JPS63101395A - Ｒｎａまたはｄｎａ配列とタンパク質との新規な結合複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列とタンパク質との
新規な結合複合体、その製造方法、およびその生物学的
用途特に抗ウイルス用途に係る。

メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）またはその成熟
に至る過程の中間体から適切に選択した領域と相補的な
オリゴヌクレオチド配列（一連のリゲヌクレオチドまた
はデオキシヌクレオチド）が相補塩基の対合形成によっ
て上記ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、した
がって当該ｍＲＮＡの発現を阻止することができるとい
うことは公知である。

そのような配列は「アンチセンス」配列とよばれている
（ＧＲＥＫＮ＋　Ｐ、Ｊ、、ＰＩＮＥＳ、０１ａｎｄ　
ｌＮ０ＵＹＥ。

Ｍ、（１９８６）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　５５　、５６９−５９７；　ＩＺＡＮＴ、　Ｊ
、Ｇ、　ａｎｄ　ＷＥＩＮＴＲＡＵＢ、　Ｈ，（１９８
４）。

Ｃｅ１ｌ　３Ｌ　１００７　１０１５　）。

これらアンチセンス配列は、トランスフェクションの技
術（ＣＯＬＥＭＡＮ、　Ｊ、　、　ＧＲＥＥＮ、　Ｐ、
Ｊ、　ａｎｄＩＮＯＴＪＹ”ＥＴ　　Ｍ、（１９８４）
　、Ｃｅｌ　１．３７−４２９−４３６　：ＩＺ）ＪＺ
Ｔｅ　Ｊ　−Ｇ　−ａ　ｎ　ｄ　細ＩＮＴＲＡＵＢ　＊
　Ｈ−（１９８５）　。

５ｃ１ｓｎｃ＊　　２２９，３４５−３５２）またはマ
イクロインジェクション（微小注入）　（ＩＺＡＮＴ、
　Ｊ、Ｇ。

ＩＬｎ　ｄ　ｗＥＩＮＴＲＡＵＢ−Ｈ９（１９８４）　
、Ｃｓ　１１３６　＊１００７−１０１５　：　ＭＥＬ
ＴＯＮ、　Ｄ、Ａ、（１９８５）、　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８２．　
１４４−１４８　：ＫＡＷＡＳＡＫＩ、　Ｅ、Ｓ、　（
１９８５）、　Ｎｕｅｌｓｌｃ　Ａｃ１ｄｓＲａｓ、　
１３　、４９９１−５００４）によって完全な細胞中に
導入された組換えプラスミド上で穏々のプロモーターか
ら逆の方向に沿って挿入配列が転写されて生成した。

やや違ったアプローチをとって非イオン性のオリゴヌク
レオチドメチルホスホネートアナログ（類似体）が合成
されたが、これらのアナログは核酸分解（ｄｅ’ｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ　ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｌｑｕｅ）に対する
抵抗性が増大しておシ、培養細胞の原形質膜に侵入し、
一方これらと相補的なりＮＡ配列またはＲＮＡ配列と特
異的にハイブリダイズする能力は維持される（　ＴＳ’
Ｏ，Ｐ、　Ｏ，Ｐ、　、　ＭＩＬＬＥＲ，Ｐ、　ｌｉｉ
、　　ａｎｄＧＲＥＥＮＥ、　Ｊ、　Ｊ、　（１９８３
）　ｌ！Ｉ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｓｎｔ　ｏｆＴａｒｇｅ
ｔ−Ｏｒｉ＠ｎｔ＠ｄ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕ
ｇｓ、　ａｄｓ。

Ｃｈｅｎｇ、　Ｙ、Ｃ，、ａｔ　ａｔ、　（Ｒａｖｓｎ
　Ｐｒ＋ｅｓｓｙ　Ｎｅｖ−Ｙｏｒｋ）＊　Ｐｌ＋−１
８９−２０６：　ＭＩＬＬＥＲ，Ｐ、Ｓ、。

ＡＧＲＩＳ、　Ｃ，）Ｉ、　ＡＵＲＥＬＩＡＮ、　Ｌ、
、　ＢＬＡｊに、　Ｋ、Ｒ，。

ＭＵＲＡＰｃＡＭＩ、　Ａ、、　ＲＥＤＤＹ、　Ｍ、Ｐ
、、　５ＰＩＴＺ、　ｌ１１．Ａ。

ａｎｄ　ＴＳ’Ｏ，Ｐ、Ｏ，Ｐ、（１９８５）、　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍｉｅ　６７゜７６９−７７６）。

これらの複合体はウィルス阻止に対してインビトロで活
性であることが明らかにされているが、これは約１００
マイクロモルという程度（１５０μｍｏｌｅまたは７５
μｍｏｌ・）の濃度のときのことでアシ、治療に用いよ
うとするには濃度が高過ぎると思われる。さらに、この
方法によって取シ込まれる（インターナリゼーション）
オリゴヌクレオチドは小さい（ヌクレオチド単位１０個
以下）ので認Ｗ＆特異性とハイブリダイゼーションの安
定性は低い。

また、アクリジンと結合したオリゴデオキシヌクレオチ
ドを用いて細胞抽出物中でウィルス遺伝子の発現を抑え
る研究も行なわれている（　ＴＯＵＬＭＥＪ、Ｊ、、　
ＫＲＩＳＣＨ，Ｈ，に、　ＬＯＲＥＡＵ、　Ｎ、、　Ｔ
ＨＵＯＮＧ。

Ｎ、Ｔ、　　ａｎｄ　ＨＥＬＥＮＥ、　（１９８６）、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８３．１２２７−１
２３１　：）ＩＥＬＩＮＥ、　Ｃ，、ＭＯＮＴＥＲＡＹ
−ＧＡＲＥＳＴＩＥＲ，Ｔ、。

５ＡＩＳＯＮ、　’ｒ、、　ＴＡＫＡＳＵ（、Ｉ、　Ｍ
、、　’ＦＯＵＬ匹、　、Ｔ、Ｊ、。

ＡＳ８ＥＬＩＮ’Ｅ、　Ｖ、、　ＬＡＮＣＥＬＯＴ、　
Ｇ、、　ＭＡＵＲＩＺＯＴ。

Ｊ、Ｃ，、ＴＯＵＩ、ＭＥ、　Ｆ、　ａｎｄ　ＴＨＵＯ
ＮＧ、　Ｎ、Ｔ。

（１９８５）、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ＠６７、　７７７−
７８３）。

しかしこれらの複合体はインビトロで約１００マイクロ
モル程度の濃度で活性であることが明らかになっている
が、これはやはシ治療用途に対しては高過ぎると思われ
る。複合体化されたオリゴヌクレオチド配列が取シ込ま
れる（ｉｎｔ・ｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）効率に関する
資料はない。

さらに、挿入（インターカレーション）化合物であるこ
れらの複合体は不安定化（ｄｏｓｔａｂｉｌｌｓａｔｉ
ｏ＋ｘ）の場合に変異誘発の危険を伴ない得る。

また、ヌクレオチドの５′末端のリン酸の所でＤＮＡ配
列を修飾したオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドの
共有結合体が、さらにアミン、ペグチドおよびタンパク
質の間の共有結合体が既に合成されている。

プラスミドＤＮＡをカルがジイミドで処理して行なった
実数の結果、核酸部分にもたらされた修飾では当該プラ
スミドのカナマイシン耐性は影響を受けないということ
が示された。しかし、これらの共有結合複合体の細胞内
への取シ込み（インターナリゼーション）に関する生物
学的実験は全く行なわれてなく、ましてそれらがもって
いるであろう生物学的特性、特に抗ウイルス性に関する
実験は何もない（ＢＡＲＢＡＲＡ　Ｃ，Ｆ、　ＣＨＵＳ
、　ＧＥＯＦＦＲＥＹＭ、ＷＡＨＬ　ａｎｄ　ＬＥＳＬ
ＩＥ　Ｅ、０ＲＧＥＬ　（１９８３）。

Ｎｌｌ＋！１＠ｌｌ！　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　
１１，６５１３）。

また、α２マクログロブリンをＤＮＡ配列に結合した複
合体も得られておシ、その際の使用方法は、このＤＮＡ
の末端に導入しておいた対合してないグアニン残基のと
ころで結合が起−こるようなものである。しかし、この
共有結合複合体の細胞内への取）込み（インターナリゼ
ーション）に関する生物学的実験は全く行なわれてなく
、ましてそれらがもっているであろう生物学的特性、特
に抗ウイルス性に関する実数は何もない（５ＨＥＵＥ−
ＹＡＮＮＣＨＥＮＧ、ＧＬＥＮＮ　Ｔ−ＭＥＲＬＩＮＯ
ａｎｄ　ＩＲＡ　Ｈ−ＰＡＳＴＡＮ、　（１９８３）、
　Ｎｕｃｌ＊ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ１１、
　６５９）。

別に、タンｚ４り質のカルがキシル基がら形成された第
四級アンモニウム塩とＤＮＡ配列のリン酸基との間で得
られる非共有結合性の複合体の製造に関する研究も行な
われている。しかし、取シ込み（インターナリゼーショ
ン）に関する生物学的実験は全く行なわれてなく、まし
てそれらの複合体がもっているであろう生物学的特性、
特に抗ウイルス性に関する実験は何もない（Ｂ、　Ｉｃ
ＫＥＴＴ。

）ＬＡＳＨＡ　ＧＯＲＤ）ＬＡＮ、　Ｒ，ＨＡＷＴＲＥ
Ｙ、　Ｎ、　ＭＯＯＤＬＥＹ。

Ｍ、　ＡＲＩＡＴＴＩ　ａｎｄ　Ａ、　ＨＡＷＴＲＥＹ
　（１９８６）　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　Ｐｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ　
３Ｌ　　ｎ”　８１ｐｐ、１２４９−１２５７）。

今日までに得られたＤＮＡ複合体はいずれも、これらの
複合体を向かわしめようとする標的細胞を認識せず、ま
た治療目的、特にウィルス性疾患の治療に有効な濃度で
標的細胞中に取シ込まれることもない。

本発明は標的細胞内に取シ込まれ得る、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列とタンパク質との新規な結合複合体（ｃｏｎｊ
ｕｇｕ≦ｄｏ　ｃｏｕｐ１ｍｇ＠）を提供することを目
的とする。

また本発明の別の目的は完全（ｉｎｔａｃｔ）細胞中で
アンチセンス配列を放出（解放）することが可能な新規
結合複合体を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、生物学的活性を維持したｔ
ｔ細胞内にインターナリゼーションによって取シ込まれ
る、すなわち細胞の原形質膜を有効に通過することがで
きる新規な結合複合体を提供することである。

本発明はその一面において、細胞内に取シ込まれること
ができ、アンチセンス配列を放出（ｄｅｌｌマｒｅｒ）
することができ、したがって遺伝子、特にウィルス遺伝
子の発現を抑制できる新規な結合複合体を提供する。

また別の一面において本発明は、標的細胞に取シ込まれ
ることができ、特定の遺伝子の発現を抑制することがで
き、場合によシ複合体の要素の一方によって標的細胞を
特異的に認識することができる新規な結合複合体を提供
する。

さらに別の一面では、細胞の膜表面の特定のしセプター
（受容体）と特異的に反応することができ、そのレセプ
ターを保持している細胞によって取シ込まれ、かつその
細胞内で生物学的活性を発揮することができる新規な結
合複合体が提供される。

最後に、本発明の一面では治療目的に適合する用量で抗
ウィルス活性を示し得る新規な結合複合体が提供される
。

以上の本発明のさまざまな面は以下の如き特徴を有する
新規な結合複合体によって達成される。

−その分子構造の一部は修飾されてない塩基からなるＤ
ＮＡ配列かＲＮＡ配列に対応しておシ、かつ。

この配列の最初のヌクレオシド単位はその５′炭素を介
していくつかのリン酸基に結合しているかまたは結合し
ておらず、これらリン酸基のリンにのみ結合しておシリ
ン酸基間の結合に関与していない酸素原子の少なくとも
１個はイオン原子で置換されていてもよく、および／ま
たは、 −隣接する２個のリン酸基間の結合のうちの少なくとも
１つはイオウ原子、■基、ＣＦ２基またはＣＨ２基を含
むことができ、および／または、−ＤＮＡ配列かＲＮＡ
配列の最初のヌクレオシド単位に結合している最後のリ
ン酸基の結合はイオウ原子、Ｍ基、ＣＦ２基またはＣＦ
２基を含むことができ、および／または。

一隣接する２個のヌクレオシド単位をつないでいる３’
　−５’リン酸結合は、リンにのみ結合しておシ隣接す
る２個のヌクレオシド単位間の直接結合には関与してい
ない酸素がイオウ原子によって置換されているようなも
のであるか、あるいはまた、ヌクレオシド単位のうちの
１つの５′末端とリンとの結合を仲介している酸素がイ
オウ原子、１籟基。

ＣＦ２基またはＣＦ２基によって置き換えられているよ
うなものであシ、および／または、 −複合体の分子構造の他の部分はペプチド鎖配列に対応
し、この鎖は結合腕を介してＤＮＡ配列またはＲＮＡ配
列の最後のヌクレオチド単位の３′のリン酸基に結合し
ておシ、前記結合腕は４プチド鎖が有しておシ末端がア
ミノ基、特にＮＨ２で構成されている側鎖配列に由来す
るのが有利である。

本発明の好ましい１群のオリゴヌクレオチドの場合最初
のヌクレオシド単位は１個以上のリン酸基に結合してい
る。

リン酸基の数は１個が好ましい。

本発明の結合複合体の好ましい１群では、最初のヌクレ
オシド単位は次のリン酸基に結合している。

ここで、Ｒ１とＲ２はそれぞれ水素原子、炭素原子が１
〜１０個、好ましくは１個か２個のアルキル基、β位が
シアノ、アリールもしくはアリールスルホニル基で置換
されたエチル基、またはトリハ四グン化エチル基を表わ
す。

本発明の結合複合体のうち好ましい１群において、２個
のヌクレオシド単位をつないでおシリン原子を少なくと
も１個有する３′→５′結合はホスホゾエステル結合、
ホスホトリエステル結合またはアルキルホスホネート結
合である。

本発明の結合複合体化合物中で隣接する２個のヌクレオ
シド単位をつないでいる３′→５′ホスホジ工ステル結
合は次のように表わすことができる。

本発明の結合化合物中で隣接する２個のヌクレオシド単
位をつないでいる３′→５′ホスホトリ工ステル結合は
次の式で表わすことができる。

塩基 ただし、Ｒ３は炭素原子が１〜４個のアルキル基、特に
メチル基、β位がシアノ、アリールもしくはアリールス
ルホニルで置換されているエチル基、またはトリハロダ
ノエチル基を表わす。

本発明の結合化合物中で隣接する２個のヌクレオシド単
位をつないでいる３′→５′ホスホネ一ト結合は次式で
表わすことができる。

ただし、Ｒ′３は炭素原子が１〜４個のアルキル、特に
メチルを表わすことができる。

オリゴヌクレオチドの塩基についてそれらの数はオリゴ
ヌクレオチドの数の値に等しく、その各各は結果として
得られるオリゴヌクレオチド鎖がＤＮＡ配列またはＲＮ
Ａ配列に相当するような意味をもつ。すなわち言い換え
ると、オリゴヌクレオチド鎖がＲＮＡ鎖である場合塩基
はＡ、Ｕ、ＣまたはＧを表わすことができ、ＤＮＡ鎖の
場合には塩基はＡ、Ｔ、Ｃ４たはＧを表わすことができ
る。

本発明の複合体の構造中に含まれるＤＮＡ配列またはＲ
ＮＡ配列は、標的のオリゴヌクレオチド配列と相補的な
配列（以後アンチセンスオリゴヌクレオチド配列ともよ
ぶ）に相当しておシ、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮ
Ａ）と相補的なりＮＡ配列またはＲＮＡ配列に相当する
のが有利である。

またこのＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡと相
補的な配列に相当していることもでき、特にすメソーム
結合部位、スプライス（ｊｐｉｓｓａｇｅ）部位の配列
と相補的な配列、さらに一般に、ウィルスのＲＮＡポリ
メラーゼの認識部位のように目標とする（１個以上の）
遺伝子の発現メカニズムに必須なあらゆるＤＮＡまたは
ＲＮＡ相補配列に相当していることもできる。

本発明の結合複合体の構造中に含まれるＤＮＡ配列また
はＲＮＡ配列は、標的のオリゴヌクレオチド配列と相補
的な配列、特にｍＲＮＡと相補的な配列の塩基の順序と
比べて塩基順序が変更されているようなものであシ、お
よび／または、場合によって塩基が！換されているよう
なものであるが、ただしこの置換の程度は、標的のオリ
ゴヌクレオチド配列と相補的な上記オリゴヌクレオチド
配列、特にＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列と、その標的オ
リゴヌクレオチド配列、特にｍＲＮＡの配列とのハイブ
リダイゼーションが特徴的なままであってあいまいにな
らないような程度である。

本発明の好ましい実施態様によると、結合複合体は、オ
リゴヌクレオチド鎖がｍＲＮＡの５′末端と相補的な配
列に相当するようなものである。

このように、本発明の複合体はＲＮＡ配列またはＤＮＡ
配列のいろいろな塩基の構造が変わっていないという有
利な性質を示す。これは、本発明の複合体の構造中に含
まれるオリゴヌクレオチド配列と標的オリゴヌクレオチ
ド配列との間の認識特性を最適に維持することをめざし
たものとする。

本発明の結合複合体の構造中に含まれるオリゴヌクレオ
チドの数は７個以上としなければならない。実際この値
を下回ると本発明の複合体と標的オリゴヌクレオチド配
列とのハイブリダイゼーションの程度が悪くなるという
問題が生じ得る。

（以下余白） さらに、この値より小さいと１本発明の結合複合体の特
異性が充分でなくなる恐れがある。

本発明の結合化合物の構造中に含まれるヌクレオシド単
位の数には、この複合体がインターナリゼーションによ
って取り込まれる限り特に上限はない。

ヌクレオシド単位の数は、この数の増大とそれに対応し
て（複合体を化学合成によって製造する場合）合成が困
難になるということが活性の充分な増大によって償わな
れなくなるとそこで急速に限定される。

ヌクレオシド単位の数は１本発明の結合化合物の構造中
に含まれるオリゴヌクレオチドの分子量が好ましくは１
，５００〜２５，０００ダルトンとなるように選択すべ
きである。

本発明の結合複合体の好ましい１群の場合このオリゴヌ
クレオチドの数は５ｏを超えず、７〜２０が有利であり
、特に１２〜１８である。

本発明の結合複合体の構造中に含まれるＤＮＡ配列また
はＲＮＡ配列の最後の塩基は１本発明の複合体の残りの
部分が、これが−イブリダイズするはずの標的オリゴヌ
クレオチド配列と−イブリダイゼーションする際にそれ
に関与してもしな（てもよい。

この最後の塩基の意味（種類）は使用する合成様式に依
存し、入手容易な中間生成物を考えるとシチジンが有利
である。

一般に１本発明の複合体がＤＮＡ複合体である場合、最
後の塩基は本発明の結合複合体と標的のオリゴヌクレオ
チド配列とのハイブリダイゼーションに関与しない。

本発明の複合体がＲＮＡ複合体である場合は本複合体と
標的オリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーショ
ンに最後の塩基が関与するであろうＯ 上述の基Ｒ１＊　１２　＊　Ｒ３が炭素原子を１〜１゜
個もつアルキル基を表わす場合、これらの基は本発明の
複合体の安定性の増大に寄与する。

ポリペプチド鎖Ｐは天然でも合成でもよいが、次のよう
な特性をもっていなければならない。すなわち、ポリペ
プチド鎖はインターナリゼーシヨンによって標的細胞中
に取り込まれることかでき。

しかも有利なことに標的細胞の細胞膜のレセプターによ
って特異的に認識され得るような特性を示すことができ
る。

本発明のポリペプチド鎖は、このポリペプチド鎖と結合
しようとするオリゴヌクレオチドの官能基、特にアルデ
ヒド基と反応できる基を少な（とも１個含んでおり、こ
のポリペプチドの官能基は側鎖の配列であって、七〇床
端が利用できるアミノ基、特にＮＦ２基であると有利で
あろう。

側鎖配列のアミノ基というのはポリペプチドのペプチド
結合−〇−ＮＨに含まれないアミノ基を意！１ 味する。

ポリペプチドとＤＮＡＩたはＲＮＡ配列との結合もまた
ポリペプチドの末端ＮＨ２を介して行なうことができる
。

本発明の結合化合物の構造中に含まれるポリペプチド鎖
は、使用した濃度でこの化合物を導入する細胞に対して
毒性であってはならない。

末端がＮＦ２基で構成される側鎖配列はリシル残基に属
するのが有利である。

また、アルギニル残基は末端がＮＦ２基で停止する側鎖
配列をもっているので、ポリペプチド鎖がアルギニル残
基な含むのも有利である。

・本発明の結合化合物の構造中に含まれるポリペプチド
鎖は少な（とも５個のアミノ酸を含むのが有利である。

合成ポリペプチドの場合、５〜約Ｚｏｏ個のアミノ酸か
らなるポリペプチドを使用すると有利であり、６０〜１
００個のアミノ酸からなるのが好ましい。

ポリペプチド鎖は、細胞の膜表面の特異的なレセプター
によって確実に認識され得るのに充分な分子量を有して
なければならない。

本発明の結合化合物の構造中に含まれるポリペプチド鎖
は平均分子量が少なくとも約１０００であるのが有利で
ある。

本発明の結合化合物の構造中に含まれるポリペプチド鎖
はポリアルギニンで構成されるのが有利であり、ポリリ
シンが好ましい。

本発明の結合化合物中に含まれるポリリシンは平均分子
量が約ｓ、ｏｏｏ〜約４ＱＯＯＯであると有利であり、
特に約１０，０００〜約２０，０００であり、約１４，
０００が有利である。

本発明の結合化合物は、ポリペプチド鎖のアミノ基、特
にＮＨ２基を末端にもつ側鎖配列を介してオリゴヌクレ
オチドの少な（とも１分子か同じポリペプチド鎖に固定
されているようなものである。

ポリペプチド鎖の１分子当たりのオリゴヌクレオチド分
子の数は１に等しいのが有利であるが。

理論的に上限はない。

実際上ポリペプチド１分子に結合したオリゴヌクレオチ
ド分子の数を制限するのは、ポリペプチド鎖上の利用で
きるＮＨ２の数、すなわち末端にアミノ基、特にＮＨ２
（すなわち末端ＮＨ２）をもつ側鎖配列の数と、使用し
たオリゴヌクレオチドとポリペプチドの各々の量によっ
て特に調整することができる結合反応の収率と、インタ
ーナリゼーションと膜レセプターの認識の性質を維持す
ることができな（なってしまうような最大の供給量とで
ある。

本発明はまた１分子構造の一部はＤＮＡ配列またはＲＮ
Ａ配列に相当し１分子構造の他の部分はＮＨ２基がカル
ボン酸上に固定されているポリペプチド鎖で構成される
ような新規な結合化合物も目的としている。

ＮＨ２基を固定するポリペプチドのカルボン酸基は、あ
らゆるポリペプチド中にみられる遊離の末端カルボキシ
基、および／またはグルタミルｇよびアスパルチル残基
の遊離のカルボン酸基である。

たとえは、ヒドラジ７ＮＨ２ＮＨ２を介して−ＮＨ２基
’＆−ＣＯＯＨ基に固定する。この場合は基に含まれて
いる場合には、アスパラギン酸ヒドラジド（ａｓｐａｒ
ｔａ　ｈ７ｄｒａｚｉｄｅ　）が得られる。

ＮＨ２基を固定するｃｏｏｎ基がグルタミル残基に含ま
れている場合はグルタミン酸ヒドラジド（ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ　ｈｙｄｒａｚｉｄｓ　）となる。

上述のようにＣ０ＯＨ基の少な（とも１個が遊離のＮＨ
２基が存在しているとＤＮＡ’！たはＲＮＡ配列とポリ
ペプチドヒドラジドとの間の結合を実施することができ
る。

本発明はまた１分子構造の一部分はＤＮＡまたはＲＮＡ
配列に相当し１分子構造の他の部分は末端が−ＮＨ２基
である側鎖配列と−−ＮＨ−ＮＨ２に変換されているカ
ルボン酸基とを有するポリペプチドに相当する結合化合
物をも目的としている。

そのようなポリペプチドはたとえば、アシアロフエチン
（ａｓｉａｌｏｆ５ｔｉｎｅ　）のようなアシアログリ
コプロティンで構成される。

さらに本発明は１分子構造の一部は上記のオリゴヌクレ
オチドに相当し１分子構造の他の部分はれるマンノース
−ポリリシンのようなマンノース含有ネオグリコプロテ
ィンに相当する結合化合物をも目的としている。

より一般的にいって本発明は１分子構造の一部は上記の
オリゴヌクレオチドに相当し１分子構造の他の部分は抗
原に対する抗体、細胞表面ホルモン（ｄｅ　ｌａ　５ｕ
ｒｆａｃｅ　ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ　ｄｅｎｈｏｒｍｏ
ｎｅｓ）　、グリコプロティン、動物または植物口性の
Ｂ鎖のような適当なポリペプチドベクターに相当してい
る結合化合物に関してｓｒ）　Ｓこのベクター（Ｉｉ介
体）はポリペプチドの側鎖配列チドリ末端カルボキシ基
またはアスパルチルもしくはグルタミル残基に含まれて
いるカルボキシル基とヒドラジンとの反応に由来するも
のである。

（以１・゛全白） 本発明は、下記式Ｉ ｃ式中、 −ｍは０〜３、好ましくは０ま九は１の整数、−Ｒ，、
Ｒ２，Ｒ３は同一でもよくまた異なってもよく、１〜１
０個、好ましくは１〜２個の炭素原子を有するアルキル
を表わすか、またはＯＲ，。

ＯＲ２、ＯＲ３がそれぞれ独立して０−を表わし、−Ｙ
及びＴは同一でもよくまた異なってもよく、０またはＳ
を表わし、 −２及びＷは同一でもよくまた異なってもよく、０　、
　Ｓ　、　ＣＨ２，ＣＦ２または■を表わし、−Ｂ、及
びＢ２は同一でもよくまた異なってもよく、−（α、β
）は（Ｈ，Ｈ）、（Ｈ，ＯＨ）または（ＯＨ，Ｈ）を表
わし、 一Σは７以上の整数で、有利には７〜３０．好ましくは
７〜２０、特に１２〜１５であシ、−Ｘは１〜５の整数
であって有利には１であシ、−Ｐは少なくとも５個のア
ミノ酸を有する天然または合成の、ｊ？　ＩＪペプチド
鎖であり、Ｋ属する窒素原子は同時にポリペプチドＰの
側鎖の末端に属し、かつ／またはヒドラジンによって改
変されたＣ０ＯＨ基に由来する一〇−Ｎ］（−Ｎ基に属
する〕の新規な結合複合体を目的とする。

本発明の結合複合体の有利な実施形態はＰが少なくとも
５個のアミノ酸を有するペプチド鎖であり、 環 Ｂつ に属する窒素原子が同時に２リペデチドＰの側鎖の末端
に属するものである。

本発明の複合体の有利なもののグループは、下記式■： Ｐ 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ１ｍ、α、β、Ｘ。

Ｒ，、Ｒ２，Ｒ，、Ｂ１．　Ｂ２　　は上記に定義した
意味を有し、Ｐは少なくとも５個のアミノ酸を有するポ
リ（プチド鎖を表わし、その中で一〇−ＮＨ−Ｎ基は該
ポリペプチドの末端−〇−ＯＨ基に由来し、かつ／また
はアスノナルチル及び／又はグルタミル残基の遊離−〇
−ＯＲ基に由来する〕 のものによシ構成される。

本発明の複合体の別の好ましいグループは式■ＮＨ （ＣＨ２）３ 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ１ｍ、α、β、Ｘ。

Ｒ，ｌ　Ｒ２１Ｒ５，Ｂ、　、　Ｂ２　　は上記に定義
した意味を有し、Ｐは少なくとも５個のアは）酸を有す
るＮＨ プチド鎖Ｐの構造中に入っているアルギニル残基の側鎖
の末端に属する〕 のものから構成される。

本発明の複合体のま１別の有利なグルーｆ＃−Ｊ、下記
式■ 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ２ｍ、α、βｌ　Ｘ　ＩＲ
，＃　Ｒ２，Ｒ３，Ｂ、　、　Ｂ２　　は特許請求の範
囲第１項に定義した意味を有し、Ｐは少なくとも５個の
アミノ酸を有するペプチド鎖であり、その中で−（ＣＨ
２）４−基はポリペプチド鎖Ｐの構造中に入っているリ
シル残基の測鎖に属する〕 のものからなる。

本発明の結合複合体の有利なグループは、式！。

■、■または■のもので要素Ｙまたは２の少なくとも１
つが酸素ではないものからなる。

本発明の結合複合体のまた別の有利なグループは、式ｉ
、ｎ、ｍのものでＹ、Ｚ、Ｔ、Ｗが全テ酸素を表わすも
のからなる。

本発明の結合複合体のまた別の有利なグループは、式■
のものでＹ、Ｚ、Ｔ及びＷが全て酸素を表わし、下記式
Ｖ ｃ式中、ｍ、Σ、Ｘ、α、β、　Ｂ１．　Ｂ２及びＰは
前に示した意味を有する〕 １、ＩＦ、Ｉ［［または■のものでｍが０のものからな
る。

でｍがＯであシ、下記式■： 〔式中、Ｂ、ｌ　Ｂ２’α、β、Σ、Ｘ及びＰは前に示
した意味を有する〕 に対応するものからなる。

本発明の結合複合体の有利なグループは対（α。

β）が（ｉｉ　ｌ　Ｈ）を表わす式１．ＩＩ、Ｉ［［、
！Ｖのもの、即ちオリゴヌクレオチド配列がＤＮＡ配列
であるものからなる。

本発明の結合複合体の有利なグループは対（α。

β）　；６１　（Ｈ、ＯＨ”）　ｆｒ表わす式ｘ、ｎ、
ｍ、■のもの、即ちオリゴヌクレオチド配列がＲＮＡ配
列であるものからなる。

本発明の結合複合体のまた別の有利なグループは、対（
α、β）が（１（、Ｈ）を表わす式Ｖのものからなる・ 下記式■： Ｐ 〔式中、Ｂ、　、　Ｂ２．Σ、　Ｘ　、　ｍ及びＰは前
に示した意味を有する〕 に対応する複合体である。

本発明の複合体の別の有利なグループは、基（α、β）
が（Ｈ，Ｈ）を表わす式■のものからなる。

下記式■−２： 〔式中、Ｂ、　、　Ｂ２．Σ、Ｘ及びＰは前に示した意
味を有する〕 に対応する複合体である。

本発明の複合体の別の有利なグループは、対（α、β）
が（Ｈ，ＯＨ）を表わす式Ｖのものからなる。

下記式■： 〔式中、Ｂ、　、　Ｂ２　、　Ｘ　、　ｍ　＊Σ及びＰ
は前に示した意味を有する〕に対応する複合体である。

本発明の複合体の別の有利なグループは、基（α、β）
か（Ｈ、ＯＨ）を表わす式■のものからなる。

下記式■−３＝ 七 〔式中、Ｂ、　、　Ｂ２．α、β、Σ、Ｘ及びＰは前に
示した意味を有する〕に対応する複合体である。

本発明の複合体の別の有利なグループは、対（α、β）
が（ＯＨ，Ｈ）を表わす式１．Ｉｆ、ＩＩＩ。

■のものから表る。

本発明の複合体の別の有利なグループは、対（α、β）
が（ＯＨ、Ｈ）を表わす式Ｖのものからなる。

下記式■： （ＣＨ２）　４ 〔式中、Ｉｊ４．Ｂ２．Ｘ、ｍ、Σ及びＰは前に示し九
意味を有する〕に対応する複合体である。

本発明の複合体の別の有利表グループは、Ｂ２がシチジ
ンを表わす式１．ｎ、ＩＩ［、Ｍ、Ｍのものからなる。

本発明の複合体の別の有利なグループは、Ｂ２がシチジ
ンを表わす式■のものからなる。

下記式Ｘ 〔式中、Ｘ、Σ２ｍ、α、β、Ｂ、及びＰは前に示した
意味を有し、Ｃはシチジンを表わす〕に対応する結合複
合体である。

本発明の複合体の別の有利なグループは、Ｂ２がシチジ
ンを表わす式■、■−２，■−３，■。

■、■のものからなる。

（以１↑白） 本発明の複合体の別の有利なグループは下記式〔式中、
Ｂ、及びＰは前に示した意見を有し、Ｃはシチジンを表
わし、Σは１２〜１５であシ、Ｘは１〜５であって好ま
しくは１である〕の結合複合体からなる。

有利には約１５０００の分子量を有する式ｖ　、　ｖｒ
　。

Ｖｌ−２、Ｖｌ−３、Ｖｎ、ＶＩ［Ｉ、　ＩＸ、Ｘ、Ｘ
ＩＯものからなる。

特に有利な複合体は、下記式Ｘ■ −ｐは分子量が約１５０００のポリ（Ｌｌ　リシンを表
わし、 −Ｃはシチジンを表わし、 一Σが１５であり −塩基鎖Ｂ、が３’　−ＴＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡ
Ｃ−５’である〕 及び下記式■ 〔式中、　　　　　　　　　　′ −Ｐは分子量が約１５０００のぼり（Ｌｌ−リシンを表
わし、 −Ｃはシチジンを表わし、 一Σは１３であシ ー塩基鎖Ｂ、は３’　−ＴＴＡＣＡＣＧＧＡＧＣＡＡ−
５’である〕に対応するものである。

ド配列７〜１５個のヌクレオシド）のポリペグチド配列
（例えばポＩＪ　Ｌ　＋　ＩＪシン）への結合は前者を
分解酵素（例えばホスホジェステラーゼ）に対して安定
化し、またその目標とするオリゴヌクレオチド配列への
ハイブリダイゼーションも促進スると考えられる。

本発明はまた、上記のＲＮＡまたはＤＮＡ配列を適当な
塩基と反応させて得られる塩にも係る。特にナトリウム
塩、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基のアルキル
アンモニウム塩である。

本発明はまた、前記結合複合体の製造方法にも係る。

本発明の結合複合体の製造は、以下に記載する方法によ
シ行なうことができる。

該方法は、下記式１２ ％式％（ 〔式中、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ，、Σ１ｍｌ”、ＩＢ２１ＹＩ
Ｚ、Ｔ、Ｗは前に示した意味を有する〕の複合体の合成
を行ない、 一式Ｉ−２の化合物を酸化して末端ヌクレオシド単位の
τ及び３′位蓋の炭素上に２つのアルデヒド官能基を導
入して下記式Ｉ−３ の化合物を得、 一式Ｉ−３の化合物を、末端がアミン化された基、特に
ＮＦ２である側鎖を少なくとも１つ有する鎖であるポリ
ベグチドＰ−ＮＨ２によりｉ元的にアルキル化する（こ
の反応は複合体（Ｉ−３）のアルデヒド官能基とポリｄ
グチドのＮＦ２基の間に生起される）ことによって式■ の化合物を得 −特に分子Ｐｉ４によシ式■の結合複合体、■−３の複
合体及び結合していないＰＮＨ２の分別を行なうことか
らなる。

酸化は特に過ヨウ素酸塩、特にナトリウムの過ヨウ素酸
塩で、正確にコントロールされた一条件中で行なう。

”正確にコントロールされた一条件”なる表現は、反応
媒体を暗黒下にｐＨ４，５，０〜４℃に維持することを
意味する。

式１−３の化合物の還元的アルキル化は例えば、Ｋｈｙ
ｍ　Ｊ、Ｃ，、Ｅｌｏｃｈｓｍｌａｔｒｙ、　１９６３
．２．　３４４−３５０：　Ｇｒａｙ　Ｃ，、Ａｒａｈ
、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、。

１９７４、１６３．４２６−４２８　：　Ｌｅｅ　Ｒ，
Ｔ、　ａｔ　ＬｅａＹ、Ｃ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１９８２，８３゜２８９−２９５
　：　Ｉｍａｌ　Ｊ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｍ、、Ｔｏ
ｒｒｅｎｃｅＰ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｍ、、
　１９８２，２１．１２　７３９−１２　７４１、に記
載されるような従来の方法によ９行なうことができる。

式１−３の化合物の還元的アルキル化を実施するために
、特に水素化ホウ素ナトリウム、あるいは好ましくは水
素化シアノホウ素ナトリウム（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙ
ｄｒｕｒｅ　ｄｏ　ｓｏｄｉｕｍ）　　を使用すること
ができる。

ポリベグチドＰに対するオリゴヌクレオチド配列の数Ｘ
は、使用したポＩＪ　−２７’チドの量に対するＩ−３
の化合物の量による。

式ｉ２の複合体の化学的合成に関しては、下記式Ｉ−４
： ＯＨβ 〔式中、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ３，Ｂ、　、　ｍ　、Σ、Ｙ、
Ｚ。

Ｔ、Ｗは前に示した意味を有し、（α、β）は（α、β
）が（Ｈ，）（）または（Ｈ，ＯＨ）を表わす場合、Ｔ
−４の化合物はそれぞれＤＮＡあるいはＲＮＡ配列に対
応し、特にＤＮＡあるいはＲＮＡシンセタイデーを使用
して全て化学的な経路によるか、あるいは酵素的経路に
よｐ合成することができる。

化学的合成に関しては、Ｋｈｏｒａｎａ　ａｔ　ａｌ、
、　ＩＬｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　７２．２０９（１９７
２）、　Ｊ、Ｅ、　Ｄａｖｉｅｓａｔ　Ｈ，Ｇ、　Ｇａ
５５ｅｎ、　Ａｎｇｅｗ佛Ｃｈ＠ｍ、　Ｉｎｔ＠Ｅｄ。

Ｅｎｇ、　２２．１３（１９８３）　：　Ｋ、　Ｉｔａ
ｋｗｓ、　Ｊ、Ｊ。

Ｒｏｇａｌ　ａｔ　Ｒ，Ｂ、　Ｗａｌｌａｃｅ、　Ａｎ
ｎ、　ｒｅｖ、Ｂ１ｏｃｈｓｍ５３．３２３（１９８４
）に記載されたＤＮＡ合成の手順及びＴ、　Ｔｏｎａｋ
ａ　ａｔ　ａｌｅ　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅ５ｔ
１４．６２６５（１９８６）：Ｍ、Ｓ＊ｋｉｎｅ　ｅｔ
　Ｔ、　Ｍａｔａ。

Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、１０８．４５３１（１９８６）　　に
記載されたＲＮＡ合成の手順を用いることができる。

式１−４の複合体の酵素的合成に関しては、組換えＤＮ
ＡあるいはＲＮＡの製造に使用し得る方法のいずれをも
使用し得ると考えられ、例えはＤＮＡＳａｍｂｒｏｏｋ
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ、　ａ　ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　（１９８２）の方法であ
シ、ＲＮＡについて記載されｆｃＰ、Ａ、　Ｋｒｉｅｇ
　ａｔ　Ｄ、Ａ、　Ｍｅｌｔｏｎ　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ、Ｒａｇ、１２．７０５７（１９８４）の方法であ
る。

（α、β）が（Ｈ，ＯＨ）を表わす式［２の化合物はＲ
ＮＡ配列に対応し、従って直接合成することができる。

式１−２ 〔式中、　Ｒ，、Ｒ２，Ｒ３，Σｌ　ｍｌ　Ｂ、Ｉ　Ｂ
２１　ＹｌＺ、Ｔ、Ｗは前に示した意味を有し、（α、
β）は（Ｈ、Ｈ）または（ＯＨ，Ｈ）を表わす〕の化合
物の製造は、式１−４ ＯＨＨ 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｂ、　、ｒｎ、Σ、ｙ、ｚ
。

Ｔ、Ｗは前に示した意味を有し、αはＨまたはＯＨを表
わす〕の化合物から出発して、これに式０式％ 〔式中、Ｂ２はＡ、Ｔ、Ｃ，ＧまたはＵを表わし、有利
にはＣである〕の化合物をＴ４のＲＮＡ　ＩＪガーゼ（
’ｌ’４１Ｊガーゼ）の存在下に反応させて下記式Ｏ− の化合物を得、 一次にグル口過してｉ６の化合物を１−４の化合物及び
反応していないＩ−５の化合物から分離し、 一次に細菌性アルカリホスファターゼを作用させて前に
定義した式■−２の化合物または（酸素が基Ｒ１及びＲ
２によって保護されていない場合は、これも細菌性アル
カリホスファターゼによシ除去される）の場合は、（式
１−２　）’ＨＯＨ の化合物を得ることによって行ない得る。

Ｔ４　　リガーゼの結合に関しては下記の文献、Ｄ、Ｍ
。

Ｈｌｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，１，Ｇｕｍｐｏｒｔ　（１
９７９）　Ｎｕａｌ。

Ａｃ、Ｒａｓ、７．４５３−４６５．Ｃ，Ａ、Ｂｒｅｎ
ｎａｎ、Ａ、Ｅ。

Ｍａｎｔｈｅｙ　ｅｔ　Ｒ，１，Ｇｕｍｐｏｒｔ（１９
８３）　、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ）ｒｍｏｌｏｇ
ｙ　ｖｏ！、　１００　、３８−５２　に依ることがで
きる。

（以下余白） Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Σ、ｍ、Ｂ１　、Ｂ２　、Ｙ。

Ｚ、Ｔ、Ｗが前記に示した意味を有し、（α、β）が（
Ｈ，Ｈ）、（Ｈ，ＯＨ）または（○Ｈ，Ｈ）を表わす弐
ｉ２の化合物の化学的合成は、その上にヌクレオチド単
位が連続的に付加されるリボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌｅ
）支持体を使用する固相法により行なうのが有利である
。この固相法は以後特に“ｐｈＯ３ｐｈｏｒａｍｉｄｉ
ｔｅ法゛′と指称するが、この方法はＨａｔｔｅｕｃｃ
ｉ　Ｍ、Ｄ、、　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　Ｈ，１１，、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、ユ０３３１８５　（１９８１）に
記載されている。

この方法は前出の式Ｉ−４の化合物の合成にも使用し得
る。上記のリボシル化支持体は樹脂であり、有利には制
御された多孔度を有するガラスピーズ（゛コントＯ−ル
ドボアガラスレジン″あるいは”　ＣＰ　Ｇ樹脂″の名
称で知られている）であり、Ａ、Ｃ，Ｇ、ＴあるいはＵ
のいずれかの塩基のりボヌクレオシドまたは特に以下に
示すものから選ばれる塩基のプリンまたはピリミジンＸ
ｓ体を有する。即ち、 一キサンチン（２，６−シヒドロキシプリン）、−ヒボ
キサンチン（６−ヒドロキシプリン）、−プリン（フー
トイミダゾ［４，５−ｄｌピリミジン）、−ピリミジン
（１，３−ジアジン）、 −アデニン−１Ｎ−オキシド、 −シトシンー５−カルボン酸、 一グアニンー３Ｎ−オキシド、 −２−チオウラシル、 −４−チオウラシル、 ＝５−カルボキシ−２−チオウラシル、−６−カルボキ
シメチルウラシル −ウラシル−５−カルボン酸、 一ウラシルー６ーカルボン酸、 −８−ブロモアデニン、 ＝５−ブロモシトシン、 ー訃ブロモグアニン、 −６−ブロモプリンである。

このようなリボシル化樹脂を調製し、オリゴヌクレオチ
ド配列合成に使用する条件は以下の実施例中に詳述する
。

本発明の結合複合体は生物学的反応体、特に検出プロー
ブとして有利に使用できる。

本発明はまた、上述の結合複合体の少なくとも１つを使
用した、特に細胞培養培地中での遺伝子発現のインビト
ロ阻害方法にも関する。

以下の実施例は説明のために記載するものであっ．て制
限的なものではない。

（以下余白） １、式■および■のオリゴヌクレオチドの合成１）材料
と手法 細胞培養用の培地とウシ胎児血清はＥｕｒｏｂｉ。

（Ｐａｒｉｓ）製でちる。ポリ（Ｌ−リシン）（Ｍ＝１
４、０００　）　、細菌のアルカリ性ホスファターゼ（
Ｅ．Ｃ．３．１．３．１．　−　１−ｒ型）、ミオキナ
ーゼ（　Ｅ．Ｃ．２．７．４．３．　−　Ｖ型）、スペ
ルミンおよび水素化シアノホウ素ナトリウム（　ｃｙａ
ｎｏｂｏｒｏｈｙｄｕｒｅｄｅ　ｓｏｄｉｕｍ）はＳｊ
ｇｍａ製である。

ゲル濾過用担体はＰｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅ
ｍｉｃａｌｓ（媒質ＳｅｐＨａｄｅｘ　Ｇ　−　５　０
　）またはＢｉｏ　−　ｒａｄ　（　Ｂｉ。

−ＧｅｌＰ６ＤＧ）裏である．Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（　
ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅによる汚染の例−
Ｅ．Ｃ．６．５．１．３．）と標識してない次式の化合
物（１−５） 〇− （以後ｐｃｐという）はＰｈａｒｍａｃｉａ製である。

クレアチンキナーゼ（　Ｅ．Ｃ．２．７．３．２．　）
、ホスホクレアチン、　Ｈｅｐｅｓ，ジチオヌレイトー
ルおよびＡＴＰはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　裂である。

トコメチオニン（２２〜３０ＴＢｑ／ミリモル）はＡｍ
ｅｒｓｈａｍ製で．標準分子量クン７ｇり質ばＮＥＮ社
製である。

２）細胞とウィルス Ｌ９２９細胞は、５％（　Ｖ／Ｖ　）ウシ胎児血清、３
ｆ／ノ　ｂｏｕｉｌｌｏｎ　ｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｓｅ。

３、４ｆ／ノグルコース、６０ＩＵ／−ペニシリンおよ
び５０１＋９／ｒｎｔストレプトマイシンを添加した最
小必須培地（ＭＥＭ）中で培養する。

■ＳＶのインディアナ株または脳心筋炎ウィルス（ＥＭ
ＣＶ）は、Ｌ９２９単層細胞上で培養し、限界希釈法に
よって滴定する（ＭＩＬＨＡＵＤ、Ｐ、Ｇ、。

ＳＩＬＨＯＬｌＭ、ＦＡＵＲＥ、Ｔ、ａｎｄＭＩＬＨＡ
ＵＤ。

Ｘ、　（１９８３）、　Ａｎｎ、　Ｖｉｒｏｌ　、　（
Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ　）１３４Ｅ、４０５−４
１６）。

式Ｉ−４のオリビデオキシリボヌクレオチドは、Ｂｌｏ
ｓｅａｒｃｈ社が市販しているＤＮＡ合成装！（−Ｔ−
デルＳａｍ　Ｏｎｅ　）　’ｒ　使用し、ホスホトリエ
ステル法（ＫＨＯＲＡＮＡ、　Ｈ，Ｇ、、　ＡＧＡＲＷ
ＡＩ’ＬＬ、　Ｋ、　Ｌ、　。

ＢＵＥＣＨＩ、Ｈ，、ＣＡＲＵＴＨＥＲ８，Ｍ、Ｈ，、
ＧＵＰＴＡ、Ｎ、に、、ＫＬＥＰＰＥ、に、、ＫＵＭＡ
Ｒ，Ａ、。

０ＨＴＳＵＫＡ、Ｅ、、ＲＡＪ　　ＢＨＡＲＤＡＲＹ、
Ｕ、Ｌ、。

ＶＡＮ　　ＤＥＳＡＮＤＥ、Ｊ、Ｈ，、ＳＣＡＲＡＭＥ
ＬＬＡ。

Ｕ、、ＴＥＲＡＯ，Ｔ、、ＷＥＢＥＲ，Ｈ，ａｎｄ　　
ＹＡＢｒｆＡＤＡ。

Ｔ、（１９７２）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、７２，２０
９−２１７）によって合成する。製造業者の指示通９の
ことが認められる。脱保護されたオリゴヌクレオチドは
、ｐＨ７，５の１０ｍＭトリエチルアミン重炭酸塩緩衝
液（ＴＥＡＢ）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５
０カラムから同じ緩衝液で浴出して精製し、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドに対応する高分子量の生成物産を
試験する。必要であれば、このオリゴヌクレオチドを分
析条件と同様な条件でＰＡＧＥ法によって精良する＠ Ａ、２．１）ｃｐの式Ｉ−４の化合物への付加適用する
条件は次の刊行物に記載されているものである。

−ＨＩＮＴＯＮ、Ｄ、Ｍ、ａｎｄ　ＧＵＭＰＯＲＴ、Ｒ
，Ｉ。

（１９７９）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、　ｒｅｓ
、　’Ｌ　４５３−４６５；−ＢＲＥＮＮＡＮ、Ｃ，Ａ
、、ＭＡＮＴＨＥＹ、Ａ、Ｅ、ａｎｄＧＵＭＰＯＲＴ、
　Ｒ，１，（１９８３）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｑｙ、　１００．３８−５２゜オリビデ
オキシリボヌクレオチド（８０ナノモル）を、次式Ｉ−
５： ０Ｈ −ｏ−ｐ−。

０′″ （式中Ｂ、はＡ　、Ｔ　、Ｃ、ＧまたはＵであシ、化合
物店および■の合成の場合はＣが有利である）の化合物
（以後ｐｃｐという）３２０ナノモ、１１／　（ｎｍｏ
ｌｅ　）５’（”Ｐ　）　−ｐＣｐ　１．８５　ＭＢｑ
、　ス、−ｅルミン８ｏナノモル、クレアチンリン酸１
．８１１Ｍ０１ｅおよびＡＴＰ　４．５　ｎｍｏｌｅヒ
ドロキシエチル）−ピペラジンエタンスルホ／酸（Ｈｅ
ｐｅｓ　）、　　５０　ｍ？ｖ１．　　ｐＨ７，９、Ｍ
ｎＣノ３、１０ｎＭ。

ジチオヌレイトール（ＤＴＴ）、２０ｍＭ−に再溶解し
、グリセロールを３０％（Ｖ／Ｖ　’）含む連結用緩衝
液５μノ中のミオキナーゼ１．７０とクレアチンキナー
ゼ１．７Ｕを加え、Ｔ、ＲＮＡリガーゼ（１０〜１５μ
））を最終濃度２３μＭで添加して反応を開始する。

反応混合物を６時間１８℃でインキュベートする。２０
　ｍＭのＴＥＡＢで平衡化したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ　６−
ＤＧカラムクロマトグラフィーにかけて２０ｍＭのＴＥ
ＡＢで展開して結合しなかったｐｃｐと塩を除去する。

各画分の２６０ｎｍ吸収と放射能を測定する。

オリｊ”デオキシリボヌクレオチド−ｐＣｐを含有する
画分を集めて蒸発乾燥する。

Ｂ１式Ｉ−Ｚのオリゴヌクレオチドのｐｈｏｓｐｈｏｒ
ａｍｉｄｉｔｅ式Ｉ−２のオリゴヌクレオチド（同様に
以後オリゴデオキシリボーＮとする。このＮはｒＸと略
されるリボヌクレオチドを表わし、ＸはＡ、Ｃ。

Ｔ、ＧもしくはＵまたはこれら塩基の上記に定義したよ
うな誘導体を表わし、化合物刈および■の合成の場合は
Ｃが有利である）は、ＤＮＡ合成装置を用い、ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄ　ｉ　ｔｅ法（ＭａｔｔｅｕｃｃｉＭ
、　Ｄ、、　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　Ｍ、　ＬＩ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、１０３．３１８５（１９８１））に従って合成
する。

この方法ではリボシル化し＆ＣＰＧ樹脂を使用する。こ
の樹脂の製造例は次の通）。

Ｈ＊　Ｂｚ 式中のＤｍ　ｔ　ｒはジメトキシトリチルｋ、）Ｇ３ｚ
は塩基Ａ、　Ｕ、　Ｃ，０％Ｔ１またはこれら塩基の誘
導体（その反応性のアミノまたはヒドロキシル基はベン
ゾイル現は２′位から３′位の酸素原子の２個のうちの
いずれか一方がベンゾイル基（Ｂｚ）を有し、他方が水
素を有していることを、それぞれ意味する。

このジメトキシトリチル化されベンゾイル化されたりボ
ヌクレオシドＸに対応する式はまた次のように略式に書
くことができる。

この化合物の製造はＩ（ｅｍｐｅ、　Ｃｈｏｗ、　５ｕ
ｎｄｑｕｉｓｔ＋Ｎａｒｄｉ　＊　Ｐａｕｌｓｏｎ　ａ
ｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　（１９８２）、Ｎ、Ａ、Ｒ，
。

１立（２１）、　６６９５に記載されている。

Ｂ、２６次式の化合物の製造 Ｂｚ この化合物の製造はＣｈｏｗ、　Ｋｅｍｐｅ、　ａｎｄ
　Ｐａ１ｍ（１９８１）Ｎ、Ａ、　Ｒ，、且、　２８０
７に記載されている。

これはＭｉｙｏｓｈｉ　ＬＩ　Ａｒｅｎｔｚｅｎ　Ｒ，
慶Ｈｕａｎｇ　Ｔ、＋ａｎｄ　Ｉｔａｋｕｒａ　Ｋ、　
（１９８０）、　Ｎ、Ａ、Ｒ，、８，５５０７に記載さ
れている。

Ｂ、４．担体の製造 Ｂ、３．で得られた生成物を活性化されたＣＰＧ樹脂（
市販品）に固定するにはＧｏｕｇｈ　Ｒ，＊　Ｂｒｕｎ
ｄｅｎＭ、Ｊ、、　Ｇｉｌｈａｍ　Ｐ、　Ｔｏ、　（１
９８１）　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、　２２
．４１７７に従って行なう。

次に、デオキシリボヌクレオチドをこの担体上に順々に
加えていくが、これはオリゴヌクレオチドの自動合成装
置を用い、上記のＭａｔｔｅｕｃｃｉとＣａｒｕｔｈｅ
ｒｓの論文に記載された方法に従って、またはこの方法
から派生した手法もしくはその他の何らかの適切な方法
に従って実施すると有利である。オリゴデオキシヌクレ
オチドの脱保護はＮＨ。

中で実施し、次にエタノール（オリゴヌクレオチド含有
浴液１容量に対して２．５容量）で沈殿させ、沈殿した
残渣を乾燥し、ポリアクリルアミドデル１気泳動（ＰＡ
ＧＥ）法（ＭＡＮＩＡＴＩＳ、Ｔ、、ＪＥＦＦＲＥＹ、
　Ａ、　ａｎｄ　ＫＬＥＩＤ、　Ｄ、　Ｇ、　（１９７
５）　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　７２．１１８４−１１８９　
）によってこの画分の純度をテストする。必要でちれば
、このオリゴヌクレオチドを分析条件と同様な条件下の
ＰＡＧＥ法によって精製する。

４）　Ａ、　３　、で得られたオリゴデオキシリボヌク
レオチド件は特にＢＡＹＡＲＤ；　ｎ、、ＢＩＳＢＡＬ
、Ｃ。

ａｎｄ　ＬＥＢＬＥＵ、Ｂ、、（１９８６）、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ２５、３７３０−３７３６に記載の方
法を用いて適合させる。

乾燥したオリゴデオキシリボヌクレオチド−ｐｃｐを１
０　ｍＭのＴＥＡＢ５０μノ中に溶解し、細菌アルカリ
性ホスファターゼ１単位と共に３７℃で１時間インキュ
ベートする。脱リン酸化したオリビデオキシリボヌクレ
オチドをＢｉｃｙｇｅｌＰ　６−　ＤＧカラム上で１０
ｍＭのＴＥＡＢ中に濾過し、オリゴデオキシリボヌクレ
オチドを含有する両分を凍結乾燥する。残渣をメタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム１００μノ（０，１酢酸ナトリウム緩
衝液中１１ｔｒｎｏｌｅ＋　ｐＨ４−７５）に溶解し、
反応混合物を暗室中で２時間Ｏ〜４℃にインキュベート
する。次に、ポリ（Ｌ−リシン）１００μ７（０，２Ｍ
リン酸緩衝液中８０　ｎｍｏｌｅ、　ｐＨ８，０）と水
素化シアノホウ累ナトリウム１００μノ（０，２Ｍリン
酸緩衝液中１０　μｍｏｌｅｅ　ｐＨ８，０）とを加え
、２時間室温でインキュベートする。次に、０．１Ｍ酢
酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４，７５）で平衡化した５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラムに試料を入れ、同じ緩
ｗｉ液で溶出する。Ｌｏｗｒｙ法（ＬＯＷＲＹ、Ｏ，Ｈ
，。

ＲＯ８ＥＢＲＯＵＧＨ，Ｎ、Ｓ、、ＦＡＲＲ，ａｎｄ　
ＲＡＮＤＡＬＬ、　Ｒ，１，（１９５１）、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

１９３．２６５−２７５）を使用して各画分のオリゴデ
オキシリボヌクレオチド−ポリ（Ｌ−リジン）含量をテ
ストし、２６０ｎｍ吸収および放射能を測定する。

３）Ｂ、で合成したオリゴデオキシリボーＮ（化合物店
と■の合成ではＮ＝＝ｇｒＣ）をメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム１００　ＡＪ　（０，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中
１　μｍｏｌｅ、　ｐＨ４，７５）に溶解し、反応混合
物を暗室中で２時間０〜４℃にインキュベートする。次
に、ポリ（Ｌ−リシン）１００μノ（０，２Ｍリン酸緩
衝液中８０　ｎｍｏｌｅ　、　ｐＨ８，０）と水素化７
７ノホウ素ナトリウム１００μｊ（０，２Ｍホウ酸緩衝
液中１０　μｍｏｌｅ、　ｐＨ８，０）とを加え、２時
間室温でインキュベートする。次に、０．０２Ｍ６酸ア
ンモニウム緩衝液、ＮａＣｊ　Ｏ，５Ｍ　（ｐＨ６）で
平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラムに試料を
入れ、同じ緩衝液で溶出する。Ｌｏｗｒｙ法（ＬＯＷＲ
Ｙ、Ｏ，Ｈ，、ＲＯ８ＥＢＲＯＵＧＨ，Ｎ、Ｓ、、ＦＡ
ＲＲ，Ａ、Ｌ、ａｎｄ　ＲＡＮＤＡＬＬ、　Ｒ，１，（
１９５１）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３
゜２６５−２７５　）を使用して各両分のオリゴヌクレ
オチド−ポリ（Ｌ−リジン）含量をテストし、２６０ｎ
ｍ吸収を測定する。

６）タンパク質合成の試験 Ｌ９２９細胞（３〜５ＸＩＱ’（［５１、メチオニンヲ
含有しない最小必須培地（ＭＥＭ）で２回洗浄し、メチ
オニンを含まない最小必須培地５００μノ中でメチオニ
ン〔”５）１８５ｋＢｑと共に４５分３７℃で標識する
。このタンノ９り質を既に記載されている（ＢＡＹＡＲ
Ｄ、Ｂ、、ＢＩＳＢＡＬ、Ｃ，ａｎｄ　ＬＥＢＬＥＵ。

Ｂ、、　（１９８６）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
２５．３７３０−３７３６）ようにして５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ勾配（７，５〜１５％、ｗ／ｖ）法によって抽出して
分析する。ゲル中のタンパク質の分布を螢光間接撮影法
（ＬＡＳＫＥＹ、　Ｒ，ａｎｄＨＩＬＬＳ、　Ａ、　（
１９７５）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５
６゜３３５−３４１　）分析し、Ｖｅｒｎｏｎ　（商標
）の濃度計を用いてオートラジオグラフィー上に定量化
する。

（以ｊ−余白） ■、結果 オリゴデオキシリボヌクレオチドとポリ〈Ｌ−リシン）
の結合 オリゴリボヌクレオチドは、その３°−末端リボース残
塁を過ヨウ素酸で酸化した後Ｎ−モルホポリ核によって
共有結合的にポリ（Ｌ−リジン）に連結することができ
る（ＫＩＩＹＨ，Ｊ、Ｃ，（１９６３）　Ｂｉｏｃｈｅ
ｌｉｓｔｒｙ　２．３４４−３５０；ＲＡＹＦＯＲＤ、
　Ｒ，、ＡＮＴＨＯＮＹ、　Ｄ、ＤＪｒ、、　　Ｏ’Ｎ
ＥＬＬ、　　Ｒ，Ｅ、Ｊｒ　　ａｎｄ　　ＨＥＲＲＩＣ
に、　　Ｗ、Ｃ，（１９８５）Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈ
ｅｍ、、　２６０．１５７０８−１５７１３）　、この
方法を合成オリゴデオキシリボヌクレオチドと共に使用
するためには酸化可能な３゛−末端リボース残塁を加え
る。この操作はＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて行なうこと
ができる。これによって、受容体オリゴヌクレオチド（
すなわち合成オリゴデオキシリボヌクレオチド）の３°
−ヒドロキシルと、ヌクレオチド３°−５°ニリン酸（
すなわちｐＣｐ）のような５“−リン酸を担持するオリ
ゴヌクレオチド（供与体）との間で３’、　５’ホスホ
ジ工スデル結合が形成される（　ＢＲＥＮＮＡＮ、　Ｃ
，＾、　、　ＨＡＮＴＩＩＥＹ、＾、［、ａｎｄ　ＧＵ
ＨＰＯＲＴ、　Ｒ，１，（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１００．３８−５２
；　Ｕｔｌｌ、ＥＮＢＥＣＫ、　０．Ｃ，ａｎｄ　ＧＵ
ＨＰＯＲＴ。

Ｒ，１，ｉｎ　”Ｔｈｅ　ＥｎＺｙｍｅｓ”　（Ｐ、Ｇ
、　Ｂｏｙｅｒ、　ｅｄ）　３ｒｄ　Ｅｄ、　　ｖｏｌ
、　　１５．　　ｐ、　　３１．　　八ｃａｄｅｍｉｃ
　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

１９８２１゜［３２Ｐ］　　ｐＣｐとオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとは８５％以上もの収率で結合すること
ができる。

このｐｈｏｓｐｈｏｒａＩＩｌｉｄｉｔｅ法には、式１
−４の化合物に式ニー５の化合物（すなわち化合物χＩ
ｒＪ５よび■の場合にはｒｔｃｏ＞を添加するという中
間８２階を経ることなく、３°−末端に酸化可能なリボ
ース残基を有する合成オリゴヌクレオチドが直接（ｑら
れるという利点がある。さらに、このｐｈｏｓｐｈｏｒ
ａｍｉｄｉｔｅ法によると、上の３）Ａで述べた方法に
よって得られる化合物のサイズより大きいオリゴヌクレ
オチドを得ることができる。

次いで、３°−末端のシチジル残塁を酸化した後、ポリ
（し−リジン）のε−アミノ基に結合する（ＢへＹＡＲ
Ｄ　　Ｂ１．　　ＢＩＳＢＡＬ　　Ｃ，、ａｔ　　ＬＥ
ＢＬＥＵ　　Ｂ、　　（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　２５．３７３０−３７３６）。

分子量が１４にＤａのポリ（［−リシン）にオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを１〜１５個、有利には１〜３個
程度結合すると良好な結果が得られる。

水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）のゲノムは、Ｎ、ＮＳ
、Ｍ、ＧおＪ：びＬ（Ｄ５ＩＩ！ａ（ｆ）タンパク質を
コードしている約１１　、０００ヌクレオチド長の一本
鎖のＲＮＡ　（負の極性）で構成されていることが思い
だされる（ＨＵＡＮＧ、Δ、Ｓ、　ａｎｄ　ＢＩＳＨＯ
Ｐ、　１１．Ｌ、　（１９７３）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ
、、　４２．９６９−９８３）　Ａタンパク質Ｎは、ピ
リオンのＲＮＡの全長にわたっており、ゲノムの複製お
よび場合によってはその転写に関与している（−＾ＧＮ
ＥＲ，Ｒ，、Ｒ，、（１９７５）。

Ｉｎ　”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ”　（Ｈ，Ｆｒａｅｎｋｃｌ−Ｃ。

ｎａａｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｒ，Ｗａｇｎｅｒ、　Ｅｄ、）
　ｐｐ　１−９３．　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ　Ｃｏｒｐ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。現在までに
行なわれた研究でｍＲＮＡに対する合成オリゴヌクレオ
チドの最大の阻害効果は、ＡＵＧ開始コドンを含んでも
含まなくても標的ｍＲＮＡの５°領域に相補的なオリゴ
マーを用いた場合に有利に得られている（ＣＯＬＥＨＡ
Ｎ　　Ｊ、、　　ＩＩＩＲＡｓＩＩＩＨＡ　　八、、　
　ｌＮ０ＫＩＩＣＩＩＩ　　Ｙ、、　　ＧＲ［：ＩＥＮ
　Ｐ、Ｊ、、　ｅｔ　ｌＮＮ０ＵＹＥ　（１９８５）、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５．６０１−６０３；　　ＩＺ
ＡＮＴ　　Ｊ、Ｇ、、　　ｅｔ　　ＷＥＩＮＴＲ八ＵＢ
　　へ、　　（１９８５）　　５Ｃｆｅｎｃｅ、　　２
２９．　３４５−３５２；　　ＭＩＬＬＥＲＰ、Ｓ、、
　　＾ＧＲＩＳ　　Ｃ，Ｈ。

、　　ＡＵＲＥＬＩ八Ｎ　　Ｌへ、　　ＢＬＡＫＥ　　
Ｋ、Ｒ，、ＨＵＲＡＫ八旧　八へ、　　ＲＥＤＤＹ　Ｈ
，Ｐ、、　５ＰＩＴＺ　Ｓ、Ａ、、　ｅｔ　ＴＳ’ＯＰ
、０．Ｐ　（１９８５）　Ｂｉ。

ｃｈｉｍｉｅ　６７、７６９−７７６）。

そこで２種のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成す
る。一つはくオリゴデオギシリボヌクレオチド１、第１
図）ヌクレオチド１５個からなっており、ｖＳｖのＮタ
ンパク質をコードしているＩＩＩＲＮΔの５′末端領域
に相補的である。これは、５°末端近くのＡＵＧコドン
のまわりの主要リポソームの保護された開始部位とハイ
ブリダイズする。

２番目のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴデオ
キシリボヌクレオチド２、第１図）はヌクレオチド１３
個の内部配列をもっている。これはｍＲＮ　Ａのコード
領域の中央に位置している（Ｇａ１１ｉｏｎｅ、　　Ｃ
，Ｊ、　　Ｇｒｅｅｎｅ、　　Ｊ、Ｒ，、Ｉｖｅｒｓｏ
ｎ、　　Ｌ、Ｅ、　　ａｎｄＲｏｓｅ　Ｊ、に、　（１
９８１）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　３９．５２９−５３５
）。

これらの合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを上記の
ようにしてポリ（Ｌ−リシン）に共有結合する。オリゴ
デオキシリボヌクレオチドとポリ（Ｌ−リシン）の平均
の分子数の比はそれぞれ約０．５および０．６である。

収率はそれぞれ約２５％および３０％である。

オリゴデオキシリボヌクレオチド−ポリ（Ｌ−リ５゛末
端配列に相補的であり上記のように定義される複合体を
、感染多重度を１としてＶＳＶで感染させる前に［９２
つ細胞と共に２時間インキュベートする。ウィルスのタ
イターは１２時間後に限界希釈法によって測定する（旧
し１１八ＵＤ、　Ｐ、Ｇ、、　５ＩＬＨＯＬ。

Ｍ、、　ＦＡＩＩＩＩＥ、　Ｔ、　ａｎｄ旧ＬＨ＾ＵＤ
、　Ｘ、　（１９８３）、　Ａｎｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　
（Ｉｎｓｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ）　１３４Ｅ、　４０５
−４１６）。予備的な実験によって、この複合体がＶＳ
ｖによる感染後しばらくしてから（すなわら２時間後）
添加すると常に有効であることが示されている。

オリゴヌクレオチドとポリ（Ｌ−リシン）の複合体の抗
ウィルス活性に関する結果を次の人工に挙げる。

ＶＳｖに対するタイターは第１列に示した。

低下は用量に依存することと、抗ウィルス活性は培地中
の本発明の複合体の徂が１００ｎＨという低濃度でも検
出でき、４００ｎＨでは９９％以上の阻害が達成される
こととが′ｆＡ察される。

別の試験（人工の第３列）においては、１９２９１胞を
ポリ（Ｌ−リシン）とオリゴデオキシリボヌクレオチド
５°−末端配列の混合物と共にインキュベートしたが、
有意義な抗ウィルス活性はみられない。この結果が示し
ていることは、生物学的活性を得るにはオリゴデオキシ
リボヌクレオチドとポリ（し−リシン）との共有結合が
必要であるということである。さらに、１μＭまでの濃
度の分子７３１４．０００のポリ（し−リシン）と共に
細胞をインキュベートしてみてもウィルスの増殖に対す
る影響はまったく見られない。

表１の第２列には別の実験の結果を示した。この場合は
、１９２９＠胞を同；Δではない巳ＭＣＶウィルスで感
染する前に本発明の複合体と共に２時間インキュベート
する。感染の１５時時間巾ィルスの量を測定する。ＶＳ
Ｖに対する抗ウィルス活性とは違って、複合体の濃度を
変えてみてもＥＭＣＶの増殖に対する有意義な効果は認
められない。これは、ポリ（Ｌ−リジン）と複合化した
５°末端配列の抗体ウィルス活性の特異的な面を証明し
ている。

さらに、ＶＳＶのＮタンパク質をコードしているｍＲＮ
　Ａの内部配列に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオ
チドをポリ（Ｌ−リジン）に結合した複合体と共に細胞
をインキュベーションても、感染接１２時間で測定した
ｖＳＶタイターには有意義な影響はみられない。この結
果は人工の第４列に示した。このように、本発明の複合
体のハイブリダイゼーション部位の位置は本発明の複合
体の阻害効率に影響を与える。これは次の刊行物の結果
と一致しており（ＩＺＡＮＴ、　Ｊ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｗ
ＥＩＮＴＲＡＵＢ、　Ｈ。

（＋９８４）、　　Ｃｅ１ｌ　　３６．　１００７−１
０１５：　　＋１ＡＮＴ、　　Ｊ、Ｇ、　　ａｎｄ讐Ｅ
ＩＮＴＲＡＵＢ、　Ｈ，（１９８５）、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２２９．３４５−３５２；旧ＬＬＥＲ，Ｐ、Ｓ、、
　　八ＧＲＩＳ、　　Ｃ，ｌＬ、　　ＡＵＲＥＬＩＡＮ
、　　Ｌ、、　　ＢＬ八へＥ、　　に、Ｒ，、ＨＩＩＲ
ＡＫＡ旧、　　Ａ、、　　ＲＥＤＤＹ、　　Ｈ，Ｐ、、
　５ＰＩＴＺ。

Ｓ、八、　　ａｎｄ　　Ｔ’ＳＯ１Ｐ、Ｏ，Ｐ、　　（
１９８５）　　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　　６７゜７６９−
７７６）、ＩＩＩＲＮ　Ａの５゛領域がアンチセンスオ
リゴヌクレオチドによる翻訳の阻害に関して特に適して
いる標的の一つであることを示している。

ｖＳｖに感染した細胞およびＶＳＶに感染していない細
胞の中でのタンパク質の合成に対する複合体の効果を検
討した。

Ｌ９２９細胞を、感染の多重度を１としてｖＳｖで感染
させる２時間前に、ポリ（Ｌ−リジン）と複合体化した
ｍＲＮ　Ａの５°末端配列°または複合体化していない
ｍＲＮＡの５′末端配列と共にいろいろな濃度でインキ
ュベートする。感染５時間後メチオニン［３５Ｓコで細
胞を標識し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって酸不
溶性のポリペプチドを分析する。本発明の複合体では、
ＶＳＶがコードしているＮタンパク質の合成が（容量に
応じて）低下する。ＶＳｖがコードしているＭタンパク
質の合成は同様に低下するが、細胞性タンパク質の合成
は同時に増大することに注意すべきである。

２００ｏｍｏｌの５゛末端配列含有オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドと４００ｐｍｏｌのポリ（Ｌ−リシン）と
の混合物と共に８胞をインキュベートすると、すなわち
、本発明の複合体を使用した時と同じモル比および同じ
濃度でインキュベーションを実施すると、対照と比較し
てつ・イルス性タンパク質の合成の阻害効果はまったく
認められない。このように、オリゴデオキシリボヌクレ
オチド配列とポリペプチド支持体との間の共有結合は生
物学的活性にとって必要なのである。

別の結果では、本発明の複合体２００ｐｍｏの不在下ま
たは存在下でタンパク質の合成が測定される。

本発明の複合体は、感染していない細胞中では細胞性タ
ンパク質の合成に対して何の影響も示さず、ｖＳｖに感
染した細胞中で見られる細胞性タンパク質の合成の増大
は、おそらく、ｖＳｖによって誘発された宿主細胞のタ
ンパク質合成阻害が部分的に解除されることに起因する
のであろう。

本発明の複合体のウィルス性タンパク質合成に対する効
果を定量化するために、ＶＳｖがコードしているＮタン
パク質の合成の低下に相当する領域のデンジ１〜メータ
ーによる濃度分析を実施する。

ウィルス性のＮまたはＭタンパク質の伍は５５　ｋＤａ
の細胞性タンパク質ピークに対して規格化する。

第２図に、本発明の複合体によるＮおよびＭタンパク質
の合成の阻害を示す。黒く塗りつぶした四角（１）で示
した曲線はＮタンパク質を表わし、黒く塗りつぶした三
角（ム）で示した曲線はＭタンパク質に対応する。横軸
は本発明の複合体の濃度をｎ１ｙｌで示し、縦軸はタン
パク質（ＮまたはＭ）の相対量である。ウィルス性タン
パク質と細胞性タンパク質との比は、本発明の複合体の
濃度が上昇するに伴い、タンパク質Ｎでは２５から０．
１に、またタンパク質Ｍでは１３からほとんど検出でき
ない程のレベルに低下する。

第３図は、ＶＳｖに感染したし９２９細胞と感染してい
ない細胞中でのタンパク質合成に対する本発明の複合体
の効果を示した図である。

感染の多重度を１としてｖＳＶで感染する前に（黒い四
角■で示した曲線）または感染しないで（黒丸・で示し
た曲１）　、Ｌ９２９細胞をさまざまな濃度の本発明の
複合体と共に２時間インキュベートする。コントロール
として、オリゴデオキシリボヌクレオチドの５°末末端
列４００ｎＨと共にまたはこれを存在させずに（白丸Ｏ
）、ポリ（Ｌ−リシン）の存在下で１９２９細胞をイン
キュベーＩ・する。

ＶＳｖで感染した６時間後メチオニン［３５Ｓ１で４５
分間かけて細胞を標識する。酸不溶性の全放射能を測定
する。

横軸は本発明の複合体の濃度をｎＭで表わし、縦軸は［
３５Ｓ］メチオニンの取込み場をｃｐｍｘｌｏ−３で示
す（ｃｐｍ＝毎分のカウント数）。

第３図に示されているように、感染していない細胞を本
発明の複合体と共にインキュベートした場合には、酸で
沈澱できる全放射能は変化しないままである。細胞を本
発明の同じ複合体の吊を僧やしてこの複合体で処理し、
２時間後にＶＳＶと競合させく感染の多重度＝１）、感
染６時間後メチオニン［””３１で標識すると、用量の
増加に依存してタンパク質合成に増大が見られる。ここ
でちまた、複合体化してないオリゴデオキシリボヌクレ
オチド２００ｐｍｏｌとポリ（［−リシン）４００ｐｍ
ｏ　ｌとの８合物では、ＶＳＶで感染した細胞中でタン
パク質の全合成は変化しない。

これらの結果をすべて合せると、本発明の複合体の抗ウ
ィルス活性、上述の活性を得るための結合の必然性、本
発明の複合体の特異性およびシ９２９細中で使用する用
１での毒性のなさが確認される。

これらの結果は、本発明の複合体が培養細胞中でｖＳｖ
に対して特異的に有効な抗ウィルス活性を示すことを証
明している。

本発明は、活性成分として本発明の結合複合体を少なく
とも１種含有する生物学的試薬にも関する。

また本発明は、本発明の結合複合体を少なくとも１種用
いて遺伝子の発現をインビトロで、特に培養細胞培地中
で抑制する方法にも関する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で合成した２種のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの塩基配列を示す図であり、第２図は本発明
の複合体によるタンパク質ＮおよびＭの合成の阻害の様
子を示すグラフであり、第３図はＶＳＶに感染したシ９
２９細胞と感染していない細胞との中でのタンパク質合
成の阻害に及ぼづ本発明の複合体の効果を示すグラフで
ある。 ＠ｌ。 Ｆｌ（＋、２ １００　　２００　　　　　１ＪＡ　　ｎＭＦｌｏ、３

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、 −ｍは０〜３、好ましくは０または１の整数、−Ｒ＿１
   、Ｒ＿２、Ｒ＿３は同一でもよくまた異なつてもよく、
   １〜１０個、好ましくは１〜２個の炭素原子を有するア
   ルキルを表わすか、または基ＯＲ＿１、ＯＲ＿２、ＯＲ
   ＿３がそれぞれ独立してＯ＾−を表わし、−Ｙ及びＴは
   同一でもよくまた異なつてもよく、ＯまたはＳを表わし
   、 −Ｚ及びＷは同一でもよくまた異なつてもよく、Ｏ、Ｓ
   、ＣＨ＿２、ＣＦ＿２またはＮＨを表わし、−Ｂ＿１及
   びＢ＿２は同一でもよくまた異なつてもよく、アデニン
   （Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ
   ）またはウラシル（Ｕ）から選択された塩基を表わし、
   −（α、β）は（Ｈ、Ｈ）、（Ｈ、ＯＨ）または（ＯＨ
   、Ｈ）を表わし、 −Σは７以上の整数で、有利には７〜３０、好ましくは
   ７〜２０、特に１２〜１５であり、 −Ｘは１〜５の整数であつて有利には１であり、−Ｐは
   少なくとも５個のアミノ酸を有する天然または合成のポ
   リペプチド鎖であり、 環 ▲数式、化学式、表等があります▼ に属する窒素原子は同時にポリペプチドＰの側鎖の末端
   に属し、かつ／またはヒドラジンによつて改変されたＣ
   ＯＯＨ基に由来する▲数式、化学式、表等があります▼
   基に属する〕の結合複合体。
2. （２）Ｐが少なくとも５個のアミノ酸を有するペプチド
   鎖であり、 環 ▲数式、化学式、表等があります▼ に属する窒素原子が同時にポリペプチドＰの側鎖の末端
   に属することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   結合複合体。
3. （３）式II： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ、ｍ、α、β、ｘ、Ｒ＿１
   、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｂ＿１、Ｂ＿２は特許請求の範囲第
   １項に定義した意味を有し、Ｐは少なくとも５個のアミ
   ノ酸を有するポリペプチド鎖を表わし、その中で▲数式
   、化学式、表等があります▼基は該ポリペプチドの末端 ▲数式、化学式、表等があります▼基に由来し、かつ／
   またはアスパルチル及び／又はグルタミル残基の遊離▲
   数式、化学式、表等があります▼基に由来する〕の特許
   請求の範囲第１項記載の結合複合体。
4. （４）式III： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ、ｍ、α、β、ｘ、Ｒ＿１
   、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｂ＿１、Ｂ＿２は特許請求の範囲第
   １項に定義した意味を有し、Ｐは少なくとも５個のアミ
   ノ酸を有するペプチド鎖であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼基はポリペプチド鎖
   Ｐ′の構造 中に入つているアルギニル残基の側鎖の末端に属する〕
   の特許請求の範囲第１項記載の結合複合体。
5. （５）式IV： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、Σ、ｍ、α、β、ｘ、Ｒ＿１
   、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｂ＿１、Ｂ＿２は特許請求の範囲第
   １項に定義した意味を有し、Ｐは少なくとも５個のアミ
   ノ酸を有するペプチド鎖であり、その中で−（ＣＨ＿２
   ）＿４−基はポリペプチド鎖Ｐの構造中に入つているリ
   シル残基の側鎖に属する〕の特許請求の範囲第１項記載
   の結合複合体。
6. （６）要素ＹまたはＺの少なくとも１つが酸素ではない
   特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の結合
   複合体。
7. （７）式Ｖ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） 〔式中、ｍ、Σ、ｘ、α、β、Ｂ＿１、Ｂ＿２及びＰは
   特許請求の範囲第５項に示した意味を有する〕の特許請
   求の範囲第５項記載の結合複合体。
8. （８）下記式VI： ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） 〔式中、Ｂ＿１、Ｂ＿２、α、β、Σ、Ｘ及びＰは特許
   請求の範囲第５項に示した意味を有する〕の特許請求の
   範囲第５項記載の結合複合体。
9. （９）下記式VII： ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） 〔式中、Ｂ＿１、Ｂ＿２、Σ、Ｘ、ｍ及びＰは特許請求
   の範囲第５項に示した意味を有する〕の特許請求の範囲
   第５項記載の結合複合体。
10. （１０）下記式VIII： ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） 〔式中、Ｂ＿１、Ｂ＿２、Ｘ、ｍ、Σ及びＰは特許請求
    の範囲第５項に示した意味を有する〕の特許請求の範囲
    第５項記載の結合複合体。
11. （１１）下記式IX： ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） 〔式中、Ｘ、Σ、ｍ、α、β、Ｂ＿１及びＰは特許請求
    の範囲第５項に示した意味を有し、Ｃはシチジンを表わ
    す〕の特許請求の範囲第５項記載の結合複合体。
12. （１２）下記式Ｘ I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｘ I ） 〔式中、Ｂ＿１及びＰは特許請求の範囲第５項に示した
    意味を有し、Ｃはシチジンを表わし、Σは１２〜１５で
    あり、Ｘは１〜５であつて好ましくは１である〕の特許
    請求の範囲第５項記載の結合複合体。
13. （１３）Ｐが約５０００〜約４００００、特に約１００
    ００〜約２００００、有利には約１５０００の分子量を
    有する特許請求の範囲第５項〜第１２項のいずれかに記
    載の結合複合体。
14. （１４）下記式ＸII： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸII） 〔式中、 −Ｐは分子量が約１５０００のポリ（Ｌ）リシンを表わ
    し、 −Ｃはシチジンを表わし、 −Σが１５であり −塩基鎖Ｂ＿１が３′−ＴＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡ
    Ｃ−５′である〕及び下記式ＸIII： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸIII） 〔式中、 −Ｐは分子量が約１５０００のポリ（Ｌ）−リシンを表
    わし、 −Ｃはシチジンを表わし、 −Σは１３であり −塩基鎖Ｂ＿１は３′−ＴＴＡＣＡＣＧＧＡＧＣＡＡ−
    ５′である〕の特許請求の範囲第１２項記載の結合複合
    体。
15. （１５）下記式 I −２ ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −２） 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、ｍ、Σ、Ｂ＿１、Ｂ
    ＿２、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗ、α及びβは特許請求の範囲第１
    項に示した意味を有する〕の化合物の合成を行ない、−
    式 I −２の化合物を酸化して末端ヌクレオシド単位の
    ２′及び３′位置の炭素上に２つのアルデヒド官能基を
    導入して 下記式 I −３： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −３） の化合物を得、 −式 I −３の化合物を、末端がアミン化された基、特
    にＮＨ＿２である側鎖を少なくとも１つ有する鎖である
    ポリペプチドＰ−ＮＨ＿２により環元的にアルキル化す
    る（この反応は化合物（ I −３）のアルデヒド官能基
    とポリペプチドのＮＨ＿２基の間に生起される）ことに
    よつて式 I ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） の化合物を得、 −特に分子ろ過により式 I の結合化合物、 I −３の化
    合物及び結合していないＰＮＨ＿２の分別を行なうこと
    を特徴とする本発明の結合複合体の製造方法。
16. （１６）式 I −２： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −２） 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Σ、ｍ、Ｂ＿１、Ｂ
    ＿２、Ｙ、Ｚ、Ｔ、Ｗは特許請求の範囲第１項に示した
    意味を有し、（α、β）は（Ｈ、Ｈ）または（ＯＨ、Ｈ
    ）を表わす〕の化合物を、 式 I −４： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −４） 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Σ、ｍ、Ｂ＿１、Ｙ
    、Ｚ、Ｔ、Ｗは特許請求の範囲第１項に示した意味を有
    し、αはＨまたはＯＨを表わす〕の化合物から出発して
    、 これに式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −５） 〔式中、Ｂ＿２はＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵを表わし、有
    利にはＣである〕の化合物をＴ＿４ＲＮＡリガーゼの存
    在下に反応させて式 I −６： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −６） の化合物を得、 −次にゲルロ過して I −６の化合物を I −４の化合物
    及び反応していない I −５の化合物から分離し、 −次に細菌性アルカリホスファターゼを作用させて式
    I −２の化合物または 基 ▲数式、化学式、表等があります▼が 基 ▲数式、化学式、表等があります▼の場合は 式（ I −２）′； ▲数式、化学式、表等があります▼（ I −２）′ の化合物を得ることによつて得る特許請求の範囲第１５
    項記載の結合複合体の製造方法。
17. （１７）式 I −２の化合物を、リボシル化支持体を使
    用しその上にヌクレオチド単位を順次付加して固体相で
    得る特許請求の範囲第１５項に記載の結合複合体の製造
    方法。
18. （１８）特許請求の範囲第１項〜第１４項のいずれかに
    記載の結合複合体の少なくとも１つを含むことを特徴と
    する生物学的反応物。
19. （１９）特許請求の範囲第１項から第１４項のいずれか
    に記載の結合複合体の少なくとも１つを使用する、特に
    細胞培養培地中でのインビトロ遺伝子発現阻害方法。