ球の刺激
ＰＷＭレクチン（終濃度１：１００．米国ギブコ社製）
と１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）とを含む１５ｍ１のＲ
ＰＭＩ １６４０培地に、採取したリンパ球１．Ｏｘ
１０’個と、健常人からの洗詐した精子５ ｘ ＩＧ’
個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート（米
国コーニング社製、コーニング−２５８２０）の１５の
ウェルに分注し、５１ ＧＯ２インキュベーター中で３
７°Ｃて５日間培養した。培養後、個々のウェルから採
取された刺激されたリンパ球をプールし、２回洗い、１
０ｍ１のＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁した。
と１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）とを含む１５ｍ１のＲ
ＰＭＩ １６４０培地に、採取したリンパ球１．Ｏｘ
１０’個と、健常人からの洗詐した精子５ ｘ ＩＧ’
個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート（米
国コーニング社製、コーニング−２５８２０）の１５の
ウェルに分注し、５１ ＧＯ２インキュベーター中で３
７°Ｃて５日間培養した。培養後、個々のウェルから採
取された刺激されたリンパ球をプールし、２回洗い、１
０ｍ１のＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁した。
この刺激操作後、トリパンブルー染色法により調べたと
ころ、５８％のリンパ球が生存していた。
ころ、５８％のリンパ球が生存していた。
細胞融合
繁田らの方法（Ｓｐｅｒｍ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ
ｉ＋ｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ
ｈｕｍａｎ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ
ａｎｔｉｇｅｎｓ。
ｉ＋ｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ
ｈｕｍａｎ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ
ａｎｔｉｇｅｎｓ。
Ｃｌ１ｎ、 Ｅｘｐ、 １ｍ５ｕｎｏ１．４２：４５
８−４６２ （１９８０））に従い、分子量１ｏｏｏの
ポリエチレングリコールの存在下て、先に得られた刺激
された生きているリンパ球５．３ ｘ Ｉｎ’個と、同
数のマウスミエローマ細胞（Ｐ：１−Ｎ５−１／１．Ａ
ｇ、 ４： Ｎ５−１）とを融合した。ｌＯ口ｐｉの融
合細胞を９６個のウェルのそれぞれに入れ、ｓｚ ｃｏ
、インキュベーター中て３７℃て培養した。９６個のウ
ェルのうち２７個にはウェル当たり１ ｘ １０’個の
リンパ球のみを収容し、他の６９個のウェルにはウェル
当たり４ ｘ １０’個のリンパ球と、支持細胞層とし
て６ ｘ １０’個のマウス胸腺細胞を収容した。培養
２−４時間後に培地なＨＡＴ選択培地に変え、培養１２
．１９．及び２３０後に個々のウェルの上清を後述する
サンドイッチ酵素免疫分析法により試験してヒト免疫グ
ロブリンを産生じているかどうか調べた。培養２３日後
では、支持細胞層を用いない２７ウエルのうち１４ウエ
ルで、支持細胞層を用いた６９ウエルのうち ′４４
ウェルて細胞の増殖が認められた。
８−４６２ （１９８０））に従い、分子量１ｏｏｏの
ポリエチレングリコールの存在下て、先に得られた刺激
された生きているリンパ球５．３ ｘ Ｉｎ’個と、同
数のマウスミエローマ細胞（Ｐ：１−Ｎ５−１／１．Ａ
ｇ、 ４： Ｎ５−１）とを融合した。ｌＯ口ｐｉの融
合細胞を９６個のウェルのそれぞれに入れ、ｓｚ ｃｏ
、インキュベーター中て３７℃て培養した。９６個のウ
ェルのうち２７個にはウェル当たり１ ｘ １０’個の
リンパ球のみを収容し、他の６９個のウェルにはウェル
当たり４ ｘ １０’個のリンパ球と、支持細胞層とし
て６ ｘ １０’個のマウス胸腺細胞を収容した。培養
２−４時間後に培地なＨＡＴ選択培地に変え、培養１２
．１９．及び２３０後に個々のウェルの上清を後述する
サンドイッチ酵素免疫分析法により試験してヒト免疫グ
ロブリンを産生じているかどうか調べた。培養２３日後
では、支持細胞層を用いない２７ウエルのうち１４ウエ
ルで、支持細胞層を用いた６９ウエルのうち ′４４
ウェルて細胞の増殖が認められた。
酵素免疫分析によるヒト免疫グロブリンの検出サンドイ
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった。ポリビニルプレート（
米国、）・アルコ：／ −３９１２）１７） ９ ’６
個（’） ウｘ ルを、０．０５Ｍ 重ｉ５ｅ Ｍｉ
’ｉａ 衝液（ｐＨ９，６）中ウサギ抗ヒト免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ ＋１ｇＡ÷ＩｇＭ）抗血清ＩｇＧ分画
（タンパク濃度０．８μｇ／１００ ｐＬｌ／ウェル）
でコーティングし、４℃で一夜培養した。プレートの未
結合領域は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と５％正
常ウマ血清とを含む０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
４） （ブロッキング溶液）をウェルに入れて室温で
１時間インキュベートすることによってブロックした。
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった。ポリビニルプレート（
米国、）・アルコ：／ −３９１２）１７） ９ ’６
個（’） ウｘ ルを、０．０５Ｍ 重ｉ５ｅ Ｍｉ
’ｉａ 衝液（ｐＨ９，６）中ウサギ抗ヒト免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ ＋１ｇＡ÷ＩｇＭ）抗血清ＩｇＧ分画
（タンパク濃度０．８μｇ／１００ ｐＬｌ／ウェル）
でコーティングし、４℃で一夜培養した。プレートの未
結合領域は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と５％正
常ウマ血清とを含む０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
４） （ブロッキング溶液）をウェルに入れて室温で
１時間インキュベートすることによってブロックした。
０．０５ＸのＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液でウェ
ルを洗った後、５０ル１の培養上清を加え、室温で２時
間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清から作られ
た巨ａｂ’ ）２をパーオキシダーゼて標識したものを
ブロッキング溶液でＩ：４０００に希釈したもの５（１
＃Ｌ＋をウェルに加えた。室温て１時間インキュベート
した後プレートを洗い、０．００５２ ）１２０ｔを含
ム［］、ＩＭクエン酸Ｍ衝液（ｐｔ＋５．０）中オルソ
フェニレンジアミン（和光紬薬工業社製）を終濃度ｏ、
ｏｚｘとなるように加えた。反応は５０μＩの１０＄Ｈ
□ＳＯ４を加えることによって停止し、マイクロプレー
ト光度計（ＭＴＰ １２．コロナ電機社製）で測定した
。その結果、増殖か認められた上記５８ウエルのうち、
２２ウエルからヒト免疫グロブリンか検出された。
ルを洗った後、５０ル１の培養上清を加え、室温で２時
間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清から作られ
た巨ａｂ’ ）２をパーオキシダーゼて標識したものを
ブロッキング溶液でＩ：４０００に希釈したもの５（１
＃Ｌ＋をウェルに加えた。室温て１時間インキュベート
した後プレートを洗い、０．００５２ ）１２０ｔを含
ム［］、ＩＭクエン酸Ｍ衝液（ｐｔ＋５．０）中オルソ
フェニレンジアミン（和光紬薬工業社製）を終濃度ｏ、
ｏｚｘとなるように加えた。反応は５０μＩの１０＄Ｈ
□ＳＯ４を加えることによって停止し、マイクロプレー
ト光度計（ＭＴＰ １２．コロナ電機社製）で測定した
。その結果、増殖か認められた上記５８ウエルのうち、
２２ウエルからヒト免疫グロブリンか検出された。
酵素免疫分析による抗精子抗体の検出
９６ウエルのポリビニルプレート（ファルコンー：１９
１２）を洗浄したヒト精子でコーチインクした。コーチ
インクは、５０座１の精子懸濁液（６ｘ１０’／ｍｌ）
を個々のウェルに加え、室温で空気乾燥することによっ
て行なうた。プレートは使用時まで４°Ｃて貯蔵した。
１２）を洗浄したヒト精子でコーチインクした。コーチ
インクは、５０座１の精子懸濁液（６ｘ１０’／ｍｌ）
を個々のウェルに加え、室温で空気乾燥することによっ
て行なうた。プレートは使用時まで４°Ｃて貯蔵した。
１２ ＢＳＡと２ｚ正常ウマ血清とを含むリン酸緩衝液
を個々のウェルに加え、室温で１時間保持してウェルの
タンパク結合領域をフロックした。リン酸緩衝液で洗っ
た後、５０井１の培養上清を精子てコートされたウェル
に加え、室温て１時間インキュベートした。その後、先
に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして抗ヒト
精子抗体を検出した。その結果、ヒト免疫クロプリンか
検出された２２ウエルのうちｌっのウェルから抗ヒト精
子抗体か検出された。
を個々のウェルに加え、室温で１時間保持してウェルの
タンパク結合領域をフロックした。リン酸緩衝液で洗っ
た後、５０井１の培養上清を精子てコートされたウェル
に加え、室温て１時間インキュベートした。その後、先
に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして抗ヒト
精子抗体を検出した。その結果、ヒト免疫クロプリンか
検出された２２ウエルのうちｌっのウェルから抗ヒト精
子抗体か検出された。
抗ヒト精子抗体産生細胞のクローニンク抗ヒト精子抗体
か検出されたウェル中のハイブリトーマを、１５％ Ｆ
ｅ２を含むＲＰＭＩ １６４０培地中て６ ｘ １０’
／ウエルのマウス胸腺細胞と共に３７°Ｃてｓｚ ｃｏ
□インキュベート中で培養した。培養は、９６ウエルコ
ーニンクプラスチツクプレートの第１列の８つのウェル
に約１ ｘ １０’ハイブリドーマ／ウエルの濃度に上
記培養液を入れ、１列ごとにｌ：２に段階希釈して行な
った。従って最後の列は１：２０に希釈された。培養１
７日後、９６ウエルのうち４つのウェルで細胞の増殖が
認められ、そのうちの２つで強い抗ヒト精子抗体か検出
された。そのうちの１つのウェルからハイブリドーマを
採取し、先に行なったのと全く同様にして第２回目のク
ローニングを行なった。その結果、９６のウェルのうち
４６のウェルて細胞の増殖が認められ、そのうちの４２
のウェルで抗ヒト精子抗体の産生か認められた。４２の
ウェルのうち、抗ヒト精子抗体価の最も高かったウェ、
ルからハイブリトーマを採取し、第３回目のクローニン
グを同様にして行なった。その結果、９６のウェルのう
ち５６のウェルて細胞の増殖が認められ、５６のウェル
の全てて強い抗ヒト精子抗体か検出された。これらのウ
ェルのうちの１つを取り、以下の実験に用いた。
か検出されたウェル中のハイブリトーマを、１５％ Ｆ
ｅ２を含むＲＰＭＩ １６４０培地中て６ ｘ １０’
／ウエルのマウス胸腺細胞と共に３７°Ｃてｓｚ ｃｏ
□インキュベート中で培養した。培養は、９６ウエルコ
ーニンクプラスチツクプレートの第１列の８つのウェル
に約１ ｘ １０’ハイブリドーマ／ウエルの濃度に上
記培養液を入れ、１列ごとにｌ：２に段階希釈して行な
った。従って最後の列は１：２０に希釈された。培養１
７日後、９６ウエルのうち４つのウェルで細胞の増殖が
認められ、そのうちの２つで強い抗ヒト精子抗体か検出
された。そのうちの１つのウェルからハイブリドーマを
採取し、先に行なったのと全く同様にして第２回目のク
ローニングを行なった。その結果、９６のウェルのうち
４６のウェルて細胞の増殖が認められ、そのうちの４２
のウェルで抗ヒト精子抗体の産生か認められた。４２の
ウェルのうち、抗ヒト精子抗体価の最も高かったウェ、
ルからハイブリトーマを採取し、第３回目のクローニン
グを同様にして行なった。その結果、９６のウェルのう
ち５６のウェルて細胞の増殖が認められ、５６のウェル
の全てて強い抗ヒト精子抗体か検出された。これらのウ
ェルのうちの１つを取り、以下の実験に用いた。
このハイツリトーマを２４ウエルのプラスチックプレー
ト（コーニング−２５８２０）に移し３７°Ｃで５！
Ｃｏ２インキュベート中て培養した。細胞か増殖した後
、培養物を組織培養フラスコ（コーニング−２５１００
と２５１１０）に広げて培養した。この培養物からヒト
精子不動化ヒト単一クローン抗体を採取した。
ト（コーニング−２５８２０）に移し３７°Ｃで５！
Ｃｏ２インキュベート中て培養した。細胞か増殖した後
、培養物を組織培養フラスコ（コーニング−２５１００
と２５１１０）に広げて培養した。この培養物からヒト
精子不動化ヒト単一クローン抗体を採取した。
抗体吸収試験
このヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体の特異性を調
べるために抗体吸収試験を行なった。
べるために抗体吸収試験を行なった。
抗体吸収試験は、種々の組織抽出液（ホモジネート上清
）１体液、種々の動物の精子を免疫吸収体として用いて
このハイブリドーマの培養上清を吸収し、残遊する抗体
活性を精子不動化試験により求めることによって行なっ
た。正常ヒト血清の１０ｚ生理食塩水溶液で適当に希釈
した培養上清１゜井１を、１００ルＩの段階希釈した免
疫吸収体と混合し、この混合物を４°Ｃで一夜インキユ
ベートした。試験の前に予め培養上清の抗体活性をＳｌ
、。値で約１０単位に調節した。インキュベート後、上
清を遠心分離しく９５００ｇ、 １０分）、精子不動化
値を調べた。ヒト精液（ＲＡＳ） 、ヒト母乳（ＩＩＭ
）及び正常ヒト血清（ＮＨ３）は硫酸アンモニウムで沈
殿させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。
）１体液、種々の動物の精子を免疫吸収体として用いて
このハイブリドーマの培養上清を吸収し、残遊する抗体
活性を精子不動化試験により求めることによって行なっ
た。正常ヒト血清の１０ｚ生理食塩水溶液で適当に希釈
した培養上清１゜井１を、１００ルＩの段階希釈した免
疫吸収体と混合し、この混合物を４°Ｃで一夜インキユ
ベートした。試験の前に予め培養上清の抗体活性をＳｌ
、。値で約１０単位に調節した。インキュベート後、上
清を遠心分離しく９５００ｇ、 １０分）、精子不動化
値を調べた。ヒト精液（ＲＡＳ） 、ヒト母乳（ＩＩＭ
）及び正常ヒト血清（ＮＨ３）は硫酸アンモニウムで沈
殿させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。
精嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結
乾燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水
に溶解した。動物の精子は３回生理食塩水で洗った後免
疫吸収試験に用いた。結果を第１表に示す。
乾燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水
に溶解した。動物の精子は３回生理食塩水で洗った後免
疫吸収試験に用いた。結果を第１表に示す。
第 １ 表
＋１６−：ｌｃ４単一クローン抗体の特性免疫グロブリ
ンクラス ＩｇＭ（入）生物学的活性 精子不動化 ＋ （５０００５１５ｏ）精子
凝集 ＋ （１：１６０Ｇ希釈）ヒト組織
に対する特異性 射精精子 十 精液 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク賀 − 事大 − 精巣上体 定かてない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 − Ｂ型赤血球 − 白血球 − 無精子症患者精漿 十 精嚢腺分泌液 十 これらの結果から、上記ヒト精子不動化ヒト単一クロー
ン抗体の対応抗原は、男性副性器より分泌され精子に付
着するいわゆる精子被着抗原（ｓｐｅｒｍ ｃｏａｔｉ
ｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）であると判定される。
ンクラス ＩｇＭ（入）生物学的活性 精子不動化 ＋ （５０００５１５ｏ）精子
凝集 ＋ （１：１６０Ｇ希釈）ヒト組織
に対する特異性 射精精子 十 精液 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク賀 − 事大 − 精巣上体 定かてない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 − Ｂ型赤血球 − 白血球 − 無精子症患者精漿 十 精嚢腺分泌液 十 これらの結果から、上記ヒト精子不動化ヒト単一クロー
ン抗体の対応抗原は、男性副性器より分泌され精子に付
着するいわゆる精子被着抗原（ｓｐｅｒｍ ｃｏａｔｉ
ｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）であると判定される。
また、上記単一クローン抗体の種特異性（精子に対する
反応性）は以下の通りである。
反応性）は以下の通りである。
ブタ 士
ウシ −
ヤギ −
ウサギ −
ハムスター −
ラット −
＋１．ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体の対応抗原
の調製 ゛ヒト精漿及びトリプ
シン処理したヒト精漿をセファクリルＳ−：１００
（商品名）によるゲルろ過クロマトグラフィーに架けた
。ゲルろ過クロマトグラフィーは、カラムサイズ１．５
ｘ ９０ｃｍのカラムを用い、溶出液としてリン酸緩
衝液（ｐｌ−１７，４）を用い、溶出液の流速を１０１
／時間として行ない、２ｍｌ／試験管づつ分画を集めた
。試料として、ヒト精漿（飽和硫安沈殿分画）１０■ｇ
／■ｌ、又はこれにトリプシン（１醜ｇ／ｓｌ）を加え
、３７℃１時間反応させたものを用い、それぞれ１１を
クロマトグラフィーに架けた。このゲルろ過クロマトグ
ラフィーにより得られた各分画について、上記ヒト精子
不動化ヒト単一クローン抗体を免疫吸着体として用い、
ヒト精子との競合を利用した酵素免疫分析を行なった。
の調製 ゛ヒト精漿及びトリプ
シン処理したヒト精漿をセファクリルＳ−：１００
（商品名）によるゲルろ過クロマトグラフィーに架けた
。ゲルろ過クロマトグラフィーは、カラムサイズ１．５
ｘ ９０ｃｍのカラムを用い、溶出液としてリン酸緩
衝液（ｐｌ−１７，４）を用い、溶出液の流速を１０１
／時間として行ない、２ｍｌ／試験管づつ分画を集めた
。試料として、ヒト精漿（飽和硫安沈殿分画）１０■ｇ
／■ｌ、又はこれにトリプシン（１醜ｇ／ｓｌ）を加え
、３７℃１時間反応させたものを用い、それぞれ１１を
クロマトグラフィーに架けた。このゲルろ過クロマトグ
ラフィーにより得られた各分画について、上記ヒト精子
不動化ヒト単一クローン抗体を免疫吸着体として用い、
ヒト精子との競合を利用した酵素免疫分析を行なった。
この酵素免疫分析はヒト洗浄精子（３×Ｉｎ’ ／ウェ
ル）をコートしたプレートを用いて行なった。ブロック
した後、２０倍希釈したバイプリドーマ培養上清（５０
ｇｌ／ウェル）とゲルろ過各分画（５０，１／ウエル）
を加え、４℃−夜反応させた。その後は酵素免疫分析に
よる抗精子抗体の検出に述べた方法で行なった。
ル）をコートしたプレートを用いて行なった。ブロック
した後、２０倍希釈したバイプリドーマ培養上清（５０
ｇｌ／ウェル）とゲルろ過各分画（５０，１／ウエル）
を加え、４℃−夜反応させた。その後は酵素免疫分析に
よる抗精子抗体の検出に述べた方法で行なった。
この酵素免疫分析の結果を第１図に示す。第１図中、三
角及び黒三角はヒト精漿についての結果を、丸及び黒丸
はトリプシン処理したヒト精漿についての結果を示す。
角及び黒三角はヒト精漿についての結果を、丸及び黒丸
はトリプシン処理したヒト精漿についての結果を示す。
第１図に示されるように、ヒト精子不動化ヒト単一クロ
ーン抗体との結合がヒト精子により阻害される分画、す
なわち。
ーン抗体との結合がヒト精子により阻害される分画、す
なわち。
この抗体に対する抗原活性を有する分画は分子量約４４
万以上の高分子分画であることがわかった。
万以上の高分子分画であることがわかった。
この分子量約４４万以上の高分子分画（ヒト精漿）を次
にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に架け、さら
に上記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体を免疫吸看
体として用いたウェスタンブロッティング法を行なった
。これらは以下のようにして行なった。Ｌａｅｍ＋ｗｉ
ｉ らの方法によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行なった。ｌレーン当たり、ゲルろ過クロマトグ
ラフィーの最初のピーク（抗原分画）を５７．ｇ（タン
パク質量）架けた。ゲルは１４％ゲルを用いた。ウェス
タンフロッテインクは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓｔｌｃｌ（
ｐ１１８．］）−１９２＋ｓＭグリシン／２（］１％メ
タノ−を用い、６０ボルト２時間通電して行なった。ニ
トロセルロース上の抗原検出には、無血清培地からゲル
ろ過により精製したＩｇＭ分画をビオチンでラベルした
ヒト型精子不動化単一クローン抗体を用い、アビジン−
ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ＶＥＣ丁ＡＳＴＡ
！Ｎ）、 次イテ０．０５＄ ４−’ｙ口ａｉ−＋７ト
ールと（１，０１＄Ｈ２０□−ＴＢＳを反応させた。（
ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｌＨ：ｌ−２００ｍＭ
ＮａＣ１ｐＨ７，４）を反応させた。その結果、前記ヒ
ト精子不動化ヒト単一クローン抗体に特異的に結合する
分子量約２万の分子かＩ′ｌｉ離された。
にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に架け、さら
に上記ヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体を免疫吸看
体として用いたウェスタンブロッティング法を行なった
。これらは以下のようにして行なった。Ｌａｅｍ＋ｗｉ
ｉ らの方法によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行なった。ｌレーン当たり、ゲルろ過クロマトグ
ラフィーの最初のピーク（抗原分画）を５７．ｇ（タン
パク質量）架けた。ゲルは１４％ゲルを用いた。ウェス
タンフロッテインクは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓｔｌｃｌ（
ｐ１１８．］）−１９２＋ｓＭグリシン／２（］１％メ
タノ−を用い、６０ボルト２時間通電して行なった。ニ
トロセルロース上の抗原検出には、無血清培地からゲル
ろ過により精製したＩｇＭ分画をビオチンでラベルした
ヒト型精子不動化単一クローン抗体を用い、アビジン−
ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ＶＥＣ丁ＡＳＴＡ
！Ｎ）、 次イテ０．０５＄ ４−’ｙ口ａｉ−＋７ト
ールと（１，０１＄Ｈ２０□−ＴＢＳを反応させた。（
ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｌＨ：ｌ−２００ｍＭ
ＮａＣ１ｐＨ７，４）を反応させた。その結果、前記ヒ
ト精子不動化ヒト単一クローン抗体に特異的に結合する
分子量約２万の分子かＩ′ｌｉ離された。
以上の結果より、ヒト精子不動化ヒト抗体に対応するこ
の発明の抗原は、その分子−１が約２万であり、精漿中
ては分子量約４４万以上の高分子となつて存在すること
か明らかとなった。
の発明の抗原は、その分子−１が約２万であり、精漿中
ては分子量約４４万以上の高分子となつて存在すること
か明らかとなった。
１１１、抗原の分析
上記抗原を含む精漿（ＩＢ／＋＊ｌ）について、第２表
に示す各処理を行なった。その後、前記と同様な酵素免
疫分析を行ない、その抗原活性の変化を調べた。結果を
同表に示す。さらに、各種酵素又は酸化剤による処理を
行なった際の酵素免疫分析の結果を第２図及び第３図に
示す。第２図中、黒丸は対照（リン酸緩衝液）、黒三角
はプロナーゼ（商品名）、白丸はトリプリジン、白三角
はグリコシダーゼによる処理を行なった場合の結果をそ
れぞれ示す。第３図中、白丸は対照（リン酸緩衝液）、
黒丸は過ヨウ素酸による処理を行なった場合の結果を示
す。
に示す各処理を行なった。その後、前記と同様な酵素免
疫分析を行ない、その抗原活性の変化を調べた。結果を
同表に示す。さらに、各種酵素又は酸化剤による処理を
行なった際の酵素免疫分析の結果を第２図及び第３図に
示す。第２図中、黒丸は対照（リン酸緩衝液）、黒三角
はプロナーゼ（商品名）、白丸はトリプリジン、白三角
はグリコシダーゼによる処理を行なった場合の結果をそ
れぞれ示す。第３図中、白丸は対照（リン酸緩衝液）、
黒丸は過ヨウ素酸による処理を行なった場合の結果を示
す。
第２表
上記結果かられかるように、この発明の抗原は、プロナ
ーゼ（商品名）てその抗原活性か減少し、混合グリコシ
ダーゼでは変化せず、また、第１図に示されるように２
８ｏｎ鵬に吸収を有することから糖タンパク質であると
考えられる。
ーゼ（商品名）てその抗原活性か減少し、混合グリコシ
ダーゼでは変化せず、また、第１図に示されるように２
８ｏｎ鵬に吸収を有することから糖タンパク質であると
考えられる。
第１図は、ヒト精漿及びトリプシン処理ヒト精漿のゲル
ろ過クロマトグラフィー及び酵素免疫分析の結果を示す
クラブ、 第２図及び第３図は、この発明の抗原を各種処理した場
合の抗原活性の変化を示すグラフである。
ろ過クロマトグラフィー及び酵素免疫分析の結果を示す
クラブ、 第２図及び第３図は、この発明の抗原を各種処理した場
合の抗原活性の変化を示すグラフである。
Claims (2)
- （１）男性副性器から分泌され、精子に付着する精子被
覆抗原であって、その分子量が約２００００であり、精
漿中では分子量約４４００００以上の高分子として存在
し、アルカリ処理、熱処理、酸化処理又はストレプトマ
イセス・グリセウスによって生産されるプロテアーゼ混
合物での処理によりその抗原活性が減少し、酸処理、還
元処理、トリプシン処理、混合グリコシダーゼ処理によ
りその抗原活性が実質的に変化しない、ヒト精子不動化
抗体の産生を誘起することができる抗原。 - （２）前記ヒト精子不動化抗体は、精子不動化抗体を保
有する不妊婦人のリンパ球とマウスミエローマ細胞とを
融合させて得られるハイブリドーマによって産生され、
λ鎖を有するヒト免疫グロブリンＭに属し、精子不動化
値がＳｉ＿５＿０として約５０００以上であり、精子凝
集値が約１：１６００希釈以上であり、ヒト射精精子、
精漿及び精嚢に対して特異的に反応し、ヒト母乳、ヒト
血清、ヒト睾丸抽出液、ヒト肝臓抽出液、ヒト脾臓抽出
液、ヒト脳抽出液、Ｂ型ヒト赤血球、ヒト白血球とは反
応せず、ブタ射精精子とは弱い交差反応性を示すがウシ
射精精子、ヤギ射精精子、ウサギ射精精子、ハムスター
精巣上体精子及びラット精巣上体精子とは反応しないヒ
ト精子不動化ヒト単一クローン抗体である特許請求の範
囲第１項記載の抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61246250A JP2534480B2 (ja) | 1986-10-16 | 1986-10-16 | ヒト精子不動化抗体の対応抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61246250A JP2534480B2 (ja) | 1986-10-16 | 1986-10-16 | ヒト精子不動化抗体の対応抗原 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63101331A true JPS63101331A (ja) | 1988-05-06 |
| JP2534480B2 JP2534480B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=17145732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61246250A Expired - Lifetime JP2534480B2 (ja) | 1986-10-16 | 1986-10-16 | ヒト精子不動化抗体の対応抗原 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2534480B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045519A (ja) * | 1983-06-29 | 1985-03-12 | イステイチユト フアルマコロジコ セロノ ソチエタ ペル アツイオニ | 精液抗原画分及びその製造方法 |
-
1986
- 1986-10-16 JP JP61246250A patent/JP2534480B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045519A (ja) * | 1983-06-29 | 1985-03-12 | イステイチユト フアルマコロジコ セロノ ソチエタ ペル アツイオニ | 精液抗原画分及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2534480B2 (ja) | 1996-09-18 |
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