JPH03500530A - 新規な両親媒性核酸接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な両親媒性核酸接合体 止−！ 狡止立国 この発明は、発現を抑制するための、溶解変調ｉ負成分に接合した特異的ポリヌ クレオチド結合ポリマーに関する。

者Ｊｕｔ避 細胞内発現の調節を可能とする試薬への興味と必要性力（増しつつあるが、この 試薬は、遺伝子と関連した様々な問題を解決する上で、至上の可能性をもつこと になろう、そうし）ツた試薬、特に相補性核酸試薬は、ウィルス本来の遺（云子 の発現を抑制する抗ウィルス剤として使用できよう。また、これらは、抗新生物 剤としても作用し、ガン細胞の増殖率を丁番デたり、ガン全体の増殖を抑制する 可能性もある。これら試薬は、細胞内で未知の機序によって転写産物に結合し、 １季定の構造遺伝子の発現を抑制することになろう。

この可能性に関して相当の関心が持たれ、多くの培養実験によれば、この手法は かなり有望視されること力（分力）ってきた。しかし、従来用いられていた数々 の手法にしま多くの欠点もある。治療用として有用な薬剤とするために番よ、こ の試薬は、全身投与量を比較的低くできるように、低濃度で有効性を発揮せねば ならない０次に、試薬は、比較的安定であって、様々なヌクレアーゼによる分解 に抵抗性を示す必要がある。

第三に、この試薬は、長いインキュベーション期間を回避するように、一度細胞 質に取り込まれたら迅速に拡散する必要があり、その相補的配列に極めて特異的 に結合しなければならない。第四に、試薬は、膜透過性があって、血中で濃度が 上昇しないように、低濃度で有効性を示さなければならない。

最後に、宿主の哺乳類への副作用が最小限であって、免疫反応を出来る限り押え られるオリゴヌクレオチド試薬を提供する必要がある。こういった種々の基準は 、様々な程度で妥協が必要であるが、今まで製られた試薬は、一般的使用には逼 かに及ばなかった。

聚１文献 単一塩基のミスマツチへの高い感受性を保持し、最大の選択性が得られるような 、比較的短鎖のプローブの使用は、以下の論文に示唆されている。５ｚｏｓ　ｔ ａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｓｏｌ。

（１９７９）　６８：４１９−４２９：　Ｗｕ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　（１９７２）　２３６：１９８；ＩｔａｋｕｒａおよびＲｉｇｇｓ 、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８０）　２０９：１４０１；Ｎｏｙｅｓ、　Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ＋１．　（１９７９）　２５４：　７４７２−７４７５；　 Ｎｏｙｅｓラット、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９ ７９）　７６：１７７０−１７７４；Ａｇａｒｗａｌら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｌｌ、（１９８１）　２５６：１０２３−１０２８゜Ｔｕｌｌｉｓら、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、（１９８０）　９ ３：９４１；０ｒｋｉｎら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｓｔ、（１９８３）　 ７１ニア７５；　Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　（１９８３）　８０：２７８；　Ｐｉｒａｔｓｕら、Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、（１９８３）　３０９：２８４−２８７：　Ｗａｌｌａ ｃｅら、　Ｇｅｎｅ（１９８１）１６：２１゜ ウィルスの複製を抑制する、特異的な核酸配列の使用に関する論文が、多数みら れる。例えば、Ｚａｍｅｃｉｎｋおよび５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７Ｂ）　７５：２８０−２８４ＨＴｕ ｌｌｉｓら、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ１．　（ １９８４）　８Ａ：５８（要約）；　Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄｓ、　Ｒｅｓ、　（１９８５）　１３：４９９１：Ｗａｌｄｅｒら、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：５６９−５７１；　Ｚａｍｅｃｉｎｋら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）　８３： ４１４３−４１４６゜各種トリエステルおよびメチルホスホン酸などの修飾核酸 も、発現の抑制に有効と見られてきた。Ｍｉｌｌａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒ ｙ（１９７４）　１３：４８８７−４８９５ＨＢａｒｒｅｔｔら、　上記の論文 　（１９７４）１３：４８９７−４９０６；　Ｍｉｌｌｅｒら、上記の論文（１ ９７７）１６：１９８８−１９９７；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　（１９８５ａ、　ｂ）　２４：６１３２および６１３４；Ｓｍ１ｔｈら、　 Ｐｒｏｃ、　？Ｊａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　（１９８６）８ ３：２７８７−９１；Ａｇｒｉｓら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８６ ）　２５：６２６８−６２７５；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 （１９８６）　２５：５０９２−５０９７゜相補的配列への結合性を高める修飾 型核酸配列は、以下の論文に見られる。Ｖｌａｓｓｏｖら、Ａｄｖ、　Ｅｎｇ、 　Ｒｅｇ、　（１９８６）：３０１−３２０；　Ｓｕｍｍ、ｅｒｔｏｎ、　Ｊ、 　Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、　（１９７９）　７８ニア７−９９；　Ｋｎｏｒｒ ｅ（１９８６）　Ａｄｖ、　Ｅｎｇ、　Ｒｅｇ、　１９８６：２７７−３００゜ ポリエチレングリコールに結合するタンパク質の免疫源性の低下については、以 下の文献に記載されている。　ＴｏｍａｓｉおよびＦａｌｌｏｗ、ＷＯ３６１０ ４１４５（ＰＣＴ１０５８５１０２５７２）；　Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９８４）　７：１７５− １８６　、米国特許第４．５１１．７１３号、および米国特許第４．５８７．０ ４４号も参照のこと。

主所少翌后 細胞内発現を調節するために、注目の配列に相補的な比較的短い核酸配列、リン カ−１および最終産物に両親媒性、通常では親水性より疎水性（親水基によって 両親媒性が生じるような）を付与する基を含めて、新規な核酸複合体がいろいろ と提供されている。核酸部分には、通常もしくは異なった糖、リン酸基もしくは 修飾リン酸基、または通常の塩基以外の塩基が含まれることがあり、そこでは、 修飾によって、対象の配列への結合が妨害されない、そういった組成物は、新生 物細胞、ウィルス感染細胞中でのウィルスタンパク質、ヒトならびに動物の病原 体の必須タンパク質（単数もしくは複数）なとで、ｔｎＲＮＡの成長および／ま たは特定の構造遺伝子の発現を抑制するために用いられる。

豚！胆揉■脱ユ この発明は、細胞内でのｍＲＮＡの成熟および／または構造遺伝子の発現を抑制 する、新規な核酸接合体を提供することを目的とする。各種の接合体には、比較 的短鎖のオリゴヌクレオチド配列、リンカ−１および両親媒性産物を形成するよ うにＨＬＢ　（親水性・親油性バランス）を変更する基が含まれている。生成物 の両親媒性は、細胞膜を介しての接合体の輸送に寄与し、核酸誘導体の水溶性の 増大（例えば、長鎖ホスホン酸メチルの水溶性を増大させるような両親媒性基の 使用）、およびエキソヌクレアーゼによる消化に対する正常核酸の安定性亢進な どの利点がさらに得られる。

この発明の化合物は、はとんどが以下の一般式を有する。

Ｘは一般に、電子対、カルコゲン（酸素もしくはイオウ）、またはアミノ、特に ＮＨを示す。

Ｚは、天然型もしくは合成の糖残基を示し、それらは五炭糖の２’、３’ならび に５′水酸基の２カ所および六炭糖での相当部位で結合したものである。一般に 、糖は、リボースもしくはデオキシリボース、またはその他、アラビノース、キ シロース、グルコースもしくはガラクースなどの五炭糖もしくは六炭糖（特には 五炭糖）が適している。

Ｎは、天然のプリンもしくはピリミジンと結合やハイブリッド形成可能な天然も しくは非天然塩基（プリンもしくはピリミジン）のいかなるものでもよく、これ らプリンおよびピリミジンには、アデニン、シトシン、チミジン、グアニジンの ような天然型デオキシリボースヌクレオシドのプリンおよびピリミジン、または ウラシル、イノシンのような他のプリンおよびピリミジンなどが挙げられる。

Ｌは、少なくとも１原子の多機能基に由来するリンカ−であって、水素を除いた 約６０個以下の原子、一般には約３０個までの炭素原子を有する、水素を除いた 約３０個以下の原子、通常では２０個以下の炭素原子、および約１０個までのへ テロ原子、より一般には約６個までのへテロ原子、特にはカルコゲン、窒素、リ ンなど、非オキソカルボ、ニル基（カルボキシカルボニル基）、オキソカルボニ ル基（アルデヒドもしくはケトン）、またはそれらのイオウもしくは窒素含有原 子団、例えば、チオノ基、チオ基、イミジル基など、およびジスルフィド基、ア ミノ基、ジアゾ基、ヒドラジノ基、オキシミノ基など、ホスフェート、ホスホノ などを示す。

Ｍは、この分子に両親媒性、特にホスフェートに関して疎水性、ホスホネート（ これらの炭素：へテロ原子の比は、少なくとも２：１、通常では少なくとも３： １、さらに２０：工を越えるまで）に関して両親媒性を付与する溶解性調節成分 であって、少なくとも６個の炭素原子そして約３０個以下の炭素原子を含む炭化 水素、ポリオキシ化合物（アルキレンオキシ化合物）を含むことがあり、これら の化合物中では、酸素原子は約２ないし１０個、通常では２ないし６個、好まし くは２ないし３個の炭素原子と結合し、少な（とも約６単位、通常では約２００ アルキレンオキシ単位以下、より一般には約１００単位以下、好ましくは約６０ 単位以下であろう。

一方のＹはＬに対する結合子であって、他方のＹは一価のオキシ、チオ、アミノ 、糖もしくはそれらの置換型官能基、または約２０炭素原子未満のアルキル基、 通常では約６炭素原子未満、Ｐに結合した場合では、水素工ないし３０原子、通 常では１ないし１２原子のヒドロカルビル基もしくはアクリル基、または工ない し４個のへテロ原子団（Ｚに結合する場合、オキシ、チオもしくはアミノ）を有 する置換型ヒドロカルビル基もしくはアクリル基である。

ａは、少なくとも５、そして約５０以下、通常では約３５以下である。

リン成分には、ホスフェート、ホスホラミデート、ホスホルイミデート、ホスホ ロチオエート、ホスホロチオネート、ホスホロチオレート、ホスホルアミドチオ レート、ホスホネート、ホスホルイミデートなどが含まれる。

プリンおよびピリミジンには、チミジン、ウラシル、シトシン、６−メチルウラ シル、４，６−シヒドロキシピリミジン、イソシトシン、ヒボキサンチン、キサ ンチン、アデノシン、グアノシンなどが含まれる。

糖には、リボース、アラビノース、キシリロース、またはそれらのα−デオキシ 誘導体が挙げられる。その他のヌクレオシドとして、ヘキソースを利用すること ができる。

多様なリンカ−を、末端ヌクレオチドの性質、リンカ−基がオリゴヌクレオチド の合成中に存在するか否かで選択される官能基、溶解性調節成分上に存在する官 能基に応じて利用することができる。多数のリンカ−が市販されていて、多官能 化合物を連結するために用いられてきた。リンカ−には以下のようなものが含ま れる。　０ＣＨｚＣＨＪＨＣＯ（Ｃ）Ｉｔ）−ＣＯＮＨ：０ＣＨｚＣＨｚＮＨＸ 　（ＣＨｚ）−ＮＨ；　ＯＰ（０）（ＯＨ）ＮＨＣ）ｌ（ＣＨｚ）−ＣＯＮＨ； 　０ＣＨ２ＣＨｚＮ）ＩｃＯφＳ　；　ＮＨ（ＣＨり−ＮＯ；　０（ＣＨｚ）− ０ＨＯ（ＣＨｚＣＨｚＮＨ）−：　ＮＨ（ＣＨり−５ＹＮ；　Ｃｏ（ＣＨｄｌｌ ＣＯニー５ｃＨｚｃｎｚｃｏ　−；　−０（ＣＨｚＣＨＪＨ）ａ　−；　−ＮＨ （ＣＨｚ）ａｃＯ；　−３ＣＨｚＣ）ｌｚＣＯ；　ＣＯφＮＹＳ　；　（ＮＣＨ ｚＣＨｚ）−ＣＲｚＮ　；０（ＣＯ）ＮＨ（ＣＨｚ）、、ＮＨ；通常では約５０ ０ないし２０００ダルトンのポリグイシン、ポリリジン、ポリメチオニンなどの アミノ酸のホモおよびコポリマー（電荷の有無に拘らない）。式中、Ｘは２．５ −キノンシルを示し、Ｙは、スクシニミジルを形成する（３−スクシンジオイル ）を示し、ｎは、通常では２ないし２０の範囲、より一般には２ないし１２であ って、ｍは、１ないし１０、通常では１ないし６である。

親油性／両親媒性基には、様々な原子団があり、脂肪族、芳香族、脂環式、複素 環式化合物、またはこれらの組み合わせが挙げられる。それらの化合物は、炭素 原子２個あたりへテロ原子１個または０個を有し、電荷の有無に拘らない、通常 では炭素数が少なくとも６、より一般には１２、および約５００以下、通常では 約２００以下から成る。これらには以下のものが含まれる。炭素数が少なくとも ６、そして約３０未満、通常では約２４以下から成るアルキル基であって、炭素 数が少なくとも約６、通常では少なくとも約１２、そして約２４未満からなる脂 肪酸、脂肪酸の炭素数が一般には約１２ないし２４個の範囲にあるグリセリド（ それには、−ｍに２もしくは３位または再位置で１ないし２個の脂肪酸が付いて いる）、１ないし４個の環を有する芳香族化合物、アルキレンの炭素数が２ない し１０、一般には２ないし６、より一般には２ないし３である、モノもしくはポ リ環式、融合もしくは非融合のポリアルキレングリコール、通常では少なくとも 約６単位、より一般には少なくとも約１０単位、そして一般には約５００単位未 満、より一般には少なくとも約２００単位未満、好ましくは約１００単位未満で あって、アルキレングリコールがホモポリマーまたはコポリマーであり得るもの ：アルキル基の炭素数が少なくとも約６、−ｍには少なくとも約１０、および約 ２４以下、一般には約２０以下のアルキルベンゾイル；アルキル基の炭素数が少 なくとも約６、一般には少なくとも約１２、および約２４以下、−ｉには約２０ 以下のアルキルホスフェートもしくはホスホネートなど。

溶解性調節成分は、生理的条件下で荷電しているかまたは非荷電（非荷電が好ま しい）であって、通常では水素以外の原子１０個の基あたり１電荷を有するもの である。例えば、約４０ないし５０単位のポリエチレングリコール、エチレンと プロピレングリコールとのコポリマー、ポリエチレングリコールのラウリル酸エ ステル、トリフェニルメチル、ナフチルフェニルメチル、パルミテート、ジステ アリルグリセリド、ジドデシルホスフプチジル、コレステリル、アラキトニル、 オクタデカニロキシ、テトラデシルチオなどの基が挙げられる。

可能性のある官能基には、オキソ、チオ、カルボニル基（オキソもしくは非オキ ソ）、シアノ、ハロ、ニトロ、脂肪族の不飽和基などが含まれる。

以下の一般式のオリゴヌクレオチド接合体が、特に興味深い。

ＸＩは、窒素または酸素を示す。

Ｚｌ　は、３′および５′位で置換されたリボースまたデオキシリボースを示す 。

１個のＹｌはＬ′への結合であり、そして他のＹｌは炭素原子数０〜３のヒドロ キシ、アルキル、アルコキシ又はアミノ（置換されたアミノ、例えばアルキル、 アシル等を含む）、又は５炭糖、特にリボース又はデオキシリボース（Ｐ及び水 素への結合の場合）、アルキル、又は炭素原子数１〜１０個、通常１〜６個のア シル、またはアルキル（Ｚｌに結合する場合）である。

Ｎｌ　は天然プリン及びピリミジンにハイブリダイズすることができる任意のプ リン又はピリミジンであるが、好ましくは天然プリン又はピリミジンである。

Ｌ′は、炭素数が少なくとも約２０、そして約３０以下、一般には約２０以下の リンカ−を示し、酸素、窒素ならびにイオウ、特にはオキシ、アミノもしくはチ オである０ないし１０個、一般には工ないし６個のへテロ原子を有する。

Ｍｌ　は、好ましくは少なくとも約２０単位、そして約２００単位以下、通常で は約１５０単位以下のポリアルキレンオキシ基の溶解性調節成分であって、疎水 性または両親媒性を示し、そのアルキレン基は、炭素数が２ないし３から成る。

ａｌは、少な（とも５、通常では少なくとも７、そして通常では約５０以下、一 般には約３０以下、より一般には約１０ないし３０、好ましくは約１３ないし３ ０である。

この発明の組成物を調製する際、上記のオリゴヌクレオチドおよび溶解性調節成 分は、通常では独立成分として存在し、リンカ−アームによって結合可能でる。

オリゴヌクレオチドは、任意の便利な合成法によって調製できる。組換え法は、 はとんど利用できないが、有用となる場合がある。ポリヌクレオチドを調製する ための合成装置の各種市販品がＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、 、　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、＋およびＰｈａｒｍａｃｉａなど多数の会社 から入手できる。トリエステル、ホスホラミディティ、ホスホネートなどとして ブロックオリゴヌクレオチドを使用するために、数々の方法が知られており、環 化法が用いられると、個々のヌクレオチドは連続して添加される。

合成の終了時点では、様々なプロトコルを使用できる。殆どの場合で、末端のブ ロック基を除去することができ、末端ヌクレオチドは、リンカ−の添加によって 修飾することができ、リンカ−が最終のオリゴヌクレオチドに特異的となり得る 。末端のブロック基がリンカ−の全体または一部として作用し得る場合もある。

また、オリゴヌクレオチドは担体から除いて、さらに操作することもでき、その 際、特に担体に対するリンカ−が疎水性の修飾域を結合するためのリンカ−とし て使用可能である。オリゴヌクレオチドの５′または３′末端をさらに分画する ための様々な方法が、ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ。

ＤＮＡ　（１９８５）　４：３２７−３３１；　ＣｏｎｎｏｌｌｙおよびＲｉｄ ｅｒ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、（１９８５）　１３：４４８５−４５ ０２に見られる。

官能基に応じて、アミン、エステル、無機ならびに有機の酸素ならびにイオウエ ーテル、アミンなどを産出するために、様々な反応が利用できる。カルボキシル 基と作用させる場合、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミド、スクシンイ ミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステルなどの様々な活性基を使用できる 。

数々の活性な官能基、例えば、イソシアネート、ジアゾ基、塩化イミノ、イミノ エステル、無水物、ハロゲン化スルフィニル、イソチオシアネート、塩化スルホ ニルなどを使用できる。非核酸域成分核酸成分に結合する様々な反応を実施する ための条件は、ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ、　ＤＮＡ　（１９８５）　４：３２７ −３３１；Ｓｍ１ｔｈら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　（１９８５ ）　１３：２３９９−２４１２に見られる。

リンカ−のオリゴヌクレオチドへの添加の前後、またはそれと同時に、溶解性調 節成分をリンカ−に添加することができる。はとんどの場合、溶解性調節成分は 、オリゴヌクレオチドに対するリンカ−の反応の後に添加する。リンカ−へ溶解 性調節成分を結合させるほうが望ましい場合もあり、その際、リンカ−はオリゴ ヌクレオチドに結合し、オリゴヌクレオチドは支持体に結合する。すでに指摘し たように、リンカ−と溶解性調節成分との反応は、その際の特定官能基、疎水性 域の性質、要求される反応条件などとともに変化する。

はとんどの場合、反応は、温和であって、極性溶媒、極性もしくは非極性の組み 合わせ溶媒中で生じる。様々な溶媒を用いることができ、水、アセトニトリル、 ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、塩化メチレンなどが含まれる。反応 温度は、はとんど約−１０ないし６０°Ｃの範囲である。通常では、複合体の成 分間の反応が終了した後に、得られた産物を精製工程にかける。

精製法は、オリゴヌクレオチドが支持体に結合しているか否かに応じて変えるこ とができる０例えば、オリゴヌクレオチドが支持体に結合している場合では、オ リゴヌクレオチドへのリンカ−の添加後に、未反応鎖を分解することができ、そ の結果、得られた産物に夾雑物の入ることを防ぐことができる。そういった場合 、オリゴヌクレオチドへのリンカ−の結合は、合成支持体（例えば、濃アンモニ ア）からの分解に耐えるために、十分安定でなければならない、オリゴヌクレオ チドが支持体に結合していない場合、リンカ−との反応だけか、溶解性調節成分 の中間体に対する接合体もしくは最終産物としての反応において、各中間体また は最終産物は、電気泳動、溶媒抽出、ＨＰＬＣ，クロマトグラフィーのような従 来の技術によって精製することができる。ｖｃいて、精製産物は使用に備える。

この発明の生成物は、オリゴヌクレオチド配列が目的の配列に相補的となるよう なものを選択する。目的の配列は、原核細胞もしくは真核細胞、ウィルス、正常 もしくは新生物細胞中に存在することがある。これらの配列には、細菌の配列、 プラスミドの配列、ウィルスの配列、染色体の配列、ミトコンドリアＤＮＡの配 列、色素体ＤＮＡの配列などが挙げられる。これらの配列には、コードタンパク 質のためのオーブンリーディングフレーム、リポソームＲＮＡ　、　５ｎＲＮＡ 　、　ｈｎＲＮＡ　。

イントロン、非翻訳の５′末端ならびに３′末端隣接オープンリーデイングフレ ームなどが含まれる。従って、この発明の配列は、ＲＮＡ転写物の利用率の抑制 、特定タンパク質の発現の抑制、リプレッサー発現の抑制による特定タンパク質 の発現の促進、ウィルスもしくは新生物細胞の増殖の抑制などに関与することが できる。細胞の表現型の修飾、ウィルス、細菌、タンパク質、マイコプラズマ、 クラミジアなどの病原体の増殖の抑制、または新生物細胞もしくは正常細胞の特 定のクラスに関する罹病率を低下させるために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　 ｖｉｖｏで用いることができる。従って、この発明の組成物は、宿主への投与に よって治療用に、またはある種の病態ではこの発明の１つ以上の化合物を、細胞 の天然遺伝子の転写および／または発現の抑制に使用することができる。この発 明の組成物は、哺乳動物の宿主における様々な病原体からの保護に使用すること ができる。これら病原体には、腸内毒素細菌、肺炎球菌、淋菌など、シアルシア 属、アメーバ属など、癌腫、肉腫、リンパ腫のような新生物細胞など、ヘルパー 細胞、サプレッサー細胞、ＣＴＬ　、　ＮＫ　、　ＡＤＣＣのような特異的Ｂ細 胞、特異的Ｔ細胞などが挙げられる。

この発明の配列は、標的配列に対するこの発明の組成物の結合に関与した何らか の機序によって、転写産物の成熟およびタンパク質の発現を抑制し得るように選 択することがある。

これらの機序には、修飾の抑制、核膜を介した輸送の阻害、エキソヌクレーゼに よる分解などが含まれることがある。

この発明の配列は、増殖因子、リンホカイン、イムノグロブリン、Ｔｅｌ胞レセ プタ部位、ＭＭＣ抗原、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼ、抗体耐性、重複薬 剤耐性（ａ＋ｄｒ）、代謝過程でアミノ酸、核酸などの形成に関与する遺伝子、 ＤＨＰＲなど、およびオープンリーディングフレームと会合するインドロンまた は隣接配列を発現する配列のような配列に相補的であり得る。

以下の表に、この発明の組成物の別の応用を幾つか例示する。

合成りＮＡの治療面での応用 対象領域　特異的適用標的 この発明の組成物は、組成物がｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用さ れるか否に応じて、様々な方法で宿主に投与することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏでは、細胞質および核などの細胞内部へ膜を介しての輸送によって特定遺伝子 の発現を調節するように、この組成物を栄養培地に添加することができる。この 発明の組成物には、マイコプラズマの培養物中で哺乳動物細胞を保護する上で、 数々の代謝過程（例えば、特定産物の産生）に関する様々な発現、産生の様々な 分布などの影響を評価するような特定の使用法がある。この発明の組成物の細胞 内輸送には特殊な添加物を必要としないが、この発明の組成物は、リポソームや その他の粒子中へのカプセル化によって修飾が可能であり、例えば、非イオン性 界面活性剤、センダイウィルスなどの透過剤との結合に使用することもできる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ投与では、特定の目的に応じて、この発明の組成物を、注射、 注入、錠剤などの様々な方法で投与できるので、組成物は、経口、静脈内、腹腔 内、皮下、病巣内などで投与することができる０組成物は、様々な方法で製剤化 が可能であって、脱イオン水、水、リン酸塩添加生理食塩水、エタノール、水溶 性エタノールなどの様々な生理学的に安全な溶媒に懸濁ことかできる。またはリ ポソームもしくはアルブミン微粒子に製剤化できる。

適用および投与法が多様であるので、特定の組成物を示唆することはできない、 むしろ、各適用において、この発明の組成物は、従来方法での試験が可能であっ て、適切な濃度を実験的に決定することができる。安定剤、緩衝液、添加剤、界 面活性剤、賦形剤などを含めることもできる。これらの添加剤は従来からあり、 通常では約５重量％未満、一般には１重量％未満で含有し、適宜、有効量とする 。賦形剤については、活性物質の必要量に応じて９９．９％を越えるまで含める ことができる。

以下の実施例は、例示のために提供するものであって、限定するためではない。

ｌ二」皇 スＪＬ［吐ｌ Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋ（アミノ１ンク　、ベンゾキノンおよびビス−アミノへキシ ル　ボＩエチレングＴコール　いた、ＤＮＡのポリエチレングリコール沃　の人 ミ　イ　゛に　ＤＮＡ第１ゴ　レオ　゛の　・ムＤＮＡの化学的合成は、市販の いかなるＤＮＡ合成装置により、従来のホスホラアミダイト法を若干変えて実施 した。

この方法は、Ｃａｒｕ　ｔｂｅｒｓらが記載した手法（Ｂｅａｕｃａｇｅおよび Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、欧州特許出願第８２／１０２５７０号）の変法である。

この方法では、無水アセトニトリルに溶解した０、　１　Ｍヌクレオシドホスホ ラミダイトを等量の０．５Ｍテトラゾールと混合してから、コハク酸塩スペーサ ーを介して対照の細穴ガラス支持体に結合した成長ＤＮＡ鎖の５′水酸基末端の ヌクレオチドにカップリングさせた（ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅ ｒｓ。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８０）２１ニア１９−２２） 、ヌクレオシドの添加後に、無水酢酸による未反応５′水酸基へのキャップ構造 の付加、ヨウ素酸化、およびトリクロロ酢酸−塩化メチレン中での５′脱トリチ ル化を行った。続いて、樹脂結合オリゴマーを、無水アセトニトリル中での徹底 した洗浄によって乾燥させ、この工程を繰り返した。この方法を用いた正常の周 期は、９８％を越える縮合効率で１２分であった（トリチル基の離脱によって判 定）。

合成の最終段階として、産物のオリゴヌクレオチド鎖から除去し、Ａ１１ｎｏｌ ｉｎｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ 、　ＣＡ）を用いてアミノエタノールホスホラミダイトを５′水酸基に付加した 。続いて、樹脂結合オリゴヌクレオチドは、脱保護し、ホスフェート型の結合に 適した方法を用いてカラムから除去した。

通常のホスホジエステルの場合、カラムからの除去および濃水酸化アンモニウム 中５５°Ｃで一晩の加水分解が適していた。

続いて、産物を５０％エタノールから数回凍結乾燥し、逆相肝ＬＣＣ−８シリカ 充填カラムにより、５ないし５０％のア七ト二トリル／　２５　ｍＭ酢酸アンモ ニウム（ｐＨ６，８）の溶出液で直線勾配をかけて精製した。必要に応じて、こ の物質は、２０％アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，５）を 溶出液に用いて、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ　ＤＥＡＥ　６０−７充填のイオン交換１ ’１ＰＬＣによって一層の精製を行うことができる。次に、回収された産物は、 １５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってその特徴を調べた。この電気泳 動は、Ｍａｘａ＋ａ　Ｇ１１ｂｅｒｔ＋Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ　（１９８０）　６８：４９９−５６０に記載された通りに実施した。仕上 げ後のゲル中のオリゴヌクレオチドは、５ｔａｉｎｓ−ａｌｌを用いて視覚化し た。この５ｔａｉｎｓ−Ａｌｌ法は、ＤＮＡメチルホスフェートまたはエチルト リエステルなどの非電荷ヌクレオチドには作用しなかった。

完全に脱保護して精製した産物は、続いて、適切なカップリング法を用いて適当 なポリエチレングリコール誘導体に転化する。ベンゾキノン、カルボジイミド、 ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン− １−カルボキシレート）、５ＰＤＰ　（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジ ルジチオ）プロピオネート、カルボニルジイミダール、Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋ　、 ジスクシンイミジルスベリミデイトおよびフェニルイソチオシアネートを含む幾 つかの方法を用いることができる。

ベンゾキノンへの１ンカー言゛′ＤＮＡの力・・プ１ング　およびビス　アミノ へキシル　ポリエチレングリコールへの加最初の工程で、ビス（アミノヘキシル ）ポリエチレングリコールを、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）に 溶解したベンゾキノンのモル比で１００ないし１０００倍過剰量と反応させる。

室温で１時間後、過剰な未反応ベンゾキノンをセファデックスＧ−２５のカラム クロマトグラフィーで除去する。続いて、活性化されたポリエチレングリコール を０．１　Ｍ重炭酸ナトリウム溶液に添加し、モル比１０：１で反応性のアミン リンカ−鎖を含むＤＮＡオリゴマーと反応させ、反応を完了させた。反応（通常 では一晩）の終了時、未反応オリゴマーをセファデックスｃ−ｉｏｏのゲル濾過 によって除去し、複合体の特徴は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調 べる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　１ａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、　ＮＹ　参照）。必要に応じて一層の精製を、イオン交換クロマトグ ラフィーおよびゲル電気泳動を用いて行うことができる。

これらの反応産物の構造式は以下のとおりである。

ス去ｌ辻ｉ Ａｍｉｎｏｌｉｎｋおよびカルポニルジイミ　゛ゾールシ　ポリエチレングリコ ール　いた　ＤＮＡのポ１エチレング丁コニ五Ｍ盪鉢至金底 この実施例では、Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋオリゴヌクレオチドを、実施例１での記載 と同様に合成した。オリゴマーを支持体から除去し、アンモニア中で脱保護した 後、溶液を真空蒸発乾燥し、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）で０．１　Ｍ としてから、Ｇ２５スパンカラム上で精製し、この物質をナトリウム塩に転化し て低分子量の夾雑アミン含有物質を除去した。この溶液は、続いて、カルボニル ジイミダゾール活性化ポリエチレングリコール（平均分子量＝２０．０００）の ０．２Ｍ溶液とし、２３°ｃで一晩反応させた。

未結合オリゴヌクレオチドをセファデックスＧ１００のゲル濾過によって除去し た。このカラムクロマトグラフィーにおいて、複合体がカラムの排除体積中に溶 出し、遊離のオリゴヌクレオチドおよび未結合ポリエチレングリコールは遅れて 溶出した。続いて、この物質を真空中で濃縮し、複合体の特徴をポリアクリルア ミドゲル電気泳動にて解析した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）上記文献） 。

スクシンイミジルゝ　ポリエチレングリコール　たこの方法では、アミノリンク ホスホロアミダイトのさらなる付加なしでトリチル基を除去すること以外は例１ のようにして、ＤＮＡを合成する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製 の後、標準法［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８３） １１：６２２５−４２；　Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）、前掲；Ｍａｘａ ｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８０）７４：５６０ −５］　に従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの前向き反応により、生成り ＮＡをリン酸化する。ラベル化されたオリゴマーは、ＤＥＡＥクロマトグラフィ ーおよびＣ−１８逆相カラム（例えばＷａｔｅｒｓ　Ｃ−１８ＳｅｐＰａｋ　） により、未反応のＡＴＰから分離され得る。試料を、分析用の２０％ポリアクリ ルアミドゲル上で純度についてチェックする。

次いでリン酸化されたオリゴマーを、ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ　、　ＤＮＡ（１ ９８５）　４：３２７−３１の方法に従って、ＥＤＣカルボジイミド存在下で１ −メチルイミダゾ、−ルおよびヘキサンジアミンで処理する。この反応は、次の 構造を有するホスホロアミデート結合を介してジアミンリンカ−をオリゴヌクレ オチドに共有結合でつなぐ。

そしてオリゴマーのアミンリンカ−アームを次のようにしてＮＨ３−スクシニル モノメトキシオキシポリエチレングリコール（ＭＷ−５０００）と縮合させる。

オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む５０＋ａＭリン酸ナトリウ ム緩衝液、ｐ）１７．１中、リットル当り１００オの最終濃度に溶解する。この 溶液に１０倍モル過剰の５Ｓ−ＰＥＧ（５０００）を乾燥固体として添加し、溶 解させ、そしてその反応混合物を２５°Ｃにて一晩インキユベートする０次いで 生成物を、水中の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００上でのゲル濾過クロマトグラフ ィーにより精製し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により特徴付ける。

最終生成物の構造は下記のものである：イミ　ゾール２　カルボン　エスールお よびビスーアミノアルキルボ１チレング１コール　た　ＤＮＡのボ１エチレング １コール憬　の入 この例では、例１において与えられた方法に従ってＤＮＡを合成した。合成後、 生成物は、該分子の５′一端からトリチルが遊離された状態で合成支持体上に保 持された。ついで該固体材料を無水アセトニトリルで十分に洗浄し、そして乾燥 アルゴンの流れのもとで風乾させる。プラスチックのシリンジを使って、無水ア セトニトリル中に溶解された０、３Ｍカルボニルジイミダゾールｌ　ｃｃを、オ リゴマーを結合した支持体を含む合成カラムを通して１時間に渡ってゆっくり押 出した。該カラム上の５′−カルボニルイミダゾール活性化オリゴマーを１５ｄ のアセトニトリルで洗って過剰の試薬を無くし、続いてアセトニトリル中０．１ Ｍのビス（アミノへキシル）ポリエチレングリコール、水、アセトニトリルおよ び塩化メチレンで１６時間連続して処理した。ポリエチレンオリゴマー接合体を 、濃縮水酸化アンモニウムで溶出し、そして５５℃での５時間のインキュベーシ ョンにより同様に脱保護した。

次にその反応生成物を、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋ｐＨ７，５を１分当り０、５　 ｍにて流すＴＳＫ　Ｇ４０００Ｓ−カラム上での高性能ゲル濾過クロマトグラフ ィー（ＨＰＧＦＣ）により精製する。アガロースゲル電気泳動によりさらに精製 を行ってもよい。この方法により合成された最終接合体の構造は次のようである ：この例では、例１において与えられた方法に従って、マウスのβ−グロブリン ｍＲＮＡの開始領域に相補的な２０ヌクレオチドのＤＮＡを合成した。生成物は 、該分子の５′一端からトリチルが遊離された状態で合成支持体上に保持された 。ついで固体材料を無水アセトニトリルで十分に洗浄し、そして乾燥アルゴンの 流れのもとで風乾させる。プラスチックのシリンジを使って、無水アセトニトリ ル中に溶解された０、　３　Ｍカルボニルジイミダゾール１　ｃｃを、支持体に 結合したオリゴマーを含む合成カラムを通して４５分間ゆっくりと押出した。

酸カラム上の５′−カルボニルイミダゾール活性化オリゴマーを１５ａｆのアセ トニトリルで洗って過剰の試薬を無くし、続いてアセトニトリル：水（１０：１ ）中０．２Ｍのデカンジアミンで３０分間処理した。該カラム上の該物質をアセ トニトリルおよび水で洗って未反応のデカンジアミンを無くし、濃水酸化アンモ ニウムで溶出した。カラムからの溶出の後、オリゴマー接合体を含む水酸化アン モニウム溶液を封管バイアル中に入れそして５５℃にて５時間インキュベートし た。

次いで、生成物を５０％水性エタノールから数回凍結乾燥し、そして逆相ＨＰＬ ＣＣ−８シリカカラムにより、直線勾配において５〜５０％アセトニトリル／２ ５１酢酸アンモニウム、ｐｉ（６，８で溶出して精製した。必要であれば、溶出 液として２０％アセトニトリル／２５＋ｎＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６，５を使 ったＮｕｃｌｅｏｇｅｎ　ＤＥＡＲ６０−７上でのイオン交換クロマトグラフィ ーにより、さらに精製してもよい。回収された生成物を、ＭａｘａｗおよびＧ　 ｉ　１　ｂｅｒ　ｔによりＭｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　（１９８０）６８：４ ９９−５６０中に記載されたようにして行う１５％ポリアクリルアミドゲル中で のゲル電気泳動により特徴付けた。終了したゲル中のオリゴヌクレオチドは５ｔ ａｉｎｓ−ａｌｌを使って可視化された。

第一アミンの存在は、二つの方法により決定された。第一は、フルオレスカミン との反応は第一アミンの存在に特徴的な蛍光生成物をもたらすが、アミンリンカ −を欠く以外同じタイプの対照オリゴマーを同様に処理しても蛍光は全く観察さ れなかった。第二は、デカン接合体を１００　ｍの０．１　Ｍ炭酸水素ナトリウ ム中に溶解し、これに１■のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を 加えた。１時間のインキュベーション後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５スパンカ ラム上でのゲル濾過により、未反応のＦＩＴＣを除去した０次いで生成物を、前 述のようにポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そしてＵＶ照明のも とて生成物の蛍光バンドを可視化した。５ｔａｉｎｓ−ａｌｌでの次なる染色に より可視化されたオリゴマーと一致する単一の蛍光バンドが観察された。

この反応の生成物は、製塩基への穏和な暴露に対し安定であるアルキルカルバメ ートである。この方法により合成される最終接合体の構造は次のものである：こ の方法により他のモノアミノアルキルおよびアリール誘導体が製造され得る。構 成されているこのシリーズの他の分子は、エチレンジアミンおよびヘキサンジア ミンを使った誘導体を包含する。長鎖の付加は、必要濃度を達成するために溶媒 の極性を僅かな変更を必要とするかもしれない、また、反応時間を延長するなら ば、低濃度を使うことができる。

劃−」− イミ゛ゾール２　カルボン　エスール　ボッ１ジンｉンカー　ＤＳＳおよびＢＩ Ｓ−アミノアルキルポ１エチレング１コールを　たＤＮＡのボッエチレングリコ ール銖　のム底 この例では、例１において与えられた方法に従って、マウスのβ−グロブリンｍ ＲＮＡの開始領域に相補的な２５ヌクレオチドＤＮＡを合成する。合成後、合成 支持体を８０％酢酸で３０分間処理し、該分子の５′一端からトリチルを除去し た。

ついで固体材料を無水アセトニトリルで徹底的に洗浄し、そして乾燥アルゴンの 流れのもとで風乾させ、そして例４に記載したようにして０．３　Ｍカルボニル ジイミダゾールで処理した。該カラム上の５′−カルボニルイミダゾール活性化 オリゴマーを１５ｍのアセトニトリルで洗って過剰の試薬を無くし、そして０． １Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８を含む５０％アセトニトリル中に溶解された０、 ２Ｍポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ＝１０００）で室温にて１６時間処理した。カラム 上の物質を、水およびアセトニトリルで洗って塩および未反応のポリリジンを除 き、そして濃水酸化アンモニウムでカラムから溶出した。

カラムからの離脱の後、オリゴマー接合体を含む水酸化アンモニウム溶液を、封 管されたガラスのバイアル中に入れそして５５℃にて５時間インキュベートした 。

次いで、生成物を５０％水性エタノールから数回凍結乾燥し、そして１０ｍＭ） リス緩衝液、ｐＨ７，５中、ＴＳＫ　Ｇ４０００ＳＷ上でのゲル濾過クロマトグ ラフィーにより精製した。第一アミンの比率は、フルオレスカミンとの反応によ り決定された。

ポリアミンリンカ−を欠く対照のオリゴマーでは蛍光が全く観察されなかった。

ポリアミン接合体を負に荷電させるために、該複合体をＦＩＴＣで処理して該分 子をラベルしそしてアミン上の正電荷を中和した。これは、該物質の一部を１０ ０４の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解し、これに１■のＦＩＴＣを添加する ことにより達せられた。１時間のインキュベーションの後、未反応のＦＩＴＣを 、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５スパンカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィー により除去した［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、（１９Ｂ２）、前掲］。

次いでＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ（１９８０）前掲により記載されたよう に行うポリアクリルアミドゲル電気泳動によって生成物を分析した。５ｔａｉｎ ｓ−ａｌｌで可視化されたＤＮＡと一致するブロードな蛍光バンドが観察さた。

分子の５′一端に共有結合で連結されたポリリジンを含むオリゴマーを、次のよ うにビス−（アミンヘキシル）ポリエチレングリコール（肚・３５００）と架橋 させた。該ポリエチレンオリゴマーをまず０．１Ｍ炭酸ナトリウム、３Ｍ　Ｎａ Ｃ１に対して透析し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０装置（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄ ａｎｖｅｒｓ、Ｎ、Ｊ、）を使って４■／ｄの最終濃度に濃縮した。この溶液５ ０Ｊ１１に２５ｕのジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、１０■／戚ＤＭＳ Ｏ中）を添加し、そしてその混合物を室温で１０分間インキュベートした。次い で未反応のＤＳＳを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５上でのクロマトグラフィーにより 直ぐに除去し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０膜で濃縮した。溶液をビス＝（ アミノヘキシル）ポリエチレフグリコール中０．２　Ｍに作り、そして室温で一 晩インキユベートシて最終接合体を形成せしめた。前述のように操作してＴＳＫ 　Ｇ４０００Ｓ−カラム上で精製を行った。

この接合体は次の一般式を有する： １、製品タイプＩ 上式中、Ｘは普通Ｈであるが、少なくとも１つのＸが−Ｃｏ　（ＣＨｚ）　１ｃ ＯＨＮ−ＰＥＧｓ。。。である。

使われる反応過剰量またはポリエチレングリコールおよびポリリジンの分子量を 変更することにより、色々な大きさの置換基のサイズおよび電荷を存するポリマ ー接合体を作製することが可能である。該複合体のこれらの性質を変えられるこ とは、様々な適用における該化合物の利用を企画することを可能にする。

［ ＤＮＡメチルホスホネートのポＩエチレング１コール憬体夏合底 ＤＮＡメチルホスホネート（ＭＰ）の化学合成は、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒのホスホ クロリグイト法の変法を使って行うことができる［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ、 Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９７５）９７：３２７８；　Ｌｅｔｓｉｎｇ ｅｒおよびＬｕｎ５ｆｏｒｄ、　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９７６ ）９８：３６０５−３６６１；ＴａｎａｋａおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８２）益：３２４９−６０］　。

この方法では、無水アセトニトリル２．６−ルチジン中に溶解された乾燥保護ヌ クレオシドを化学量論量のメチルジクロロホスフィンによりその場でｇ活性化す る。活性化されたヌクレオシドモノクロライドを、スクシネートスペーサーを媒 介して調節多孔質ガラスに結合した伸長ＤＮＡ鎖のヌクレオチドの５′−水酸基 に順次付加せしめる［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄ、Ｌｅｔｔ、　（１９８０）２１ニア１９−７２２］、各付加の後で、 無水酢酸による未反応５′−水酸基のブロック、ヨウ素酸化、および３％トリク ロロ酢酸−塩化メチレン中での５′−説トリチル化を行う。

次いで、樹脂に結合したメチルホスホネートオリゴマーを無水アセトニトリル中 での十分な洗浄により乾燥し、そしてこの工程を繰返した。この方法を使った通 常のサイクル時間は２３分であり、〉３２％の縮合効率を伴う（トリチル脱離に より判断）。塩基での開裂の際に５′一端のリン酸ジエステルを生じるシアノエ チルホスホトリエステルとして最後の塩基を添加してもよい。この段階は、調製 の中間段階においてオリゴヌクレオチドを放射能ラベルし、ゲル電気泳動を使っ て生成物を精製しそして配列決定することを可能にする［Ｎａｒａｎｇ　ら、Ｃ ａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７５）５３：３９２−３９４；Ｍｉ　１ｌ ｅｒ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８３）１１：６２２５−６ ２４２］。

アミン−末端リンカ−アームを次のように付加する。上記のようにトリチルを除 去し、そして０．２Ｍジメチルアミノピリジンを含む乾燥アセトニトリル中に溶 解された０、　２　Ｍｉｌｌ１ｉｎｏｌｉｎｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｗｅｒ　Ｃ１ｔｙ）で樹脂を５分間処理する。次いで上記 のようにリンカ−アームのオリゴヌクレオチドをヨウ素中で酸化しそしてアセト ニトリル中で洗浄する。脱保護されたいずれの第一アミンも塩基−安定性アセト アミドに修飾されそのためさらなる反応に無効であるので、無水酢酸でのブロッ クは行わない。

合成の最後に、アミン末端のリンカ−アームのメチルホスホネートオリゴマーを 次のようにして脱保護する。ＤＮＡを含む樹脂をカラムから取り出し、ウォータ ージャケット付ラム中に入れ、１〜２ｄのフェノール：エチレンジアミン（４： １）中４０’Ｃで１０時間インキュベートする。フェノール：エチレンジアミン 中でのインキュベーションの後で、メタノール、水、メタノール及び塩化メチレ ンを使って連続して樹脂を洗浄し、該フェノール試薬及び塩基保護基を除く。窒 素流での乾燥の後、塩基−脱保護された鎖を、ＥＤＡ：エタノール（１：　１） または水酸化アンモニウムによる室温での簡単な処理を使って支持体から開裂せ しめる。

アミン−末端ＤＮＡメチルホスホネートの精製を次のように行う、該物質を５０ ％水性エタノールから数回凍結乾燥し、そして逆相ＨＰＬＣＣ−８カラムを通し て直線勾配において５−５０％アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐ ｎ６．ｓで溶出させて精製する。フルオレスカミン反応性により決定した、アミ ン−含有フラクションをプールし、真空中での乾燥により生成物を回収し、そし て２０％アセトニトリル／２５１酢酸アンモニウム、ｐｌ’１６．５で溶出させ るＮｕｃｌｅｏｇｅｎ　ＤＥＡＥ６０−７上でのイオン交換クロマトグラフィー によりさらに精製する。

ついで精製された生成物を、ヘテロ二価性架橋剤ＳＭＣＣおよび５ＡＴＡ　（ス クシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）を使って適当なポリエチレングリ コール誘導体に変換する。ヌクレオシド塩基と反応しそして修飾する他の試薬（ 例えばスルホニルクロライド、グルタルアルデヒド又は酸無水物）は、まだ合成 支持体と結合し十分にブロックされたオリゴヌクレオチドを用いて行わない限り 、推奨されない。

５′−末端の反応性アミンリンカ−アームを含むＤＮＡメチルホスホネートをま ずｐＨ８，５（０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム）にて１００〜１０００倍モル過剰 の５ＡＴＡと反応させる。室温で３０分後、水中でのＧ−２５カラムクロマトグ ラフイーにより余分な未反応の５ＡＴＡを除去し、真空中で濃縮し、そして次の 反応の用意ができるまで冷却保存する。０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，９中で の１００〜１０００倍モル過剰のＳＭＣＣとの室温での１時間の処理により、ポ リエチレングリコールをマレイミド誘導体に変換する。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ− １００上でのクロマトグラフィーにより過剰の架橋剤を除去し、該物質を真空中 で濃縮し、そして次の反応の用意ができるまで冷却保存する。この物質は冷却保 存すれば約１週間の間安定である。次いで５ＡＴＡ　ＤＮＡメチルホスフェート を、’０．１Ｍリン酸緩衝液中に溶解された塩酸ヒドロキシアミン（ｐＨを７． ２に調整）で１−２時間処理する。

この処理は反応性のスルフヒドリルを遊離させるために提供する。この生成物を １０倍モル過剰のビス−（ＳＭＣＣアミノヘキシル）と、オリゴマーを含む溶液 に後者を粉末として添加することにより反応させる。

次いで該複合体の精製を行う、非結合のオリゴヌクレオチドを、１０ｎ＋Ｍ）リ ス、ｐＨ７，５で溶出させる５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００上でのゲル濾過また はＴＳＫ　Ｇ４０００Ｓ−上でのＨＰＧＦＣにより除去する。この手順の最終生 成物の概略的構造は、次のものである。

ホスホルアミシト　いるＤＮＡアルキルトリエステルのボ１エチレング１コール 迭　のム 表題の化合物のトリエステルの合成は、Ｚｏｎらの方法（Ｇａｌｌｏら、Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　（１９８６）１４ニア４０５〜２０；　Ｓｕｒｎｍｅ ｒｓ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、（１９８６）１４ニア４２１〜３６） に従って行なわれる。この合成方法は他の例に記載されているようなエチルトリ エステルのその場での製造に用いられる方法と同じである。完全にブロックされ たジメトキシトリチルヌクレオシドはベンゼンから繰り返し凍結乾燥することに よって乾燥され、無水アセトニトリル／２，６−ルチジンに溶解され、−７０° Ｃで同じ溶媒中のクロロジイソプロピルアミノエトキシホスフィンの撹拌溶液に 滴下添加される。生成物は、水抽出、真空乾燥およびシリカゲルクロマトグラフ ィーによって回収される。

ＤＮＡエチルトリエステル（ＥＴＥ）の化学合成は、従来のホスホルアミシト法 をわずかに改良した方法を用いて行われる。

この方法において、無水アセトニトリルに溶解したヌクレオシドホスホルアミシ トをテトラゾールと混合し、続いて５′−ヒドロキシ末端ヌクレオシド結合に結 合する。ヌクレオシド添加後、未反応５′−ヒドロキシルと無水酢酸との結合、 沃素酸化、およびトリクロロ酢酸−塩化メチレン中での５′−説トリチル化を行 なう。次いで樹脂結合オリゴマーを無水アセトニトリル中の大量洗浄によって乾 燥し、このプロセスを繰り返す。この方法を用いる通常の周期時間は、９６％以 上の縮合効率で（トリチル放出により判断）、１７分である。

放射ラベルおよび精製を促進するためジエステルとして末端残基を加えることが 都合がよい。ＨＰＬＣ精製を望む場合、５′−末端トリチル基が残っているが、 通常５′−末端トリチルは除去され、例１に記載のアミノ結合法を用いる。

合成の最後において、完全にブロックした生成物を以下のようにして塩基−説ブ ロックする。完全に保護されたＤＮＡを含む樹脂をカラムから取り出し、水−外 被クロマトグラフカラムに入れる０次いでこの樹脂を１〜２ｄのフェノール：エ チレンジアミン（４：１）中に４０゛Ｃで１０時間インキュベートする。フェノ ール：エチレンジアミン中でのインキュベーションの終了時に、フェノールを含 まない試薬で洗い、メタノール、水、メタノールおよび塩化メチレンを続ｌ＋７ 田いて塩基保護基を分離する。窒素流下で乾燥後、ＥＤＡ：エタノール（１：　 １）を用いてまたは室温における水酸化アンモニウムによる簡単な処理を用いて 支持体より塩基−説ブロック化鎖を開裂する。

次いで、アミノリンクＤＮＡエチルトリエステル生成物の精製を以下のようにし て行なう。この物質をまず数回５０％メタノール水溶液より凍結乾燥し、５−５ ０％アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６，８の直線勾配で溶出す る逆相ＨＰＬＣＣ−８シリカカラムによって精製する。フルオレサミン反応性に よって決定したアミン含有画分を貯め、真空乾燥により生成物を回収し、さらに ２５％アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐ）１６．５で溶出するＮ ｕｃｌｅｏｇｅｎ　ＤＥＡＥ　６０−７のイオン交換ＨＰＬＣによって精製する 。

生成物であるオリゴヌクレオチドは、前記のあらゆる方法によるポリエチレング リコールへの結合に適当である。我々の実験において、ＳＭＣＣ、５ＰＤＰ、カ ルボニルイミダゾール、ジスクシンイミジルスベリミデートおよびフェニルイソ シアネートを含む多くの方法が用いられた。

ＳＭＣＣ／５ＰＤＰ結合反応は以下のとおりである。結合アームプルーブを過剰 の５ＰＤＰと結合させ、続いてジチオスレイトール（ＤＴＴ）による還元、未反 応ＤＴＴ除去および遊離スルフヒドリルによるビス（アミノヘキシル）ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）へあらかじめ結合したＳＭＣＣへの架橋を行なう。チ オエーテル結合の形成は急速であり、選択的であり、形成した結合は種々の条件 に対し全く安定である。

ＤＮＡ含有アミン結合アームをｐＨ８，５において（０，１Ｍ重炭酸ナトリウム ）　、１００〜１０００倍モル過剰の５ＰＤＰと反応させる。室温で１時間後、 Ｇ−２５カラムクロマトグラフイーで過剰の未反応試薬を除去し、プルーブ５Ｐ ＤＰ共役体を真空上濃縮する。ビス（アミノヘキシル）ポリエチレングリコール を前記例に記載されたようにしてマレイミド誘導体に転化する。

５ＰＤＰ　ＤＮＡ　）ジエステルを０．１　Ｍ燐酸バッファー（ｐ）１７．２） に溶解した１０＋ａＭのメルカプトエタノールで１時間処理する。

この処理により５′−チオピリドンが分離され、反応性スルフヒドリルが形成す る。過剰の還元剤は、末端ＳＨの再酸化を防ぐためすべての分離を窒素上脱気し た０、１Ｍ燐酸バッファー、ｐＨ６，８内で行なうことを除いて前記のようにＧ −２５カラムを用いて行なわれる。この方法において、マレイミジル化ポリエチ レングリコールとのその後の反応を防ぐため、すべての過剰の還元剤を除去する ことが重要である。

この方法において分離されたチオピリドンは、５′−末端ＳＨの存在を定量する 便利な間接的方法を提供する。還元によって分離されたチオピリドンは３４３　 ｎｌ１１においてＵＶ吸収を有する。この波長における溶液の吸収の増加追うこ とにより、一連の還元が容易に追跡できる。次いで、８０８０のモル消衰係数を 用いてチオピリドンを定量する。次いで粉末あるいは濃厚溶液としてＳ）Ｉ末端 オリゴマートリエステルを含む溶液に加えることによって、生成物を１０倍モル 過剰のビス（ＳＭＣＣ−アミノヘキシル）ポリエチレングリコールと一晩反応さ せる。この反応を一晩２５°Ｃで行なう。

次いで複合体の精製を行なう、１０ｍＨのＴｒｔｓ、　ｐＨ７，５で溶出する５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００またはＴＳＫ　Ｇ４０００Ｓ−のＨＰＧＦＣによる ゲル濾過によって、結合していないオリゴヌクレオチドを除去する。この方法の 最終生成物の構造は下式で表わされる。

”　トリエステル法を　いるＤＮＡアルキル並びにアリールト１エスールのポ１ エーール悸　のＡ 々のアルキル〜Ｉびにア１−ル　のホスホトリエステル第１ゴヌクレオチドの人 可変アルカン鎖長を有する種々のトリエステルの最も有効な製造方法は、ｂ−ク ロロフェニルホスフェートトリエステル（ＰＴＥ）として望む配列を合成する従 来のホスフェートトリエステル化学による０合成の終了の際、合成支持体に結合 した完全に保護されたオリゴヌクレオチドクロロフェニルトリエステルをテトラ ブチルアンモニウムフルオリドおよびアルコールの存在下エステル交換する。Ｄ ＮＡオリゴヌクレオチド構成の基本的方法は古典的ＤＮＡ合成化学である。　Ｇ ａ１ｔの０１ｉ　ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ　：　Ａ　Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ　、　ＩＲＬＰｒｅｓｓ＋　Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ　Ｄ、Ｃ，（１９８４）参照。

ＤＮＡｐ−あるいは０−クロロフェニルホスホトリエステルの化学合成は、Ｌｅ ｔｓｉｎｇｅｒ、　Ｔａｎａｋａ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９ ８２）２５：３２４９〜６０のホスホクロリント法の改良法を用いて行なわれた 。

無水アセトニトリル２，６−ルチジンに溶解し、クロロフェノキシジクロロホス フィンによりその場で活性化された完全にブロックされたおよび乾燥したヌクレ オシドを、前記例のスクシネートスペーサーにより制御細孔ガラス支持体に結合 した成長しているＤＮＡ鎖の５′−ヒドロキシ末端ヌクレオチドに加える。誘導 ガラス支持体、完全にブロックされたヌクレオシドおよび他の合成試薬はＡｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）また はＡｍｅｒｃａｎ　Ｂｉｏｎｕｃｌｅａｒ　（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ） より市販入手可能である。ヌクレオシド添加に続き、無水酢酸による未反応５′ −ヒドロキシのキャッピング、沃素添加、およびトリクロロ酢酸−塩化メチレン 中での５′−説トリチル化を行なう。

樹脂結合オリゴマークロロフェニルトリエステルを無水アセトニトリル内で洗浄 することにより乾燥し、この操作を繰り返す、この方法を用いる通常の周期は１ ３分であり、その縮合効果は９２％以上である（トリチル放出により判断）。

最後の塩基をβ−シアノエチルホスホトリエステルとして加えると、塩基の開裂 の際に５′−末端ホスホジエステルを生ずる。このステップはオリゴヌクレオチ ドの放射ラベルおよびゲル電気泳動を用いる生成物の精製を可能にする（　Ｎａ ｒａｎｇら、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７５）５３：３９２〜４； 　Ｍｉｌｌｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ（１９８６）２５：５０９２〜９ ７）。

合成支持体に結合した完全にブロックされた物質をテトラブチルアンモニウムフ ルオリド（ＴＢＡＦ）およびアルコールの存在下無水条件でエステル交換する。

この方法により急速なおよび定量的アルコール交換が生ずる。この方法は安定な 生成物を形成できる大部分のアリール並びにアルキルアルコールに対し２０分で 終了する。

この例において、最終濃度０．２ＭにＴＢＡＦを溶解するため無水ｎ−プロパツ ールを用いる。次いでこの溶液をゆっくりオリゴマークロロフェニルトリエステ ルを含む樹脂上に注ぎ、約１時間室温で反応させる。次いでこの樹脂をメタノー ル並びにアセトニトリルで洗い、乾燥アルゴン流下で乾燥する。

例８のようにアミン結合アーム添加、脱ブロック、および精製を行なう、ポリエ チレングリコール結合を例７のようにして行なう。結合体の最終収率は、用いた ヌクレオシド樹脂の約１０％である。最終生成物の構造は下式で表わされる。

翌１−Ｗ 前行する例において与えられた合成法を用いて、通常タイプ及びエチルトリエス テルタイプの両オリゴヌクレオチドを作製した。分子の５′末端に疎水性基を含 有する両親媒性ＤＮＡ接合体の最も簡単な例において、合成の終りにトリチル基 を残した。このタイプの精製された物質を、ヘモグロビンを生産する様に誘導さ れたマウス赤血白血病細胞でのヘモグロビンの特異的発現の防止におけるそれら の有効性について試験した。これらの及び次の例において試験されたオリゴヌク レオチドを第１表に示す。

これらの実験のために選択された細胞は、ＤＭＳＯ及び酪酸を包含する種々の薬 物によりヘモグロビンを合成するように誘導され得るＦｒ１ｅｎｄネズミ赤血白 血病（ＭＥＬ）細胞である（Ｇｕｓｅｌｌａ及び）ｌｏｕｓｅｍａｎ、　Ｃｅ１ １（１９７６）８：２６３−２６９を参照のこと〕。

ＭＥＬ細胞はＣ（ｈインキュベーター中での常用技法を用いる培養中に増殖する 。

グロビンを発現する誘導された細胞は、ヘモグロビン産生細胞を青く染めるベン ジジン処理により可視化され得る（Ｌｅｄｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７５ ）　１９０：８９３］　、細胞は、インキュベーション中１■／ｌ〜１　ｎ　／ 　ｒｎｆｌの範囲の濃度で、選択されたオリゴヌクレオチド複合体に暴露された 。対照は模倣（ｍｏｃｋ）処理細胞及びランダム配列オリゴマー対照により処理 された細胞を用いた。処理された細胞を染色強度に基（グロビン生産について種 々の時間間隔においてスコアーし、そして結果を対照と比較した。対照細胞の約 ５０％が誘導性である。毒性及び細胞損傷の標示を得るため、トリバンプルー排 除により、処理による細胞死及び損傷をスコアーした。

得られた結果を第２表に示す。これらの結果は、トリチル末端オリゴマーが合成 阻害の所望の程度を生成せしめるのに一層効果的であることを示している。しか しながら、トリチル末端オリゴマーは、療法剤としてのこれらの一般的使用を推 奨しないある程度の細胞損傷を示した。

］−」Ｌ−衷 マウス細胞におけるヘモグロビンの蓄積に対するトリチルオリゴマーの効果 立　にお番る　−グロビン鳶　の人　に・　る　言゛アＪレキＪＬ／「第１ゴヌ クレオチドの六先行例において与えられた合成法を用いて、５′−末端アミノア ルカンに結合した１５〜２０塩基長のオリゴヌクレオチドを例５に記載したよう にして作製した。このタイプの精製された物質を、ヘモグロビンを生産するよう に誘導されたＭＥＬ細胞でのヘモグロビンの特異的発現の阻害におけるそれらの 有効性について試験した。この結果を第３表に示す。試験方法は例１Ｏに示した 通りである。

第一」Ｌ−表 培養細胞でのヘモグロビン合成の阻害におけるオリゴヌクレオチドの有効性に対 する疎水性の増加の効果第３表に示すように、得れた結果が示すところによれば 、アミノアルカン末端オリゴマーは、末端アルカンを欠くそれらの同族配列に比 べて、選択的合成阻害の所望の程度を生成する上で一層効果的である０例えば、 Ｃ１゜誘導体は、ヘモグロビン陽性細胞の数の減少において対照未修飾２０マー に比べて約６０％多く効果的であった。一般に、アルキル鎖が長くなるに従って 、同じ程度（％）の阻害を行うのに必要なオリゴマーの濃度は低くなる。

例１に示した合成法を用いて、リンカ−としてエチレンジアミンを使用して５′ 〜末端フルオレツセインに結合した１５〜２０塩基長のオリゴヌクレオチドを作 製した。細胞へのオリゴマーの取り込みを蛍光顕微鏡によりモニターすることが でき、このことが生成物による細胞死の他の証拠を提供する点において、この物 質はさらなる利点を有する。精製された蛍光オリゴマーを、ヘモグロビンを生産 するようにＲＮされたＭＥＬ細胞でのヘモグロビンの特異的発現の阻害における それらの有効性について試験した。結果を第４表に示す。

この試験の方法は例１０に示した通りである。

１−土一表 件　でのヘモグロビン人　の　に・　るＦＩＴＣＡ　の四来 オリゴマー３１　生存細胞　ベンジジン＋１１１（％）　細胞の阻害 第４表かられかるように、得られた結果が示すところによれば、フルオレンセイ ン末端オリゴマーは、ヘモグロビン合成の選択的阻害の生成において、ＦＩＴＣ を欠（それらの同族対照配列と少なくとも同等に効果的である。さらに、処理さ れた細胞の蛍光顕微鏡観察は、フルオレセインが結合したオリゴマーの取り込み に暴く増強された蛍光を示した。次に、これらの細胞を単離し、生理的食塩水中 で数回洗浄し、そして水中での数回の凍結・解凍により溶解せしめた。生ずる溶 液を遠心して細胞破片を除去し、そして・存在するフルオレッセイン結合オリゴ マーの量をアミンコ（Ａｍｉｎｃｏ）蛍光分光計で定量した。得られた結果が示 すところによれば、処理された細胞は細胞当り平均１０７分子のフルオレッセイ ン結合オリゴマーを同化した。これは、類似のＤＮＡオリゴマー（すなわち容解 性成分を欠く）の細胞当り細１０６分子の細胞取り込みに比べて約１０信高い。

従って、オリゴマーへの疎水性成分（この場合フルオレセイン）の付加が、蛋白 質合成を選択的にブロックするその能力に影響を与えることな（オリゴマーの細 胞取り込みの実質的増加をもたらすことがわかる。

ングリコール　「オリゴヌクレオチドの六先行例に示した合成法を用いて、５′ −末端ポリエチレングリコールに結合した２０塩基長のオリゴヌクレオチドを、 例４に記載したようにして作製した。これらの分子複合体を精製し、そして例１ ０に記載したようにヘモグロビンの特異的発現の阻害におけるそれらの有効性に ついて試験した。

男−」Ｌ−表 培養細胞でのヘモグロビン合成の阻害に対するポリエチレングリコール接合体の 効果 １″）第１表を参照のこと。

第５表に示すように、得られた結果が示すところによれば、ポリエチレングリコ ールに結合したオリゴマーは所望の程度の選択的合成阻害の生成において、対照 より効果的であった。

この例におけるポリエチレングリコール接合体は、２０マ一体とポリエチレンレ ンゲリコールとの対照組み合わせよりも約１０倍活性が高いことが見出された。

さらに、ＰＥＧ接合体収ついて観察される増加した有効性と一致して、培地への ポリエチレングリコールの単なる添加が、添加された対照アンチセンスオリゴマ ーの有効性を増加せしめることに注目することは興味深い。

上記の結果から、本発明の新規な接合体が、転写機構を調節する効率の増強にお いて実質的な利点を提供することが明らかである。この発明に従えば、広範な種 類の細胞性（原核性及び真核性の両方）、並びにウィルス性の、生理的過程が制 御され得る。この組成物はインビトロ及びインビボで使用することができる。前 者においては、哺乳類のマイコプラズマからの保護、表現型の変更等の機構を研 究することができる。後者においては、病原体の増殖阻害、ある種の細胞、例え ばＢ−細胞及びＴ−細胞の選択的阻害等における療法のために組成物を使用する ことができる。

この明細書に記載したすべての刊行物及び特許出願はこの発明が属する分野にお ける通常の知識を有するものの技術水準を示すものである。すべての刊行物及び 特許出願は、各それぞれの刊行物又は特許出願が引用により組み含まれるべきこ とが特定して且つ個別的に示されていたのと同様に、引用によりこの明細書に組 み込まれる。

前記の発明は理解を明瞭にするために説明により及び例示により幾分詳細に記載 されたが添付された詳細の範囲の範囲内において幾かの変化及び変更が行われ得 ることは自明であろう。

手続補正書（方式） 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２００９ ２、発明の名称 新規な両親媒性核酸接合体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シンセティック　ジェネティクス４、代理人 住所　〒１０５東京Ｍ港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 平成１年１１月７日（発送日） ６、補正の対象 （１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者 」の欄 （２）　明細書及び請求の範囲の翻訳文（３）委任状 （４）法人証明書 ７、補正の内容 （１）　（３ン（４）　別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 ＜１１　訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通 （２］　明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）　委任状及びその翻訳文 　各１通（４）法人証明書及びその翻訳文　各１通国際調査報告 ｔ＋ｒ＝／ｌ＋＜ａｌｌ／ｎｌ；１ｆｌｌ’ＩＱ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞中でのメッセンジャーＲＮＡの成熟及び翻訳を阻害する方法であって、 該細胞を、該細胞の転写生成物に相互的なオリゴヌクレオチド配列及び両親媒性 分子を得るために該オリゴヌクレオチド配列に共有結合により連結された基を含 んで成る組成物を接触せしめ、これにより該組成物を細胞内に移行せしめて前記 転写生成物の成熟及び／又は翻訳の阻害を生じさせる、ことを含んでなる方法。
2. ２．前記細胞が培養されたものであり、そして前記組成物が栄養培地に導入され る、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記オリゴヌクレオチドが約６〜３０ヌクレオチドから成るものである、請 求項１に記載の方法。
4. ４．前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがリン成分としてホスフェートを 有する、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがリン成分として１〜３個の炭素 原子のアルキル基を有するホスホネートを有する、請求項３に記載の方法。
6. ６．前記基が疎水性芳香族基である、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記芳香族基がトリチル基である、請求項７に記載の方法。
8. ８．前記芳香族基がフルオレッセイン基である、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記基がポリアルキレンオキシ基であり、ここで該アルキレンは２〜１０個 の炭素原子から成るものである、請求項１に記載の方法。
10. １０．前記ポリアルキレンオキシ基が約６〜２００単位から成るものである、請 求項９に記載の方法。
11. １１．細胞の転写生成物に相補的なオリゴヌクレオチド配列及び両親媒性を得る ために該オリゴヌクレオチドに共有結合された両親媒性又は疎水性基を含んで成 る組成物を含む細胞。
12. １２．前記細胞が培養細胞である、請求項１１に記載の細胞。
13. １３．細胞の転写生成物に相補的な少なくとも６個のヌクレオチドから成るオリ ゴヌクレオチド配列；アルキレンが２〜１０個の炭素原子を有するポリアルキレ ンオキシ基を含んで成る両親媒性基；並びに前記オリゴヌクレオチド配列及び前 記両親媒性基に共有結合した、少なくとも１個の炭素原子を有するリンカー；を 含んで成る組成物。
14. １４．前記ヌクレオチドが６〜３０ヌクレオチドから成るものである、請求項１ ３に記載の組成物。
15. １５．前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがリン成分としてホスフェート を有する、請求項１３に記載の組成物。
16. １６．前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがリン成分として１〜３個の炭 素原子を有するアルキル基を伴うホスホネートを有する、請求項１３に記載の組 成物。
17. １７．前記連結基が、アミノ、キノン、チオエーテル又はアミド基の少なくとも １つを含む、請求項１３に記載の組成物。
18. １８．前記オリゴヌクレオチド配列が少なくとも部分的に非コード配列に相補的 である、請求項１３に記載の組成物。
19. １９．前記オリゴヌクレオチド配列が少なくとも部分的にコード配列に相補的で ある、請求項１３に記載の組成物。